Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ О- И Н-АНТИГЕНОВ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ РОДА AZOSPIRILLUM

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ О- И Н-АНТИГЕНОВ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ РОДА AZOSPIRILLUM"



-33Л

На правах рукописи

БУРЫГИН Геннадий Леонидович

сравнительное исследование о- и н-антигенов

почвенных бактерий рода лгоягтии'м

03.00.07 - микробиология 03.00.04-биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2003

Работа выполнена в Институте биохимии н физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научные руководители; кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Матора Л.Ю.

Ведущая организация: Институт микробиологии РАН

Защита состоится ".12/' . Ч'.^":" - инни диссертационного

совета Д 002.14^.^] Щ -- '(• ,{ растений и микроор-

ганизмов России-. ч. . V ■'(■'■■Г ' .>,-. просп. Энтузиастов, 13)

С диссертацией ■ > - . • а /и-; о ...¡и-л-хе ИБФРМ РАН.

Автореферат р I.-.с:1 _ - ;.. „'. г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор химических наук, профессор Щёголев СЮ.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Тараненко Т.М.

доктор биологических наук, профессор Карпунина Л.В.

доктор биологических наук

Никитина В,Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Молекулярная архитектура клеточной стенки грамотрицательных бактерий достаточно хорошо изучена на примере семейства Еп1егоЬас1епасеае. В тоже время, разнообразие грамотрицательных микроорганизмов не исчерпывается представителями этого семейства. Очевидно, что экстраполяция представлений о клеточной стенке семейства энтеробаюерий на всю группу грамотрицательных прокариот не вполне правомерна. Основанием для этого, в частности, служат результаты, полученные при изучении клеточной поверхности почвенных ассоциативных бактерий рода ЛтхргШит. К числу таких результатов можно отнести способность азоспнрилл к образованию на клетке полярного пучка пилей (Шелудько и Кацы, 2001); наличие углеводных фрагментов в составе полярного жгутика (Моепз а а1„ 1995); обнаружение лнпополисахар ид-бел ковых и полисахарид-липндных комплексов в составе капсульного материала (Коннова с соавт., 1994); отсутствие индивидуального капсульного антигена (Матора и Щеголев, 2002); установленный для азоспирилл характер Й-Э диссоциации, нетипичный для грамотрицательных микроорганизмов (Серебренникова, 1998) и др. Таким образом, азоспирилла, являясь, безусловно, типичным представителем грамотрицательных бактерий, демонстрирует особенности строения своей наружной мембраны. В первую очередь, это относится к структуре основных антигенов - соматического, жгутикового и капсульного. Изучение деталей строения этих важнейших бактериальных антигенов представляет фундаментальный интерес, поскольку даёт возможность узнать, как организована поверхность бактерий, функционирующих в ризосфере растений. Кроме того, такие знания необходимы при создании биоспецифических зондов для экологических и таксономических исследований азоспирилл.

Целью настоящей работы было получение новых сведений о строении жгутикового и соматического антигенов азоспирилл типовых штаммов и изучение топографической диспозиции этих антигенов в составе клеточной поверхности бактерий. В соответствии с этой целью, в данной работе были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать природу ранее обнаруженных антигенных перекрёстов для препаратов полярного жгугика с препаратами липополисахарида (ЛПС) бактерий рода АгозркШит.

2. Получить ответ на вопрос, являются ли углеводные фрагменты гликозилиро-ванного флагеллнна полярного жгутика азоспирилл специфическими антигенами, или они иммунохимически идентичны соматическому антигену.

3. Провести сравнение иммунохимических, электрофоретических и спектро-фотометрических характеристик ЛПС штаммов азоспирилл, принадлежащих к одному и тому же и к разным серотипам.

4. Оценить иммунохимическую специфичность углеводных антигенов типового штамма А. ЬгавНеюе Эр245 на основе конкурентного иммуноанализа с применением современных вариантов методов спектротурбидиметрии и динамического рассеяния света.

ЦНБМСХА ^^

5, Проанализировать изменения липополисахаридных антигенов в зависимости от возраста и условий выращивания бактериальной культуры. Научная новизна работы. Выявлено наличие чехла (липо)тюлисахаридной природы, экранирующего флагеллин полярного жгутика бактерий p. Aiospirillvm.

Продемонстрировано наличие антигенных перекрестов у Н-антигена бактерий для представителей видов A, brasHense и A. lipoferum.

Показано, что углеводные структуры, входящие в состав гликознлированкого флагеллина полярного жгутика штамма A. brasiknse Sp7, антигенно идентичны одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена,

Установлено, что структура антигенных детерминант О-специфических полисахаридов (О-ПС) ЛПС азоспирнлл меняется под влиянием условий культивирования бактерий на лабораторных средах. При этом экспонировзнность самих О-ПС в составе соматического антигена варьирует в зависимости от фазы роста бактериальной культуры.

Практическая значимость. Предложенный оригинальный способ получения высокоочищенных препаратов ЛПС, содержащих полный спектр антигенных детерминант и демонстрирующих хорошее разделение при электорофорезе в ПААГ, может быть использован при решении широкого круга исследовательских и практических задач. Использованный в работе тест на ингибирование подвижности бактерий p. Azospirillum при добавлении к клеточной суспензии штаммоспецифнчных антител (Ат) на ЛПС может быть применён для их быстрой штаммовой идентификации.

Полученные в работе результаты использованы при проведении совместных исследований с сотрудниками группы генетики микроорганизмов Лаборатории генетики, группы биоорганической химии Лаборатории биохимии и Лаборатории биосенсоров на основе наноразмерных структур ИБФРМ РАН по темам НИР перечисленных научных подразделений. Они отражены также в методическом пособии «Практические занятия по физико-химическим и биохимическим методам исследования биополимеров» (Саратов, изд-во Сарат. ун-та, 2003 г.) и использованы при проведений занятий по спецкурсам «Микробиология с основами вирусологии» и «Физико-химические методы исследования биополимеров» со студентами химического факультета Саратовского госуниверситета. Кроме того, результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами биологического факультета СГУ. Основные положения, выносимые на защиту:

• Полярный жгутик бактерий рода Azospirillum имеет чехол (ли-по)полисахаридной природы, ассоциированный с поверхностью флагеллы и обладающий экранирующим эффектом.

• Н-антигек демонстрирует наличие антигенных перекрёстов у представителей видов A. brasilense и A. lipoferum. Углеводные фрагменты гликозилированно-го флагеллина полярного жгутика штамма A. brasilense Sp7 антигенно идентичны фрагментам соматического антигена.

• Спектры поглощения света препаратами ЛПС имеют характерные отличия для серологически различных штаммов, а изменения спектров, наблюдаемые

внутри одного серотипа, коррелируют с иммунохимическими и биохимическими различиями штаммов.

• И мму но доминантным моносахаридом в составе антигенных детерминант липополисахарид-белкового комплекса (ЛПБК) штамма A. brasilense Sp245 является галактоза.

• Антигенные свойства ЛПС азоспирилл зависят от фазы роста культуры и условий культивирования бактерий на лабораторных средах.

• Обработка протеиназой К высокомолекулярного ЛПС-содержащего комплекса, экстрагированного из наружной мембраны азоспирилл, обеспечивает получение высокоочищенных препаратов ЛПС, содержащих полный спектр антигенных детерминант и демонстрирующих эффективное разделение при электорофорезе в ПААГ.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены в виде устных и стендовых сообщений на: 6-ой Европейской конференции по азотфиксации (Севилья, Испания, 2000), Межвузовской конференции молодых учёных «Растение, микроорганизмы и среда» (Санкт-Петербург, Россия 2000), Конференции «Молодые учёные Волго-Уральского региона на рубеже веков» (Уфа, Россия, 2001), 2-ой Всероссийской школе по экологической генетике «Симбиогенетика и эволюция» (Санкт-Петербург, Россия, 2001), 1-ой Региональной конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2002), 6-ой Путинской школе-конференции молодых учёных «Биология — наука XXI века)) (Пущино-на-Оке, Россия, 2002), 10-ом Международном Конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии «Мир микробов» (Париж, Франция, 2002), 11-ом Международном конгрессе по молекулярным взаимодействиям растений и микроорганизмов (Санкт-Петербург, Россия, 2003) и Международном симпозиуме «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и растений в условиях техногенных загрязнений» (Саратов, Россия, 2003).

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН 24 сентября 2003 года.

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 10 опубликованных работах, включая 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованных источников, содержащего 187 источников, и двух приложений. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, включает 21 рисунок и 2 таблицы.

Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (№ гос. per. 01890017743, научный руководитель зав. лаб. д. х. н. профессор Щёго-лев С. Ю.). Работа поддержана грантами Комиссии РАН по работе с молодежью по итогам конкурсов 2002 и 2003 г.г. по поддержке базовых кафедр и филиалов

кафедр, созданных при институтах РАН, грантом РФФИ № 02-04-58780з для поездки на 10-й Международный Конгресс по бактериологии и прикладной микробиологии «Мир микробов» (Париж, Франция, 2002) и гратом Президента РФ № НШ-1529.2003,4 на поддержку молодых российских учёных и ведущих научных школ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования

В работе использовали штаммы Л. brasilense Sp7, Cd, JM125A2, Sp245, Spl07, A. lipoferitm Sp59b, E. coli K12, а также мутанты штамма Sp7: 7.К.2, IZ5 и S-вариант штамма Sp7 и мутанты штамма Sp245: КМ018 и КМ252. Мутантный штамм IZ5 был любезно предоставлен Г. Александре (Департамент микробиологии и молекулярной генетики университета г. Лома Линда, Калифорния, США). S-варианг штамма Sp7 был любезно предоставлен Л.П. Петровой (ЛГМ ИБФРМ РАН). KM0I8 и КМ252 были получены в результате омегонового мутагенеза штамма Sp245 (Katzy et аЦ 1998).

Бактерии выращивали на синтетической малатной среде (Döbereiner and Day, 1976) при 30°С. В некоторых случаях малатная среда содержала дополнительно 0.1 М трис(гидрок'симетил)аминометана (ТРИС) или 0.1 М N-2-гидрокси-этилпи лераз ин-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES). В качестве поддерживающей среды использовали также LB.

Для получения антител на ЛПС азоспирилл использовали методику иммунизации животных целыми бактериальными клетками, предварительно обработанными 2% глутаровым альдегидом (Матера с соавт., 1998). Фракции IgG получали из антисывороток осаждением сульфатом аммония (Кэбот и Мейер, 1968).

Для иммунохимических экспериментов с использованием специфических антител препараты ЛПС получали экстракцией с помощью ЭДТА (Leive et al, 1968) с небольшой модификацией. Для электрофоретических и спектрофотомет-рических экспериментов ЛПС получали с помощью оригинального способа, включающего протеиназную обработку солюбилизата наружных мембран бактериальных клеток. В экспериментах по определениюиммунохимической активности О-антнгена был использован препарат липополисахарнд-белкового комплекса (ЛПБК), выделенный из капсульного материала бактерий штамма А. brasilense Sp245 С.А. Конновой с соавторами (ЛБ ИБФРМ РАН) (1994).

Для получения препарата полярного жгутика отмытые и осажденные клетки ресуспендировали в 40 мл физраствора, забуференного фосфатами. Полученную суспензию гомогенизировали в течение 90 сек с помощью блендера. Для осаждения клеток суспензию дважды центрифугировали в течение 15 мин при 3000g. Полученный супернатант подвергали ультрацентрифугированию в течение 1 часа при 100000g. В некоторых случаях ультрацентрифугирование препарата жгутика проводили в градиенте плотности сахарозы. С целью получения очищенного флагеллина проводили кислотную диссоциацию полярного жгутика с

последующей реассоциацией в нейтральной среде.

Для изучения подвижности бактериальных клеток готовили препарат «раздавленная» или «висячая» капля. Предметные стёкла просматривали в просвечивающий микроскоп J EN AVAL (Carl Zeiss, Jena, ГДР) (техника фазово-контрастной микроскопии), используя объектив с широким охватом поля зрения. Во время наблюдений вели видеозапись с помощью видеокамеры DCR-TRV900E (SONY, Япония), Оценивали подвижность всех клеток в поле зрения микроскопа. При этом у 50-150 случайно выбранных подвижных единичных клеток определяли среднюю скорость движения.

Двойную иммунодиффузию проводили по стандартной методике (Ouchterlony and Nilsson, 1979).

ДСН-электрофорез (Hitchcock and Brown, 1983) проводили в 12,5% ПААГ. С целью визуализации ЛПС и белков гели окрашивали серебром (Tsai and Frasch, 1982) или Кумасси R-250, соответственно, а также использовали их для электропереноса на нитроцеллюлозные фильтры («Millipore», 0.45 мкм). Для иммуноде-текции антигенов в качестве первых Ат использовали кроличьи антитела на ЛПС исследуемого штамма (50 мкг/мл), полученные как описано выше. В качестве вторых Ат использовали козлиные антикроличьи антитела, меченные пероксида-зой хрена (Tsang et al1983).

Твёрдофазкый иммуноанализ целых клеток проводили по методике, описанной в статье Богатырева с соавторами (Bogatyrev et al., 1992), используя в качестве метки коньюгат коллоидного золота с протеином А. Микроскопический анализ проводили на просвечивающем электронном микроскопе «BS-500» («Tesla», ЧССР) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

При проведении конкурентного иммуноанализа ингибирующие моносахариды добавляли к антителам в концентрации 10"2 М, Растворы антител, ЛПБК и ингибиторов - моносахаридов готовили в буфере, содержащем 0.1 M раствор NaCl и 0,01 M ТРИС-НС1 (pH 7.2). Для определения ингибирукицего действия моносахаридов использовали метод динамического рассеяния света. Об ингиби-рущем эффекте судили по ослаблению интенсивности светорассеяния на ранних стадиях образования преципитата. Для определения объемной доли биополимера в составе частиц нерастворимых иммунных комплексов использовали вариант метода спектротурбнд иметрии (Щёголев, 1999), усовершенствованный с участием аспиранта ИБФРМ РАН Хлебцова Б.Н. и заведующего Лабораторией биосенсоров на основе наноразмерных структур (ЛБНС) ИБФРМ РАН Хлебцова Н.Г.

Измеряли спектры ослабления света в единицах оптической плотности А, обусловленной его рассеянием на взвешенных частицах преципитата. Зависимость А от X определяли в интервале 400-600 нм. Измерения проводили на спектрофотометре «Specord М40» (Carl Zeiss, Jena, ГДР) с использованием специальной приставки для корректного определения спектров мутности (Хлебцов с со-авт., 1988), Определение размеров иммунных комплексов проводили с помощью метода динамического светорассеяния на установке, описанной Хлебцовым с соавторами (Khlebtsov et al., 2001). Для качественной оценки эффективности ин-гнбирования использовали метод двойной иммунодиффузии.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование антигенов полярного жгутика бактерий р. ЛгоэрМИит

Результаты исследования антигенов полярного жгутика разделяются на две самостоятельные части, которые включают исследование антигенной специфичности выявленного (липо)полисахаридного чехла, ассоциированного с поверхностью полярного жгутика азоспирилл, и исследование антигенов собственно фла-геллина полярного жгутика.

Выявление (липо)полисахаридного чехла на поверхности полярного

жгутика

С помощью электронной микроскопии и антител на ЛПС нами было выявлено наличие (л ипо)пол и сахаред но го чехла на поверхности полярного жгутика

штаммов бактерий рода АюхртИит. Рис. 1 демонстрирует взаимодействие коньюгатов протеин А -коллоидное золото и штаммос-пецифичных антител на ЛПС с бактериальной клеткой штамма А. ЬгтИепзе Бр245. Метка выявляет наличие ЛПС не только на самой клетке, ио и на поверхности полярного жгутика.

На рис. 2 приведены результаты сравнительного иммунодиффузионного анализа препарата нативкого жгутика, не освобождённого от чехла, и препарата ЛПС штамма Эр245 с антителами на ЛПС данного штамма. Ранее было установлено наличие двух иммунохимически различных О-ПС в составе ЛПС данного штамма (Ка1гу е( а1, 1998). В данном случае препарат жгутика образует общую линию преципитации с одним из О-ПС, входящим в состав ЛПС Бр245. Второй О-ПС, характерный для ЛПС данного штамма, также присутствует в составе препарата жгутика, но линия преципитации, соответствующая ему, выражена намного слабее. Отделение чехла от жгутика оказалось возможным только в результате кислотной диссоциации полярного жгутика с его последующей реассоциацией. Однако единственной структурой, сохраняющей нативность после описанных про-

Рис. 1. Взаимодействие коньюгатов протеин А - коллоидное золото с Ат на ЛПС А. Ьга-$Иеп$г 5р245 с клетками данного штамма. Длина масштабной метки 200 нм.

1 г|

Рис. 2. Результаты иммунодиффузионного анализа препарата ЛПС (1) и препарата полярного жгутика (2) А. ЬгазИете Бр245 с Ат на ЛПС данного штамма.

флзгеллнн

I

S-антиген

: R-антнген

цедур с полярным жгутиком азоспирилл, был ЛПС. При этом вместо полимерного флагеллина ассоциировались случайные конгломераты молекул.

Исследование углеводных фрагментов гликознлированного флагеллина

полярного жгутика

Исследование углеводных фрагментов полярного жгутика штамма A. brasilense Sp7, у которого в работе (Moens et a/., 1995) впервые для азоспирилл было показано наличие структур данного типа, проводили с помощью двух производных этого штамма IZ5 и 7.К.2. Первый из этих производных был отобран Г. Александре. Штамм IZ5 характеризовался неподвижностью клеток и отсутствием в составе флагеллина полярного жгутика структур, выявляемых с помощью красителей на углеводы (Alexandre, Zhulin, неопубликованные данные). Штамм 7.К.2 был отобран в ЛФХКС ИБФРМ РАН с помощью иммунодиффузионного теста с антителами на ЛПС штамма Sp7. Он отличался отсутствием в составе ЛПС одного из двух характерных для Sp7 О-специфических полисахаридов. Различия в молекулярной массе субъединиц полярного жгутика исходного штамма Sp7 и штамма IZ5 видны на рис 3 А. Кроме того, рисунок 3 Б демонстрирует, что ЛПС IZ5 анти-генно идентичен липополиса-хариду исходного штамма Sp7.

На рис. 4 А представлены результаты иммуноблоттинга препаратов полярного жгутика

Рис. 3 А. Результаты электрофореза в ПААГ препаратов полярного жгутика Бр7 (1) и К5 (2) (окраска Кумасси).

Б. Результаты иммуноблоттинга с Ат на ЛПС Бр7 препаратов ЛПС Бр7 (1) и 1г5 (2).

флягеллнн

флагеллнн

ЛПС

¡ЙИ> Ш:

Рис. 4. Результаты иммуноблоттинга препаратов полярного жгутика Эр7 (1) и 1X5 (2) с Ат на флагеллин полярного жгутика А. И-ро/егит 4В (А) и с Ат на ЛПС Бр7 (Б).

штаммов Sp7 и IZ5 с использованием антител на флагеллин полярного жгутика A. lipoferum 4В, любезно предоставленных Г\ Александре (Alexandre et д/„ 1999). Взаимодействие антител на флагеллин штамма, относящегося к виду А. lipoferum, с препаратами полярного жгутика штаммов, относящихся к виду А. brasilense, свидетельствует о наличии родоспецифичных антигенных детерминант в составе Н-антигена у азоспирилл. Сохранившаяся у мутанта IZ5 способность взаимодействовать с данными антителами говорит о том, что его флагеллин, в отличие от углеводных фрагментов жгутика, очевидно, не претерпел каких-либо изменений.

На рис. 4 Б приведены результаты иммуноблоттшнга тех же препаратов полярного жгутика со штаммоспецифнчнымн антителами на ЛПС штамма Sp7. В то время как антитела на флагеллин одинаково эффективно взаимодействуют с препаратами полярного жгутика дикого штамма (гликоэилированный флагеллин) и мутанта с н егл икозил про ван ным жгутиком, антитела на ЛПС распознают только препарат жгутика дикого штамма. При этом как у исходного штамма, так и у его мутанта антитела выявляют сопутствующий жгутику липополисахарид (чехол - см. выше), отдельно мигрирующий в электрическом поле.

Таким образом, мы установили, что антитела на ЛПС распознают некие углеводные структуры, входящие в состав глнкозклированного флагеллина полярного жгутика бактерий дикого штамма и, очевидно, гомологичные отдельным фрагментам соматического антигена. Для получения ответа на вопрос, какие

именно структуры в составе ЛПС штамма Sp7 антигенно идентичны углеводным компонентам флагеллина полярного жгутика, мы использовали штамм 7.К.2.

Сравнительный электро-форетнческнй анализ ЛПС штаммов Sp7 и 7.К.2 (рис. 5 А) свидетельствует о том, что в составе ЛПС у 7X2 отсутствует один из двух 0-ПС, ранее описанный как S-антиген (Матора с соавт., 2003). Поскольку выше было отмечено наличие перекрестной иммунологической реакции между жгутиком и ЛПС, в частности - S-антигеном (рис. 4 Б), логичным представлялось предположение о том, что углеводные фрагменты флагеллина полярного

флагеллин

S-Ar

R-Ar

а б в

Рис. 5 А. Результаты электрофореза в ПААГ препаратов ЛПС Бр7 (1) и 7.К.2 (2) (окраска серебром).

Б. Результаты электрофореза в ПААГ препаратов полярного жгутика 5р7 (1) и 7.К.2 (2) (окраска Кумасси).

В. Результаты иммуноблогшкга препаратов полярного жгутика данных штаммов с Ат на ЛПС Зр7.

жгутика штамма Бр7 гомологичны фрагментам именно этого О-ПС. Электрофо-ретический анализ с последующей иммунодетекцией препаратов полярного жгутика показал, что флаге длин у штамма 7.К.2 имеет меньшую молекулярную массу и, в отличие от 5р7, и не взаимодействует с антителами на ЛПС данного штамма (рис. 5 Б, В). В составе препарата жгутика исходного штамма антитела выявляли наличие О-аитигенных детерминант, как мигрирующих при электрофорезе отдельно, так и находящихся в составе флагеллииа полярного жгутика (рис. 5 В). При этом хорошо видно, что в препарате полярного жгутика 7X2 Э-антиген не выявляется ни в составе флагеллина, ни в составе сопутствующего материала (чехла). В то же время второй О-ПС (Я-антиген) визуализируется очень четко.

Полученные результаты позволили нам прийти к заключению о том, что углеводные структуры гликозилированного флагеллина полярного жгутика штамма Бр7 могут являться, по своей сути, фрагментами 5-антигена данного штамма. Однако, чтобы сделать безоговорочный вывод об антигенной идентичности этих структур, необходимо было получить антитела на мономеры полярного жгутика штамма Бр7,

Получение и анализ антител на флагеллин А, ЬгазНепзе 8р7

Самым важным этапом в решении поставленной задачи являлось получение флагеллина штамма тщательно освобождённого от (липо)полисахаридного чехла. Мы использовали схему, предложенную Муравлевым с соавт. (1999), и получили антитела на высокоочищенные субъединицы полярного жгутика, разделённые с помощью электрофореза в ПААГ и извлечённые из геля путем специальной диффузии.

Результаты сравнительной иммунодиффузии полученных антител на изолированный флагеллин штамма Бр7 и антител на ЛПС данного штамма представлен на рис. 6. Слияние полос преципитации свидетельствует о том, что субъединицы полярного жгутика имеют общие детерминанты с ЛПС. Мажорная шпора, отмеченная стрелкой на этом рисунке, в свою очередь, свидетельствует о том, что основной пул антител, полученных на изолированный полярный жгутик, специфичен именно Н-антигену.

Углеводные детерминанты гликозилированного флагеллина вносят очень небольшой вклад в иммунный ответ на изолированный жгутик, о чем свидетельствует слабо заметная шпора, обнаруживаемая для препаратов жгутиков 5р7 и 7.К.2 (рис.7). Данный рисунок также демонстрирует характер взаимодействия антител на мономеры жгутика А. ЬгазИете Бр7 с препаратами изолированных жгутиков

Аг

Рис. 6. Результаты иммунодиф-фузионного анализа препарата полярного жгутика штамма вр7 (Аг) с Ат на ЛПС (1) и Ат на флагеллин (2) данного штамма.

•5 :|«АТ ШШ Д J

4 "3 )■

Рис, 7. Результаты иммунодиффузиониого анализа препаратов жгутика штаммов А. brasiiense Sp7 (1, 4), А. brasiiense 7.К.2 (2), А. brasiiense Sp245 (3), A. Upoferum Sp59b (5), E. coli K12 (6) с Ат на флагеллин A. brasilense Sp7.

детерминант их углеводных фрагментов, так и фнчными) также видо- и штаммоспецифячных флагеллина.

другого штамма этого же вида (А. brasiiense Sp245), штамма другого вида (А. Upoferum Sp59b) и бактерий другого рода (£. coli К12). Отсутствие взаимодействия со жгутиком EL coli - свидетельство родовой специфичности всех антигенных детерминант мономеров полярного жгутика азоспирилл. Различная интенсивность взаимодействия антител с препаратами жгутиков других штаммов азоспирилл может привноситься как штаммовой специфичностью наличием (наряду с родоспецн-детерминант в составе самого

45 -Г

S X 40 -

* X к 35 ■■

i 30 -■

£ * г 25 --

20 --

о * о е 15 ■■

к « k 10 ■■

1 5 -0 -

100

Исследование изменений подвижности клеток азоспирилл при взаимодействии с антителами к О- и Н-антигенам

Для того, чтобы проверить предположение о экранированности флагеллина полярного жгутика выявленным нами (лнпо)полисахаридным чехлом, мы совместно с сотрудниками группы генетики микроорганизмов Лаборатории генетики ИБФРМ РАН провели серию экспериментов по исследованию подвижности азоспирилл штаммов 5р7 и Зр245 в присутствии антител на ЛПС данных штаммов и антител на флагеллин штамма Эр?. Мы судили о взаимодействии данных антител с полярным жгутиком азоспирилл, оценивая подвижность всех клеток в поле зрения микроскопа и определяя среднюю скорость

■■■средняя скорость движения клеток

—% подвижных клеток

Рис, 8. Зависимость процента подвижных клеток и средней скорости движения клеток А, Ьгаз Пете 8р7 от концентрации Ат на ЛПС данного штамма: ! — контроль (без антител); 2—1 мкг/мл; 3 — 10 мкг/мл; 4 - 100 мкг/мл; 5 - 1000 мг/мл.

движения у случайно выбранных подвижных единичных клеток. Во время наблюдений вели видеозапись с помощью видеокамеры.

Диаграмма зависимости процента подвижных клеток и средней скорости подвижных клеток А. ЬгазИете Бр7 от концентрации штаммоспецифичных антител на ЛПС (рис. 8) свидетельствует о том, что увеличение концентрации данных антител приводило к полному прекращению движения бактерий. При этом ни добавление к клеточной суспензии антител на флагеллин, ни добавление антител на ЛПС другого штамма, не приводило к такому эффекту (Таблица 1). Из этого

Таблица I. Процент подвижных клеток и средняя скорость подвижных клеток А. ЬгазИете 5р7 при их взаимодействии с Ат разной специфичности

контроль Ат/ЛПС 8р7 Ат/ЛПС Эр245 Ат/флагеллин Бр7

Процент подвижных клеток, (%) 89.84 0 75.67 62.93

Средняя скорость подвижных клеток, (мкм/с) 35.3±1.23 0 32.24±1.0 28.5±1.05

следует, что флагеллин у азоспирилл действительно изолирован от окружающей среды (липо)полнсахаридным чехлом и, вероятно, может участвовать в процессах прикрепления данных бактерий на корнях растения только в качестве носителя субстанции, обеспечивающей адсорбцию.

2, Изучение О-антигенов азоспирилл

Сравнительный анализ ЛПС различных штаммов азоспирилл

Мы сравнили, насколько различаются между собой иммунохимкческие, элек-трофоретические и спектрофотометрические характеристики ЛПС штаммов азоспирилл, принадлежащих к одному и тому же и к разным серотипам. На рис. 9 приведены спектры поглощения света продуктами фенол-серной реакции препаратов ЛПС (для краткости ниже мы их будем именовать «спектрами поглощения») для четырёх штаммов азоспирилл, попарно демонстрирующих антигенные перекресты в иммунодоте с гомологичными антителами. Сравнение данных спектров позволяет выявить их характерные особенности для штаммов, принадлежащих к одному серотипу. Спектры поглощения первой пары штаммов (5р7 и Сс1) демонстрируют наличие двух пиков поглощения (при длинах волн 410-420 нм и 485 нм). В то же время спектры поглощения препаратов ЛПС двух других штаммов, Бр245 и 5р107, отличаются только одним выраженным пиком поглощения при длине волны 480 нм (рис. 9). Таким образом, принадлежащие к одному виду, но серологически различные штаммы Бр? и 8р245 (а также С<1 и &р107) обнаруживают чёткие отличия спектров поглощения ЛПС. В соответствии с ре-

зультатами работы Дюбуа с соавт. (Dubois et а/., 1956), это свидетельствует о существенном различии их моио-сахаридного состава.

С другой стороны, эти данные наглядно демонстрируют, что иммунохимиче-ская гетерогенность О-специфических полисахаридов в пределах ЛПС одного штамма не связана с радикальными различиями их моносахар идного состава, Это следует из сравнения спектров поглощения ЛПС для штаммов Sp7 и Cd, отличающихся (по результатам электрофоретического и иммунодиффузионного анализа) отсутствием одного из О-ПС в составе ЛПС штамма Cd. Это наблюдение было подтверждено результатами сравнения спектров поглощения данных ЛПС со спектром ЛПС мутанта 7.К.2. и при сравнении спектров ЛПС Sp245 и его мутантов КМ252 и КМ018, в составе ЛПС которых отсутствуют, соответственно, 0-ПС1 и 0-ПС2. Сходный качественный характер спектров поглощения ЛПС исходного штамма, его производных и мутантов, выявленный в каждом из рассматриваемых случаев, свидетельствует о принципиальном сходстве моносахаридного состава О-специфических полисахаридов в составе ЛПС данных штаммов. Отмечаемые при этом количественные изменения спектров могут быть следствием тех структурных различий, которые и определяют иммунохимическую специфичность каждого конкретного О-ПС.

Описанный поход мы применили также для выявления возможных различий моносахаридного состава ЛПС R- и S-вариантов штамма Sp7. Сравнение спек-трофотометрических и иммунохимических характеристик данных препаратов позволило прийти к выводу о том, что антигенные различия R- и S-вариантов не связаны с существенными изменениями моносахаридного состава их ЛПС.

Конкурентный иммуноанализ в оценке строения углеводных эпитопов

Мы получили сведения о строении антигенных детерминант ЛПБК, выделенного Конновой с соавторами (1994) из капсульного материала штамма А. brasilense Sp245. Для этого был применён известный принцип, основанный на использовании эффекта ингибирования процесса образования нерастворимых комплексов Аг+Ат при добавлении к их смеси различных «конкурентных» соединений с известным химическим строением (Кэбот и Мейер, 1968). В качестве моносахаридов - ингибиторов использовали рамнозу, галактозу, ксилозу и галак-

А

Д,нм

Рис. 9. Спектры поглощения света продуктами реакции с фенолом и серной кислотой препаратов ЛПС 5р7, Cd, 5р245 и 8р107.

туро новую кислоту, присутствие которых в составе углеводных полимеров поверхности штамма Sp245 было показано ранее (Коннова с соавт., 1994),

Рис, 10 показывает, что только добавление галактозы (Gal) ингнбировало реакцию ком пле ксообразования и приводило к уменьшению скорости нарастания и стационарной интенсивности светорассеяния (кривая 2). Добавление других моносахаридов (кривые 3-5) влияло на кинетическую кривую очень незначительно.

Отношение скоростей реакции на начальных участках 1.16/1.60 можно рассматривать как количественный показатель ингибирования процесса формирования иммунных комплексов. Средний радиус частиц иммунных комплексов ЛПБК+Ат по данным динамического светорассеяния был равен 220 им, а удельная мутность системы по данным спек-тротурбидиметрии составляла 27. Используя эти данные, было определено, что объёмная доля биополимера в частице преципитата составляет примерно 34%. Введение ингибитора (Gal) уменьшало удельную мутность до 16, снижало значение среднего размера частиц на 20% и уменьшало объёмную долю биополимера до 29%. Уменьшение объёмной доли биополимера в преципитате и среднего радиуса частиц может служить дополнительным свидетельством ингибирования взаимодействия антигена и антител. Данные эксперименты были проведены совместно с аспирантом ИБФРМ РАН Хлебцовым Б.Н. (Khlebtsov B.N., Burygin G.L., Matora L.Yu., Shchyogotev S.Yu., Khlebtsov N.G. // Biochim, Biophys. Acta, 2003, submitted for publication).

В качестве независимого метода для сравнительного анализа ингибирующей активности моносахаридов использовали двойную иммунодиффузию. Установлено, что только добавление к антителам галактозы приводило к ослаблению линий преципитации по сравнению с контролем. Таким образом, и в этом случае эффективным ингибитором реакции между ЛПБК и антителами являлся данный моносахарид, что свидетельствует о его доминирующем положении в составе антигенных детерминант ЛПБК штамма Sp245.

Ранее было показано, что определяющую роль в формировании структуры антигенных детерминант штамма A. brasilense Sp7 играют остатки рамнозы н

) I

Время, с

Рис. Ш, Кинетические кривые 190 иммунных комплексов ЛПБК+Ат при использовании в качестве ингибиторов галактозы (2), рамнозы (3), ксилозы (4) и галактуроновой кислоты (5) в сравнении с контролем (1). Вставка показывает начальные линейные участки кинетических кривых для систем ЛПБК+Ат (1) и ЛПБК+Ат+йа! (2).

галактозы. При этом последний моносахарид демонстрировал наибольшую степень торможения иммунохимических реакций (Матора с соавт., 1998). Таким образом, анализ известных и полученных нами результатов позволяет сделать вывод о том, что иммунохимическая специфичность О-антигенов у данных штаммов азоспирилл определяется не только иммунодоминантным моносахаридом, но обшей конфигурацией антигенных детерминат, определяемой положением соседних моносахаридов полимерной или олигомерной цепи. Это заключение согласуется с общим представлением о структуре антигенных детерминант бактериальных полисахаридов (Jann and Westphal, 1975;Kabat, 1980).

Влияние возраста культуры на экспонированность различных О-ПС в составе ЛПС азоспирилл

Клетки азоспирилл, проанализированные на разных фазах роста, демонстрировали в наших экспериментах различную эскпонированность О-специфических полисахаридов в составе ЛПС. Рис. 11 демонстрирует кривую роста штамма Sp245 в сочетании с результатами иммунодиффузионного анализа материала с поверхности клеток, отобранных на различных стадиях роста культуры. Результаты иммунодиффузии говорят о том, что один из О-ПС данного штамма (О-ПС1) визуализуется постоянно, вне зависимости от стадии роста культуры, в то время как второй О-ПС (0-ПС2) выявляется преимущественно на логарифмической и стационарной фазах роста. При этом на поздней логарифмической и ранней стационарной фазах роста культуры полосы преципитации, соответствующие данному О-ПС, проявляются очень слабо (рис. 11), Картина перераспределения вкладов двух О-ПС штамма Sp7 в формирование бактериальной поверхности в зависимости от возраста культуры выглядит более наглядно, поскольку сопровождается изменением морфологии его колоний. Молодые колонии штамма Sp7 имеют гладкий фенотип, но со временем приобретают шероховатую поверхность и неровный край. Преимущественный синтез одного из О-ПС (R-антигена) на поздних стадиях роста культуры (рис. II) коррелирует с формированием шероховатого фенотипа колоний данного штамма на плотной среде.

Изменение антигенных свойств ЛПС азоспирилл при модификации условий культивирования

В наших экспериментах было обнаружено, что модификация состава лабораторных сред также может приводить к изменению антигенных свойств ЛПС азоспирилл. Таким фактором оказалось добавление 0.1 М ТРИС в среду культивирования бактерий A. brasilense Sp245. На рис. 12 А представлены результаты иммунодиффузионного анализа препаратов ЛПС, выделенных из бактерий, выращенных до логарифмической фазы роста как на среде, содержащей ТРИС, так и без него. В иммунодиффузионном профиле ЛПС штаммов, выращенных на среде, содержащей ТРИС, практически не выявлялась полоса преципитации, соответствующая 0-ПС1. Подобные изменения картины взаимодействия с антителами у данного О-ПС не обнаруживались ни при внесении в среду культивирования 0.1 М HEPES, ни при замене среды культивирования. Кроме того, у ЛПС

Аш

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Время, ч

Время, ч

Рис. И. Результаты иммунодиффузионного анализа материала с поверхности клеток штаммов Зр245 (А) и 5р7 (Б), взятых на разных стадиях роста культуры.

2 3

А

Б

Рис. 12. А. Результаты иммунодиффузионного анализа препаратов ЛПС Эр245 и КМ018 с Ат против ЛПС Эр245 (а). 1 ~ 5р245, 2 - КМ018, 3 -КМ018, выращенного в присутствии 0.1 М ТРИС, 4 - 5р245, выращенного в присутствии 0.1 М ТРИС, 5 - КМ018, выращенного в присутствии 0.1 М НЕРЕЭ, 6 - КМ018, выращенного на среде ЬВ.

Б. Результаты электрофореза в ПААГ препаратов ЛПС Бр245 (1), КМ018 (2) и ЛПС КМ018, выращенного на среде, содержащей 0.1 МТРИС (3).

штамма КМ018, выращенного в присутствии ТРИС, в электрофоретическом профиле в ПААГ отсутствовала серия полос с молекулярной массой около 30 кДа, характерных для дикого штамма и мутанта (рис. 12 Б). В то же время спектры поглощения света продуктами реакции с фенолом и серной кислотой препаратов ЛПС штамма КМ018, выращенного как в присутствии ТРИС, так и без него, практически не различались между собой, что свидетельствует о близости их моносахарцдного состава. Такие же изменения антигенное™ ЛПС мы наблюдали у штамма 8р7. В препарате ЛПС данного штамма, выращенного в присутствии ТРИС, также было отмечено исчезновение одной из двух полос преципитации в иммунодиффузии с гомологичными антителами.

Таким образом, выявленное нами модифицирующее влияние ТРИС свидетельствует о том, что параметры культивирования азоспирилл в лабораторных условиях могут влиять на структуру антигенных детерминат их ЛПС.

Модификация способа получения высокоочищенных препаратов ЛПС Нами предложен способ быстрого выделения высокоочищенных препаратов бактериальных липополисахаридов, апробированный на бактериях р. АгозргШ-

ïum. В основу предлагаемого усовершенствования положены два различных метода выделения ЛПС. Первый из них основан на экстракции ЛПС из бактериальной мембраны с помощью хелатирующего агента ЭДТА (Leive et al., 1968). Второй позволяет получать препараты ЛПС в количествах, пригодных для анализа в ПААГ (Hitchcock and Brown, 1983). Его принцип заключается в том, что высоко-очищенный не содержащий белка препарат ЛПС получается обработкой предварительно лизированных бактерий высокоэффективным протеолитическим ферментом - протеиназой К. В результате такой обработки ЛПС оказывается единственным биополимером, остающимся в растворе (Hitchcock and Brown, 1983).

Предложенный нами способ заключается в протеиназной обработке не лизата бактерий, а солюбилизата их наружных мембран. Это позволяет упростить процедуру выделения чистого ЛПС, минуя стадию разрушения бактериальных клеток в присутствии додецилсульфата натрия, что, в частности, обеспечивает отсутствие примесей этого соединения в получаемом препарате ЛПС.

Бактерии выращивали на соответствующей питательной среде при оптимальной температуре культивирования до логарифмической фазы роста, отделяли их от среды культивирования с помощью центрифугирования и экстрагировали из них комплекс, состоящий из липополисахарида и белка, путем добавления к клеточной массе буферного раствора, содержащего ЭДТА в количестве 0.01 - 0.05 ммоль на 1 г влажных клеток. Экстракт отделяли от интактных бактериальных клеток с помощью центрифугирования и добавляли к нему протеиназу К до конечной концентрации 80мкг/мл. Данную смесь инкубировали в течении 60 мин при температуре 56-60°С. Получаемый ЛПС использовали как в растворе, так и после выделения из раствора с помощью стандартных процедур осаждения.

Препарат ЛПС, полученный с помощью предлагаемого нами способа (рис. 13 А, 3), при электрофоретическом разделении демонстрировал более чёткий трек, чем препарат ЛПС, полученный с помощью протеиназной обработки целых клеток (рис. 13 А, 1). Результаты иммунодиффузии (рис. 13 Б) свидетельствуют о том, что ЛПС, экстрагированный из наружной мембраны бактерий, ЛПС, выделенный из бактериального лизата, а также ЛПС, полученный с помощью усо-

* £

I ¡V

Рис. 13 А. Результаты электрофореза в ПААГ препаратов ЛПС Бр245, полученных протеиназной обработкой бактериального лизата (1), экстракцией из целых клеток с помощью ЭДТА (2) и протеиназной обработкой экстракта, выделенного с помощью ЭДТА (3).

Б. Результаты нммунодиффузионного анализа данных препаратов с Ат на ЛПС 5р245.

вершенствованного метода, идентичны с иммунохимической точки зрения.

Таким образом, в результате протеиназной обработки солюбилизата наружной мембраны, полученного с помощью ЭДТА, мы получали препарат ЛПС, применимый для анализа в ПААГ и продемонстрировавший при электрофорезе более чёткое разделение. При этом данный препарат аитигенно идентичен ЛПС, выделенному из бактериального лизата, но выгодно отличается простотой получения. Выделенный описанным способом препарат, благодаря отсутствию труд-ноудалимых примесей ДСН, может быть использован не только в электрофоре-тических экспериментах, но и в широком наборе микробиологических, биохимических и иммунологических исследований.

Выводы

1. Выявлены и охарактеризованы структуры, определяющие антигенные перекресты между соматическим антигеном и полярным жгутиком бактерий р. АюьрЬШит.

2. "Установлено наличие чехла (липо)полисахаридной природы, ассоциированного с поверхностью полярного жгутика и экранирующего флагеллин у типовых штаммов А. ЫшИете.

3. Показано, что углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина полярного жгутика штамма А. ЬгазИете Бр7 аитигенно идентичны одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена.

4. Продемонстрировано наличие антигенных перекрёстов у Н-антигена бактерий для представителей видов А. ЬгазНете и А. Иро/егит,

5. Для серологически различных штаммов азоспирилл установлены характерные отличия спектров поглощения света препаратами ЛПС и отмечены изменения спектров, наблюдаемые внутри одного серотипа, коррелирующие с иммунохимическими и биохимическими различиями штаммов.

6. Показана роль галактозы как иммунодоминантного моносахарида в составе антигенных детерминат липополисахарид-белкового комплекса, выделенного из капсульного материала штамма Л. ЬгазНете Эр245.

7. Установлено, что структура антигенных детерминант О-специфических полисахаридов ЛПС может изменяться под влиянием условий культивирования бактерий на лабораторных средах. При этом экспонированность самих О-ПС в составе соматического антигена варьирует в зависимости от фазы роста бактериальной культуры.

8. Показано, что усовершенствованный способ выделения высокоочшценных ЛПС из солюбилизата наружных мембран бактерий обеспечивает получение препаратов, демонстрирующих эффективное разделение при электорофорезе в ПААГ и обладающих полным спектром антигенных детерминант.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Burygin G„ Matora L., Shchyogolev S. Structural alteration of Jipopoiysaccha-rides from the nitrogen-fixing bacteria Azospiriiium brasilense as a result of a modification of culture growth conditions И Abstr. IVth Eur. N2-fixation Conf. -Sevilla, Spain, 2000. - P.135.

2. Бурыгин ГЛ., Матора Л.Ю., Щёголев С.Ю. Изменение антигенных свойств липополисахаридов Azospiriiium brasilense при внесении в среду культивирования трис(гидроксиметил)аминометана // Прикл. биохим. и микроб иол. -2002. - Т.38, №3.- С. 292-294.

3. Бурыгин Г,Л„ Матора Л.Ю., Щёголев С.Ю. Изучение липополисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий рода Azospiriiium Н Сб. тез, Конф. «Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков». — Уфа: Башкирский университет, 2001 - - Т. 2. - С. 23-25.

4. Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щёголев С.Ю. Исследование гомологичных структур в составе липополисахарида и полярного жгутика бактерий рода Azospiriiium Н Сб. тез. Первой региональной конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой». - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2002. - С. 14,

5. Бурыгин Г.Л., Серебренникова О.Б., Матора Л.Ю„ Щёголев С.Ю, Быстрый метод скринирования мутантов по структуре липополисахарида ассоциативных бактерий рода Azospiriiium // Сб. тез. VI Путинской школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века». - Тула: Изд-во Тул. гос. пел. ун-та им. Л.Н. Толстого, 2002. - Т. З.-С. 10.

6. Burygin GX. Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu, Investigation of homologous structures that are part of the lipopolysaccharide and the polar flagetlum of Azospiriiium brasilense // Abstr. Xth Intern. Congr. on Bacteriology and Applied Microbiology "The World of Microbes". - Paris, France, 2002. - P. 261.

7. Матора Л.Ю., Серебренникова O.E., Петрова Л.П., Бурыгин ГЛ., Щёголев С.Ю. Нетипичный характер R-S диссоциации Azospiriiium brasilense 1! Микробиология. - 2003. - Т. 72, № 1.-С. 60-63.

8. Практические занятия по физико-химическим и биохимическим методам исследования биополимеров: Учебное издание / И.Н. Клочкова, С.А. Кон-нова, Л.Ю. Матора, Г.Л. Бурыгин, С.Ю. Щёголев / Под ред. С.Ю. Щёголева. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003. - 87 с.

9. Katzy E.I., Petrova L.P., Shelud'ko A.V., Borisov I.B., Kamneva A.B., Matveeva

E.V., Matora L.Yu., Burygin G.L. Properties of the plant-growth-promoting rhizobacterium Azospiriiium brasilense relevant to colonization of artificial media and wheat roots and to bioremediatiori 11 Abstr. Int. Symp. "Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants With Technogenic Environmental Pollutants", - Saratov: Saratov University Publishing House, 2003. - P. 15.

10. Matora L.Yu., Burygin G.L., Shchyogolev S.Yu, Immunochemical analysis of Azospiriiium lipopolysaccharides // Abstr. Xl-th Intern. Congr. on Molecular

Plant-Microbial Interactions "New bridges between Past and Future". - St-Petersburg, Russia, 2003. - P. 309.

Подписано в печать 08.10.2003. Формат 60x84/16. Гарнитура Times. Бумага типовая. Объём 1 печл. Тираж 100 экз. Заказ №5

Отпечатано с готового оригинал-макета в ИБФРМ РАН 410049, Саратов, пр. Энтузиастов, 13