Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение надмолекулярной организации и нанотехнологическое применение жгутиков Halobacterium salinarum при помощи методов модификации генов флагеллинов

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение надмолекулярной организации и нанотехнологическое применение жгутиков Halobacterium salinarum при помощи методов модификации генов флагеллинов"

На правах рукописи

БЕЗНОСОВ Сергей Николаевич

изучение надмолекулярной организации и нанотехнологическое применение жгутиков HAL ОБА CTERIUM SALIN ARUM при помощи методов модификации генов флагеллинов

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 т щ

Пущино - 2014

005547852

005547852

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте белка РАН, в группе надмолекулярных белковых структур.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Федоров Олег Васильевич Официальные оппоненты:

Патрушев Лев Иванович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии.

Масулис Ирина Станиславовна, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории функциональной геномики и клеточного стресса.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, лаборатория молекулярной организации биологических структур.

Защита состоится « 19 » июня 2014 г. в 15-30 часов на заседании диссертационного совета Д.002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московская область, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН.

Автореферат разослан « » апреля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Накопленные к сегодняшнему времени данные указывают на то, что жгутик архей является уникальным аппаратом подвижности, существенно отличным от бактериального. Жгутики архей, как правило, являются мультисубъединичными, то есть состоят из нескольких типов флагеллинов. Также у архей сборка жгутика осуществляется по механизму, принципиально отличающемуся от бактериального, а флагеллины архей имеют сигнальные последовательности и чаще бактериальных подвергаются посттрансляционным модификациям. Нет архейных гомологов и у других белков, участвующих в сборке бактериального жгутика. Однако полного представления о процессе сборки жгутика архей и механизме образования его спиральной структуры на сегодняшний момент нет. Работы по нокауту генов флагеллинов ограниченного числа видов архей позволили прийти к заключению, что именно мультикомпонентный состав жгутика обеспечивает его спиральную форму. Так, у галофильного археона На1оЬас!егшт яаИпагит филамент жгутика состоит из пяти флагеллинов, обозначаемых как А1, А2, В1, В2 и ВЗ, и путем инактивации генов А-флагеллинов (Тагавоу е> а1., 2000) было показано, что для формирования спирального филамента необходимо наличие обоих А-флагеллинов. Вопрос о роли В-флагеллинов остался открытым.

Изучение надмолекулярной организации жгутиков архей методами делеции и инактивации генов флагеллинов как правило приводит к существенным изменениям в структуре жгутиков, поэтому полезным инструментом для подобных исследований может являться направленная модификация флагеллинов заданными вставками из аминокислотных последовательностей. Такие последовательности, экспонированные на поверхности жгутика, позволяли бы идентифицировать и определять расположение отдельных флагеллинов в жгутике с полным набором белков. Однако к настоящему времени нет данных о пространственной структуре флагеллинов, позволяющих выбрать места для вставки подобных последовательностей. Вместе с тем в последние несколько лет стремительно увеличивается количество публикаций по использованию в нанотехнологических целях надмолекулярных белковых структур, таких как жгутики, пили и вирусы бактерий. Жгутики архей могут иметь определенные преимущества, как перед бактериальными аналогами, так и перед вирусными частицами для использования в данных целях. Это обусловлено, с одной стороны экстремальным характером условий обитания большинства архей, с другой стороны мультикомпонентностью их жгутиков, дающей возможность получения полифункциональных материалов. Возможность модификации жгутиков архей аминокислотными последовательностями с заданными связывающими свойствами открыла бы путь к созданию нового класса нанобиоматериалов.

Цель и задачи исследования. Представленная работа посвящена изучению надмолекулярной организации жгутиков Н. 5аИпагит, а также использованию

полученных знаний для создания на основе жгутиков нового класса наноматериалов. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) изучить распределение флагеллинов и их роль в надмолекулярной организации жгутика Н. salinarum путем делении генов флагеллинов и последующим наблюдением за морфологией жгутиков у делеционных мутантов; 2) провести направленную модификацию флагеллинов Н. salinarum аминокислотными вставками так, чтобы они не нарушили формирования и функции жгутика и были доступны для детекции; 3) с помощью метода модификации флагеллинов Н. salinarum изучить их распределение в составе жгутика; 4) с помощью метода модификации флагеллинов Н. salinarum получить жгутики с заданными связывающими свойствами и синтезировать наноматериалы на основе таких жгутиков.

Научная новизна и практическая ценность исследования. Полученные путем делеции флагеллиновых генов данные позволили уточнить роль А-флагеллиновых генов, а также показать возможную роль В-флагеллиновых генов. Показано, что двух А-флагеллинов (Al, А2) достаточно для формирования спирального филамента жгутика, при наличии же только одного функционального гена А1- или А2-флагеллина клетки синтезируют протяженные прямые жгутики. Также показано, что при делеции А-флагеллиновых генов из продуктов В-генов строятся короткие изогнутые филаменты, основная роль в формировании которых принадлежит В2-флагеллину.

Впервые успешно осуществлена направленная модификация флагеллинов архей, позволившая при отсутствии данных о пространственной структуре флагеллинов вывести на поверхность функциональных жгутиков заданные последовательности из аминокислотных остатков. Разработанный метод открывает возможности по прямому исследованию состава жгутиков различных архей. Путем модификации А1-, А2- и В2-флагеллинов Н. salinarum дополнительной антигенной детерминантой показано, что в составе жгутика данные флагеллины распределены по всей длине филамента. Сопоставление данных по делеции и модификации генов флагеллинов говорит о том, что В2-флагеллин стабилизирует спиральную структуру филамента, формируемую А-флагеллинами. Кроме того, метод модификации флагеллинов позволяет получать на основе жгутиков архей новые наноматериалы. В данной работе на основе модифицированных жгутиков Н. salinarum был получен материал для анода литий-ионного аккумулятора, показывающий улучшенные характеристики.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: International symposium «Biological motility» (Пущино, 2004); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005); 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2006); Nanotechnology international forum «Rusnanotech» (Москва, 2009, 2010, 2011); Пущинской научно-практической конференции «Системная биология» (Пущино, 2009); XIX Менделеевском съезде по общей и

прикладной химии (Волгоград, 2011); VII российской конференции "Физические проблемы водородной энергетики" (Санкт-Петербург, 2011); Международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе пять статей в реферируемых журналах из списка ВАК. Кроме того, материалы диссертации легли в основу для двух заявок на изобретения РФ, по которым получены патенты.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы (122 наименования). Диссертация содержит 25 рисунков и 2 таблицы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение и анализ штаммов Н. salinarum с делегированными флагеллиновыми генамн. Для получения штаммов Н. salinarum с делетированными флагеллиновыми генами использовался метод делении внутри рамки считывания (deletion in frame). Данный метод проводился с использованием нерепликативных для Н. salinarum плазмид, несущих в своем составе слитые нуклеотидные последовательности, находящиеся в хромосоме с обеих сторон от участка, который необходимо удалить. При трансформации клеток такие плазмиды встраиваются в хромосому по механизму гомологичной рекомбинации, затем при росте клеток без селективного давления возможен повторный акт рекомбинации, сопровождающийся исключением плазмиды. В том случае, когда исключение плазмиды происходит по участку противоположному тому, по которому имело место встраивание, возникает делеция. В работе на основе плазмиды pNX (Tarasov et al., 2000) был получен набор подобных плазмид для делеции различных флагеллиновых генов Н. salinarum (таблица 1). Все плазмиды содержат гены устойчивости к ампициллину и новобиоцину (антибиотик архей), кроме того в них имеется ген галофильной ß-галактозидазы. Также в плазмидах присутствует бактериальный ori ColEl, и отсутствует архейный репликон. Данные плазмиды можно нарабатывать в препаративных количествах в штаммах E.coli, тогда как при трансформации клеток архей и последующей селекции в среде с новобиоцином, сохранение плазмид в клетках возможно только в результате их встраивания в хромосомальную ДНК.

Таблица 1. Плазмиды, использованные для получения штаммов Н. яаПпагит с делениями генов флагеллинов.

Название плазмиды Назначение Описание

рЫХДА Деления А-оперона Получена клонированием в плазмиду рИХ фланкирующих участков А-оперона

рМХДВ Деления В-оперона Получена клонированием в плазмиду рМХ фланкирующих участков В-оперона

рИХА2ДА1 Деления А1-гена Получена клонированием в плазмиду рЫХ гена А2, окруженного фланкирующими участками А-оперона

рКХА1ДА2 Деления А2-гена Получена клонированием в плазмиду р№{ гена А1, окруженного фланкирующими участками А-оперона

рЫХВ1 Деления В2-и ВЗ-генов Получена клонированием в плазмиду рЫХ гена В1, окруженного фланкирующими участками В-оперона

рИХВЗ Деления В1 и В2-генов Получена клонированием в плазмиду рЖ гена ВЗ, окруженного фланкирующими участками В-оперона

рКХВ1В2 Делеция ВЗ-гена Получена клонированием в плазмиду рЫХ генов В1 и В2, окруженных фланкирующими участками В-оперона

рМХВШЗ Делеция В2-гена Получена клонированием в плазмиду рЫХ генов В1 и ВЗ, окруженных фланкирующими участками В-оперона

Созданные плазмиды использовались для получения штаммов Н. .чаИпагит с делециями генов флагеллинов. Поиск делеционных мутантов осуществлялся с использованием гибридизации по Саузерну и методом ПЦР. В обоих случаях оценивалось уменьшение размера соответствующего участка хромосомы Н. яаИпагит на величину делении. Полученные делеционные мутанты (AflgA, AflgAAflgB,

&АёА1АА§В, ЛМА2АП8В, А^ААМВ2АМВЗ, АМААМВ1А^В2, АМЛАМВЗ, А/^ЛААяВ?) Н. .чаПпагит, по скорости роста не отличаются от штамма дикого типа (Я1М1), но характеризуются отсутствием подвижности. Штаммы были проанализированы на наличие и форму жгутиковых образований у клеток с помощью электронной микроскопии (рис. 1). Данные по всем делеционным штаммам Н. ъаИпагит были сведены в таблицу 2.

Рис. 1. Электронно-микроскопические фотографии клеток мутантных штаммов и дикого типа (ШМ1) Н. яаНпагит, негативно окрашеных 2% уранил ацетатом. Масштабная линейка - 200 нм.

Таблица 2. Результаты делеции различных генов флагеллинов Н. хаИпагит.

Делетированные flg- гены, кодирующие белки жгутика Присутствующие У?£-гены, кодирующие белки жгутика Морфология филаментов жгутика Присутствие белков, определяемое методом иммуноблотгинга

- А1А2В1В2ВЗ Нормальной формы: длинные, изогнутые Все

В1В2ВЗ А1А2 Длинные, изогнутые А1А2

А2В1В2ВЗ А1 Длинные, прямые А1

А1В1В2ВЗ А2 Длинные, прямые А2

А1А2 В1В2ВЗ Короткие, изогнутые В2

А1А2ВЗ В1В2 Короткие, изогнутые В2

А1А2В2 В1ВЗ - -

А1А2В1В2 ВЗ - -

А1А2В2ВЗ В1 - -

А1А2В1В2ВЗ - - -

Из анализа следует, что в отличие от клеток дикого типа К1М1 (клетки имеют пучки многочисленных спиральных жгутиков толщиной 10 нм) клетки бесфлагеллинового AflgЛAflgB штамма не имеют жгутиков. Однако на поверхности is.JlgAis.flgB штамма изредка обнаруживаются короткие прямые филаментоподобные образования, возможно являющиеся пилями. Подобный тип строения филаментов обнаружен и у клеток tsflgAIS.flzli2tS.flgM-, /\flgA AflgB 1 А/1%В2- и мутантных штаммов. В отличие от них штамм /\figAt\flgB3, в хромосоме которого имеются только В1- и В2-флагеллиновые гены, обладает в большей степени протяженными и изогнутыми филаметноподобными структурами на своей поверхности, подобными тем, которые синтезирует штамм с делецией генов А-флагеллинов. При этом ранее было показано, что из В-флагеллинов в состав жгутиковых филаментов штамма с инактивацией синтеза А-флагеллинов преимущественно входит В2-флагеллин (Тагаяоу е/ а1., 2000). Это наводит на мысль, что все или некоторые из В-флагеллинов должны участвовать в сборке так называемого "крюка" - переходной части двигательного аппарата подвижности архей между мембранным мотором и внешним спиральным филаментом, при этом основная

роль в формировании подобных изогнутых структур в отсутствии А-флагеллинов принадлежит В2-флагеллину.

Клетки штамма с делецией генов В-флагеллинов имеют протяженные спиральные филаменты, морфологически сходные со жгутиками дикого типа. Если дополнительно удалять по одному из А-флагеллиновых генов, то из продукта только одного А-гена строится протяженный прямой филамент (штаммы 1А/1%В и А/^А2А/1^В). Это подтверждает ранее полученные данные (Тагаэоу е/ а1., 2000), что для формирования протяженного изогнутого филамента жгутика достаточно двух А-флагеллинов, но в отсутствие В-флагеллинов филамент становится тоньше и утрачивает свою структурную стабильность. Поскольку любые делеции генов флагеллинов всегда приводят к утрате у клеток подвижности, а структура филаментов всегда существенно изменяется по сравнению с филаментами жгутиков дикого типа, то из полученных путем делеции флагеллиновых генов данных нельзя составить окончательное представление о роли различных флагеллинов в формировании надмолекулярной структуры жгутика Н. заГтагит. Поэтому мы решили провести дополнительные эксперименты, позволяющие идентифицировать и определять расположение отдельных флагеллинов в жгутике с полным набором белков. С этой целью нами был разработан метод направленной модификации флагеллинов Н. ¡аПпагит.

Метод направленной модификации флагеллинов II. ъаИпагит и анализ модифицированных жгутиков. Метод модификации предполагает выведение заданных аминокислотных последовательностей (например, антигенных детерминант) на поверхность жгутика без утраты его функциональности с возможностью последующей локализации меток на поверхности жгутика. Для этого клетки Н. 5аПпагит трансформируются плазмидами, содержащими модифицированные олигонуклеотидными вставками гены флагеллинов. Для модификации были выбраны А1-, А2- и В2-флагеллины, как основные белки филамента жгутика Н. ¡аПпагит. В первую очередь на основе плазмиды рМХ были получены плазмиды, в составе которых клонирован либо А-, либо В-флагеллиновый оперон с фланкирующими участками. Далее необходимо было выбрать место введения олигонуклеотидных последовательностей, кодирующих модифицирующую жгутики аминокислотную последовательность. Известно, что в составе жгутиков флагеллины Н. ааИпагит 14-гликозилированы, и каждый из них содержит по 3 сайта (последовательность ЫХТ(Б)) для такой модификации. Известно также, что гликозилирование происходит на внешней поверхности клетки и, скорее всего, в момент, когда сборка надмолекулярной структуры жгутика уже произошла (Битрег, 1987; СЬаЬап е1 ей., 2006). Следовательно, введение пептидных вставок вблизи участков полипептидной цепи флагеллина, имеющих в своем составе сайты для гликозилирования, также должно приводить к их экспонированию на поверхность жгутика. В генах А1-, А2- и В2-флагеллинов были подобраны или искусственно созданы сайты для эндонуклеаз рестрикции так, что

вводимая олигонуклеотидная последовательность оказывалась между участками, кодирующими первые два сайта для гликозилирования. На примере модификации А1-флагеллина метод введения олигонуклеотидных последовательностей, кодирующих выбранный пептид, можно схематически изобразить следующим образом: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и также содержит липкий З'-конец для клонирования по сайту рестрикции BstXl: 5'-NN(NNN)xGCCG-3'. Второй олигонуклеотид комплементарен первому для формирования дуплекса и кроме того содержит липкий конец для клонирования по сайту BstXl: 5'-(NNN)x NNCGGC-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в А1-ген приведена на рис. 2. Подобным образом в А1-, А2- и В2- флагеллины был введен FLAG-пептид — последовательность аминокислотных остатков DYKDDDDK, к которой коммерчески производятся специфичные антитела. Данная последовательность была выбрана для модификации ею флагеллинов Н. salinarum, поскольку это даст возможность обнаружить данную последовательность с помощью антител на поверхности жгутиков, и тем самым проверить работоспособность метода модификации. Кроме того, была получена плазмида с А-флагеллиновым опероном, где в область А2-гена осуществлена вставка синтетической олигонуклеотидной последовательности, кодирующей золото-связывающий пептид LKAHLPPSRLPS. Данный пептид был установлен Белчер с сотр. методом фагового дисплея (Nam et al., 2006).

После обработки BstXl

Флагеллин aidyanltvrqa » agadninlsk ... GAT ТАС GCG AAC CTG ACG GTG CGC CAG GCC G - 3' 5' - CI GGG GCT GAC AAC АТС AAC CTC AGC AAG ... / \

Общий вид встраиваемой последовательности NN(NNN)XGCCG - 3' 3' - CGGCNN(NNN), \ / \

FLAG-последовательность 3' - CGG / \ DYKDDDDKA AC TAC AAG GAC GAT GAC GAT AAG GCC G - 3' CTG ATG TTC CTG СТА CTG СТА TTC

Рис. 2. Схематическое изображение способа введения олигонуклеотидной вставки в А1-ген, кодирующей выбранную модификацию.

Полученные плазмиды использовали для трансформации клеток Н. хаМпагит. Следует отметить, что в выросших на среде с антибиотиком клетках помимо встроенного с плазмидой модифицированного А- или В-флагеллинового оперона также содержатся нативные А- и В-опероны. Следовательно, в составе жгутиков помимо модифицированных флагеллинов могут содержаться и их немодифицированные формы. Всего было получено 4 типа мутантных штаммов-производителей модифицированных жгутиков: 1) с модификацией А1-флагеллина РЬАО-пептидом, 2) с модификацией А2-флагеллина РЬАО-пептидом, 3) с модификацией В2-флагеллина РЬАО-пептидом, 4) с модификацией А2-флагеллина золото-связывающим пептидом.

После того, как штаммы, несущие модифицированные гены флагеллинов А1, А2 и В2 были выращены на культуральной среде, их жгутики были выделены и очищены. В первую очередь, препараты модифицированных РЬАО-пептидом жгутиков, а таюке препарат жгутиков дикого типа (как контроль) анализировались с помощью иммуноблоттинга с использованием коммерческих моноклональных антител к РЬАО-пептиду (рис. 3).

% 4 «и* В2

тт А1

A2.B1.B3

12 3 4 5

Рис. 3. Иммуноблоггинг препаратов жгутиков Н. яаНпагит дикого типа (1), с модифицированным РЬАО-пептидом флагеллином А1 (2), с модифицированным РЬАО-пептидом флагеллином А2 (3), с модифицированным РЬАО-пептидом флагеллином В2 (4). Электрофореграмма препарата жгутиков Н. хсйтагит в денатурирющих условиях (5). Использованы антитела против РЬАО-пептида.

В каждом препарате модифицированных жгутиков наблюдается специфичное связывание антител флагеллином. При этом сохраняется электрофоретическая подвижность модифицированных флагеллинов А1, А2 и В2 относительно друг друга, аналогичная немодифицированным флагеллинам Н. ваНпагит (рис. 3, трек 5).

Следовательно, модификация РЬАО-пептидом по выбранным местам не приводит к нарушению в механизме пост-трансляционных модификаций флагеллинов, поскольку известно, что электрофоретическая подвижность флагеллинов Н. ьаИпагит существенно понижена за счет гликозилирования (Ра§цу е? а/., 1996).

Далее, препараты модифицированных жгутиков анализировались с помощью иммуно-электронной микроскопии (рис. 4) в сравнении с контрольным препаратом жгутиков дикого типа.

А г* > г ч

15"Г-- Л ?*•■", * ч '' -V / . 3 ц " '' ' 1 г ^ » —

Рис. 4. Иммуно-электронная микроскопия препаратов жгутиков Н. .чаИпагит дикого типа (А), РЬАОА1 (Б), РЬАОА2 (В), РЬАОВ2 (Г). Препараты были мечены специфичными антителами и конъюгатами белка А с частицами коллоидного золота (10 нм). Негативное контрастирование уранил ацетатом. Масштабная линейка 200 нм.

Жгутики дикого типа не связывают антитела, тогда как все модифицированные жгутики проявляют специфичное связывание. Связывание антител происходит по всей длине филаментов, которые сохраняют спиральную форму. Представленный метод модификации флагеллинов подтверждает правильность выбора места модификации в молекуле флагеллина (между первыми двумя сайтами Ы-гликозилирования), так как во всех случаях для флагеллинов А1, А2 и В2 при выводе на поверхность филамента РЬАО-пептида не происходит нарушения спиральной структуры жгутиков. Представленный в данной работе метод модификации флагеллинов Н. йаНпагит позволяет напрямую локализовать белки в составе жгутика

иммуно-электронной микроскопией. Мы считаем, что данный подход в дальнейшем может быть использован для локализации минорных флагеллинов Я. salinaram - В1 и ВЗ, а также изучении состава жгутиков других Архей.

Распределение флагеллина В2 по всей длине филамента жгутика Я. salinarum оказалось несколько неожиданным, так как ранее было показано, что в отсутствие А-флагеллинов В2-флагеллин формирует структуры подобные крюкам жгутиков и в составе нативных жгутиков возможно выполняет роль белка крюка. Флагеллин В2, доля которого в жгутиках сопоставима с долями А1 - и А2-флагеллинов (рис 3, трек 5), участвуя, по-видимому, в формировании предполагаемой области крюка, при этом также присутствует вдоль всей длины филамента жгутика. Наличие трех типов флагеллинов (Al, А2 и В2) в соразмерных количествах в филаменте жгутика Я. salinarum, на наш взгляд согласуется с данными 3-х мерной реконструкции жгутика, полученной путем обработки крио-электронных изображений (Cohen-Krausz and Trachtenberg, 2002). Сходные данные были получены и для жгутиков Sulfolobus shibatae (Cohen-Krausz and Trachtenberg, 2008). В обоих случах, на изображении среза жгутика наблюдается 3-х лучевая симметрия, и, следовательно, жгутик как Я. salinarum, так и S. shibatae сформирован тремя протяженными полимерными нитями. Возможно, в случае Я. salinarum, каждая нить может быть сформирована только А1-, только А2- и только В2-флагеллином. Поскольку, как показано, в отсутствие В-флагеллинов, филамент жгутика становится тоньше и утрачивает стабильную форму, то наличие В2-флагеллина необходимо для стабилизации изогнутой формы филамента, построенного из А1- и А2-флагеллинов.

Жгутики со вставкой в А2-флагеллин золото-связывающего пептида после инкубации с наночастицами коллоидного золота (5 нм) были анализированы электронной микроскопией (рис. 5).

Л • <

ь

о-

А

Рис. 5. Электронно-микроскопическое изображение жгутиков Я. salinarum дикого типа (А), модифицированных золото-связывающим пептидом (Б). Масштабная линейка — 300 нм. Негативное контрастирование уранил ацетатом.

Связывание частиц происходит также по всей длине филаментов, сохраняющих нативную форму. Следовательно, для локализации флагеллинов в составе жгутика архей можно вводить в флагеллины не только пептиды, которые связываются специфичными антителами, но и другие аминокислотные последовательности, способные связать некое вещество или молекулу. То есть данный метод модификации в зависимости от вставки может являться универсальным методом получения жгутиков с заданными связывающими свойствами, а значит являться методом получения наноматериалов.

Использование модифицированных жгутиков архей для создания новых наноматериалов. Известно, что выведенные на поверхность белков тетраглутаминовые или тетрааспарагиновые последовательности способны эффективно связывать ионы металлов (например, Со2+, Cu2+) (Nam et al., 2006). Так как в составе FLAG-пептида также имеется 4 последовательных отрицательно заряженных аминокислотных остатка - аспартата, модифицированные данным пептидом жгутики были проверены на связывание металлических ионов. Петля, образованная восемью остатками, оказалась достаточной для выведения кластера заряженных аминокислот на поверхность жгутика и способной связывать ионы металлов. Затем ионы в присутствии боргидрида натрия переводились в нерастворимые частицы оксидов, прикрепленные к жгутику (рис. 6). Также минерализации были подвергнуты модифицированные жгутики, предварительно фрагментированные ультразвуком. Фрагменты жгутиков за счет меньшей длины, чем у нативных жгутиков, иначе ведут себя при минерализации. Из-за меньших диффузионных препятствий и меньшей протяженности фрагментам жгутиков при минерализации с частицами оксида удается формировать более плотный материал (рис 6, Г). Анализ полученных изображений фрагментированных жгутиков показывает, что из-за неоднородного состава фрагментов (модифицированные и немодифицированные участки на фрагментах жгутиков) они ориентируются относительно друг друга таким образом, что при минерализации модифицированные части фрагментов связываются частицами оксида кобальта, а немодифицированные части фрагментов выступают с внешней стороны кластеров из сцепленных фрагментов жгутиков и частиц оксида кобальта.

Рис. 6. Электронно-микроскопическое изображение жгутиков Н. ¡аНпагит: (А) дикий тип, (Б-Г) модифицированные жгутики со вставкой в А1-флагеллин РЬАО-пептида. Жгутики были минерализованы оксидом кобальта (А, Б, Г) и оксидом меди (В). При приготовлении образца Г жгутики предварительно фрагментировались ультразвуком. Негативное контрастирование уранил ацетатом. Масштабная линейка -300 нм.

I

Оксид кобальта в настоящее время считается одним из перспективных материалов для анодов литий-ионных аккумуляторов. Несмотря на высокую теоретическую емкость оксида кобальта (900 мАч/г в сравнении с емкостью промышленно используемого углерода в 372 мАч/г), он не отличается высокой стабильностью. Улучшить параметры анода на основе оксида кобальта возможно путем его наноструктуризации. Материал, полученный путем минерализации РЬАОА1 -жгутиков оксидом кобальта был протестирован в качестве анода литий-ионного аккумулятора. Полученные характеристики оказались выше по сравнению с чистым оксидом кобальта и материалом на основе жгутиков дикого типа (рис. 7). Предварительная фрагментация жгутиков приводит к положительному в изменению электро-химических свойств наноматериала. Электрохимическая емкость стабилизируется на уровне в примерно 500 мАч/г, что в 2 раза выше по сравнению с серийно используемым в качестве анода углеродом и сопоставимо с характеристиками анода, изготовленного на основе модифицированного вируса М13

(Nam ei ai, 2006). Таким образом, впервые с помощью метода направленной модификации флагеллинов архей на основе жгутиков был получен наноструктурированный материал с полезными свойствами для индустрии аккумуляторов.

Рис. 7. Изменение разрядной емкости электродов на основе оксида кобальта (1), жгутиков дикого типа (2) наноструктурированного материала РЬАОА1-жгутики/оксид кобальта (3) и наноструктурированного материала РЬАОА1-жгутики/оксид кобальта с предварительным фрагментированием жгутиков (4).

выводы

1. Показано, что для придания спиральной формы филаменту жгутика Н. salinarum достаточно двух флагеллинов - А1 и А2, однако в отсутствие В-флагеллинов филамент становится тоньше и утрачивает стабильность формы.

2. Основная роль в формировании коротких изогнутых структур, синтезирующихся после делеции А-флагеллиновых генов, принадлежит В2-флагеллину.

3. Разработан метод выведения на поверхность жгутика Н. salinarum петель из последовательностей аминокислотных остатков. Метод может быть использован для идентификации и определения расположения белков в составе многокомпонентного жгутика.

4. Путем модификации по отдельности А1-, А2- и В2-флагеллинов пептидом, детектируемым антителами, показано, что в составе спирального филамента все три флагеллина распределены по всей его длине.

5. Показано, что модифицированные таким методом жгутики Н. salinarum могут быть использованы в качестве матриц для получения новых наноматериалов.

6. На основе модифицированных жгутиков Н. salinarum созданы опытные образцы электродов для литий-ионных аккумуляторов, которые продемонстрировали улучшенные характеристики по сравнению с промышленными аналогами.

Список публикаций по теме диссертации:

1. В.Ю. Тарасов, М.Г. Пятибратов, С.Н. Безносов, О.В. Федоров, О надмолекулярной организации филаменты жгутиков архей. Доклады академии наук, 2004, том 396, № 6, стр. 835-837;

2. С.Н. Безносов. М.Г. Пятибратов, О.В. Федоров, О мультикомпонентности жгутиков Halobacterium salinarum. Микробиология, 2007, том 76, № 4, стр. 494-501;

3. С.Н. Безносов. М.Г. Пятибратов, О.В. Федоров, Жгутики архей как матрицы для создания новых наноматериалов. Российские нанотехнологии, 2009, Том 4, № 5-6, стр. 373-378;

4. С.Н. Безносов. М.Г. Пятибратов, О.В. Федоров, Т.Д. Кулова, A.M. Скундин., Электрохимические характеристики наноструктурированного материала на основе модифицированных жгутиков галофильной архей Halobacterium salinarum для отрицательного электрода литий-ионного аккумулятора. Российские нанотехнологии,

2011, Том 6, № 11-12, стр. 43-48;

5. S.N. Beznosov. M.G. Pyatibratov, P.S. Veluri, S. Mitra, O.V. Fedorov, A way to identify archaellins in Halobacterium salinarum archaella by FLAG-tagging. Central European Journal of Biology, 2013, Volume 8, Issue 9, pp. 828-834.

6. O.B. Федоров, С.H. Безносов. М.Г. Пятибратов, Способ получения наноструктурированного материала на основе рекомбинантных жгутиков архей. Заявка на изобретение РФ № 2009114562. Выдано положительное решение от 10.02.2014 г.

7. О.В. Федоров, С.Н. Безносов, М.Г. Пятибратов, Способ получения наноматериала на основе рекомбинантных жгутиков археи Halobacterium salinarum. Заявка на изобретение РФ № 2010115343. Выдано положительное решение от 04.03.2014 г.

8. S.N. Beznosov. M.G Pyatibratov, V.Y. Tarasov, Differences in mechanisms of flagella spiralization in Bacteria and Archaea. Theses of International symposium «Biological motility». Pushchino, May 23 - June 1, 2004, p. 8.

9. М.Г. Пятибратов, С.Н. Безносов. А.Г. Алатырев, O.B. Федоров, Об общем и различном в системах таксиса Бактерий и Архей. Тезисы докладов Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 6-9 июня, 2005 г., стр. 378-380.

10. С.Н. Безносов. А.Г. Алатырев, М.Г. Пятибратов, О.В. Федоров, Изучение надмолекулярной организации аппарата подвижности Halobacterium salinarum. Тезисы докладов 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 17-21 апреля, 2006 г., стр. 4.

11. S.N. Beznosov, M.G. Pyatibratov, O.V. Fedorov, Halophilic archaeal flagella usage for design of new nanomaterials. Theses of Nanotechnology international forum «Rusnanotech». Moscow, October 6-8, 2009, pp. 672-673.

12. С.Н. Безносов. От изучения надмолекулярной структуры жгутиков галофильных архей к созданию новых наноматериалов. Тезисы докладов Пущинской научно-практической конференции «Системная биология». Пущино, 2009 г., стр. 22.

13. С.Н. Безносов. T.JI. Кулова, Материал на основе модифицированных жгутиков галофильного микроорганизма Halobacterium salinarum для анода литий-ионного аккумулятора. Тезисы докладов XIX Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, Волгоград, 25-30 сентября, 2011 г., Том. 4, стр. 54.

14. С.Н. Безносов. М.Г. Пятибратов, T.JI. Кулова, Наноструктурированные материалы на основе модифицированных жгутиков галофильного археона Halobacterium salinarum для анода и катода литий-ионного аккумулятора. Тезисы докладов Международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика», Пущино, 22-24 октября, 2012 г., стр. 10.

Подписано в печать 10.04.2014г. Печать лазерная

Заказ № 2465 Тираж: 100 экз.

Типография «Р1хРпт» ИНН 503900523316 142290, Пущино, м-н «АБ», 22 (4967) 75-97-84 www.fix-print.ru