Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Архитектоника филамента бактериального жгутика

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Архитектоника филамента бактериального жгутика"

/ /7 С/.

ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ РАН

На правах рукописи

ФЕДОРОВ ОЛЕГ ВАСИЛЬЕВИЧ

УДК 577.122

АРХИТЕКТОНИКА ФИЛАМЕНТА БАКТЕРИАЛЬНОГО ЖГУТИКА

03.00.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Пущино - 1994

Работа выполнена в Институте белка РАН.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Член-корреспондент РАН Б.Ф.Поглазов Институт биохимии имени А.Н.Баха РАН

Доктор биологических наук В.В.Леднев

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Доктор физико-математических наук Ю.А.Лазарев Институт биофизики клетки РАН

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Институт кристаллографии имени А.В.Шубникова РАН

Защита диссертации состоится . У Э 1994г. в часов на заседании специализированного совета Д 200.23.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142292 г. Пущино Московской области, Институт биофизики клетки РАН

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Научного центра биологических исследований РАН (г. Пущино)

Автореферат разослан 1994 г.

Ученый секретарь специализированного советД^ кандидат биологических наук / Т.И.Смолихина

/

/

1. Введение.

Вопрос о взаимосвязи структуры и функции биологических объектов является центральным вопросом молекулярной биологии. На протяжении многих лет последовательно, шаг за шагом, исследовалась проблема: каким образом природа организует некое множество атомов для выполнения определенной биологической функции? История науки содержит много ярких примеров решения задач в этой области. Достаточно вспомнить многолетний труд Перутца, расшифровавшего пространственное строение молекулы гемоглобина, или гениальную гипотезу Уотсона и Крика, предложивших модель двойной спирали ДНК.

Безусловно наиболее эффективным методом изучения структуры биологических объектов является рентгёноструктурный анализ. С помощью этого метода были определены структуры ряда белков и нуклеиновых кислот с высоким разрешением, а в некоторых случаях сравнение пространственной структуры молекул и их комплексов с субстратами послужило основой для построения схем механизмов действия ферментов. Методу, однако, присущ ряд недостатков и ограничений. Прежде всего это большая трудоемкость. Другим ограничением метода является невозможность его прямого применения для исследования динамических свойств структуры. Существенно сужает круг объектов, пригодных для изучения рентгеноструктурным методом, необходимость иметь объект исследования в кристаллическом виде. 8 случае полимеризующихся белков это может быть принципиальным ограничением. Все это приводит к тому, что применение метода рентгеноструктурного анализа для исследования структуры макромолекулярных комплексов, а тем более для выяснения структурных изменений, происходящих при их сборке и функционировании, является пока проблематичным. Между тем выяснение механизмов сборки биологических объектов или вопрос о том, каким образом изменения, произошедшие в одной части молекулярного комплекса, могут вызвать структурные перестройки в другой - все это остростоящие проблемы биологии. Эффективным представляется подход, при котором молекулярный комплекс удается разбить на более мелкие блоки, структура и функция которых могут изучаться достаточно независимо. Из знания структуры и назначения отдельных частей (что принято

называть архитектоникой целого) складывается картина функционирования всего молекулярного комплекса.

Толчком к проведению описанных ниже исследований послужил видеофильм, снятый X. Хотани с использованием сверхчувствительной видеокамеры и совершенного темнопольного микроскопа, о структурных перестройках, происходящих в бактериальных жгутиках под влиянием внешнего воздействия. Было показано, что жгутики могут "прилипать" своим проксимальным концом к предметному стеклу микроскопа. При растекании капли суспензии жгутиков в воде с метилцеллюлозой, добавленной для увеличения вязкости раствора, создается поток жидкости, вызывающий вращение спиральной нити жгутика вокруг липкого конца, прикрепленного к предметному стеклу. Частички метилцеллюлозы при этом бомбардируют нити жгутиков. Удар частичкой метилцеллюлозы по проксимальному концу вызывает в нити жгутика структурный переход, в результате которого нить перестраивается из левозакрученного винта в правозакрученный. Такие переходы обратимы (Х.Хотани, неопубликованные результаты). Это означает, что существует макромолекулярный комплекс, одно лишь механическое воздействие на "спусковой крючок" которого вызывает перестройку всего комплекса. Если к этим наблюдениям добавить, что нить жгутика собирается из единственной субъединицы с молекулярным весом около 60 ООО и что in vivo нить жгутика действительно претерпевает перестройки, аналогичные наблюдаемым in vitro, становится ясно, что это простейшая из известных надмолекулярная структура, обладающая всеми атрибутами, присущими более сложным механохимическим системам.

Существует еще одно преимущество, которое окончательно определило выбор объекта. Бактериальные жгутики - объект, легко доступный в препаративных количествах. Жгутики разных штаммов одного вида бактерий или даже разных видов бактерий могут быть получены без особого труда. Сравнительное изучение строения таких жгутиков и оказалось плодотворным для выявления общего и частного в строении различных жгутиков и определения посредством этого архитектоники бактериальных жгутиков.

Пользуясь случаем, хочу выразить свою благодарность А.С.Спирину за постоянный интерес к работе и ее поддержку.

2. Бактериальные жгутики.

2.1. Некоторые сведения о структуре и функции жгутиков. У бактерий различают два вида подвижности: скольжение и плавание. Механизм скольжения бактерий по поверхности практически не изучен. Подвижность, при которой бактерии плавают в жидкой среде, является самой распространенной и наиболее изученной формой бактериальной подвижности. Это движение не беспорядочное, а модулируемое условиями окружающей среды. Многие внешние факторы, такие как температура, pH среды, давление, свет, химические агенты оказывают влияние на поведение бактерий. Бактерии же обладают уникальной способностью мигрировать в область среды с более благоприятными условиями. Такое поведение бактерий называется таксисом. Исполнительным механизмом таксиса бактерий является аппарат подвижности - жгутик. Долгое время считалось, что механизм бактериального движения аналогичен волнообразному биению эукариотических жгутиков и ресничек. Силверман и Саймон блестящими опытами доказали, что верна вращательная модель, при которой нить жгутика вращается и выполняет пассивную роль гребного винта (Silverman and Simon, 1974, Nature, 249, 73.). Другое принципиальное отличие бактериального движения от эукариотмческого состоит в том, что источником энергии для него является не АТФ, а трансмембранный электрохимический потенциал (Белякова, Глаголев и Скулачев, 1976, Биохимия, 41, 1478; Glagolev and Skulachev, 1978, Nature, 1978, 272, 280.}. Таким образом, несмотря на использование одного и того же термина - жгутик, бактериальный и эукариотический аппараты подвижности принципиально различаются.

Наиболее полно изучен аппарат подвижности у энтеробактерий. В условиях экспоненциального роста они могут иметь от пяти до десяти перитрихально расположенных жгутиков длиной 5-10 mm (Рис 1). Наблюдая за клетками энтеробактерий легко заметить, в микроскоп,что быстрое направленное плавание ежесекундно заменяется на кувыркание на одном месте (tambling), после которого бактерия плывет в новом направлении. Это ключевое явление в механизме таксиса бактерий (Macnab and Koshland, 1972, P.N.A.S., 69, 2509). При движении в благоприятном для себя направлении, например, в сторону увеличения концентрации аттрактанта, реже включается режим кувыркания. В результате бактерия плывет в этом направлении

Рис.1. Электронно-микроскопическое изображение клетки E.coli с нормальными жгутиками. (Jones, Aizawa, 1991. Adv. Microb, Physiol., 32. 109). Масштабная линейка - 1/um

более длительное время. Наличие репеллента, наоборот, приводит к более частому включению кувыркания, а значит и смене направления движения. Были найдены бактерии мутантных штаммов, постоянно находящиеся в состоянии кувыркания, и оказалось, что их жгутики имеют «форму, отличную от так называемой нормальной формы (см. ниже). Позднее было прямо показано, что бактерии в момент плавания и кувыркания имеют формы жгутика, получившие названия нормальной и курчавой форм (Macnab and Ornston, 1977, J.M.B., 112, 1).

Интактный бактериальный жгутик (Рис. 2) состоит из трех хорошо различаемых подструктур: базального тела, выполняющего роль встроенного в клеточную стенку ротора мотора, филамента и крюка, являющегося соединительным элементом между базальным телом и филаментом. (DePamphilis and Adler, 1971, J. Bacteriology, 105, 384).

Базальное тело, составленное по меньшей мере из семи различных белков, ответственно за моторную функцию жгутика. Генетические исследования показали, что для функционирования мотора необходимы и некоторые другие структуры, очевидно встроенные в клеточную стенку. Основными элементами базального тела считаются MS - кольцо, локализованное в

Рис.2. Электронно-микроскопическое изображение ттактного жгутика Е.сои. Видны базальнов тело, крюк, филамент (Jones, Aizawa. 1991, Adv. Microb. Physiol., 32, f09). Масштабная линейка ■ O.S/im

цитоплазматической мембране, LP-кольцо, расположенное во внешней мембране и выступающее в пептидоглмкановый слой, а также стержень, пронизывающий все эти структуры. Строение и фунционирование базального тела жгутика в настоящее время интенсивно изучаются рядом исследователей.

Крюк на электронных микрофотографиях выглядит как изогнутая структура длиной около 50 nm и диаметром около 20 nm (DePamphilis and Adler, 1971, J. Bacteriology, 105, 384). Собирается эта структура из единственного белка, она мало изучена, а по изученным свойствам похожа на филамент.

Филамент жгутика собирается из единственной субъединицы - флагеллина и представляет собой жесткую спиральную трубу длиной до 10 mm и диаметром около 20 nm. Рост филамента жгутика при сборке происходит с дистального конца (Emerson, Tokuyasu, Simon, 1970, Science, 169, 190). Считается, что субъединицы доставляются к месту сборки по полому каналу внутри жгутика. Жгутик нормальной формы имеет левоспиральный филамент с шагом спирали 2,5 mm и радиусом спирали около 0,6 mm, с хорошо различимым на электронном микроскопе при торцевой проекции центральным каналом (Asakura, Eguchi and lino, 1968, J.M.B., 35, 227). Укладка субъединиц в филаменте была исследована на мутантных прямых жгутиках (O'Brien and Bennet, 1972, J.M.B., 70, 133). Мономеры флагеллина на поверхности филамента составляют псевдогексагональную решетку. Различают 1-, 5-, 6- и 11-заходовые спирали. В 1-заходовой спирали на виток приходится 5,5 мономеров.

Каспар и Клюг показали, что полая труба, собранная из субъединиц одного типа, может быть только прямой (Caspar and

Klug, 1962, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 27, 1). Однако нормальная форма филамента спиральна, более того, наблюдаются жгутики с различными параметрами спирали, что известно под названием полиморфизма (Asakura, 1970, Advances in Biophysics, 1, 99). Эти полиморфные формы могут обратимо переходить друг в друга при изменении таких условий окружающей среды как температура, pH, ионная сила или под воздействием вязкого потока (Kamiya and Asakura, 1976, J.M.B., 106, 167; Hotani, 1982, J.M.B., 156, 791). Для объяснения полиморфизма было предложено две модели. Модель Аса куры предполагает наличие двух конформационных состояний полипептидной цепи у субъединицы (Asakura, 1970, Advances in Biophysics, 1. 99). Модель Калладина основана на допущении альтернативного связывания субъединиц (Calladine, 1978, J.M.B., 118, 457). Согласно этим моделям каждый из 11-заходовых рядов находятся в одном из двух состояний: L или R. Все ряды, находящиеся в одном и том же состоянии, являются смежными. Предполагается, что ряд, находящийся в одном из состояний, отличается по длине от ряда, находящегося в другом состоянии. Это приводит к скрученности филамента. Возможны 12 различных полиморфных форм, содержащих от О до 11 однотипных рядов. Очевидно, что филаменты, в которых все ряды находятся либо в L, либо в R-состоянии, будут прямыми (Рис. 3). Теоретический анализ, проведенный Капладином, показал, что субъединицы в двух таких прямых филаментах должны быть упакованы различным образом. Многие из предсказанных полиморфных форм, включая две прямые, были обнаружены среди мутантных флагеллинов.

Детальное электронно-микроскопическое исследование позволило Лауну установить, что жгутики разных штаммов Escherichia coli существенно различаются по толщине (от 19 до 27 nm), по молекулярному весу составляющего их белка (от 37 ООО до 69 ООО), по морфологическому типу поверхности жгутика (Lawn, I. Orskov and F. Orskov, 1977, J. Gen. Microbiol., 101, 111).

Известно, что поверхность жгутика является одним яз трех специфических поверхностных антигенов энтеробактерий, поэтому жгутики разных штаммов могут различаться по антигенной специфичности.

Филаменты отделяются от бактерии энергичным встряхиванием или пропусканием культурапьной среды через шприц. Достаточно очищенные и с хорошим выходом (5 мг с 1 л среды) филаменты можно выделить высокоскоростным центрифугированием супернатанта, полученного после осаждения

Tluin1)

-г

to

12

1

it! цт"')

2 4

A

О

О •

N

Normal

- Coiled

Semi-coiled

4-Curly <I)

sc Curly(I)

■ Straight

t|im

(a)

(b)

U)

'hc. 3. Модель, объясняющая полиморфизм филамента (Calladine, 1978, '.M.S., 118, 4S7). а) Значения кривизны (к) и скрученности (i) для 12 еоретически возможных форм (О) и для наблюдаемых филаментов жгутиков закрашенные символы}. Кривизна - функция числа продольных рядов убъединиц, находящихся в альтернативном состоянии, скрученность -функция наклона рядов субъединиц к оси филамента. Ь) Ожидаемые формы Ьиламентов. Расчетная длина всех филаментов - 4 ¡лт. с) Названия, данные экспериментально наблюдаемым формам филаментов.

клеток на низкой скорости. Филаменты могут быть легко диссоциированы на составляющие их субъединицы кратковременным денатурирующим воздействием, например, повышением температуры до 65°С или понижением рН до 2.0. Полимеризация мономерного флагеллина может быть произведена в присутствии высокой концентрации соли. Реконструкция филамента при физиологических концентрациях солей происходит только при добавлении к раствору мономерного флагеллина коротких фрагментов филаментов. Принципиально, что природа затравки определяет форму реконструированного филамента.

Поскольку флагеллин является единственной субъединицей филамента, то объяснение уникальных свойств филамента следует искать в структуре флагеллина. Между тем, в то время, когда мы приступали к исследованиям, о структуре флагеллина было известно крайне мало. Перед нами стояла задача изучения структуры флагеллина и объяснения, исходя из свойств этой структуры, принципов сборки и функционирования филамента. Флагеллин - полимеризующийся белок, что препятствует его кристаллизации. Не увенчались успехом и попытки кристаллизации флагеллина с нарушенной способностью к полимеризации, например, с отщепленным концевым участком цепи (неопубликованные результаты нашей группы; Aizaw а, персональное сообщение). Поэтому прямого определения структуры флагеллина, с достаточным для понимания механизма функционирования разрешением, ожидать не приходится. Остается другой путь - изучение структурной организации косвенными методами с последующим построением модели, которая должна объяснять наблюдаемые свойства. Ниже перечислены главные из таких свойств:

флагеллины разных штаммов и даже видов бактерий, имеющие значительно различающиеся молекулярные веса и обладающие разной антигенной специфичностью, способны сополимеризоваться;

из субъединиц единственного типа собирается трубчатая структура как прямая, так и скрученная либо в левую, либо в правую спираль;

процесс полимеризации in vitro происходит путем достраивания затравок (коротких фрагментов филамента) мономерным флагеллином, причем природа затравки, определяет свойства реконструированного филамента.

\

2.2. Изучение доменной структуры флагеллина.

Исследование архитектоники филамента бактериального жгутика подразумевает в первую очередь выделение каких-то элементов структуры, которые могут быть названы частями, составляющими единое целое. В качестве таких элементов нами были выбраны домены, понимаемые как структуры кооперативно разрушающиеся при денатурирующем воздействии (Privalov and Khechinashvili, 1974, J.M.B., 86, 665;). Метод сканирующей калориметрии в сочетании с ограниченным протеолизом и методами, регистрирующими изменения во вторичной структуре белков, позволяют выделять такие домены в белках. Разнообразие филаментов по толщине, по форме (нормальные, прямые, курчавые), по антигенной специфичности, наконец, по природе своего происхождения (разные бактерии и штаммы) предоставляет нам возможность выявить общее и частное в доменной организации структур различных флагеллинов.

В качестве первого шага мы сравнили флагеллины нормальных и мутантных прямых жгутиков Salmonella. Использовались нормальные филаменты штамма SJW1103, прямые филаметы L-типа штамма SJW1660 и R-типа штамма SJW1655. Штаммы были любезно предоставлены доктором Камия (Университет г. Нагоя, Япония). Микрокалориметрические измерения были выполнены в 0.15 М NaCI, 0.01 М фосфатном буфере при pH 7.0 на микрокалориметре ДАСМ-1М. Результаты полученные для филаментов (сплошная линия) и для мономеров флагеллина (пунктирная линия) показаны на рис 4. Кривые плавления нормального и прямого филамента L-типа содержат два отчетливых пика. Для прямого филамента R-типа кривая состоит также из двух, но сильно перекрывающихся полос. Кривые избыточного теплопоглощения представляют собой простые симметричные пики. Они имеют подобную форму и максимумы, локализованные в узком интервале температур - 47,5 - 48 Плавление мономерного флагеллина - обратимый процесс, т.е. охлаждение и последующий повторный прогрев каждого из растворов мономерных флагеллинов дает кривую плавления, практически не отличимую от предыдущей для этого образца.

В таблице 1 приведены некоторые термодинамические параметры процессов тепловой денатурации этих флагеллинов, которые были вычислены в предположении, что молекулярный вес флагеллинов этих штаммов равен 51 000 (Kondoh and Hotani, 1974, Biochim. Biophys. Acta, 336, 117).

л / t

N 1 1 1 1 / / / / / / ✓ # 1 V \ * \ \ \ __\

1

// iß >\ V \ \ \ \ \

R г\

1. 1 II // // / / / У / \ \ V \ \ \ 1 \ V \ ч V

1 1 1 1 1 I 1 1 1

20 30 40 50 60

Температура, °С

Рис. 4. Кривые плавления, полученные для филамента (сплошная линия) и для мономерного флагеплина Salmonella (пунктирная линия). N, L и Я соответствуют результатам для филаментов нормального и соответствующих прямых типов жгутиков.

Таблица 1.

Термодинамические параметры тепловой денатурации флагеллинов

_разных штаммов Salmonella________

Тип филамента Полимер DdH Са1 kJ-mol"1 Мономер DdHCal kJ-mol'1 DdHV" , kJ-mol"1 R

нормальный 2220+120 1340±50 680150 1,97

L-тип 2010+120 1340+50 690+50 1,94

R-тип 19201120 1340150 660150 2,03

R= DdHCa,/DdHvH

Значение параметра R близкое к двум говорит о том, что для всех трех флагеллинов их мономерная форма содержит как минимум два кооперативно плавящихся домена.

Мы провели также измерения спектров кругового дихроизма полимерной и мономерной форм всех трех флагеллинов в условиях, аналогичных таковым при проведении микрокалориметрических опытов. В каждой из двух форм все три флагеллина имели подобные профили кривых кругового дихроизма. Значение молярной эллиптичности на остаток при 220nm и 20°С для полимеров было в 1.6 раза выше, чем для мономеров (-18200+400 degcm2/drnol против -110001400 deg cm /dmol). Аналогичный результат КД-измерений был получен Урутани для одного из штаммов Salmonella (Uratani, Asakura and lmahori, 1972, J.M.B., 67, 85). Наблюдаемое увеличение эллиптичности говорит о том, что полимерное состояние характеризуется большим содержанием а-спирапей.

В качестве следующего шага были сравнены филаменты энтеробактерий Salmonella и E.coli. Исследовались полимерные и мономерные формы флагеллинов нормальных филаментов. Зависимости теплопоглощения и молярной эллиптичности от температуры представлены на рис. 5. Результаты их обработки сведены в таблице 2. Отметим общие свойства обоих бактериальных флагеллинов. Во-первых, факт, что теплопоглощающие пики калориметрической кривой и изменения эллиптичности при 222 nm происходят в одном и том же температурном интервале, свидетельствует о том, что уменьшение степени спиральности флагеллинов в мономерной и

Температура, °С

Рис.£. Зависимости теплопоглощения (—) и молярной эллиптичности 6 222

(-----) от температуры. 0.01 М фосфатный буфер 0.15 М NaCI (pH 7.0)

а/ полимерная форма Salmonella. Ь) мономерная форма Salmonella, с) полимерная форма E.coli. d) мономерная форма £. coli.

Таблица 2.

Термодинамические параметры тепловой денатурации нормальных типов филамент Salmonella и E.coli.

природа филамента по D лимер dHcal мономер DriHcal

kJmol"1 Л." kJ-mof '

E.coli 27501150 45,6±2,5 145Q±200 24,2+1,7

Salmonella 22201120 43,5±2,0 1340±50 26,311,0

полимерной формах происходит при разрушении каких-то доменов. Во-вторых, деконволюционный анализ калориметрических кривых (Филимонов В.В., Потехин С.А., Матвеев C.B., Привалов П.Л., 1982, Молекулярная биология, 16, 551) показывает, что мономерные формы флагеллинов содержат по две кооперативные единицы - домена. Очевидно также, что

полимерные формы флагеллинов содержат дополнительные элементы упорядоченной структуры, не присутствующие в мономерах.

Таким образом, на основании сравнительного изучения свойств филаментов и образующих их флагеллинов двух разных бактерий, а также трех штаммов одной бактерии, два из которых имели мутантные формы филаментов, можно сделать вывод, что флагеллины имеют довольно сложную доменную организацию. Обидим свойством всех изученных флагеллинов является то, что мономерная форма характеризуется наличием двух доменов, а в полимерном состоянии возрастает содержание спиралей во вторичной структуре флагеллина и появляются дополнительные домены.

2.3. Изучение взаимосвязи между доменной структурой флагеллина н функцией жгутика, Исходя из доменной структуры флагеллина и способности флагеллинов разных штаммов и даже разных бактерий сополимеризоваться, мы предположили, что за полимеризационную функцию флагеллина отвечают определенные домены. С целью проверки этого предположения сравнительному исследованию были подвергнуты флагеллины двух штаммов E.coli: K-12J62 и В38 из Всесоюзной коллекции микроорганизмов. Для штамма K12J62 наблюдался низкий выход флагеллина, однако он был единственным, для которого в то время ожидалось определение первичной структуры флагеллина. Штамм В38 был выбран как дающий хороший выход при выделении флагеллина, и отличающийся от K12J62 по ряду характеристик (электрофоретической подвижности, антигенной специфичности, аминокислотному составу). Важно отметить, что флагеллин В38 хорошо полимеризуется на затравках K12J62 и наоборот. Понимая необходимость знания первичной последовательности флагеллина В38, мы начали работу по ее определению.

Молекулярные веса флагеллинов E.coli K12J62 и В38 электрофоретически были определены как 56 ООО и 59 ООО, соответственно. Следует сказать, что определение молекулярного веса флагеллина K12J62 по электрофоретической подвижности дает неоднозначный результат. Оказалось, что его подвижность при электрофорезе зависит от соотношения белок/буфер для образца и степени термальной обработки образца и может изменятся в пределах, соответствующих молекулярным весам 56 ООО - 63 ООО.Флагеллины названных штаммов были подвергнуты

ограниченному протеолизу протеазами различной специфичности (трипсин, химотрипсин, ппазмин, клострипаин, термолизин, эластаза) (рис. 6).

кИ

«Ш» 94

59 ^ ^67

ЦП ——

43

20.1 14.4

Рис. Б. Результат ограниченного проте-олиза мономерного флагеллина В38 не-20 сколькими про-

теазами. а) флагел-лии В38, Ь) расщепление трипсином: соотношение белок/ энзим 200/1, время протеолиза - 1Б мин.; с) расщепление химо-трилсином: 20/1, 30 д и . мин.; д) расщепление

^ 6 термолизином: 200/1,

15 мин, е) белки-маркеры.

Были обнаружены следующие общие закономерности: 1) полимерный флагеллин устойчив к действию протеаз; 2) у мономерного флагеллина наблюдается быстрое расщепление концевых участков с образованием одного, а несколько позже и другого устойчивых фрагментов Устойчивые фрагменты флагеллинов штаммов В38 и К12иб2, получаемые ограниченным трипсинолизом, показаны на рис. 7. Эти фрагменты были выделены в препаративных количествах. Для флагеллина К 12^2 они имели молекулярные веса 44 ООО и 34 ООО и были обозначены ЯК44 и РК34. Разделение проводили препаративным электрофорезом в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях. Для флагеллина В38 выбранные фрагменты имели молекулярные веса 50 ООО и 37 ООО и были обозначены РВ50 и РВ37. Разделение их проводили на системе РР1.С на анионообменной колонке Мопо-О посредством градиентной элюции (0,05-0,22 М ЫаС1 в 20 тМ трис-НС1, рН 8,0).

Ш

30 20 14

«ГЭ

РК44

» ЯК34

Р850 „ЯВ37

1 3 5

О 3 В 15'

Рис. 7. Временная зависимость хода трипсино-лиза мономерного флагеллина и обозначения фрагментов: А) штамм К12и62, В) штамм В38.

3

о

Метод сканирующей микрокалориметрии был использован для оценки количества доменов, имеющихся во флагеллинах и их фрагментах. На рис. 8 приведены кривые плавления и результаты их деконволюционного анализа. Обнаружено, что для каждого из флагеллинов наблюдаются следующие свойства: 1) кривые плавления мономера и его крупного фрагмента при одинаковых условиях совпадают с точностью до погрешности измерений; 2) в малых фрагментах ЯК34 и РВ37 имеется всего один кооперативный блок, а в больших фрагментах И<44 и РВ50 и мономерах таких блоков два.

Необходимо было идентифицировать эти фрагменты. Незначительное уменьшение молекулярных весов при протеолизе / названных фрагментов говорит, что их образование идет путем отщепления концевых участков полипептидной цепи. Прежде всего иы ответили на вопрос: на одном или двух концах идет это тротеолитическое расщепление. С этой целью флагеллины и их фрагменты были подвергнуты расщеплению бромцианом. Согласно данным аминокислотного анализа флагеллин В38 содержит три метиониновых остатка. Тогда, если расщепление происходит с одного из концов, то возможны два варианта: а) расщепляемый участок не содержит метиониновых остатков; 5) расщепляемый протеазами участок содержит хотя бы один метиониновый остаток. В первом случае флагеллин и его тротеолитический фрагмент должны иметь три совпадающие по электрофорегической подвижности полосы, во втором случае при чаличии у фрагмента трех бромциановых осколков совпадающих полос должно быть две. Электрофоретическое сравнение эезультатов бромцианового гидролиза флагеллина В38 и

л .А. в А

А

: Л . 1

30

50

Температура, °С

Рис а. Кривые плавления флагеллина (нижние рисунки), большого фрагмента (средние) и малого фрагмента (верхние рисунки). А)-штамм К12Л62, В)- штамм В32

фрагмента РВ50 показывает, что одна из полос совпадает, а три изменили свой вес не более чем на 3 ООО (рис. 9). Следовательно, при протеолитическом расщеплении флагеллина.

ш

Ш Рис 9. Результат СЫВг расщепления.

а) флагеллин В38, Ь) фрагмент РВ50, ф с) фрагмент РВЗ~}, ф белки - маркеры, (е -

0) соответствующие флагеллину и его а Ь С (| б I в фрагментам бромцианоаые осколки.

в результате которого образуются вышеназванные фрагменты, деградация происходит на обоих концах молекулы. Позже нами была определена по гену первичная структура флагеллина В38 (Рис. 10) и таким образом стали известны места возможного расщепления цепи трипсином, точно определено положение метиониновых остатков. Сопоставление молекулярных весов флагеллина, его устойчивых триптических фрагментов и осколков, остающихся после их расщепления бромцианом, позволяет назвать образующиеся при ограниченном трипсинолизе фрагменты. Первый из образующихся устойчивых фрагментов представляет собой среднюю часть полипептидной цепи с отщепленными 66 остатками на М-конце и 43 остатками - на С-конце. При образовании второго устойчивого фрагмента происходит дополнительная деградация до 162 остатка на N-конце, а С-концевым становится 475 остаток (т.е. отщеплено 89 остатков).

Сравнение аминокислотной последовательности флагеллина В38 с последовательностью флагеллина К12 (Kuwajima, Kawagishi, Homma, Asaka, Kondo, Macnab, 1989, P.N.A.S., SS, 4953) показывает очень высокую степень гомологии N- и С-конц,евых участков полипептидной цепи. Так 91 остаток с N-конца и 77 с С-конца полностью идентичны, а для 170 N- и 90 С-концевых остатков степень гомологичности составляет 98%. Средняя часть молекулы, напротив, гомологии не обнаруживает. Анализ нуклеотидной последовательности центральной части гена флагеллина показывает, что в ней имеется достаточно большое число прямых и инвертированых повторов. Несомненно, что эта часть обладает большим рекомбинационным потенциалом. Об этом говорит и присутствие в ней инициаторного сайта генетической информации Е. coli, так называемого сайта Chi: 5'-GCTGGTGG-3' (Schultz and Smith, J.M.B., 1986, 189, 585). Таким образом ген флагеллина является геном с мозаичной структурой, при которой районы почти полной консервативности сочетаются с районами высокой вариабельности. Идентичность концевых участков флагеллинов Е. coli и Salmonella, а также аналогичный ход ограниченного протеолиза позволили нам заключить, что фрагменты FK34 и FK44 образуются путем отщепления таких же концевых участков как при трипсинолизе флагеллина В38.

Мы определили также какая часть молекулы флагеллина экспонирована на поверхности полимера. Для получения антисыворотки была проведена иммунизация кроликов смесью полимерных флагеллинов E.coli K12J62 и В38. Наличие антител к

51- 100 #

: *&sss.ss&l£bs&* *&sss.&H

: ***** ******* ***

îMAQVIMTNSLSLITQNNINKNQSALSSSIERLSSGLRINSAKDDAAGQAI « t t t * t

H&&&&&&&&&&***** ****&HHHHHHHHHH&* * *

66 ***** *******

ANRFTSNIKGLTQAARNANDGISVAQTTEGALSEIKNHLQRIRELTVQAS t t # t * t

101- 140 #

* «HHHHHHHHHHHH* Sbb s&s

*****BBBBBB rGTMSDSDLDSIQDEIKSRLDEIDRVSGQTQFNGTNVLAK t # t *

**BSSSSBB* *SSSSSB*162 *********** **** ******

DGSMKIQVGANDGQTITIDLKKIDSDrLGLNGFNVNGKGTIANKAATISD t t t t * *

:*** ***&b&&&S&i* *********

:*****SSSS* BSSSSS******* *BBBB*******A

:LAATGAIVTNSSNIVWTTKFNALDAATAFSKLXDGDSVAVAAQKYTÏNA t t t t t #

****HHHHHbiS.i **** ********* *BBBBB**BSSSSSB*

STNDFTTENTVATGTATTDLGATIXAAAGQSQSGTYTFANGKVNFDVDAS

2 41- 290 t

291- 340 t

♦s4sssí&4***

:*SSSS** *BBBB****** ****

:GNITIGGEKAFLVGGALTTNDPTGSTPATMSSLFKAADDKDAAQSSIDFG * t * t *

341- 390 t

**¿fciSbi**

***** *** ********* *SSSSSB *B

GKKÏEFAGGNSTNGGGVKFKDTVSSDALLAQVKADSrANNVKITFNNGPL t t t t t

391- 440 t

: *******

:SSSBBB* ***** ****** **BBBBB **BBBBB*

:SFTASFQNGVSGSAASNAAVriDSEGELTrrESYNTNYSVDKDrGAVSVrG t t i f t

**************** ****

& & &HHHHHHHHHHH 475

441- 490 #

GSGTGKYAANVGAQAYVGADGKLTTNTTSTGSATKDPLNALDEAIASIDK

HHHHH&iHbSS&iSblSH**

*******

522

tiiiiiiiS,**** **** ***

:FRSSLGAIQNRLDSAVTMI,NNTTraLSEAQSRI0DADYATEVSNHSKAC2I * * t t t t t

******&s&4sb**scf,s&ubs4*

** **** ****

iqqagnsviakanqvpqqvislwg

541- 565 t t t t

фпагеллинам определялось по методу Ухтерлони (Ouchterlony О., 1950, Ark. Kerni., 1, 43). В качестве антигенов использовали флагеллины обоих штаммов и фрагменты FB50, FB37, FK44, FK34. По форме полос преципитации был сделан вывод о частичной идентичности антигенных детерминант исследуемых флагеллинов и о полной их идентичности у каждого флагеллина и его фрагментов. Следовательно, все антигенные детерминанты полимерной формы флагеллина расположены на наиболее устойчивой к действию протеаз части молекулы (малом из протеолитических фрагментов), и эта часть должна находиться на поверхности полимера. Концевые участки не несут антигенных детерминант филамента.

Флагеллины полимеризуются либо на затравках (фрагментах филаментов), либо под воздействием высаливающих агентов таких, например, как сульфат аммония. В поставленных нами экспериментах полимеризация фрагментов ни на затравках, ни при высаливании не происходила. Поскольку в работах Асакуры (Asakura, 1970, Advances in Biophysics. 1, 99) было показано, что полимеризация флагеллина - процесс двухстадийный, мы проверили конкурируют ли фрагменты с мономерным флагеллином за места связывания и таким образом ингибируют процесс полимеризации на затравках. Оказалось, однако, что даже многократный избыток фрагментов в растворе не оказывал заметного влияния на скорость полимеризации мономерного флагеллина на затравках. Был сделан вывод, что отщепление концевых участков у мономера ведет к утере флагеллином полимеризационной способности. Таким образом, в результате проведенных нами исследований, показаны следующие свойства флагеллина - субъединицы филамента бактериального жгутика:

1. Флагеллины E.coli и Salmonella имеют ярко выраженную доменную организацию.

2. Полимерный флагеллин устойчив к действию протеаз. При протеолизе мономерного флагеллина независимо от специфичности протеазы в первую очередь происходит быстрая

Рис 10. Первичная структура флагеллина E.coli В38. Выделены остатки метионина, по которым происходит расщепление бромциансм. Стрелки указывают места расщепления цепи трипсином при ограниченном протеолизе. Предсказанная вторичная структура этого флагеллина: Н -участки спиральной структуры, S - складчатые слои, & - вероятная спиральная структура, В - вероятный складчатый слой, ' - участки, где регулярная структура не предсказывается. Использована программа ALB (Ptitsyn S Fmkelstein, 1983, Biopolyrners, 22, 15)

деградация концевых участков молекулы.

3. Ограниченным протеолизом мономерного флагеллина могут быть получены два его фрагмента, которые сохраняют свою третичную структуру.

4. Больший из фрагментов образуется путем отщепления 66 остатков с Ы-конца и 43 остатков с С-конца. Меньший - 162 с Ы-конца и 89 с С-конца.

5. Для большего из фрагментов и мономерного флагеллина, регистрируемые микрокалориметрией и КД-измерениями характеристики вторичной и третичной структур, совпадают.

6. Малый из фрагментов содержит все антигенные детерминанты филамента.

7. Молекула флагеллина в составе полимера имеет степень спиральности в 1.6 раза выше, чем в мономерном состоянии.

8. Расчет ожидаемых вторичных структур показывает, что наибольшая вероятность образования спиральных структур имеется у участков полипептидной цепи, отщепляемых при образовании второго из фрагментов, менее стабильные спирали предсказываются в участках, отщепляемых в первую очередь. В средней части цепи спиральные структуры не ожидаются.

9. Отщепление концевых участков лолипептидой цепи приводит к потере полимеризационной способности флагеллина.

Мы предложили модель структуры субьединицы бактериального жгутика, которая удовлетворяет совокупности всех перечисленных свойств.

Молекула флагеллина состоит из трех достаточно независимых частей. Центральный домен (он же малый протеолитический фрагмент) образован средней частью полипептидной цепи без 162 остатков с Ы-конца и 89 с С-конца. Он экспонирован наружу в составе полимера, устойчив к действию протеаз и несет на себе все антигенные детерминанты филамента. Этот домен вариабелен как по величине, так и по структуре, а, следовательно, и по антигенной специфичности. Концевые части молекулы, напротив, чрезвычайно консервативны. Они отвечают за полимеризационные свойства флагеллина. При этом 95 остатков, примыкающих к И-концу центральной части молекулы и 46, добавляемых на С-конце, образуют устойчивые спирали. Вместе с центральным доменом они образуют так называемый большой из протеолитических фрагментов. К третьей из частей молекулы относятся 66 остатков, лежащих на М-конце, и 43 остатка, расположенных в С-концевой части молекулы. Эти отрезки полипептидной цепи склонны к образованию спиральной

структуры, но в мономерном состоянии не упорядочены и принимают регулярную структуру лишь в полимерном состоянии.

Главная идея этой модели состоит безусловно в том, что у флагеллинов разной природы должны быть подобны концевые части и, напротив, могут быть абсолютно непохожи наружные (центральные) домены. Убедительным подтверждением этого служит расчет ожидаемых вторичных структур для различных флагеллинов. Расчеты были проведены с использованием программы ALB и были выполнены для всех флагеллинов, для которых была известна первичная структура ( Рис. 11 )

Уместно заметить, что все вышеприведенные данные, как и модель структуры флагеллина, впервые были получены нами посредством сравнения флагеллинов нескольких штаммов E.coli и Salmonella (Fedorov, Khechnashvili, Kamiya, Asakura, 1984, J. M B , 175, 83; Fedorov, Kostyukova, 1984, FEBS Lett., 171, 145; Kostyukova, Pyatibratov, Filimonov & Fedorov, 1988, FEBS Lett.. 241, 141; Fedorov, Kostyukova, Pyatibratov, 1988, FEBS Lett., 241, 145; Федоров, Костюкова, Пятибратов, Филимонов, 1989, ДАН, 305, 746), и лишь позже подтверждены в детальных исследованиях японской группы для флагеллина Salmonella SJW1103 (Vonderviszt, Kanto, Aizawa & Namba, 1989, J.M.B., 20Э, 127; Vonderviszt Uedaira, Kidokoro, Namba, 1990, J.M.8., 214, 97; Aizawa, Vonderviszt, Ishima, Akasaka, 1990, J.M.B., 211, 673; Kanto, Okino, Aizawa & Yamaguchi, 1991, J.M.B., 219, 471).

2.4 Косборочное сворачивание флагеллина - основа процесса самосборки филаменга. Как было показано выше, полимерное состояние флагеллина, по сравнению с мономерным, характеризуется более высоким содержанием спиральных структур и наличием дополнительного домена. У флагеллина в мономерной форме концевые участки цепи легко подвергаются протеазной атаке и в то же время, как показывает теоретическое рассмотрение, они предрасположены к образованию спиральных структур. Из этого следует вывод, что концевые части приобретают регулярную структуру в процессе полимеризации.

Молекула флагеллина в мономерной форме уже имеет ярко выраженную третичную структуру, но для того, чтобы обрести способность функционировать в составе надмолекулярного комплекса, необходим дополнительный этап структурной организации. Это явление правильнее всего назвать косборочным сворачиванием. Согласно нашим исследованиям, оно затрагивает около 70 N-концевых и 50 С-концевых остатков. Явление

лл

\А [ы

90 • л А Г /1 / л '' 1 \.'ч IV V'""

хлДлИ

40 «0 >20 1«0

Номер аминокислотного остатка

б> г м

- л ' '>л Г

ЙГ^'-

\ - л л /'^л -Л . и. п 01..

] С

/Ъ 4-

■•о гго г»

V

г*о по

Л.

оо «во

А и/

♦оо ««о «ей

.л

«Ю «в® с »99

Соо1оЬое1«г

$о1топе11в

(пд«п(Ып

I-[

Си-

Рис. 11. Предсказанные вторичные структуры различных флагеллинов: (------) <х-спираль, (.....) Р-структура.

Блок-схема структуры флагеллинов. А,В и С - Ы-концевая, центральная и С-концевая части полипептидной цепи, соответственно. А£, С8 - стабильные спиральные участки; В или Ь - вариабельная часть попипептидной цепи; Ац_8 и Си.а - участки, приобретающие спиральную структуру в процессе образования филамента.

косборочного сворачивания позволяет дать толкование райее известным фактам. Так, например, Асакура, изучая кинетику полимеризации флагеллина на затравках, обратил внимание, что скорость полимеризации, линейно увеличиваясь с увеличением концентрации мономера, при очень высоких концентрациях мономера выходит на плато (Asakura, 1968, J.M.B. 35, 237). Как пишет Асакура, одной из возможных интерпретаций этого результата может быть предположение, что процесс полимеризации происходит в два этапа. Первый шаг соответствует обратимому связыванию мономера с затравкой, а второй - встраиванию связанного мономера в филамент. Только после второго этапа молекула флагеллина будет готова вступить в следующий акт. полимеризационного процесса. Очевидно, что если среднее время, необходимое для первого шага, обратно пропорционально концентрации мономера, то среднее время, необходимое для второго шага не зависит от концентрации. Полное время, необходимое для полимеризационного акта, может быть выражено как:

t = 1 / kbc н-1

где k^ - константа связывания мономера, с - концентрация мономера, t - время, необходимое для второго шага в полимеризационном процессе. Экспериментальные результаты по кинетике процесса полимеризации, полученные Асакурой, находятся в хорошем соответствии с этим выражением. Таким образом, с одной стороны, наблюдения Асакуры являются независимым подтверждением существования явления косборочного сворачивания, а с другой, наши результаты проливают свет на сущность процесса, названного Асакурой "встраиванием в полимер".

Курода получил интересные результаты по сополимеризации флагеллинов двух близкородственных бактерий - Salmonella и Proteus (Kurodа, 1972, В.В.А., 285, 253). Используя в качестве затравок при реконструкции смесь коротких фрагментов филамент Salmonella и Proteus, Курода добавлял к ним мономерный флагеллин либо Salmonella, либо Proteus, или смесь равных количеств того и другого. Оказалось, что

во всех случаях реконструкция филамента происходит на затравках и той, и другой природы;

скорость реконструкции при использовании мономеров Salmonella выше, чем в случае Proteus,

при одновременном использовании мономеров Salmonella и Proteus мономеры Protreus, как пишет Курода, "легче и чаще втраиваются в реконструируемый полимер", при этом скорость полимеризации промежуточная между скоростями полимеризации мономеров Salmonella и Proteus.

Эти наблюдения обьясняются двухстадийностью процесса реконструкции или, в других терминах, такие закономерности хода реконструкции обязаны явлению косборочного сворачивания флагеллина. Действительно, на основании этих данных можно утверждать, что у флагеллина Proteus более быстрый, чем у Salmonella, процесс связывания мономера с реконструируемым филаментом, в то время как флагеллин Salmonella способен значительно быстрее принять окончательную конформацию. К сожалению, первичная структура флагеллина Proteus до настоящего времени не известна. Сравнение последовательностей концевых участков флагеллинов Salmonella и Proteus позволило бы ответить на вопрос какие из частей молекул ответственны за связывание с полимером, а какие за образование внутрисубъединичных контактов в процессе косборочного сворачивания молекул флагеллина. Следует сказать, что на эти вопросы можно ответить и на основании опытов по сополимеризации флагеллинов мутантных штаммов одной бактерии, если проводить локализацию мутации и определять на какой из этапов (связывание или сворачивание) влияет эта замена.

2.5 Модель структуры филамента бактериального жгутика. Вторичная структура флагеллина была предсказана нами по методу Птицына и Финкельштейна (Ptitsyn & Finkelstein, 1983, Biopolymers, 22, 15). Использование метода Лима (Lim, 1974, J.W.B., 88, 857) дает практически совпадающие результаты. Основываясь на предсказаниях вторичной структуры флагеллина и принципах упаковки спиралей в глобулярных белках (Ефимов, 1977, Д.А.Н. С.С.С.Р., 235, 699; Ефимов, 1982, Молекулярная биология, 16, 271), мы построили модели третичной и четвертичной структур флагеллина E.coli.

Каждая а-спирапь в глобулярном белке должна иметь по крайней мере один гидрофобный остаток на виток и боковые цепи этих остатков должны образовывать протяженный гидрофобный кластер на поверхности спирали (Petrutz, Kendrew, Watson, 1965, J.M.B., 13, 669). Стереохимический анализ предсказывает четыре а-спирали на N-конце молекулы, которые могут быть упакованы в 4-а-спиральный пучок, как, например, в цитохроме-Ьс^ или белке

ВТМ. Две спирали на С-конце - хорошие партнеры для образования а-а-спиральной шпильки. Следует ожидать, что N- и С-концевые участки образуют совместно шести-а-спиральный блок.

Вариабельная (центральная) часть флагеллина Е. coli, согласно предсказаниям, должна содержать ß-структурные участки. Как правило, ß-структурные домены в глобурярных белках образуются 100-130 остатками и состоят из 7-9 ß-слоев. Принимая во внимание число предсказанных ß-слоев и их размеры, мы полагаем, что центральная часть молекулы флагеллина этого штамма может быть образована двумя ß-структурными доменами приблизительно одного размера.

Общая модель третичной структуры флагеллина представлена на рис. 12. Бросается в глаза ее подобие структуре белка оболочки ВТМ (Bloomer,Champness, Bricone, Staden & Klug,

Рис. 12. Модель третичной структуры флагеплина E.coli.

1978, Nature, 276, 362). Белок ВТМ, как и флагеллин, имеет две достатотно независимые части, одна из которых образована а-спиралями, упакованными в пучок. У белка оболочки ВТМ за полимеризацию отвечает 4-а-спирапьный домен. Мы полагаем, что молекула флагеллина упакована в четвертичную структуру

N - концевая часть

С-концевая часть а-а-шпилька

подобным же способом. Модель упаковки флагеллина в "однозаходовую спираль" жгутика приведена на рис 13.

Рис.13. Модель упаковки молекул флагеллина в однозаходовую спираль филзмента.

Сворачивание полипептидной цепи флагеллина происходит таким образом, что из концевых частей полипептидной цепи А и С (Рис. 11) формируется блок АС, при этом спирали могут упаковываться слегка различающимся способом, чтобы образовались либо Ц либо И-формы флагеллина. Флагеллины некоторых мутантных штаммов с прямыми жгутиками способны принимать только одну из двух возможных форм. Обозначим такой блок (АС)|_, если молекула флагеллина находится в I конформации и (АС)р, если в В. Центральная часть полипептидной цепи флагеллина образует поверхностный блок филамента. Он вариабелен и может иметь длину от нескольких до четырехсот остатков. Назовем его блоком Ь, если размер центральной части цепи невелик, и В, если - эта часть достаточно протяженная. Принимая во внимание способность различных флагеллинов сополимеризоваться, из флагеллинов содержащих упомянутые блоки могут быть собраны различные надмолекулярные структуры (Рис. 14). Ясно, что филаменты, содержащие "блок Ь будут тоньше тех, которые содержат блок В. Примеры 1 и 2 на рис. 14 показывают филаменты, у которых имеются продольные ряды как в I, так и в И-форме. Их флагеллины различаются только величиной

О 25А

65А

120А

3

1 2 3 4 5 6

(дав (АС)Ь дс^в (ДС\Ь (ЮрВ (ДС)рЬ

1) I®

* * - - - -

7 8 9 10 11 12

(АСДВ (АС)„В (АС)[_Ь (ДС)„Ь (АС)д В (АС)|_Ь 3+4 от 5+6 1 +2 7 + 8

- - - - * -

Рис 14 Возможные надмолекулярные структуры. Звездочкой обозначены структуры. способные изменять свою форму под влиянием внешних условий.

поверхностного блока. Примеры 3-6 показывают прямые филаменты, составленные из мутантных флагеллинов либо Ц либо Я формы. Наклон рядов субъединиц к оси филамента будет лево-и правоспиральным, соответственно. Присутствие блоков <АС)1 или (АС) а препятствует возможности информационных перестроек в филаменте. Филаменты 7 и 8 образованы рядами субъединиц как в I, так и в Р-форме, но они построены из мутантных молекул и потому не могут изменять свою форму. Пример 9 представляет филамент, построенный из мутантного флагеллина с (АС) блоком в Ьформе и малым поверхностным доменом в нескольких рядах и флагеллина с (АС) блоком в Н-форме и большим поверхностным доменом в остальных транспорт молекулы по каналу жгутика.рядах. Надмолекулярные структуры 10-12 могут быть собраны путем прерывистой полимеризации флагеллинов, уже описанных в таблице.

Таким образом можно конструировать искусственные надмолекулярные структуры, используя (АС) блок флагеллина как универсальную единицу для полимеризации. Блок В/Ь, формирующий наружную поверхность надмолекулярной структуры, путем делеций и соответствующих вставок может в известных пределах изменяться.

Филамент бактериального жгутика относится к самособирающимся надмолекулярным структурам. В структурной биологии считают, что сборке сложных надмолекулярных комплексов предшествует несколько предсборочных процессов, т.к. только в этом случае сборка может эффективно контролироваться. Сборка филамента жгутика удовлетворяет этому условию. Первоначальное сворачивание флагеллина, очевидно, происходит при его синтезе на рибосоме, затем флагеллин должен быть транспортирован из цитоплазмы на дистальный конец формирующегося филамента. Эти процессы совершенно не изучены, однако известно, что перед завершающим этапом формирования структуры - косборочным сворачиванием - структура такова, что предотвращает нежелательную полимеризацию флагеллина внутри клетки и облегчает транспорт молекулы по каналу жгутика. Логично предположить, что и косборочное сворачивание является типичным процессом в сборках надмолекулярных структур. Ярким тому подтверждением является кристаллографическое исследование такого явления, происходящего при самосборке вируса табачной мозаики (Caspar, Namba, 1990, Adv. Biophys. 26, 157).

3. Сравнение структурной организации филаментов бактерий и архей.

3.1. Археи и аппарат их подвижности. В 1977 году Карл Вуз обнаружил резкие отличия в составе и нуклеотидных последовательностях 16S рРНК меганогенных и обычных бактерий и предложил разделить бактерии на две группы: эубактерии и архебактерии. Вместе сэукариотами они составили три первичных царства живых организмов (Woese, Fox, 1977, P.N.A.S., 74, 5088). Полагая в дальнейшем, что молекулярные структуры более точно отражают эволюционные отношения организмов, чем классическое фенотипическое сравнение, Вуз предложил все живое на земле разбить на три домена: archaea, bacteria и eucarya. Внутри каждого домена возможны разделения на царства, такие, например, как растения и животные у eucarya. Археи Вуз разделил на

euryarchaeota и crenarchaeota. (Woese, Kandier, Wheelis, 1990, P.N.A.S., 87, 4576). И хотя вопросы систематики микроорганизмов продолжают оставаться темой оживленной дискуссии, неоспоримым является факт фундаментальных отличий между бактериями и археями. Перечисление этих различий не является предметом нашего обсуждения. Более важным для нас является то, что среди признаков, роднящих бактерии и археи, одним из главных считался принцип строения жгутиков. Мы решили сравнить строение филаментов жгутиков бактерий и архей, полагая, что такое сравнение позволит определить какие из принципов строения филамента бактериальных жгутиков наиболее фундаментальны.

Литературные данные об аппарате подвижности архей немногочисленны и довольно разрознены. Жгутики архей представляют собой нитевидные структуры, свернутые в спираль, и при электронно-микроскопическом рассмотрении выглядят подобно бактериальным (Рис. 15). Диаметр филаментов архей

Рис. 15. Электронно-микроскопическая фотография жгутиков Methanococus thermoHthotrophicus. Негативное контрастирование уранилацетатом. Масштабная линейка соответствует 150 пт.

составляет 10 - 13 nm, что приблизительно в два раза меньше диаметра жгутиков бактерий (Gerl & Sumper, 1988, J.B.C. 263, 13 246; Jarel & Koval, 1989, Crit. Rev. Microbiol., 17, 53). В основе движения архей лежит вращение жгутика, однако, явления,

подобного тамблингу бактерий, у архей не обнаружено (Alam & Oesterhelt, 1984, J.M.B., 194, 495). В настоящее время окончательно не установлено существуют ли у жгутиков архей крюк и базапьное тело или их роль выполняют какие-то другие надмолекулярные образования. Так, никаких особых структур на концах жгутиков Halobacteriuro halobium зафиксировать не удалось (Alam & Oesterhelt, 1984, J.M.B., 194, 495). У жгутиков же Methanospirilium hungatei и Methanococcus thermolithotrophicus, как будто бы, наблюдаются крюк и базальное тело (Gruden, Sparling, Markovetz, 1989, Appi. Envir. Microbiol., 55, 1414). У жгутиков Methanococcus voltae имеются утолщения на концах, детализировать которые пока не удалось (Kalmokoff, Jarrell, Koval, 1988, J. Bacteriol.,170, 1752).

В настоящее время, изучен субъединичный состав филаментов нескольких архей. Необходимо заметить, что определение субъединичного состава филаментов жгутиков архей представляет собой достаточно сложную задачу. Поскольку архей живут в экстремальных условиях по температуре, концентрации соли или величине pH. их филаменты защищены от диссоциирующих воздействий специальными молекулярными механизмами. Это затрудняет изучение субъединичного состава. Так, в упомянутой выше работе Алам и Остерхельт впервые показали, что субъединицы филамента Н. halobium при электрофорезе дают три "мажорных" полосы - 23 500, 26 500 и 31 500, каждая из которых выглядит в виде "лестницы". Авторы объяснили наличие этого эффекта посттрансляционными модификациями, поскольку было известно, что флагеллины Н. halobium могут быть в разной степени гликозилированы. Генноинженерное исследование (Gerl & Sumper, 1988, J.В.С., 263, 13246) показало, что в образовании филамента этого штамма Н. halobium участвует пять субъединиц. Их молекулярные веса, определенные на основе нуклеотидного состава их генов, равны 20 401, 20 437, 20 605, 20 569 и 20 663. Попытка устранить несоответствие истинных и определенных по электрофоретической подвижности молекулярных весов дегликозилированием флагеллинов не увенчалась успехом, хотя и приводила к изменению электрофоретически регистрируемых молекулярных весов до 19 000, 24 ООО и 29 000.

Джаррелл с соавторами изучили субъединичный состав одной из групп архей - метаногенов и пришли к выводу, что филаменты их жгутиков имеют мультикомпонентный состав (Southam, Kalmokoff, Jarrell, 1990, J. Bacteriol., 172, 3221; Kalmokoff,

Karnauchow, Jarrell, 1992, Arch. Microbiol., 157, 481). Так, согласно электрофорезу в денатурирующих условиях по две субъединицы содержат Methanococcus voltae, Methanococcus jannaschii, Methanococcus deltae, Methanospirillum hungatei и Methanoculleus marisnigri. Для филаментов Methanothermus fervidus зарегистрировано три субъединицы Авторы утверждают, что филаменты Methanococcus vanniellii и Methanococcus maripaludis состоят из четырех или более субъединиц.

Существенно расширила наши знания о жгутиках архей работа Капмокоффа и Джаррелла, в которой приведены результаты секвенирования генов флагеллинов М. voltae (Kalmokoff & Jarrell, 1991, J. Bacterid.,173, 7113). Оказалось, что таких генов четыре и молекулярные веса, соответствующих им белков, также отличаются от определенных ранее по электрофоретической подвижности. Было показано, что кодируемые этими генами полипептидные цепи содержат сигнальные пептиды. Обнаружилась также высокая степень гомологичности N-концевых участков цепи. Так, первые 69 остатков всех флагеллинов М. voltae совпадают между собой, эти же участки обладают наибольшей степенью гомологии при сравнении первичных структур Н. halobium и М. voltae. Гомология с бактериальными флагеллинами не наблюдалась.

Имеющиеся данные говорят о мультикомпонентности субъединичного состава филаментов жгутиков исследованных архей. Является ли это отличие от бактерий, наблюдаемое для метаногенов, типичным для всех архей? Как уже говорилось, электрофоретическое определение молекулярных весов флагеллинов галофильных архей может привести к неверным результатам. Причинами, приводящими к этому, могут быть повышенная устойчивость к денатурирующим воздействиям или склонность субъединиц к ассоциации. Не претендуя на точное знание молекулярных весов и субъединичного состава, мы провели исследования с целью определения наличия мультикомпонентности филаментов жгутиков, у представителей других групп подвижных архей. Полученные результаты вместе с литературными данными приведены в таблице 3.

Филогенетическое древо архей приведено на рис. 16. Курсивом и жирным шрифтом выделены роды, для которых изучен субъединичный состав жгутиков некоторых архей. Можно сделать вывод, что мультикомпонентность субъединичного состава является, по крайней мере, распространенным свойством филаментов архей.

Таблица 3.

Субъединичный состав филаментов жгутиков архей

Архея Количество субъединиц Молекулярные веса Источник флагеллинов по данным SDS-фореза данных

Halobacterium 3 31500, 26500 Alam and

halobiuni 23500 Oesterhelt 1987

Methanospirillum 2 25000, 24000 Southam

hurigatei et al. 1990

Methanococcus Kahnokoif

voltae 2 ЗЗООО, 31000 et. al. 1988 - 1992

jaunaschii 2 32000, 27000 #

marisnigri 2 31000, 25500 #

fervidus 3 34000, 25000, 24000 #

vaonieiii 3 или 4 33000 - 27500 #

Halobacterium 4 31 ООО, 28 000 Данные нашей

salinariuni 25 ООО, 23 000 группы

Natronobacterium 4 105 000, 60 000 #

magadii 59 000, 45 000

Natronobacterium 4 88 000, 86 000 tt

pharaonis 84 000, 80 000

Methanococcus 3 62 000, 44 ООО #

thermolithotrophicus 26 ООО

Thermococcus 2 29 ООО, 27 ООО tt

Stetten

Ругососсш 2

furiosuä

32 500, 32 ООО

#

Halococcus

Рис. 16. Филогенетическое древо архей (согласно VJoese, Kandier, Wheehs, 1990, P.N.A.S., 87, 4576; и Stetter, 1993, in Frontiers of Life, Edition Frontiers, 195).

Род, для которого субъединтный состав филаментов жгутиков некоторых архей известен по литературным данным, выделен курсивом.

Род, для которого субъединичный состав филаментов жгутиков некоторых архей определен в данной работе, выделен жирным шрифтом.

3.2 Структура филаиентов гапофипьных аркей.

Функциональное назначение жгутиков архей такое же, как и жгутиков бактерий. Филаменты жгутиков этих организмов морфологически подобны, но в то же время наблюдаются различия, которые могут говорить о принципиально ином строении жгутиков архей. К таким отличиям следует отнести мультикомпонентность субъединичного состава, отсутствие явления тамблинга, вдвое меньший диаметр филамента. Для более детального сравнения строения жгутиков бактерий и архей целесообразно рассмотреть организмы, которые по другим фенотипичесеим признакам наиболее близки. Таковыми являются галофильные архей, которые ранее относили к грам-отрицательным бактериям (Larsen, 1984, in Bergey's manual of systematic bateriology, p. 261) и которые даже по данным филогенетического анализа, основанного на сравнении последовательностей рибосомных РНК, близки к E.coli (Gouy & Li, 1989, Nature, 339, 145).

Мы исследовали Н. halobium R|М] (штамм любезно предоставлен доктором С. Бибиковым), Natronobacterium magadii DSM-3394 и Natronobacterium pharaonis DSM-2160 (получены из германской коллекции микроорганизмов в Геттингене). Н. halobium R^Mi был отобран как штамм, для которого была известна первичная структура флагеллинов, составляющих филамент. Две другие архей были выбраны как близкородственные между собой, эволюционно близкие с Н. halobium (см. рис. 16), но в то же время значительно отличающиеся друг от друга по молекулярным весам субъединиц филамента (см. таб. 3). Ставилась задача определить, какие свойства филаментов являются общими для этих архей и как эти свойства соотносятся с описанными ранее для бактерий.

Известно, что филаменты Н. halobium собираются из пяти субъединиц с молекулярными весами 20 401, 20 437, 20 605, 20 569 и 20 663 и все эти субъединицы гликозилированы (Gerl & Sumper, 1988, J.B.C., 263, 13246). Натронобактериальные жгутики включают в себя по четыре флагеллина: 105 000, 60 000, 59 000, 45 000 у N. magadii и 88 000, 86 000, 84 000, 80 000 у N. pharaonis (таб. 3). По крайней мере некоторые из натроно-бактериальных флагеллинов гликозилированы, о чем говорит их окрашивание реагентом Шиффа. Как и флагеллины Н. halobium субъединицы натронобактермй склонны к димеризации. Об этом свидетельствуют дополнительные высокомолекулярные полосы, наблюдаемые на электрофореграмме при концентрации

ДДС-Ыа 0,1%, которые исчезают при увеличении концентрации ДДС-№ до 0.5% и вновь появляются при повторном электрофорезе индивидуальных флагеллинов в 0.1% ДДС-Иа. Рис. 17 иллюстрирует эти данные для М.тадасШ.

105 000

60 00053 ООО" 45 ООО''

Рис. 17. Электрофореграмма жгутиков , N. тададп. 1-0,5% ДДС-Ыа; 2-0,1% ДДС-Ыа.

I 2

Электронно-микроскопическое исследование показало, что диаметр жгутиков N. рИагаотэ составляет 12.3±0.3 нм, а жгутиков N. тадас!м 10.0+0.3 нм (Рис. 18), т.е. они, как и жгутики Н. Ьа1оЫит, для которых диаметр был измерен ранее, тоньше бактериальных приблизительно в два раза.

г

%

4 - > Ч*'

н '.ч (

Ь *

РисГ 18. Электронно-микроскопические фотографии жгутиков N. рЬагаопя (а) и N. тадасй (б) посла очистки в градиенте СэС1. Негативное контрастирование 2% уранилацетатом. Масштабная линейка - 50 пт.

Таким образом, по целому ряду свойств - диаметру филамента, субъединичному составу, наличию

посттрансляционного гликозилирования, склонности субъединиц к ассоциации - филаменты архей отличаются от филамент бактерий.

Антигенные свойства флагеллинов исследовались методом Ухгерлони (Ouchterlony, 1967, In Handbook of experimental immunology, Oxford, Blackwell Sci. Pabl., p. 425). Использовались кроличьи антисыворотки, полученные против жгутиков каждой из бактерий в отдельности. Оказалось, что антитела против флагеллинов одной из архей не взаимодействуют с флагеллинами других архей, а каждый из флагеллинов определенной археи взаимодействует с антителами против жгутиков этой археи. Главный вывод, который можно сделать из этих опытов, состоит в том, что жгутики архей, по-видимому, тоже могут быть отнесены к поверхностным антигенам этих микроорганизмов, т.к. перекрестная реакция не наблюдается даже в случае близкородственных N. magadii и N. pharaonis. .

Диссоциация жгутиков галофильных архей происходит иначе, чем жгутиков бактерий. Если бактериальные жгутики диссоциируют на составляющие их субъединицы при довольно незначительном изменении условий среды вблизи оптимума условий обитания и субъединицы сохраняются в нативной форме, то разрушить четвертичную структуру архей можно только денатурирующим воздействием крайней степени, при этом даже в 8М мочевине флагеллины образуют агрегаты. Эффективным диссоциирующим агентом оказался неполярный детергент тритон Х-100, что указывает на важность гидрофобных взаимодействий в поддержании четвертичной структуры филаментов архей. Наиболее мягкое диссоциирующее воздействие на галофильные археи оказывает понижение концентрации NaCI. Постепенное понижение концентрации NaCI приводит к структурным изменениям филамента, которые могут наблюдаться электронно-микроскопически. Наиболее отчетливо такие изменения регистрируются у филаментов N. magadii, В диапазоне концентраций NaCI от 25 до 10% морфология жгутиков остается без видимых изменений. При дальнейшем понижении концентрации NaCI наблюдается "разбухание" филамента (Рис. 19, А), а затем образование протофиламентов (Рис. 19, В). Одновременно идет процесс образования шарообразных агрегатов. При понижении концентрации NaCI ниже 5% протофиламенты распадаются.

У бактериальных флагеллинов за образование межсубъединичных контактов в филаменте отвечают оба концевых участка полипептидной цепи. Мы показали, что у филамента N. magadii, при проведении ограниченного трипсинолиза в 5% NaCI возможно отщепление концевого участка цепи, не

приводящее к распаду полимера. На основе этого логично предположить, что археи в этом качестве тоже отличаются от бактерий.Нами было показано, что характерным признаком структурной организации бактериальных филаментов яляется наличие двух достаточно независимых частей флагеллина. Одна из них консервативна и образует внутреннюю структуру филамента, отвечающую за полимеризационные свойства, другая вариабельна

Рис. 19. Электронно-микроскопические фотографии филаментов жгутиков N.magadii, диссоциированных уменьшением концентрации NaC! до 5%. А - "разбухшие" филаменты. В - протофиламенты. Стрелки указывают на шарообразные агрегаты. Негативное контрастирование 2% уранилацетатом, масштабная линейка - 50nm.

и формирует поверхностный домен. Как с этой точки зрения устроены филаменты архей? Филаменты жгутиков Hhalobium, N. magadii и N. pharaonis были исследованы микрокалориметрическим методом. Кривые их плавления прведены на рис. 20. Кривая плавления Н. halobium характеризуется одним симметричным пиком теплопоглощения. По мере увеличения молекулярных весов у белков, составляющих филаменты, кривые плавления носят более сложный характер. Можно отметить следующие общие для всех филаментов свойства: процессы плавления имеют необратимый характер; понижение

концентрации ЫаС1 приводит к низкотемпературному сдвигу всех наблюдаемых пиков теплопоглощения; тепловая денатурация не приводит к распаду филаментов. Воздействие трипсином на предварительно прогретые жгутики приводит к расщеплению денатурировавших поверхностных доменов филамента. Сохранившиеся полимеры и отщепленные участки флагеллинов

Рис. 20. Кривые плавления филаментов Н. halobium (верхняя кривая) (10% NaCI, Trís-HCí, рН 8.0). N. magadii (средняя кривая) и W. pharaonis (нижняя кривая) (20% NaC!, Tris- HCI, рН 9.0).

могут быть разделены центрифугированием. На рис. 21 представлен этот результат для филаментов жгутиков N. pharaonis.

Филаменты с отщепленными поверхностными частями склонны к агрегации боковыми поверхностями. Поскольку эти филаменты легко диссоциируют на составляющие их пептиды при добавлении тритона X-1D0 и достаточно устойчивы к другим

60

80

100

Температура,°С

Рис 21. Результат воздействия трипсина на филаменты жгутиков N. рЬагаотв после предварительного прогрева филаментов до 100®С (А) Осадок (В) и супернатант (С), полученные высокоскоростным центрифугированием раствора, электрофорез которого представлен в слоте (А).

диссоциирующим агентам, мы полагаем, что их полимерная структура удерживается гирофобнымн взаимодействиями. Важно отметить, что при калориметрическом исследовании этих филаментов не наблюдается каких-либо пиков теплопоглошения. Это означает, что распад этой полимерной структуры не носит кооперативного характера.

Итак, у всех трех архей существуют поверхностные домены, количество и размеры которых различны. В этом свойстве архей можно увидеть аналогию с бактериальными жгутиками. Если продолжать поиск аналогии с бактериями, то следовало бы ожидать, что части, остающиеся после отщепления денатурировавших поверхностных доменов и удерживаемые в полимерном состоянии гидрофобными взаимодействиями, должны иметь у разных архей сходство. Такого сходства, однако, не наблюдается. Достаточно сказать, что молекулярные веса удерживаемых гидрофобными взаимодействиями фрагментов флагеллинов N. рЬагаотв больше, чем молекулярные веса целых флагеллинов Н. Иа1оЫит. И хотя при более детальном изучении сходство между частями, отвечающими за межсубъединичные контакты, возможно будет найдено, очевидно, что надмолекулярная структура филаментов архей имеет более сложную организацию, чем филаментов бактерий.

В таблице 4 сведены основные свойства филаментов жгутиков бактерий и архей.

Из всех приведенных свойств лишь одно безоговорочно верно и для бактерий, и для архей: спиральная форма филамента. По-видимому, оно отражает совершенство этой формы для перемещения клетки. Ведь не случайно, что одноклеточные с жгутиковой формой подвижности являются чемпионами по

I 5>;> г I

Таблица 4.

Свойства филаментов жгутиков бактерий архей

Спиралевидная форма

Однокомпонентность субъединичного -состава

Диаметр - 20 пт

Лабильная четвертичная структура

Флагеллин не содержит сигнальные последовательности

Легко диссоциируют и реконструируются

Спиралевидная форма

Многокомпонентность субьединичного состава

Диаметр - 10 пт

Стабильная четвертичная структура

Флагеллины содержат сигнальные последовательности

Сохраняют полимерную структуру даже после денатурирующего воздействия

относительной к своим размерам скорости перемещения в жидкой среде - за одну секунду они способны покрыть растояние порядка 30 длин своего тела.

Однако, остальные свойства различаются и некоторые из этих различий носят принципиальный характер. Так, например, меньшая толщина филамента и большие молекулярные веса, встречающиеся у флагеллинов архей, делают невозможным транспорт флагеллина по аналу внутри филамента, как это происходит у бактерий. Об ином способе переноса флагеллинов через бактериальную стенку говорит и наличие у предшественников флагеллинов архей сигнальных последовательностей. Наблюдаемые различия столь значительны, что подвергают сомнению существование общего предка, из аппарата подвижности которого могли эволюционировать жгутики бактерий и архей. Подтвердить или опровергнуть существование этого предка смогут дальнейшие исследования строения филаментов и других надмолекулярных структур бактерий и архей. В любом случае мы вправе сделать вывод о неверности

утверждения, что жгутики бактерий и архей аналогичны по своему устройству и потому являются признаком, объединяющим эти две группы микроорганизмов.

4. Выводы.

1. Установлено, что флагеллины - субъединицы филаментов жгутиков энтеробактерий - имеют ярковыраженную доменную организацию, которая одинакова у всех штаммов и даже видов бактерий, несмотря на наблюдаемые различия филаментов.

2. Показано, что один из доменов флагеллина формирует поверхность филамента. Он образован центральной частью полипептидной цепи, которая вариабельна и может различаться от штамма к штамму как по длине, так и по аминокислотной последовательности.

3. Показано, что этот поверхностный домен флагеллинов ответственен за различия филаментов бактериальных жгутиков в диаметре, антигенной специфичности, молекулярном весе, образующих филамент субъединиц.

4. Установлено, что за полимеризационные свойства флагеллина отвечают косервативные участки полипептидной цепи, какими являются 160 аминокислотных остатков с N-конца и 90 остатков с С-конца.

5. Показано, что часть этих концевых участков, примыкающая к поверхностному домену, имеет жесткую спиральную структуру и у мономерной, и у полимерной форм флагеллина. Оставшиеся 66 остатков на N-конце и 43 остатка на С-конце приобретают регулярную структуру только в процессе встраивания в полимер. Это явление названо косборочным сворачиванием.

6. Показано, что именно явление косборочного сворачивания делает возможным сборку различных трубчатых структур, как прямых, так и спиральных, из субъединиц единственного типа.

7. Определена нуклеотидная последовательность гена флагеллина Е. coli В38. Анализ этой последовательности показал, что ген флагеллина имеет мозаичную структуру, когда при высокой консервативности концевых участков гена специальный механизм обеспечивает вариабельность его центральной части.

8. Предложены модель третичной структуры флагеллина и принцип упаковки субъединиц в филаменте.

9. Показана принципиальная возможность использования уникальных свойств флагеллина для конструирования искусственных надмолекулярных структур.

10. Сделан вывод о неверности прежнего утверждения о сходстве в строении жгутиков бактерий и архей, поскольку сравнение структурной организации их филаментов выявило ряд принципиальных отличий.

Список основных публикаций по теме диссертации:

1. Fedorov O.V., Khechinashvili N.N., Kamiya R. and Asakura S. (1984). Multidomain of flagellin. J. Mol. Biol. 175, 83-87.

2. Fedorov O.V. and Kostyukova A.S. (1984). Domain structure ot flagellin. FEBS Lett., 171, 145-148.

3. O.B. Федоров, A.C. Костюкова, (1984), Доменная структура флагеллина, Тезисы докладов 16 конференции Федерации Европейских биохимических обществ, Москва, стр. 335.

4. О.В. Федоров, А.С. Костюкова, (1987), Неструктурированная часть мономерного флагеллина не экспонирована на поверхности бактериального жгутика, Тезисы VII Всесоюзного симпозиума по химии белков и пептидоа, Таллин, стр. 126.

5. Kostyukova A.S., Pyatibratov М.G., Filimonov V.V. and Fedorov O.V. (1988). Flagellin parts acquiring a regular structure during polymerization are disposed on the molecule ends. FEBS Lett., 241, 141-144.

6. Fedorov O.V., Kostyukova A.S. and Pyatibratov M.G. (1988). Architectonics of a bacterial flagellin filament subunit. FEBS Lett., 241, 145-148.

7. Федоров O.B., Костюкова A.C., Пятибратов М.Г., Филимонов В.В., (1989). Общие структурные свойства флагеллинов разных штаммов Escherichia coli, Доклады АН СССР, 305, 746-748.

8. Fedorov O.V., Kostyukova A C. and Pyatibratov M.G., (1989), Co-asssembly folding of flagellin - a pathway of helical flagella filament building from a single type of subunit, Abst. of the Internat. Symp. "Molecular organization of biological structure", Moscow, 165.

9. Fedorov O.V. and Efimov A.V. (1990). Flagellin as an object for supramolecular engineering. Protein Engineering, 3,411-413.

10. Kostyukova A.S., Gongadze G.M., Obraztsova A.Y., Laurinavichus К.S. and Fedorov O.V. (1992). Protein composition of Methanococcus thermo-lithotrophicus flagella. Can. J. Microbiol., 38, 1162-1166.

11. Пятибратов M. Г., Костюкова А.С., Тарасов В.Ю., Федоров О.В., (1993), Морфология и субъединичный состав жгутиков галоалкалофильных архебактерий, Доклады АН, 330, 116.

12. О.V.Fedorov, M.G.Pyatibratov, A.S.Kostyukova, N.K.Osina and V.Yu.Tarasov, (1994), Protofilament as a Structural Element of Flagella of Haloaikalophilic Archaebacteria, Can. J. Microbiol., 40, 177187

13. Л.А. Железная, О.В. Федоров, А.Ф. Брик, Н.И. Матвиенко, (1994), Нуклеотидная последовательность гена флагеллина Eschirichia coli В38, Биохимия (в печати).

14. Tarasov V.Yu., Kostyukova А.С., Tiktopulo E.I., Pyatibratov M.G., Fedorov O.V., (1994) Unfolding of tertiary structure of Halobacterium halobium flagellins does not result in flagella destruction. J. Protein Chem. (in press)

Материалы диссертации были доложены на научных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1985, 1988, 1989, 1992 и 1993 г.г.), 16 конференции Федерации европейских биохимических обществ (Москва, 1984), VII Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Таллин, 1987), V Всесоюзном совещании по немышечным формам подвижности (Чернигов, 1988), Мехдународном симпозиуме " Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), XIII школе Эдмонда Рошильда " Хемотаксис клеток и одноклеточных организмов" (Иерусалим, 1991), Международной конференции "Термофилы: наука и технология" (Рейкьявик, 1992).