Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение молекулярной организации жгутиков Haloarcula marismortui

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение молекулярной организации жгутиков Haloarcula marismortui"

На правах рукописи

005554483

Сюткин Алексей Сергеевич

ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ЖГУТИКОВ НАЮАЯСиЬА МАШМОЯТи!

03.01.03 — молекулярная биология

Автореферат 6 НОЯ 2014

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2014 г.

005554483

Работа выполнена в группе надмолекулярных белковых структур Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт белка Российской академии наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Кандидат биологических наук

Пятибратов Михаил Геннадьевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Левицкий Дмитрий Иванович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук, лаборатория структурной биохимии белка, заведующий;

Долгих Дмитрий Александрович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии паук, лаборатория инженерии белка, заведующий.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук.

Защита состоится « дз » декабря 2014 г. в часов на заседании совета Д 501.001.76 по

защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук на базе Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, дом 1, стр. 12, биологический факультет, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций) и на сайте \v\vw.hio.msu.ru.

Автореферат диссертации разослан « ^ » октября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И. А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Одним из наиболее заметных открытий биологии XX века стало выделение Архей, наряду с Эукариотами и Бактериями, в качестве одного из трех доменов живой природы. В отдельную ветвь жизни они были отнесены Карлом Вузом в 1977 году на основании анализа 16S рРНК. Многие представители данной группы организмов являются экстремофилами, то есть занимают экологические ниши с экстремальными значениями температур (термофилы), рН (ацидофилы и алкалофилы), соленостей (галофилы) и т.д. К настоящему времени они так же обнаружены в почве, океанах и пищеварительной системе животных, в том числе и человека. Исследование их биологии показало, что они обладают как чертами схожими с бактериями и эукариотами, так и свойствами, характерными только для данной группы организмов. Одной из уникальных систем архей является аппарат жгутиковой подвижности, внеклеточная часть которого схожа с филаментом бактериального жгутика, и представляет собой протяженную спиральную нить. В ходе исследований, однако, было показано, что, несмотря на внешнее сходство, данные структуры принципиально отличаются по архитектуре, механизму сборки и происхождению, при э'гом архейные жгутики имеют ряд общих свойств с бактериальной системой пилей IV-ro типа. В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что жгутики архей являются уникальной системой биологической подвижности, и в недавней работе было предложено называть жгутики Архей не жгутиками (flagella), а археллами (archaella) (Jarell and Albers, 2012). В связи с этим возникает вопрос, каким образом настолько различные органеллы как бактериальные и архейные жгутики формируют схожую надмолекулярную структуру?

Механизм спирализации жгутиков был детально изучен на энтеробактериях, спиральный филамент которых строится из субъединиц единственного белка - флагеллина. Данный белок может принимать две конформации, названные L- и R-конформациями. При этом каждый продольный ряд протофиламентов состоит из флагеллина, находящегося в одной из этих конформаций. Так как длины протофиламентов, состоящих из флагеллина в L-и R-конформациях, несколько отличаются, при их взаимодействии в составе филамента возникают силы скручивания, приводящие к спирализации нити жгутика.

В настоящее время жгутик архей, в сравнении с бактериальным аналогом, является малоизученной структурой как в плане строения, так и в плане функционирования. Одной из любопытных черт архей является гораздо большая, чем у бактерий, распространенность множественности генов структурного белка нити жгутика - флагеллина. Как уже было отмечено выше, жгутики архей и бактерий сильно отличаются друг от друга, вследствие

2

этого можно предположить, что множественность флагеллиновых генов архей связана с принципиально иным механизмом спирализации нити жгутика.

Степень разработанности темы. Для выяснения роли различных флагеллиновых генов у архей были проведены эксперименты по их инактивации на ограниченном круге организмов. Результаты экспериментов по инактивации флагеллиновых генов МеЛапососсиз тапрЫисНэ показали необходимость продукта каждого гена для нормальной клеточной подвижности. В нашей группе на галофильном археоне НЫоЬаМепит ¡аИпагит, имеющем шесть генов флагеллинов, было показано, что для построения спирального и протяженного филамента жгутика данному организму достаточно двух флагеллинов - Р1§А1 и Р1§А2, гены которых располагаются в одном опероне. При этом инактивация каждого из двух генов приводила к тому, что Я. хаИпагит продуцировал только прямые жгутики. Полученные результаты позволили выдвинуть предположение, что у данного организма два разных флагеллина могут быть аналогами двух конформационных состояний единственного флагеллина энтеробактерий. Так как множественность флагеллиновых генов широко распространена среди архей, было высказано предположение, что данный принцип формирования спирального филамента может быть универсален для архей. Однако с ростом числа архей с известными геномными последовательностями стало ясно, что даже представители галофилофильных архей могут сильно отличаться друг от друга по количеству, взаимному расположению и размеру флагеллиновых генов, что ставит вопрос об универсальности принципа, обнаруженного для Я. .чаИпагит.

Цели и задачи. Целью данной работы стала проверка универсальности открытого на Я. хаИпагит принципа, согласно которому для построения спирального филамента жгугика галофильных архей необходимо как минимум два флагеллина. В качестве объекта исследования был выбран галофильный археон На1оагси1а таштогШ. Данный организм интересен по нескольким причинам: 1) в геноме присутствует два гена флагеллина, при этом каждый расположен на отдельном репликоне, что не характерно для архей; 2) гены флагеллинов примерно в два раза превышают по размеру гены флагеллинов большинства архей. Данные факты позволяют ожидать, что аппарат жгутиковой подвижности Я. тапьтогШ будет обладать необычными свойствами, изучение которых поможет лучше понять механизм спирализации жгутиков галофильных архей. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Показать наличие жгутиковой подвижности у клеток Я. таштоПШ.

2. Выделить нити жгутиков Я. тапхтоПш и изучить их морфологию и состав.

3. Исследовать свойства флагеллинов Н. тапзтогШ.

4. Установить роль каждого из флагеллинов в формировании аппарата жгутиковой подвижности Н. тап5тог1т.

Научная новизна. В данной работе впервые было показано наличие подвижности Н. таг!зтогПи. В ходе исследования мы обнаружили, что спиральный и функциональный жгутик данного организма может строиться только из одного типа субъединиц, и, таким образом, механизмы формирования спиральности жгутиков галофильных архей являются более разнообразными, чем считалось ранее. Наши исследования показали, что жгутики Я. тиагшиог/ш существенно толще жгутиков, ранее изученных архей, что, по-видимому, является результатом того, что они построены из более крупных флагеллинов, при этом сами флагеллины имеют необычный тип гликозилирования. Кроме того, мы впервые показали, что множественность флагеллиновых генов у архей может быть механизмом адаптации к меняющимся условиям окружающей среды.

Теоретическая и практическая значимость работы. Выяснение принципов формирования надмолекулярных структур является одной из важнейших задач современной биологии. Понимание взаимосвязи между свойствами индивидуальных субъединиц и формируемой ими надмолекулярной структуры позволит целенаправленно изменять свойства природных ансамблей субъединиц. Прокариотические жгутики рассматриваются в качестве одного из наиболее перспективных объектов для создания на их основе искусственных нановолокон, обладающих заданными свойствами. Архей в этом плане представляют особый интерес, так как данные организмы обитают в экстремальных условиях, и, как следствие, формируемые ими структуры обладают повышенной устойчивостью к диссоциирующим воздействиям.

Положения, выносимые на защиту.

1. Клетки Н. тапзтоЫш способны синтезировать два типа филаментов (жгутиков), отличающиеся белковым составом.

2. Спиральные филаменты жгутиков галофильных архей могут строиться только из одного типа субъединиц.

3. Субъедипицы флагеллина Р1аВ в составе филаментов не идентичны по доступности к воздействию трипсина и зарядовым характеристикам.

4. Флагеллины Н. marísmortui являются гликопротеинами с необычным типом гликозилирования.

5. Множественность генов флагеллинов Н. marísmortui является механизмом адаптации к меняющимся условиям окружающей среды.

Степень достоверности и апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на международных симпозиумах "Biological motility" (Пущино, Россия, 2008, 2010, 2012 и 2014); ежегодных институтских конференциях Института белка РАН (Пущино, Россия, 2007, 2012); на международных конференциях "Molecular biology of Archaea II" (Кембридж, Великобритания, 2010) и "Molecular biology of Archaea IV" (Париж, Франция, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них статей в рецензируемых научных изданиях - 3, материалов конференций - 9.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Результаты исследования и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список использованной литературы». Список литературы включает 10 отечественных и 137 зарубежных наименований. Работа содержит 33 рисунка и 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Молекулярная организация жгутиков Н. marísmortui

Идентификация двух штаммов Н. marísmortui. Геном галофильного археона Н. marísmortui имеет полный набор генов необходимых для синтеза и функционирования аппарата жгутиковой подвижности, в том числе два гена, кодирующих флагеллины, которые располагаются на разных репликонах - хромосоме (JlaB) и плазмиде (flaA2), что не характерно для других архей. Несмотря на это, первоначально данный организм был описан как не проявляющий явной подвижности.

Культура Н. marísmortui, полученная нами из Всероссийской коллекции микроорганизмов, была параллельно засеяна в среду HS (используемой нами для культивирования Н. salinarum) и среду Tu, использовавшуюся при культивировании Н. marísmortui. Следует отметить, что по содержанию питательных компонентов среда Tu

5

является более богатой, чем Н8. Клетки Н. тапзтогШг показывали неплохой рост в Ти-среде, но в среде НБ росли очень медленно и дорастали максимум до ООбоо=0,5 (в отличие от Ти-среды, где клетки, как правило, дорастали до (Юбоо=2,5). Культура, изначально росшая в НБ-среде, была затем перенесена в среду Ти, где ее рост существенно ускорился. После этого из обеих культур мы провели выделение жгутиков с помощью методики, использовавшейся ранее для других галофильных архей. Электронно-микроскопические исследования подтвердили присутствие жгутиков в обоих препаратах (рисунок 1).

А

Рисунок 1. Электронно-

микроскопические фотографии препаратов жгутиковых филаментов Н. тапвтоНш. А) филаменты, выделенные из культуры, росшей изначально на Ти-среде; Б) филаменты, выделенные из культуры, росшей изначально на Ш-среде. Масштабная линейка - 200 нм. Результаты получены совместно с Безносовым С.Н.

По результатам ДСН-электрофореза в 15% ПААГ препараты содержали единственный белок с молекулярной массой около 70 кДа. В ходе дальнейших экспериментов с использованием гелей с меньшей плотностью акриламида выяснилось, что полученные препараты отличаются по электрофоретической подвижности (на рисунке 2 приводится электрофореграмма для 7% ДСН-ПААГ).

Рисунок 2. Электрофореграмма препаратов жгутиков Н. таштоМш в ДСН - ПААГ (7%). Трек: 1) препарат жгутиков, выделенный из культуры, росшей изначально на Ти-среде; 2) препарат жгутиков, выделенный из культуры, росшей изначально на среде НБ. М - белковый маркер (кДа).

M 1

2

Масс-спектрометрия соответствующих белковых полос показала, что из культуры, засеянной непосредственно в Ти-среду, выделяются жгутики, состоящие из Р1аА2-флагеллина (белковая полоса а на рисунке 2), в то время как из культуры, росшей сначала в НЯ-среде выделялись жгутики, состоящие из ПаВ-флагеллина (белковая полоса б на рисунке 2). Надо отметить, что молекулярные массы Р1аА2- и р1аВ-флагеллинов, рассчитанные из их аминокислотных последовательностей, составляют 47,4 (45,9) и 46,8 (45,4) кДа соответственно (в скобках приведены массы для зрелых белков, без сигнального пептида). В то же время их электрофоретическая подвижность находится на уровне 70 кДа. Аномальная электрофоретическая подвижность флагеллинов галофильных архей отмечалась и ранее и вызвана тем, что данные белки имеют высокое содержание кислых аминокислот, а также, как правило, имеют постгрансляционные модификации, в частности гликозилирование. Таким образом, нами были получены два штамма Я. тягатол/ш, отличающиеся белковым составом жгутиков. Данные штаммы были условно названы нами как Р1аА2-штамм и Р1аВ-штамм. При их культивировании в Ти-среде они были стабильны и не переходили друг в друга.

Так как ген _/7аЛ2-флагеллина расположен на плазмиде рКвЮО, мы предположили, что возникновение Р1аВ-штамма может являться результатом утраты данной плазмиды. Используя две пары праймеров к двум различным и удаленным друг от друга участкам плазмиды рКвЮО, мы показали, что в клетках Р1аВ-штамма данная плазмида действительно отсутствует. Таким образом, выделенные нами Р1аА2- и Р1аВ-штаммы являются штаммом дикого типа и рКвЮО" штаммом, соответственно.

Несмотря на то, что Р1аВ-жгутики состояли из субъединиц единственного типа они (как и Р1аА2-жгутики) имели отчетливую спиральную форму (рисунок 1). Эти результаты позволили нам впервые продемонстрировать, что спиральный жгутик Эвриархей может строиться из единственного типа субъединиц. Данный факт особенно интересен тем, что ранее проведенные исследования филаментов ряда представителей царства Эвриархей показали, что для построения функционального спирального жгутика необходимо как минимум два флагеллина. Таким образом, несмотря на то что флагеллины у Эвриархей являются достаточно близкородственными белками, они могут использовать разные принципы формирования нити жгутика.

Кроме того, электронная микроскопия показала, что жгутики, состоящие из Р1аА2-флагеллина, имеют толщину 20-22 нм, а состоящие из Р1аВ 16-18 нм. Таким образом, жгутики Я. тагштоЯш заметно толще описанных ранее жгутиков архей (10-14 нм) (рисунок 3).

Рисунок 3. Электронно-микроскопическая фотография смеси филаментов жгутиков Я яаИпагит (1) и Р1аА2-филаментов Я. таг1$тог1ш (2). Масштабная линейка 200 нм. Результаты получены совместно с Безносовым С. Н.

Следующим шагом исследования жгутиков Я. шштог/ш стало выяснение вопроса о возможных отличиях в подвижности Р1аА2- и Р1аВ-штаммов. Как уже было сказано выше, изначально клетки Я. тапятоПш были описаны как в основном неподвижные. Для сравнения подвижности Р1аА2- и Р1аВ-штаммов мы воспользовались стандартным методом микробиологии - высевом на полужидкую агаризованную среду. Через несколько дней инкубации мы обнаружили, что оба штамма образовали пятна вокруг точек посева (рисунок 4), что говорит о том, что как Р1аА2- так и Р1аВ-штаммы являются подвижными. Интересно отметить, что размер пятна был существенно больше для культуры Р1аВ-штамма. Так как скорости роста клеток обоих штаммов в жидкой среде примерно одинаковы, можно сделать вывод, что при данных условиях клетки Р1аВ-штамма обладают более высоким уровнем подвижности.

Рисунок 4. Сравнение подвижностей р1аА2- и Р1аВ-штаммов Я. таггитоНш (0,3% агаризованная Ти-среда). Время инкубации - 5 дней (42 °С).

Анализ последовательностей флагеллинов Н. тагЫтоПш. Р1аА2 и Р1аВ флагеллины Я. тапятоПш гомологичны друг другу (идентичность 56%) и имеют два консервативных участка в области Ы- и С-концов. Центральная часть флагеллинов содержит несколько высоковариабельных участков содержащих инсерции и делении и, по-видимому, не принимает участия в формировании межсубъединичных контактов, а определяет поверхностные свойства филаментов.

Выравнивание аминокислотной последовательности Р1аА2-флагеллина относительно последовательностей флагеллинов Я. эаИпагит демонстрирует два высокогомологичных региона в областях 14- и С-концов. Из полученных данных можно сделать предположение, что сравнительно крупные флагеллины Я. тапятогШ являются продуктом дупликации и

Р1аВ

Р1аА2

последующего слияния, по крайней мере, двух меньших по размеру генов флагеллинов. Кроме того, мы полагаем, что именно более крупные флагеллины приводят к тому, что филаменты Н. тапятогШ превосходят по толщине филаменты ранее изученных архей.

Термодинамические свойства филаментов Н. таштоНии Гетерогенность флагеллина в составе филаментов. Для получения дополнительной информации о структуре филаментов, состоящих из Р1аА2- и Р1аВ-флагеллина, мы воспользовались методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии в нативных солевых условиях. На полученных кривых плавления мы наблюдали два пика теплопоглощения при температурах: 72 °С (пик 1), ВО °С (пик 2) для Р1аА2-жгутиков и 55 °С (пик 1), 84 °С (пик 2) для Р1аВ-жгутиков (рисунок 5). Как видно, Р1аВ-жгутики более чувствительны к повышению температуры, чем Р1аА2. Повторное прогревание как частично (пик 1), так и полностью (пик 2) денатурированных образцов жгутиков Я. тагаотог?ш показало полную необратимость процесса тепловой денатурации.

т, °с

Рисунок 5. Кривые плавления препаратов Р1аА2- и Р1аВ-жгутиков. Результаты получены совместно с Тиктопуло Е. И.

Дальнейшие исследования, проводившиеся с использованием ограниченного протеолиза, показали, что в нативных солевых условиях филаменты Я. тагктоПш устойчивы к воздействию трипсина. Как уже было сказано выше, по данным сканирующей микрокалориметрии филаменты Я. тапэтогМ имеют два пика теплопоглощения, соответствующих кооперативному плавлению белка в составе филаментов. Данное плавление является необратимым и сопровождается потерей филаментами устойчивости к атаке трипсином. При обработке трипсином образцов, прогретых до 90 °С расщеплению подвергается практически весь флагеллин с образованием ряда продуктов протеолиза

9

(рисунок 6А). Для частично денатурированных (завершение плавления первого пика теплопоглощения) р1аВ-филаментов наблюдается несколько иная картина: большая часть флагеллина (-80%) расщепляется за считанные минуты, в то время как некоторая часть остается нерасщепленной даже при больших временах инкубации (рисунок 6Б). Данный результат указывает на то, что в составе Р1аВ-филаментов присутствуют две формы флагеллина Р1аВ, имеющие различную доступность к атаке трипсином. Данные формы были условно обозначены нами как Р1аВ-г (устойчивая) и Р1аВ-э (чувствительная).

90°С 65°С

0 1 2 3 4 1 2 3 4

Время, мин

Рисунок 6. Временная зависимость трипсинолиза FlaB-филаментов Н. marismortui после прогрева до 90 °С и 65 °С: (А) - Электрофореграмма препаратов филаментов до трипсинолиза (0), через 15, 30, 180 и 1200 мин после начала трипсинолиза (1-4, соответственно). (Б) - Изменение относительного содержания интактного флагеллина в препаратах филаментов в ходе трипсинолиза.

Мы предполагаем, что данные формы могут выполнять роль Ь- и Л-конформаций бактериального флагеллина, которые обеспечивают формирование спирального филамента из молекул единственного белка. Мы решили проверить, являются ли Р1аВ-г и Р1аВ-э двумя различными посттрансляционными модификациями (например, гликоформами) или они, как в случае с бактериальным флагеллином, полностью идентичны, а различия между ними проявляются только в составе филамента. Сравнение электрофоретической подвижности не выявило каких-либо отличий между Р1аВ-г и Р1аВ-з, в то же время результаты анионообменной хроматографии показали, что в денатурирующих условиях Р1аВ-г и Р1аВ-з не идентичны. На рисунке 7 показаны профили элюции двух форм флагеллина Р1аВ (Р1аВ-г и Р1аВ-э) на анионообменной колонке топоС? в 10 мМ Трис-НС1 буфере (рН 9), содержащем 1% Тритон Х-100 и 8М мочевину. Необходимо отметить, что для полной диссоциации архейных филаментов необходимы такие агенты, как Тритон Х-100, препятствующие образованию гидрофобных контактов в белках. Как видно, профили элюции двух форм флагеллина Р1аВ не идентичны и имеют сложный характер: по-видимому, как Р1аВ-г, так и Р1аВ-э в отдельности не являются гомогенными и в свою очередь могут быть подразделены на несколько подформ.

ШС1, [М]

0,8

0,6

0,4

0,2

-ЯаС1, |М] --51аВ5 **•• ПаВк / / / / • ■ • • • > < ' • 4 ^ " V •• >« •« • • * • • * : а : 1\ Г * \ \

/

••

А,280 нм

— 0,002

— 0,001

120 125 130 135

Время элюции, мин

140

Рисунок 7. Профили элюции препаратов двух форм Р1аВ-флагеллина Н. тапятогШ, полученные при фракционировании на анионообменной колонке топор.

Гликозилирование флагеллинов Н. тапитоНш. Таким образом, нами было показано, что в составе филаментов Р1аВ-флагеллин Н. тапзтоПш присутствует в виде нескольких форм, отличающихся по зарядовым характеристикам. Мы предполагаем, что данные отличия являются результатом посттрансляционных модификаций флагеллинов. Флагеллины Архей как правило являются гликопротеинами с 1Ч-типом гликозилирования, однако Р1аА2- и Р1аВ-флагеллины Н. таг^ьтопш не содержат канонических сайтов для И-гликозилирования Ы-Х-8(Т). Для проверки факта гликозилирования данных белков мы использовали метод детекции гликопротеинов с помощью окрашивания реагентом Шиффа (рисунок В). В качестве отрицательного контроля использовался БСА (бычий сывороточный альбумин), а в качестве положительного - жгутики Н. заИпагит.

Рисунок В. Электофореграммы препаратов жгутиков Н. таг^зтоПш. Окрашивание реагентом Шиффа (А) и кумасси 11-250 (Б). Трек: 1) БСА; 2) жгутики Н. заИпагит\ 3) ПаА2; 4) Р1аВ.

Как видно из приведенных результатов, окраска реагентом Шиффа дала положительный результат для обоих флагеллинов Н. таггзтоПш. Однако, в отличие от флагеллинов Н. заИпагит окраска флагеллинов Н. таг1зтогПи была нестабильна. Для того чтобы убедиться, что флагеллины Н. таггвтогШ являются гликопротеинами, мы провели дополнительную проверку с использованием СНЫ-анализа, который показал существенное завышение измеренного соотношения САЫ (3,50±0,08 для обоих флагеллинов) в сравнении с теоретически рассчитанным из аминокислотной последовательности (3,2 для Р1аВ и 3,204 для Р1аА2). Таким образом, мы подтвердили тот факт, что флагеллины Н. таг/этаПи! являются гликопротеинами. При этом имеет место либо И-гликозилирование по неканоническому сайту, либо какой-то иной тип гликозилирования (например, О-

гликозилирование). В последнее время появились публикации о случаях нестандартного гликозилирования у эукариот, но для архей подобные случаи пока не описаны.

Роль избыточности по генам флагеллинов у Н. таттоПш. Как нами было показано, Р1аВ-флагеллин Н. тапзтогШ способен в одиночку формировать функциональный жгутик. Таким образом, оставалась неясной биологическая роль кодируемого плазмидой рЫйЮО Р1аА2-флагеллина. Так как флагеллины сильно отличаются по термостабильности, мы предположили, что избыточность по генам флагеллинов данного организма может быть механизмом адаптации к изменениям условий окружающей среды. Известно, что стабильность галофильных белков зависит от солености среды, поэтому для проверки нашего предположения мы проверили подвижность Р1аА2- и Р1аВ-штаммов на полужидкой агаризованной среде при различных значениях температуры и солености (рисунок 9). Данные эксперименты показали, что в условиях высокой температуры/низкой солености клетки Р1аВ-штамма теряют свою подвижность в отличие от клеток Р1аА2-штамма, однако при увеличении солености среды подвижность клеток Р1аВ-штамма восстанавливается и в условиях 30% солености и 40 °С становится даже выше, чем у клеток Р1аА2-штамма.

20%, 40 °С 25%, 40 °С 30%, 40 °С

25%. 50 °С 30%. 50 °С

Рисунок 9. Подвижность Р1аА2 и Р1аВ штаммов при различных значениях соленостей (%) и температур (°С). Пятна Р1аА2 штамма слева и справа, Р1аВ - сверху и снизу.

Мы предположили, что наблюдаемый эффект является результатом того, что в условиях высокой температуры/низко^ соли Р1аВ-флагеллин частично денатурирован и не

способен формировать функциональный жгутик. Для проверки данного предположения мы провели выделение жгутиков из культур Р1аА2- и ПаВ-штаммов, выросших при тех же самых условиях в жидкости (рисунок 10). Результат данного эксперимента показал, что клетки Р1аВ-штамма не синтезируют жгутиков в тех условиях, в которых они были неподвижны на полужидкой агаризованной среде. Неожиданным результатом оказалось то, что при 30% солености и 50 °С клетки Р1аВ-штамма не синтезировали жгутики в жидкости, хотя были подвижны на полужидкой агаризованной среде. Данный результат указывает на то, что синтез жгутиков при росте на полужидкой и жидкой средах регулируется по-разному.

FlaB FlaA2

Соленость (%) 20 20 25 25 30 30 25 25 30 30 Температура (°С) 40 40 40 40 40 40 50 50 50 50

Штамм (Fla) А2 В А2 В А2 В А2 В А2 В

Рисунок 10. Электрофореграмма жгутиков, выделенных из суспензии Р1аА2- и Р1аВ-штаммов, выросших при различных условиях.

Таким образом мы показали, что избыточность по генам флагеллинов Н. тапятогШ! выполняет адаптивную функцию. Мы связываем это с тем, что для Мертвого моря (откуда и был выделен археон Н. таггятогНи) характерна цикличность температур и соленостей, при этом в зимнее время над ним выпадают обильные дожди, что приводит к резкому снижению солености вблизи поверхности. В таких условиях клетки Р1аА2-штамма будут иметь селективные преимущества.

Как уже было сказано выше, множественность флагеллиновых генов широко распространена среди архей, однако до настоящего времени данную множественность связывали лишь с тем, что продукт каждого из генов необходим для формирования функционального жгутика. В данной работе мы впервые показываем, что множественность

флагеллиновых генов может быть одним из механизмов адаптации архей к меняющимся условиям окружающей среды.

Изучение свойств жгутиков На1огиЬгит Шсиярго/ипсИ. Изучение аппарата подвижности Я. тапэтогШ! позволило нам впервые продемонстрировать, что функциональный спиральный жгутик галофильных архей может строиться только из одного флагеллина. Данный результат позволил установить, что ранее обнаруженный принцип, когда для формирования спиральной нити необходимо как минимум два различных флагеллина не является универсальным у Эвриархей. Мы решили установить, является ли Я. таНхтогШ в этом плане уникальным организмом, или же и другие галофильные архей могут формировать функциональный жгутик из субъединиц единственного белка. В последнее время резко выросло число архей, у которых были секвенированы геномные последовательности, среди них есть и такие, геномы которых содержат единственный флагеллиновый ген. Один из таких организмов, а именно, На1огиЬгит 1асизрго/ипсИ, был выбран нами в качестве объекта изучения. Этот организм ранее считался неподвижным, но нам впервые удалось продемонстрировать, что несмотря на наличие единственного гена флагеллина данный организм формировал спиральные жгутики и был подвижен. При этом для жгутиков Я. 1асшрго/ипсИ наблюдалось явление полиморфизма, проявляющееся в различной амплитуде спиралей, а также наличии кольцевых форм (рисунок 11).

130 95 72

55 43

В1

Рисунок 11. Филаменты Я. 1асшрго/итИ: А) Электрофорез в ДСН-ПААГ: 1) белковые маркеры (кДа); 2) препарат филаментов (присутствует полоса флагеллина и его димера). Б) Электронно-микроскопические фотографии филаментов. Масштабная линейка 100 нм. Результаты получены совместно с Безносовым С. Н.

Использование анионообменной хроматографии позволило, как и в случае Я. тагктопш, выявить несколько форм флагеллина, отличающиеся по хроматографическим характеристикам (рисунок 12). Данный результат служит дополнительным доказательством того факта, что спиральный жгутик галофильных архей может строиться только из одного типа субъединиц.

А

55 60 65 70 75

Время элюции, мин

1 2 3 4 5 6

Рисунок 12. Гетерогенность флагеллина Я. \acusprofundi. А) Профиль элюции, полученный при фракционировании с помощью анионообменной хроматографии флагеллиновых форм Я. 1асшрго/ипсИ. Б) электрофореграмма флагеллин-содержащих фракций, отмеченных стрелками.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как уже было сказано, жгутики бактерий и архей являются принципиально разными структурами, схожими лишь внешне. Данное внешнее сходство вызвано тем, что жгутики бактерий и архей являются функциональными аналогами, и для работы в качестве гребного винта они должны быть спиральны. Механизм спирализации бактериальных филаментов был изучен в деталях, и на основании анализа был сделан вывод о том, что для спирализации нити жгутика субъединицы флагеллина должны быть неидентичны. В то же время, аппарат жгутиковой подвижности архей является крайне слабо изученным, и для нас представляет интерес, каким образом столь различные органеллы способны формировать схожую надмолекулярную структуру. Проведенные ранее в нашей группе исследования аппарата подвижности галофилыюго археона Я. ¡аПпагит показали, что для спирализации нити жгутика данного организма необходимы как минимум два различных флагеллина, из чего был сделан вывод о том, что у данного организма два флагеллина могут быть аналогами двух конформационных состояний единственного флагеллина Энтеробактерий. Так как множественность флагеллиновых генов широко распространена среди архей, было выдвинуто предположение о том, что данный принцип является универсальным в домене Архей. С целью проверки данного предположения мы начали работу с Я. тапзтогМ. Данный организм привлек наше внимание необычным расположением генов флаггеллинов -на разных репликонах, а также большим размером генов флагеллинов (примерно вдвое крупнее флагеллинов Я. заИпагит). Исследование данного организма позволило нам установить, что он обладает подвижностью, опосредованной жгутиками, при этом мы впервые продемонстрировали, что спиральный и функциональный жгутик галофильных архей может строиться исключительно из одного типа субъединиц. Данный результат показал, что принцип построения нити жхугика, обнаруженный на Н. заИпагит не является универсальным. Кроме того, мы показали, что жгутики Я. таг1$тоПт заметно толще жгутиков, ранее исследованных архей. Мы полагаем, что это является результатом того, что флагеллины Я. тапзтогПи примерно вдвое крупнее большинства архейных флагеллинов (45,9 кДа для Р1аА2-флагеллина и 45,4 кДа для НаВ-флагеллина) и, по-видимому, являются продуктом дупликации и последующего слияния более типичных небольших флагеллинов, подобных флагеллинам Я. ¡аИпагит (19,2 кДа для FlgAl Я. ьаИпагит). Можно сделать предположение, что именно удвоенный размер флагеллинов Я. таттогШ позволяет им строить спиральный филамент, за счет того, что они, в некотором приближении, являются двумя флагеллинами в составе одной полипептидной цепи. Однако наши результаты по исследованию филаментов Я. \acasprofundi показали, что спиральный жгутик может строиться и из относительно небольшого флагеллина (23,6 кДа). На данный момент

17

механизм построения спиральной надмолекулярной структуры, каковой является нить жгутика архей остается неизвестным. Однако, на основании полученных нами данных, а также из общего принципа, согласно которому для формирования суперспирали необходимо, чтобы субъединицы, формирующие филамент, были неидентичны, мы можем предположить, что спирализация нити жгутиков Н. таг'итогПи и Н. ¡асихрт/ипсИ может осуществляться за счет того, что флагеллины данных организмов могут находиться в различных конформациях. Косвенным подтверждением этого является тот факт, что субъединицы флагеллина в составе филаментов данных организмов не идентичны по своей доступности к атаке трипсином (для Р1аВ-флагеллина Н. тапятогШ?) и зарядовым характеристикам. При этом разница в зарядовых характеристиках может являться результатом различной степени пострансляционных модификаций (гликозилирования) субъединиц флагеллина, вследствие их разной конформации. В настоящее время, из-за отсутствия данных о точной пространственной структуре флагеллина в составе архейных жгутиков, вопрос о точном механизме спирализации филамента остается открытым.

Другим интересным вопросом для нас было выяснить, для чего Н. тапэтог/ш нужны два гена флагеллина, хотя функциональный жгутик может строиться только из одного. Наши исследования показали, что данная избыточность по генам флагеллинов носит адаптивный характер, и наличие плазмиды, несущей ген Р1аА2-флагеллина, позволяет клеткам сохранять подвижность в условиях, при которых ИаВ-флагеллин не способен формировать нить жгутика. Таким образом, мы впервые показали, что множественность флагеллиновых генов у архей может играть роль в адаптации к меняющимся условиям окружающей среды.

выводы

1) Обнаружено, что культура Н. тагЬтогПи может содержать клетки, отличающиеся белковым составом филаментов жгутиков.

2) Показано, что спиральные филаменты жгутиков галофильных архей могут собираться из одного типа флагеллина.

3) Охарактеризованы нити жгутиков Н. тапзтогш, построенные из Р1аА2- и из Р1аВ-флагеллинов.

4) Показано наличие двух форм флагеллина в составе Р1аВ-филаментов.

5) Показано, что флагеллины Н. тап.чтог1ш являются гликопротеинами с необычным типом гликозилирования.

6) Показано, что избыточность по генам флагеллинов Н. тагктогШ является механизмом адаптации к меняющимся условиям окружающей среды.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ:

1) Pyatibratov М. G., Beznosov S. N., Rachel R., Tiktopulo E. I., Surin A. K., Svutkin A. S.. Fedorov О. V. Alternative flagellar filament types in the haloarchaeon Haloarcitla marismortui. II Canadian Journal of Microbiology. 2008. V. 54. № 10. P. 835-844.

2) Сюткин А. С.. Пятибратов M. Г., Безносов С. H., Федоров О. В. Различные механизмы формирования спиральности галоархейных жгутиков. // Микробиология. 2012. Т. 81. №5. С. 620-629.

3) Svutkin A. S.. Pyatibratov М. G., Galzitskaya О. V., Rodriguez-Valera F., Fedorov О. V. Haloarcula marismortui archaellin genes as ecoparalogs. // Extremophiles. 2014. V. 18. № 2. P. 341-349.

Тезисы докладов:

1) Beznosov S. N., Pyatibratov M. G., Svutkin A. S.. Alatyrev A. G., Fedorov О. V. Unique traits of Haloarcula marismortui flagellar filaments. // International Conference "Protein Biosynthesis, Structure and Function". Russia. Pushchino. 2007. P. 84.

2) Svutkin A. S.. Beznosov S. N., Pyatibratov M. G., Tiktopulo E. I., Fedorov О. V. Unique traits of Haloarcula marismortui flagellar filaments. // International Symposium "Biological Motility: Achievements and Perspectives". Russia. Pushchino. 2008. P. 276-277.

3) Svutkin A. S.. Pyatibratov M. G., Fedorov О. V. Haloarcula marismortui flagellins as ecoparalogs. // International Symposium "Biological Motility: from fundamental achievements to nanotechnologies". Russia. Pushchino. 2010. P. 275-276.

4) Svutkin A. S.. Yu X., Egelman E., Pyatibratov M. G. Surprising properties of Haloarcula marismortui flagellar filaments. // A Biochemical Society Focused Meeting "Molecular biology of Archaea II". UK. Cambridge. 2010. P. 13.

5) Svutkin A. S.. Pyatibratov M. G., Beznosov S. N., Fedorov О. V. Helicity of flagellar filaments in different haloarchaea can be provided by different mechanisms. // International Symposium "Biological Motility: Fundamental and Applied Science". Russia. Pushchino. 2012. P. 208-210.

6) Сюткин А. С.. Безносое С. Н., Пятибратов М. Г. Различные механизмы спирализации жг>тиков галофильиых архей. // Ежегодная научная конференция Института белка РАН. Россия. Пущино. 2012. С. 14.

7) Pyatibratov М. G., Beznosov S. N., Svutkin A. S.. Galeva А. V., Fedorov О. V. Variety of molecular organization of haloarchaeal flagellar filaments. // International Symposium "Biological Motility: New facts and hypothesis". Russia. Pushchino. 2014. P. 216-218.

8) Svutkin A. S.. Pyatibratov M. G., Beznosov S. N., Fedorov О. V. Investigation of molecular organization of the Haloarcula marismortui archaellar filaments. // International Symposium "Biological Motility: New facts and hypothesis". Russia. Pushchino. 2014. P. 297-299.

9) Svutkin A.. Pyatibratov M., Fedorov O. Role of the archaellin genes redundancy in Haloarcula marismortui. II International conference "Molecular biology of Archaea 4". France. Paris. 2014. P. 102.