Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура жгутиков галоалкалофильных архей

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура жгутиков галоалкалофильных архей"

РГБ ОД МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

1 6 пит Щп_

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.122

ПЯТИБРАТОВ Михаил Геннадьевич

СТРУКТУРА ЖГУТИКОВ ГАЛОАЛКАЛОФИЛЬНЫХ АРХЕЙ 1

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук О.В.ФЕДОРОВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Е.Н.ДОБРОВ,

доктор биологических наук В.Д.ВАСИЛЬЕВ

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита диссертации состоится " /У " 1995 г.

в час. ОС мин. на заседании Специализированного ученого совета Д 053.05.70 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет..

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " ¿2 " сшмл 1995 г.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

В.Н.Каграманов

г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Движение архей, как и бактерии, осуществляется за счет вращения спиральных жгутиков. Со времени открытия царства архей (архебактерий) в 1977 г. считалось, что одним из признаков, общих для бактерий и архей, является устройство их аппаратов движения, в частности, исполнительного механизма этого аппарата - наружной спиральной ниш жгутика (в дальнейшем мы будем называть ее просто жгутиком). Однако в последние годы была получена информация, указывающая на существенные различия между жгутиками бактерий и архей. Например, в отличие от бактериальных, жгутики архей многокомпонентны: они построены из нескольких различных белковых субъединиц (флагеллинов), которые в ряде случаев глпкознлнрованы. Есть основания полагать, что несмотря на то, что функциональное назначение жгутиков одинаково н морфологически они сходны, у архей используются иные, чем у бактерий, принципы формирования этой надмолекулярной структуры. Особый интерес представляет вопрос о том, состоят ли жгутики архей и бактерий в эволюционном родстве или это третий, независимо эволюционировавший тип аппарата подвижности клеток. Остаются невыясненными механизмы, обеспечивающие высокую стабильность жгутиков экстремофильиых архей.

Основные ЭШШИ работы. Целью представленной работы является изучение структуры жгутиков галоалкалофнльных архей, представителей рода N'аЬгопоЬаМепит. Предполагалось определить, какие свойства являются общими для жгутиков этих архей и как эти свойства соотносятся с описанными ранее для бактерий.

Научная новизна. В ходе исследований было показано, что многокомпонентный состав является характерным для жгутиков галоалкалофнльных архей. Выяснилось, что даже для таких близкородственных видов как Ы.тадаЛИ и Ы.р!хагаот$ имеют место существенные различия в субъедшшчном составе жгутиков. Ряд особенностей структуры жгутиков галоалкалофнльных архей позволяет сделать выводы о существенном отличии этих органелл от жгутиков бактерий и о неверности утверждения, что жгутики бактерий и архей аналогичны по своему устройству и потому являются признаком, объединяющим эти две группы микроорганизмов. Структура лиссертаиии. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора и экспериментальной части, включающей описание использованных материалов и методов, полученных результатов и их. обсуждения. Работа завершается выводами и списком цитированной литературы (11.7 ссылок). Работу иллюстрируют^^рисунков и ^таблицы. Общин объем диссертации 12& страницы. Апробация работы и публикации. Результаты докладывались на научных конференциях Института белка РАН (Пущиио, 1994, 1995), Международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущшю, 1994), V Международной

школе по биофизике "Надмолекулярная структура и функция" (Ровппь, 1994), I Европейском симпозиуме Белкового общества (Давос, 1995). По теме диссертации опубликовано восемь печатных работ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Аиадш .субъдиничного состава жгутиков ы^гопоЬдс^пит тэдэйН и ЫаПоппЬасГепит рЬагаопЬ.

В качестве объекта исследования были выбраны жгутики архей, относящихся к группе экстремальных галоалкалофнлов (оптимальные условия роста: 4М №С1, рН 9.5): ЫаШпоЬасЬеНит тадайи и Ыа1гопоЬас1епит ркагаотз. а) Определение субъединичного состава жгутиков,

Нити жгутиков Ы.тадайп и Ы.рЬагаогая были выделены с использованием модифицированной методики, применявшейся ранее для получения жгутиков галофильной археи НаЬЬасЬепит 1ш1оЫит (Сег1 с! а]., 1989). По данным электронной микроскопии полученные препараты не содержали каких-либо структур помимо нитей жгутиков. Диаметр жгутиков составляет (12.2±0.3) им для Ы.рНагаотз и (10.0+0.3) нм для Л1.тадайи (рис.1). Эти значения близки к полученным для других архей и приблизительно в два раза меньше средних значений (20 нм) для жгутиков бактерий Оагге11 сЬ а1., 1993).

Рис.1. Электронно-микроскопические фотографии жгутиков Ы.рЬагаоп/э (А) и N.magad¡i (Б) после очистки в градиенте СвС!. Негативное контрастирование 2% уранилацетатом. Масштабная линейка - 50 нм.

Для определения субъедшшчного состава патропобактерналькых жгутиков был использован ДСН-электрофорез в сочетании с анпопообменпоп хроматографией.

<r

Мы установили, что жгутики включают в себя по четыре флагеллнна, обозначенные нами как FMI (молекулярный вес: 105000), FM2 (60000), FM3 (59000), FM4 (45000) (N.magadii) и FP1 (88000), FP2 (86000), FP3 (84000), FP4 (80000) СN.pharaonis) (рис.2). Флагеллнны натронобактернн склонны к дпмернзацнн. Об этом свидетельствуют дополнительные высокомолекулярные полосы, наблюдаемые на электрофореграмме при концентрации ДСН 0.1%, исчезающие при повышении концентрации ДСН до 0.5% (рис.2) и вновь появляющиеся при повторном электрофорезе индивидуальных флагеллипов в 0.1% ДСН.

яыт ~ РР2

Ш2 _ "* ^ ррз

„.,. л«* в грд

РМо -

РМ4 — наш» Рис.2. Электрофорез в ПААГ жгутиков после

очистки в градиенте СвС1. Жгутики Ы.тадаМ, 0.5% ДСН (1), 0.1% ДСН (2), Жгутики Ы.рПагаотв, 0.1% ДСН (3).

1 2 3

Натрокобактериальные флагеллшш отличаются повышенной склонностью к агрегации. Мы сравнили результаты воздействия на жгутики ряда детергентов и денатуратов, а также различные способы разделения белков и на основании полученных данных разработали методику, позволяющую диссоциировать полимерные структуры до отдельных субъедшшц н эффективно разделять флагеллнны. Необходимо отметить, что диссоциация и разделение флагеллинов возможны лишь в присутствии таких агентов как Тритон Х-100, препятствующих образованию гидрофобных контактов в белках.

Для того, чтобы выяснить являются ли исследуемые флагеллнны гликопротеинами, использовалось специфическое окрашивание алцнановым синим и реагентом Шиффа. Проводился также анализ с помощью газожидкостнон хроматографии (ГЖХ). Результаты окрашивания свидетельствуют о гликозшшровании флагеллинов FM2 н FM4. Флагеллнны FP1-FP4, а также FMI и FM3 не окрашиваются и, по-видимому, не являются гликопротеинами. Согласно результатам ГЖХ флагеллнны N.magadii содержат сахарнды, состоящие из глюкозы и глкжуроновой кислоты, у флагеллинов N.pharaonis сахара не обнаружены.

Антигенные свойства флагеллшюв исследовались методом иммунодиффузной преципитации (Оис1йег1опу, 1953) с использованием кроличьих антисывороток, полученных против жгутиков каждой из архен в отдельности. Были получены следующие результаты: (1) Антитела против жгутиков АЛр/гагаоии не реагировали ни с жгутиками, ни с каждым из флагеллшюв Ы.тадасШ и наоборот. (2) Антисыворотки против патронобактернальных. жгутиков не взаимодействовали с жгутиками таких архей, как Н.ка1оЫит, Ткегтососст зШЬеп, МеИтпососсш. ИгегтоШ/юЬгорЫсш. (3) Как для N. тадасШ так и для Ы.ркагаопЬ каждый из флагеллинов реагировал с аитисывороткой против жгутиков. Полосы преципитации, образованные различными флагеллииами, при этом плавно сливаются, что указывает на полную идентичность их антигенных детерминант (рис.3). Результаты указывают на консервативность структуры поверхностных участков флагеллшюв из одного "комплекта", которая тем не менее не распространяется па флагеллины различных видов (даже таких близкородственных как Ы.тадайН и N.рЬагаот$) архен.

Рис. 3. Иммунодиффузионный анализ флагеллинов с использованием 2 кроличьих антисывороток к жгутикам

—— ... __ N.magadii (А) и N.pharaonis (Б): 0 -

G _J Ж з 6 ШГл! 3 антисыворотка; 1, 2, 3 - флагеллины

FP1, FP2, FP4; 4, 5, 6 - флагеллины . FMI, FM2, FM4.

Флагеллины подвергались ограниченному протеолизу с применением трипсина, протеазы S.aureus V8, хнмотрипснца. Полученные данные указывают на сходство структур субъедшшц1 FM2 и FM3, которые могут являться двумя различными модификациями одного и того же полнпептнда. Аналогичные результаты получены и для пары флагеллинов FP3 и F14. Сравнение данных по протеолизу для остальных флагеллинов указывает на существенные различия в их структурах. Сравнивая результаты ограниченного трнпеннолиза флагеллинов, можно заметить, что па начальном этапе фрагментация идет по одной из двух схем. (1) Отщепление сравнительно небольших концевых участков с образованием относительно устойчивого фрагмента. (2) Расщепление на 2-3 сравнительно крупных фрагмента. Первое имеет место для FM4, FM3 и FM2, при этом для каждого из этих флагеллинов образуются фрагменты, близкие, но не идентичные по молекулярным весам (40000, 41000 и 43000, соответственно). Для всех FP-флагеллинов расщепление идет по второй схеме. Субъедшшца FMI, имеющая молекулярный вес близкий к сумме молекулярных весов FM4 и FM2CFM3) на начальной стадии трипсиколиза также распадается на два крупных фрагмента, (рис. 4)

t

. «S

Рис. 4. Временная зависимость трипсинолиза флагеллинов

N.magadi, (А) флагеллин FM1, соотношение белок/фермент равно 500:1, (В) FM4 (250:1), (С) FM2 (500:1). (О) FM3 (500:1).

О 3 12 300 О 3 12 300 о 3 12 ЗОО' О 3 12 300

Время, мин

Проведенные исследования подтвердили, что такие свойства, как меньшая по сравнению с бактериальным» жгутиками толщина и многокомпонентность являются характерными и для галоалкалофильпых архей. Глпкознлированне флагеллинов также имеет место, но не является обязательным. Полученные результаты согласуются с данными группы Джаррелла (Канада), занимающейся исследованием метаногешшх архей ОаггеП еЬ а1., 1993).

Для изучения структуры жгутиков использовались два взаимодополняющих

подхода.

а) Эксперименты по реконструкции.

Во-первых, предполагалось подобрать условия, позволяющие проводить реконструкцию жгутиков из диссоциированных субъедншщ in vitro. Сравнивая полимеризационные свойства различных флагеллинов, мы предполагали выяснить роль каждого из них в формировании структуры жгутика. С этой целью флагеллины, разделенные с помощью электрофореза или аннонообменной хроматографии, диализом переводили в естественные солевые условия (20% NaCl). Кроме того использовались высаливающие агенты, традиционно применяемые для полимеризации in vitro бактериальных флагеллинов. Эксперименты проводились как с отдельными субъединицамаи, так и с их смесями при различных температурах, солевых условиях и рН. В большинстве случаев, формировались шаровидные агрегаты. В ряде случаев наблюдались лентовидные структуры, однако ни в одном из экспериментов не были зафиксированы структуры, подобные исходным нитям.

Таким образом, реконструкцию жгутнков галоалкалофильпых архей не удается осуществить с помощью методов, традиционно используемых для архей, полимеризации бактериальных флагеллинов, как мы полагаем из-за повышенной склонности флагеллинов к кеспецифическон агрегации. Диссоциация жгутнков как правило, приводит к образованию агрегатов, что, вероятно, связано с наличием

сильно гидрофобных участков. Жгутики удается диссоциировать на мономеры без образования агрегатов только с помощью детергентов, экранирующих гндрофобцые участки субъединиц. Мы полагаем, что при синтезе флагеллинов в клетке гидрофобные участки должны быть экранированы сразу же после синтеза, чтобы предотвратить неспецифическую агрегацию. Известно, что такую роль в клетках эукариот и бактерий могут выполнять шапероны, относящиеся к семейству шоковых белков. Мы предполагаем, что в клетках архей должны присутствовать подобные шапероны, предотвращающие неспецнфпческую агрегацию п способствующие правильной сборке флагеллинов. В настоящее время в нашей группе ведутся исследования по идентификации таких шапероиов. б) Изучение влияния NaCI иа структуру жгутиков.

Второй подход, оказавшийся более результативным, основан на изучении методами электронной микроскопии и ограниченного протеолиза процессов, происходящих при диссоциации жгутиков. Предполагалось изучить влияние различных факторов на морфологию жгутиков, выявить промежуточные структуры, образующиеся при диссоциации, сравнить свойства различных флагеллинов, выявить участки субъединиц, различающиеся по их роли в формировании структуры жгутика. Прежде всего мы решили исследовать, как изменяется структура жгутиков при понижении ионной силы.

При концентрациях NaCI от 25 до 10% морфология жгутиков N.pharaonis не изменяется. При дальнейшем понижении концентрации NaC! структура поверхности жгутиков разупорядочивается (рис.5В), однако нх длина и толщняа практически не изменяются. Жгутики с раэупорядоченной структурой сохраняются даже при очень низких (0.5%) концентрациях NaCI, и диссоциируют лишь при снижении концентрации соли до нуля. Процесс носит кооперативный характер, пнусвндпые структуры полностью исчезают, а диссоциированные флагеллины образуют шаровидные агрегаты.

При концентрациях NaCI больше 10% флагеллины в составе жгутиков устойчивы к воздействию протеаз. Разупорядочение структуры поверхности жгутиков при снижении концентрации NaCI сопровождается потерей устойчивости к протеолизу. При конце!гтрацнях NaCI меньше 10% все флагеллины постепенно расщепляются, образуя набор различных по молекулярным весам и устойчивости фрагментов. После перевода из низкосолевых в высокосолевые условия нативная структура жгутиков по данным электронной микроскопии не восстана! ливается, устойчивость флагеллинов к воздействию протеаз также не восстанавливается.

На рис.6(1) приведены результаты ограниченного трипсинолиза разупорядоченных жгутиков N.pharaonis в 5% NaCI. Флагеллины не обнаруживают различий в устойчивости к трипсинолизу н сравнительно быстро расщепляются, образуя наряду с низкомолекулярными (tp) (молекулярные веса не более 20000) фрагментами, характерный набор из четырех стабильных высокомолекулярных (TP) фрагментов 40000, 36000, 33000 и 24000. Тот же набор фрагментов образуется и при

t

Рис. 5. Электронно-микроскопические фотографии нативных жгутиков N.pharaonis в 20% NaCI (А), жгутиков с раэулорядоченной поверхностью в 5% NaCI (В), тонких нитей (протофиламентов), образуемых после обработки трипсином в 5% NaCI (С). Негативное контрастирование 2% уранилацетатом. Масштабная линейка - 50 им.

трипсииолизе индивидуальных флагеллшюв, при этом фрагмент 40000 является продуктом расщепления субъединицы FP1, фрагмент 24000 - FP2, 36000 - FP3 и 33000 - FP4.

Электронно-микроскопический анализ препаратов после трипсинолпза показал, что нитевидные структуры сохраняются даже после расщепления всех флагеллиновых молекул. Морфология жгутиков при этом существенно изменяется: их диаметр уменьшается приблизительно в два раза (до 5-6 им) в сравнении с толщиной исходных жгутиков (рис.5С). С помощью дифференциального центрифугирования мы установили, что тонкие жгутики, названные нами протофиламентамн, содержат только TP-фрагменты. Пизкомолекулярные tp-фрагменты не входят в их состав (остаются в супсрнатантс) (рис.6). В отличие от TP-фрагментов, которые, как и флагел.тшгы, имеют высокую склонность к неспецифической агрегации п, подобно исходным суйъсдшшцам, могут быть разделены лишь в присутствии детергентом, tp-фрагмснты легко разделя/отся с помощью анпонообменной хроматографии в буфере, не содержащем детергентов и денатуратов. Обработка жгутиков N.pharaonis при пониженных концентрациях соли другими протеазамн, такими как протеаза S. aureus V8 и хпмотрипенн, на начальной стадии приводит к сходным результатам, которые сложнее интерпретировать из-за наличия большого количества полос. Длительный иротеолнз приводит к деградации крупных фрагментов, с исчезновением которых исчезают и тонкие нити, флагеллины при этом не обнаруживают заметных различий в устойчивости.

димеры , TP-фрагмент ob

40000 . 36000 ■ 33000 ■

24000-

Рис. 6. Результат трипснолиза жгутиков N.pharaonis в 5% Nad (3 часа, соотношение белок/фермент - 50:1) (1). Осадок (2) и супернатант (3), полученные после высокоскоростного центрифугирования (1 час, 80000 д) жгутиков, обработанных трипсином.

1 2 3

Мы планировали определить и сравнить Ы-копцсвые последовательности флагеллинов и крупных фрагментов, образующих протофпламеиты, и таким образом выяснить расположение отщепляемых участков. Однако, оказалось, что №коицы ТР-фрагментов, как и исходных флагеллинов, блокированы (устойчивы к деградации по Эдману). Были определены Ы-копцевые последовательности двух инзкомолекуляр-ных триптнческнх фрагментов с молекулярными весами 8000 (1рА) 1! 12000 (1рВ): 1рА: К№)и-Ш01.ЕЕ<21АШЕ00КШЛ-1ЮХ0, 1рВ: КСЮЫУОСОРШЕОЫХЕУУХССР. Как показал анализ с использованием программы МкгоСеше, оба фрагмента обнаруживают некоторую гомологию с участками из С-концевой области флагеллинов Н.1ш1оЫшп (рис. 7).

tpA (Arg) Lys I Lys Leu

Fla AI Gly

(32

Asn Asn Asp ... Leu Gla Glu Gin

I I I I I I

Asn Asn Ala Asp Val Leu Val Glu Gin

142

12

tpB Tyr Asp Gly Asp Pro lie Asp ... Glu Asp Asn

• I I I I I I

Fla Al Tyr Asp Gly Ser Tlir Ah Asp Ah Glu Asn

125

Рис. 7. Сравнение N-концевых последовательностей нчзкомолекулярных триптических фрагментов флагеллинов N.pharaonis с аминокислотной последовательностью флагеллина Fla AI H.halobium Rt M, (Gert & Sumper, 1988), состоящего из 196 остатков.

Морфология жгутиков N.magadii как и в случае N.pharaonis при понижении концентрации NaCl до 10% не меняется. Однако, при дальнейшем понижении концентрации соли жгутики N. magadii ведут себя несколько иначе: их поверхностная структура также разупорядочнвается, жгутики как бы разбухают, но

Рис. 8. Электронно-микроскопические фотографии жгутиков Л/.тадас///, диссоциированных понижением концентрации ЫаС до 5%: жгутики с разупорядоченной поверхностью, и тонкие нити (протофиламенты) (А, В); нитевидные структуры после обработки трипсином (С) и протеазой в.аигеиз У8 (О). Негативное контрастирование 2% уранилацетатом, масштабная линейка - 50 им.

наряду с этим появляются шгтн в два - три раза тоньше (4-6 им в диаметре) нативных жгутиков, подобные образуемым при протеолизе протофиламентам Д1.р1шгаопи, а также шарообразные агрегаты. На начальном этапе диссоциации можно наблюдать нити смешанного типа, состоящие из чередующихся участков, имеющих разную толщину и структуру (рис.8А, В). При уменьшении концентрации ЫаС1 до нуля нитевидные структуры исчезают, остаются лишь агрегаты. При диссоциации жгутиков Ы.тадайп уже при 5% №С1 нити, близкие по толщине к

исходным не наблюдаются, присутствуют лишь протофпламентм и агрегаты. Мы пытались разделить продукты диссоциации жгутиков с помощью дифференциального центрифугирования, однако полного разделения добиться не удалось. В полученных в результате разделения фракциях не наблюдалось изменения относительного содержания флагеллинов

Изменения структуры жгутиков N.magadii при понижении концентрации NaCl ниже 10 %, как к в случае N.pharaonis, привадят к потере устойчивости флагеллинов к действию протсаз. На рис.9 приводятся результаты протеолиза жгутиков N.magadii протеазоп S.aureus V8 (Л) и трипсином (Б) в 5% NaCl. На начальных этапах протеолиза порядок расщепления субъедшшц в диссоциированных жгутиках соответствует устойчивости индивидуальных флагеллинов. При использовании протеазы S. aureus V8, субъедшшцы FM2 и FM3 остаются не расщепленными, в то время как две другие деградируют полностью. При трипсинолизе в первую очередь расщепляется FMI, затем FM2, FM3 и FM4. Образующиеся на ранних стадиях трнпеннолнза крупные фрагменты (40000-43000) постепенно деградируют до низкомолекулярных (не более 35000) фрагментов. Электронно-микроскопические исследования показали, что нитевидные структуры как и в случае N.pharaonis сохраняются после расщепления всех флагеллинов. Эти нити сравнимы по длине с исходными жгутиками, а по толщине практически не отличаются от протофиламентов, образующихся при диссоциации (рис.8С, D). Нам не удалось полностью отделить протофпламепты, состоящие из флагеллинов, лишенных концевых участков, от агрегатов, однако после дифференциального центрифугирования доля высокомолекулярных фрагментов в осадках, содержащих преимущественно протофиламенты, увеличивалась (рис.10). Протеолнгическое расщепление высокомолекулярных фрагментов приводит к полному исчезновению нитей, которые могут рассматриваться в качестве структурного элемента жгутика, и

Б

I

«•» <Ш

о Û2 I 3 I61 о 0.2 ! 3 16

Время, час

Рис. 9. Временная зависимость протеолиза жгутиков N.magadii в 5% Nad. Обработка протеазоп S.aureus V8 (соотношение белок/фермент - 20:1) ¡А); обработка трипсином (50:1) (Б).

Рис. 10. Результаты разделения продуктов трипсинолиза диссоциированных жгутиков Ы.тадасШ в 5% ЫаС!, Исходные жгутики (1): жгутики после обработки трипсином (3 часа, 50:1) (2): супернатант (3) и осадок (4), полученные после высокоскоростного центрифугирования (1 час, 80000 д) жгутиков, обработанных трипсином.

связи между протофиламептами менее стабильны, чем связи между субъедшшцамн в протофиламентах. При уменьшении концентрации №С1 связи между протофиламептами дестабилизируются, что н приводит к диссоциации жгутиков Ы.тпадасШ. В случае более устойчивых жгутиков Ы,р]шгаопг$ разрушение связей между протофиламептами происходит лишь после отщепления частей флагеллннов, участвующих в стабилизации этих связен.

Известно, что у бактериальных флагеллннов за образование межсубъединичных контактов при полимеризации ответственны оба консервативных концевых участка полипептидной цепи (РеЛогоу й а!., 1988; Уопс^твгЬ еЬ а1., 1989). Сравнение первичных структур флагеллннов архей П.ИаЬЫит и М.гюМае показывает, что наибольшая гомология имеет место в Ы-концевых участках, отличающихся высокой гндрофобностыо (вег! & Битрег, 1988; Ка1токо/Г & ^гге11, 1991), и позволяет предположить, что Ы-копцы флагеллннов архей могут участвовать в полимеризации. Натронобактернн эволюциошю ближе к галобактериям, чем метанококки, и мы вправе ожидать, что нх флагеллины также содержат консервативный И-концевой гидрофобный участок. Наличием аналогичного участка у натронобактернальных флагеллннов можно объяснить прочность межсубъединичных связей и повышенную склонность к агрегации.

Мы показали, что по меньшей мере один из концевых участков флагеллннов галоалкалофильных архей не участвует в формировании продольных контактов между субъединицами в протофиламентах, поскольку его отщепление при протеолнзе не приводит к их разрушению. Мы предполагаем, что участок, который может быть удален без разрушения полимеров, соответствует С-кошшм субъединиц, а определяющая роль в формировании межсубъединичных связей принадлежит гидрофобным Ы-концам флагеллннов. Однако, протофиламенты наблюдаются только при сохранении высокомолекулярных (не менее 24000 для N.ркагаопп и 35000 для Ы.тадаИг) фрагментов. В случае Ы.тадайп трнптнческнй фрагмент 43000,

> .

являющийся продуктом расщепления флагеллпна РМ2, наиболее стабилен и сохраняется после деградации остальных флагеллпиов до низкомолекулярных фрагментов, при этом сохраняются и протофнламенты, расщепление фрагмента 43000 приводит к их разрушению. Полученные данные указывают па то, что РМ2 формирует протофнламенты, наиболее устойчивые к ннзкосолевой диссоциации. Известно, что спиральная форма бактериальных жгуЛжов обеспечивается двумя конформационными состояниями флагеллина (СаПасНпс, 1978). Изменения формы жгутико? во время тамблинга (хаотического движения клетки, необходимого для изменения ориентации) обусловлены способностью флагеллина переходить нз одного конформационного состояния в другое. Тамблинг н соответствующие изменения морфологии жгутиков для архей (Н.1ш1оЫит) не наблюдались (А1ат & Оез1егЬек, 1984). Известно, что стабильность экстремофпльпых белков коррелирует с уменьшением их флексибильности или способности к изменению конформащш Оаешске & 2ауос152ку,. 1990). Поэтому, отсутствие тамблинга у архей может означать, что способность этих флагеллипов к изменению конформащш ограничена. Многокомпонентная природа жгутиков архей может быть связана с тем, что их спиральная форма определяется не способностью флагеллина находиться в двух различных конформациях, а наличием нескольких флагеллипов, имеющих различную структуру. Мы предполагаем, что не только субъедииица РМ2, но и другие флагеллины формируют протофнламенты, а жгутик образован из продольных рядов (протофиламеитов), состоящих из флагеллипов одного типа.

3. Исследование доменной организации флагеллинов £ помощью

микрокзлориметрии.

Для выявления в молекулах флагеллипов структурных доменов был использован метод сканирующей микрокалориметрии.

На рис.11 приведены кривые плавления жгутиков N.magtгdiг и Ы.рЬагаотз в буфере, содержащем 20% ЫаС[. В обоих случаях кривые плавления имеют сложную форму и соответствуют нескольким кооперативным переходам. Понижение концентрации соли приводит к изменениям формы кривых плавления и некоторой дестабилизации жгутиков (температуры, соответствующие максимумам теплопоглощения (Тш) уменьшаются). Кооперативное плавление имеет место при концентрациях №С1 не ниже 10%. Плавление жгутиков при меньших концентрациях соли не обнаруживает пиков теплопоглощения, что свидетельствует о разрушении третичной структуры флагеллипов. Процесс ннзкосолевой денатурации флагеллинов необратим, увеличение концентрации соли не приводит к восстановлению пиков теплопоглощения. После прогрева до максимальной температуры (130 °С), согласно электронно-микроскопическим наблюдениям, жгутики в основном сохраняют свою морфологию, хотя их поверхностная структура разупорядочнвается, появляются короткие фрагменты жгутиков, возрастает межжгутнковая агрегация. Повторное плавление демонстрирует полную необратимость тепловой денатурации флагеллинов.

Температура,°С

Рис. 11. Температурные зависимости избыточного теплопоглощения жгутиков Ы.тадасШ (вверху) и Ы.рЬагаоп'я (внизу) в 20% N301, Трпс-НС/, рН 9.0.

Как видно из рис.11 кривые плавления жгутиков N.pharaonis н N.magadii существенно отличаются. D случае N.pharaonis доля низкотемпературных пиков теплопоглощения значительно больше (примерно 65% от суммарной энтальпии перехода), чем в случае N.magadii (около 30%). После низкотемпературных переходов частично денатурированные жгутики еще сохраняют устойчивость к воздействию протеаз. Полная тепловая денатурация (подобно пизкосолевой) приводит к потере устойчивости к протсолизу. Обработка денатурированных нагреванием до 100 °С жгутиков протеазой S.aureus V8 приводит к быстрой деградации флагеллинов до ипзкомолекулярных фрагментов, при этом по данным электронной микроскопии нитевидные структуры исчезают. Обработка трипсином приводит к аналогичному результату для жгутиков N.magadii, флагеллины N.pharaonis расщепляются, образуя характерный набор из четырех ТР-фрагментов, при этом образуются нити, подобные описанным выше протофнламентам (рис. 12).

Рис. 12. Электронно-микроскопические фотографии жгутиков Ы.рЬагаота в 20% N301, денатурированных нагреванием до 100 "С, после обработки трипсином (1 час, 100:1). Негативное контрастирование 2% уранилацетагом, масштабная линейка - 50 им.

Нами были получены кривые плавления патропобактерпальпых жгутиков в условиях диссоциации Тритоном Х-100 в 15% №С1 (при более высокой концентрации соли этот детергент не растворяется). В 15 % ЫаС! при отсутствии

- 200

*

§ 100

ср о о.

ж

100

О

0

Рис. 13. Температурные зависимости избыточного теплопоглощения жгутиков Ы.рЬагаопЬ 115% ЫаСП, 10 мМ Трис-НС1, рН 9.0) до (вверху) и после (внизу) добавления 0.3% Тритона Х-100.

30

50

ТО

Температура, °С

детергента морфология жгутиков не отличается от натнвнон. Добавление в раствор Тритона Х-100 (0.3% у/у) приводит согласно электронно-микроскопическим наблюдениям к диссоциации жгутиков на мономеры. При отсутствии в препаратах полимеров и агрегатов калориметрические исследования показали наличие пиков теплопоглощения. Форма кривых плавления при этом изменяется (рис.13), что может быть связано с некоторой дестабилизацией структуры флагеллинов при разрушении полимеров. Данные по плавлению диссоциированных с помощью Тритона Х-100 жгутиков подтверждают наличие в молекулах флагеллинов двух частей, сильно различающихся по гндрофобностн и чувствительности к изменениям ионной силы и свидетельствуют о том, что гидрофобные взаимодействия субъединиц играют определяющую роль в образовании четвертичной структуры жгутиков.

Проведенные исследования указывают па дополнительные различия между жгутиками бактерий и археи. При плавлении бактериальных жгутиков происходит их деполимеризация, связанная с денатурацией Ы- и С-концевых е^спнральных доменов. Центральная часть молекулы флагеллнна, формирующая поверхность жгутика, образует домены, которые плавятся независимо от концевых участков и легко ренатурируют (Коз1уикоуа еЬ а1., 1988; Уопскгу^гЬ с1 а1., 1990). При плавлении жгутиков галоалкалофнльных археи имеет место необратимая денатурация флагеллинов, полимерная структура при этом не разрушается. Мы полагаем, что кооперативно плавящиеся домены флагеллинов непосредственно не отвечают за полимеризационпые свойства, по участвуют в стабилизации межсубъединичных взаимодействии, экранируя соответствующие участки молекул от экстремальных воздействий внешней среды.

На основании имеющихся данных мы предлагаем следующую схему строения нитей жгутиков археп: Предполагается, что а) жгутик образован из продольных рядов (протофнламентов), состоящих из субъедпнпц одного типа; б) концевые гидрофобные участки флагеллпнов образуют межсубъедиипчпые контакты, а С-концевые участки входят в состав доменов, формирующих поверхность жгутика.

Полученные результаты в сочетании с данными других исследователей свидетельствуют о том, что различия между жгутиками архей н бактерий носят, принципиальный характер и позволяют сделать пыпол о пснсрпостн утверждения, что жгутики бактерии и археп аналогичны по своему устройству, п, потому, являются признаком, объединяющим эти две группы микроорганизмов.

1. Впервые выделены п охарактеризованы нити жгутиков галоалкалофнльных археп ЫаЬгопоЬа^епит тодаЛп и Ыа1гопоЬас1впит ркагаопЬ. Показано, что жгутики этих археп включают в себя по четыре флагеллнпа с молекулярными весами 105000, 60000, 59000, 45000 (Ы. тадайи) и 88000, 86000, 84000, 80000 Ш. рЬатотз).

2. Показано, что при диссоциации шггп жгутпко» галоалкалофнльных архей в отличие от бактериальных могут образовывать промежуточные структуры - протофнламеиты.

3. Установлено, что один из концевых участков флагеллпнов не принимает участия в образовании продольных связен между субъедшпщамн в протофиламентах

4. Показано, что флагеллины в составе жгутиков содержат домены, денатурация которых не приводит к разрушению полимеров.

5. Показано, что определяющую роль н образовании четвертичной структуры жгутиков галоалкалофнльных археп играют гидрофобные взаимодействия субъедпнпц.

6. На основании экспериментальных данных предложена схема строения жгутиков архей, согласно которой жгутик образован и:! продольных рядов (протофнламентов), состоящих из флагеллпнов одного типа; при этом N1-коицевые гидрофобные участки флагеллпнов образуют межсубъедшшчиые контакты, а С-концевые участки входят и состав внешних доменов.

ВЫВОДЫ.

диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Пятнбратов М.Г., Костюкова Д.С., Тарасов В.Ю., Федоров О.В. Морфология н субъедшшчпый состав жгутиков галоалкалофнльных архебактернн -Доклады Академии паук, 1993, т.330, N 1, с.116-119.

»

2. Fedorov O.V., Pyatibratov M.G., Kostyukova A.S., Osina N.K., Tarasov V.Yu. Protofilament as a structural clement of flagclla of haloalkalophilic archaebacteria. - Can. J. Microbiol., 1994, V. 40, No.l, p.45-53.

3. Kostyukova A.S., Pyatibratov M.G., Tarasov V.Yu., Gongadze G.M., Fedorov O.V. Structural and functional pccularities of the archaebacterial apparatus of motility connected with extremal environment. - International Symposium "Biological Motility". Abstracts, Pushchino, 1994, p.281-282.

4. Pyatibratov M.G., Kostyukova A.S., Tarasov V.Yu., Fedorov O.V. Different role of N- and C-termini of archaebacterial flagellars in formation of mtersubunit bonds. - International Symposium "Biological Motility". Abstracts, Pushchino, 1994, p.283-284

5. Pyatibratov M.G., Tarasov V.Yu., Kostyukova A.S., Tiktopulo E.I., Fedorov O.V. Domain organization of halophilic archaeal flagcllins. - 5th International Scool on Biophysics "Supramolecular Structure and Function". Abstracts, Rovinj, Croatia, 1994, p.90.

6. Костюкова А.С., Полосина Я.Ю., Пятнбратов М.Г., Тнктопуло Е.И., Федоров О.В. Возможное участие шаперонон в сборке жгутиков архсп. - Доклады Академии наук, 1994, т.339, N 4, с.544-546'.

7. Kostyukova A.S., Polosina Ya.Yu., Pyatibratov M.G., Fedorov O.V. Archaeal flagellins need chaperone assistance to assemble. - First European Symposium of the Protein Society. Abstracts, Davos, Switzerland, 1995, Protein Scince, V. 4, suppl. 1, p.104.

8. Костюкова А.С., Пятнбратов М.Г., Тарасов В.10., Гоигадзе Г.М., Федоров О.В. Структурные и функциональные особенности аппарата подвижности архей, связанные с экстремальными условиями их обитания. - Биофизика, в печати.

1.08.95 г. Зак. G007P. Тир. I00 экз. Усл.печ.д. 1.0 Отпечатано на ротапринте в 0НТИ ПНЦ РАН