Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ультраструктура жгутикового аппарата галофильных архей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ультраструктура жгутикового аппарата галофильных архей"

.с.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н.БАХА

На правах рукописи

СПЕРАНСКИЙ ВЛАДИСЛАВ ВЛАДИМИРОВИЧ

УЛЬТРАСТРУКТУРА ЖГУТИКОВОГО АППАРАТА ГАЛОФИЛЬНЫХ АРХЕЙ

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН в Научно-исследовательском институте физико~химическ( биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.ВЛомоносова.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук А.Л.МЕТЛИНА

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук О.В.ФЁДОРОВ,

кандидат биологических наук В.А.ШТЕЙН-МАРГОЛИНА

Ведущая организация: Институт микробиологии РАН

Защита диссертации состоится 1995 г в /С ча,

на заседании диссертационного совета К 002.96.01 п присуждению учёной степени кандидата биологических наук Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН по адресу: 11707 Москва, Ленинский проспект, 33, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотек биологической литературы РАН (Москва, Ленинский проспею 33, корпус 1).

Автореферат разослан 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

М.И.Молчано

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Одним из фундаментальных свойств живого является способность реагировать на специфические внешние стимулы. Проблемы рецепции, преобразования и передачи сигнала входят сегодня в число приоритетных направлений развития биологической науки. Свободнопередвигающиеся прокариоты - бактерии и археи - отвечают на изменения в окружающей среде прежде всего изменением траектории своего движения. Иными словами, для них характерны реакции таксиса -постепенного перемещения в направлении условий обитания, способствующих выживанию. Аппарат подвижности - конечное звено в цепи передачи сигнала при таксисе - у бактерий и архей обычно представляет собой спиральнозакрученный жгутик либо пучок жгутиков.

По жгутикам бактерий уже накоплено немало морфологических, биохимических и генетических данных. Установлено, что жгутики бактерий состоят из трёх хорошо различимых частей - наружной нити-гребного винта, гибкого крюка и вмонтированного в клеточную оболочку базального тела. Известны последовательности образующих жгутиковую нить белков - флагеллинов, изучены их структура и способ сборки. Идентифицированы гены, отвечающие за подвижность и таксис.

Археи, прежде называемые архебактериями, согласно современным представлениям, образуют отдельный таксон - домен-"надцарство" Аг-chaea, наряду с доменами Bacteria и Eucarya (Woese et al., 1990, P.N.A.S. USA, 87:4576), причём по ряду признаков археи оказались ближе к эукариотам, чем к бактериям. Первые обобщения относительно структуры и сборки аппарата подвижности архей только начали появляться (Jarrel et al., 1993, Current Topics in Mol. Genet. (Life Sei. Adv.), 1:15). Все полученные на сегодняшний день данные свидетельствуют о том, что жгутики архей лишь внешне, функционально напоминают бактериальные, разительно отличаясь от них по структуре, белковому составу, способу сборки.

Важной особенностью прокариотического жгутика является тот факт, что его наружная нить, составляющая основную массу жгутика, сама по себе двигательной активностью не обладает и приводится во

вращение закреплённым в клетке мотором - так называемым базальн телом. Таким образом, базальная внутриклеточная часть жгутиков аппарата представляет особый интерес, и именно эта часть найме охарактеризована в структурном плане как у бактерий, так и у ар> Уже установлено, что в выделенных так называемых "интактш жгутиках отсутствуют важнейшие компоненты собственно базальн тела (Khan, 1993, J.Bacteriol., 175:2169). Перспективы выделения мно компонентов мотора пока неясны, такие традиционные методы, рентгеноструктурный анализ, применить нельзя, способы контр« специфической активности таких белков in vitro также неизвест; Сочетание разнообразных методов электронной микроскопии генетическими приёмами остаётся, по существу, единственн эффективным подходом в исследовании базальных структур жгути; прокариот.

Среди подвижных архей традиционно большой интерес исследователей вызывают галобактерии, плавающие при помо полярно расположенного пучка жгутиков в концентрированных (от до насыщенных) растворах NaCl. Жгутики галобактерий представл; особый биологический интерес, поскольку они задействованы в реакц: как хемотаксиса, так и фототаксиса в экстремальной среде. В 70-х го из галобактерий был выделен уникальный белок бактериородопсин 1984 г. (Alarn & Oesterhelt, 1984, J.M.B., 194:495) интенсивно изучаю подвижность и жгутики этих архей.

Данное исследование является естественным продолжением ра по изучению структуры систем подвижности прокариот, проводимы нашей лаборатории. Большинство традиционно применявшихся i работе с эубактериями методов оказались, однако, непригодными , исследования жгутиков архей. Использование ряда новых подхо, позволило обнаружить и охарактеризовать в составе жгутиков аппарата экстремальных галофилов уникальную структ> отсутствующую у эубактерий.

Цели и задачи исследования. Основной задачей представленной рабе было выяснение структуры базальной части жгутиков архей с помои различных методов современной электронной микроскоп

2

Тланнровалось также получить антитела к очищенным флагеллинам, :пецифически реагирующие на срезах со жгутиками.

Заушая новизна и практическая значимость. В клетках галофильных [рхей впервые описана особая цитоплазматическая структура, к которой крепится пучок жгутиков. У эубактерий жгутики, как известно, ;акреплены при помощи специализированных структур, связанных с слеточной оболочкой, и практически не продолжаются в цитоплазму, 'езультаты данной работы, вместе с некоторыми литературными [анными, позволяют предположить принципиально иной способ :репления жгутиков в клетках подвижных прокариот-архей: пучок кгутиков погружён в цитоплазму, где он закреплён при помощи »бширной дискообразной структуры. Таким образом, получено ещё одно :видетельство того, что археи обладают особой системой подвижности, финципиально отличающейся от жгутиков эубактерий.

Антитела к очищенным электрофорезом флагеллинам На1оЬас1епит аИпапит, специфически реагирующие на срезах со жгутиками, юлучены, насколько нам известно, впервые. Они позволяют исследовать !нутриклеточную часть жгутикового аппарата галобактерий при помощи Iммуноэлектронной микроскопии.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, »бзора литературы и экспериментальной части, включающей описание [спользованных материалов и методов, полученные результаты и их Осуждение. Работа завершается выводами и списком цитированной итературы { ШЧ ) ссылки. Работу иллюстрируют 36 страниц шкрофотографий. Общий объем диссертации страниц.

шробация работы и публикации. Результаты докладывались на Леждународном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 994), на заседании ученого совета Института биохимии им. А.Н.Баха 'АН, а также на ряде научных семинаров в НИИ физико-химической ¡иологии им. А.Н.Белозерского МГУ.

Соикатель удостоен стипендии имени члена-корреспондента 'оссийской Академии наук, профессора В.Л. Кретовича.

По теме диссертации опубликовано три печатных работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Основным объектом служил штамм На1оЬас(епит ¿а Ипа пит В-12 с которым в нашей лаборатории работали уже длительное вре> Использовались также культуры На1оЬас1егшт ИаЬЫит Р1хЗ и Ыа1гопоЬк 1епит magadii В-1751.

Изучение внутриклеточной части жгутикового аппара галобактерий.

Жгутики галобактерий закреплены в цитоплазме при помо дискообразной пластинчатой структуры.

Сама природа галобактерий делает крайне затруднительным изучение традиционными биохимическими и электронномикрс копическими методами. Высокая концентрация №С1, необходимая д сохранения целостности клеток, структуры и активности белков, край затрудняет проведение большинства рутинных процедур, таи например, как электрофорез, фиксация и негативное контрастирован материала для электронной микроскопии. Применение в последн случае жёстких воздействий, включающих обработку детергентами ДНКазой, даёт результаты, которые бывает очень труд интерпретировать.

На негативно контрастированных препаратах иног просматривается необычная структура на полюсе клетки, от котор жгутики отходят все вместе, пучком. Такие фотографии, однако, позволяют сделать вывод, расположена ли наблюдаемая структура толще клеточной стенки или глубже, в цитоплазме. В подобных случа обычно помогает метод ультратонких срезов. Кроме того, на срезах час удаётся выявить лабильные структуры, утрачиваемые при выделении.

При фиксации материала для приготовления срезов так проявились особые свойства галобактерий. Так, абсолютно непригодш оказался традиционно применяемый для эубактерий метод фиксац четырёхокисыо осмия по Келленбергеру (без альдегидной префиксаци: Такая особенность галобактерий связана, вероятно, с высок] содержанием в их белках кислых аминокислот, сообщающих мрлекулал

4

Рис. 1. Полюс клетки Halobacterium salinarium. Негативное контрастирование фосфовольфрамовой кислотой. Видна структура в основании пучка жгутиков. Масштабная линейка - 100 нм.

значительный отрицательный заряд (10-14 молярных процентов, Galinski, 1995, Adv. Microb. Phys., 37:273).

Для получения срезов клетки фиксировали, в основном, тпотаропым альдегидом - четырехокисыо осмия. Для выяснения шмической природы обнаруженных структур были использованы менее традиционные способы фиксации, такие как фиксация пёрманганатом <алия, а также экстракция липидов в процессе подготовки препаратов. Позитивное окрашивание уранилацетатом проводилось en bloc перед эбезвоживанием, в процесе обезвоживания и/или на срезах. Срезы, как правило, докрашивали цитратом свинца по Рейнолдсу. Толщина срезов эбычно была в пределах 60-70 нм. Препараты просматривали и фотографировали на микроскопах Hitachi HU-11B и , HU-12 при ускоряющем напряжении 75 кВ. Более толстые срезы (до 150-200 нм)

просматривали и фотографировали под разными углами зрения на высоковольтном микроскопе НИасЫ Н-700Н, снабжённом гониометром. Полученные стереопары использовали для получения информации о трёхмерной структуре объекта.

В области прохождения жгутиков через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану, где, как известно, у эубактсрий расположен вращающий жгутик мотор, у галобактерий никаких специализированных структур выявлено не было. Вместе с тем, на полученных препаратах отчетливо видно, что жгутики галобактерий значительно глубже погружены в цитоплазму, чем это всегда наблюдалось у эубактерий. При этом их основания связаны вместе сложной структурой, ранее на препаратах бактерий не описанной. На одиночном продольном срезе через клетку при малом увеличении эта структура выглядит как электронноплотная линия длиной до 250300 нм, расположенная параллельно цитоплазматической мембране в основании пучка жгутиков. Анализ серийных срезов (рис. 2) показал, что такие линии представляют собой поперечные сечения пластинки приблизительно дисковидной формы, всегда расположенной точно в месте вхождения пучка жгутиков в клетку на расстоянии около 20 нм от цитоплазматической мембраны. На наших препаратах не было выявлено ни одного пучка жгутиков без такой дискообразной пластинки у основания. Биполярные клетки, с двумя пучка-

Рис. 2. Серия электронны микрофотографий послед* нательных ультратонки срезов через полюс клетк На1оЬас1епит sa.linari.un Масштаб, линейка - 100 нм

Рис. 3. Детали строения дискообразной пластинчатой структуры. А электронная микрофотография на полюсе клетки Н. заИпапит, фотографированная при большом увеличении. Стрелками обозначены кгутики. Масштабная линейка - 20 нм. Б - одна из кривых оптической шотности, полученная сканированием участка негатива фотографии А. Стрелками обозначены участки кривой, соответствующие ДПС и щтоплазматической мембране.

ш жгутиков, имели, соответственно, по две дискообразных пластинки.

При большем увеличении на срезах, прошедших точно поперек [искообразной пластинки видно (рис. ЗА), что эта пластинка на самом [еле представляет собой сложную структуру, состоящую из ряда слоев, (бладающих неодинаковым сродством к четырехокиси осмия. В ее :оставе отчетливо различимы два электронноплотных, осмиофильных :лоя, разделенные светлым, неокрашенным промежутком. Морфология •тих слоев и их взаимное расположение полностью соответствуют

существующим представлениям о том, как должны выглядеть г электронномикроскопических препаратах мембраны, фиксированнь четырехокисью осмия. На рис. ЗБ приведена одна из кривых оптическс плотности, полученных путём сканирования снятых при увеличени 60000 раз негативов на лазерном сканере-денситометре. Видно, что хот в целом электронная плотность дискообразной пластинчатой структур (ДПС) несколько выше плотности цитоплазматической мембраны (так! различия бывают связаны с белковым и липидным составом мембран профили оптической плотности в целом совпадают.

Одним из основных принципов изучения тонкой структу биологического объекта методом электронной микроскопии являет сопоставление результатов, полученных при применении различи способов приготовления препаратов. Использование разн фиксирующих веществ позволяет делать вполне определённые выво, относительно химической природы выявляемых структур. Результа наших опытов по фиксации клеток перманганатом калия, а также экстракции липидов подтверждают предположение о наличии в состг ДПС мембранной структуры: наблюдаемые в наших эксперимен' изменения структуры ДПС оказались аналогичны изменение претерпеваемым цитоплазматической мембраной.

Аналогичным образом были исследованы срезы клеток Н. ИаЬЫи и Иа1гопоЬас1епшп magadii. В них также в основании жгутиков был обнаружены структуры, подобные ДПС Н. заНпапит. Необходим отметить, что работа с натронобактериями связана с дополнительным трудностями, обусловленными высоким рН среды роста. Результат фиксации при этом не столь удовлетворительны, как в случс галобактерий, растущих при значениях рН, близких к нейтральному.

Фиксация галобактерий в присутствии ионов Са2+.

Добавление в фиксирующий раствор ионов кальция концентрациях порядка 0.1% (10 мМ) широко используется электронной микроскопии эукариот и бактерий для обеспечения лучше сохранности ультраструктуры мембран. В наших опытах этот приё

привел к значительному уплотнению клеток со сжатием клеточной стенки и ДПС, а также промежутка между ДПС и цитоплазматической мембраной.

Примечательно, однако, что в этих условиях в составе ДПС становятся видны утолщения в местах прохождения жгутиков. Данное наблюдение представляет интерес в связи с непрекращающейся дискуссией по поводу того, снабжен ли каждый жгутик галобактерии собственным мотором или же все они вращаются на одной общей моторной "плате" (Мапуап еС а!., 1991, .1. Вааепо!., 173:1971).

Мягкое разрушение клеток снижением концентрации N0 С1.

К сожалению, подробности организации полярных структур плохо различимы в интактных, заполненных электронноплотным материалом клетках. Мы использовали для изучения ультраструктуры галобактерий их чувствительность к снижению концентрации ЫаС1. В наших опытах на первом этапе лизиса, при снижении концентрации соли до 3-3.5 М, наблюдались разрывы клеточных оболочек с вымыванием цитоплазмы в процессе дальнейшей обработки для электронной микроскопии. Если удачно подобрать режимы лизирующей обработки и фиксации, удаётся зафиксировать клетки именно на этом этапе, т.е. до появления заметных повреждений ультраструктуры самих оболочек и жгутиков.

Применение методики обработки клеток перед фиксацией растворами с пониженной концентрацией ЫаС1 позволило получить важную дополнительную информацию о ДПС и жгутиках.

Рис. 4. Срез "тени" клетки На1оЬас1епит заИпапит Отчётливо видно прохождение жгутиков. Масштабная линейка - 100 нм.

Во-первых, оказалось, что ДПС достаточно прочно связана цитоплазматической мембраной: часто удавалось наблюда лизированные клетки с практически полностью вымытым содержимым даже отдельные небольшие фрагменты клеточной оболочк сохранившие, однако, неповрежденный пучок жгутиков, связанный дискообразной пластинчатой структурой. На таких препаратах (рис. особенно хорошо видно, что жгутики, пройдя сквозь клеточную стенку цитоплазматическую мембрану, достигают дискообразной пластинки очевидно, пронизывают и ее, заканчиваясь несколько дальше цитоплазме.

Во-вторых, на полученных по этой методике препаратах луч] видны детали строения ДПС. В частности, хорошо вид] слабоокрашенные нитевидные структуры толщиной не более 4-5 I (менее половины толщины жгутика), связывающие ДПС цитоплазматической мембраной (рис. 5). На препаратах интактн клеток эти нити также присутствуют, но в большинстве случаев быва "заслонены" близлежащими электронноплотными структура\ поскольку толщина самых тонких срезов превышает толщину нт более чем в десять раз. Принимая во внимание недавние сообщения обнаружении в составе жгутиков галоалкалофильных арх

"М-

Рис. 5. Срез "тени" клетки Hal bacterium salinarium. Стрелкам обозначены нитевидные структур1 Масштабная линейка - 100 нм.

протофиламентов (Fedorov et al., 1994, Can. J. Microbiol., 40:45), было бы соблазнительно предположить связь этих нитевидных структур со сборкой жгутиков, механизм которой у архей, как известно, принципиально отличается от способа сборки жгутиков бактерий. Полностью такую возможность исключать нельзя, поскольку иногда бывает видно, как такие нити, подобно жгутикам, пройдя сквозь ДПС, продолжаются несколько дальше вглубь клетки. Более очевидным, однако, представляется, что изогнутые нитевидные структуры к жгутиковым нитям прямого отношения не имеют, а служат для закрепления ДПС (других структур, которые могли бы . фиксировать ДПС, не обнаружено).

Помимо дискообразной пластинчатой структуры, в клетках галобактерий присутствует полярная органема, которая отличается от ДПС по ультраструктуре и по локализации. Цитохимическое выявление АТФазной активности в клетках галобактерий.

Анализ серийных срезов выявил во всех исследованных клетках вблизи полюсов присутствие другой сложноорганизованной структуры, на первый взгляд, напоминающей обнаруженную нами ДПС, однако имеющей совершенно иное строение и локализацию. На отдельных срезах при небольшом увеличении она также может, иметь вид параллельной цитоплазматической мембране электронногоютной линии, однако эта линия никогда не простирается в зону вхождения жгутиков. Внимательное рассмотрение срезов при большом увеличении обнаруживает и другие существенные отличительные черты. "Подстилая" цитоплазматическую мембрану приблизительно на том же расстоянии, что и дискообразная пластинка, описываемая структура, в отличие от нее, не содержит мембраноподобного образования и соединена с цитоплазматической мембраной регулярно расположенными электронноплотными мостиками, в основании которых иногда удаётся разглядеть отдельные частицы-глобулы. Одинаковый вод этой структуры на продольных и на поперечных срезах через клетку позволяет предположить, что она состоит из повторяющихся субъединиц, упакованных в двумерный пласт, прилегающий к цитоплазматической

мембране. Серийные срезы выявляют сложную форму данной структур] простирающейся на десятые доли микрометра в продольном и поперечном направлениях вдоль цитоплазматической мембраны, которой она тесно прилегает. По своей ультраструктуре и г расположению в клетке она очень напоминает известную уже более ; лет так называемую "полярную органеллу" (по традиции иног; называемую также "полярной мембраной", Murray & Birch-Anderse; 1963, Can. J. Microbiol., 9:393), встречающуюся у эубактерий. Э' высокоупорядоченная структура характерна только для бактерш имеющих на полюсе один или несколько жгутиков (Tauschel, 198 Methods in Microbiology, 20:237-259). Выявление в составе полярнс органеллы АТФаз и цитохромоксидаз (Brock & Murray, 1988; Can. J. M crobiol., 34:594, Tauschel, 1985, Arch. Microbiol., 141:303) позволит предположить для нее роль мощной внутриклеточной энергетическс станции. Следует, однако, подчеркнуть, что полярная органелла никог; не простирается непосредственно в область вхождения жгутиков в клеть (Ferris & Beveridge, 1984, Can. J. Microbiol., 30:322), и ни разу не бьи продемонстрирована ее структурная связь со жгутиками. Таким образои в пользу ее участия в работе жгутиков пока говорят лишь косвеннь данные.

Обнаруживаемые в клетках архей субплазмалеммные структур (Cho et al., 1967, J. Bacteriol., 94:196; Robertson et al., 1982; J. Ultrast. Res 80:148; Jarrell & Koval, 1989, CRC Crit. Rev. Microbiol., 17:53; Gongadze < al., 1993, Current Microbiol., 27:5) по традиции обычно соотносят полярной органеллой ("полярной мембраной"), блестящ охарактеризованной в работах Мэррея и Таушела. Между тем, по своем расположению по крайней мере некоторые из них больше напоминаю описанную нами ДПС. С помощью цитохимической реакции на АТФаз мы выявили ещё одно отличие между двумя субплазмалеммным структурами Halobacteriiim salinarium.

Цитохимическую локализацию АТФазной активности проводили п методике Таушела (Tauschel, 1988, Methods in Microbiology, 20:237-259^ представляющей собой модификацию метода Вахштейна-Майзель, необходимыми изменениями, связанными, в основном, с экстремально

концентрацией NaCl, необходимой для жизнедеятельности галобактерий и активности их ферментов. Суть метода состоит в "захвате" ионами звинца неорганического фосфата с образованием нерастворимого осадка РЬ5(Р04)0Н на месте гидролиза АТФ. Высокая электронная плотность образующегося осадка, наряду с минимальной диффузией, позволяет использовать данную процедуру для электронномикроскопической визуализации активности фермента. После проведения цитохимической реакции клетки подвергаются традиционной обработке для электронной микроскопии.

Были испробованы три основных варианта: 1) с префиксацией глютаровым альдегидом; 2) с префиксацией формальдегидом; 3) без префиксации, живые клетки помещали непосредственно в инкубационную среду.

Сильная АТФазная реакция наблюдалась на срезах в местах локализации полярной органеллы, но не ДПС, после инкубации клеток в среде с субстратом без предварительной префиксации. В контрольных опытах - без добавления субстрата - электронноплотного осадка не наблюдалось. Важно отметить, что мы использовали АТФазную реакцию in situ в качестве маркёра, позволившего нам разграничить в клетках галобактерий полярную органеллу и ДПС.

Таким образом, на срезах клеток Halobacterium salinarium нам удалось идентифицировать, помимо ДПС, структуру, которая не только морфологически соответствует полярной органелле эубактерий, но и обладает характерной для полярной органеллы АТФазной активностью. Необходимо ещё раз подчеркнуть, что мы пока не располагаем данными, которые позволили бы всерьёз говорить о роли полярной органеллы в работе жгутиков. Тем не менее, сам по себе факт обнаружения подобной структуры в клетках архей представляется чрезвычайно интересным и позволяет предположить её связь с какими-то жизненно важными функциями, общими для клеток галобактерий и архей. Стрит также отметить, что ультраструктура галобактерий в целом очень напоминает таковую грамотрицательных эубактерий, кроме того, галобактерий

Рис. 6. Схематическое изображение полюса клетки Halobacteriu, salinarium: Ж - жгутики, КС - клеточная стенка, ЦПМ цитоплазматическая мембрана, ДПС - дискообразная пластинчата структура, ПО - полярная органелла. Масштаб не соблюден.

оказались довольно близки к Е. coli по структуре ответственных за такс! метилакцептирующих белков (Alam & Hazelbauer, 1991, J. Bacterid 173:5837) и последовательностям рибосомных РНК (Gouy & Li, 198' Nature, 339:145).

На рис. 6 представлена схема расположения полярных структур галобактериальной клетке, построенная по результатам анализа боле чем двадцати полных серий срезов, прошедших под разными углами продольной оси клетки. Несмотря на то, что на срезах часто наблюдаете очень близкое взаимное расположение дискообразной пластинчато структуры и полярной органеллы, четкой связи между ними обнаружил не удалось.

Как уже отмечалось выше, ни у одной из исследованных нами архе не было выявлено никаких специализированных структур в облает прохождения жгутиков через клеточную стенку и цитоплазматическу] мембрану, хотя на срезах клеток эубактерий практически всегда можн различить диски базального тела и некоторые дополнительны структуры, связанные со жгутиками. Принципиально иная организаци клеточной стенки у архей (Firtel et al., 1993, J. Bacteriol., 175:755(

>зволяет предположить, что их жгутики также закреплены иначе, чем у бактерий. Так, археон Thennoplasma acidophihim как будто вообще 1шён клеточной стенки, но тем не менее имеет жгутики и подвижен Hack et al., 1979, J. Bacteriol., 137:456). Мембраноподобные структуры в :новании пучка жгутиков обнаружены не только в клетках архей-лофилов и галоалкалофилов, но также и у метаногенов (Jarrell & Koval, 189, CRC Crit. Rev. Microbiol., 17:53) и серозависимых термофилов iongadze et al., 1993, Current Microbiol., 27:5). Мы предполагаем, что гутики в клетках архей закреплены при помощи специализированных руктур, подобных описанной нами ДПС.

Из появившихся предварительных данных по выделению из клеток )хей структур, связанных с основаниями жгутиков (Kupper et al., 1994, Bacteriol., 176:5184), складывается впечатление, что связывающая :нования жгутиков ДПС значительно более лабильна, чем сами гутики; до сих пор никому не удалось подойти к выделению таких груктур, очищенных хотя бы от основной массы жгутиков, без чего не редставляется возможной их биохимическая характеристика. Больший :пех, возможно, принесёт применение генетических методов.

Перспективным подходом для дальнейшей характеристики структур тутикового аппарата архей нам представляется также изучение окализации флагеллинов в клетках методом электронномикрос-опической иммуноцитохимии, который позволяет непосредственно сследовать локализацию антигена. С этой целью были получены im ¡тела, специфически связывающиеся с флагеллпнами Halobacterium ilinarium.

Получение полнклональных антител к флагеллинам Halobacterium alinarium.

Жгутики выделяли из культуры, находящейся в стационарной фазе юста, при помощи дифференциального центрифугирования. Первый тап очистки состоял в высокоскоростном центрифугировании юлученных препаратов в градиенте хлористого цезия. Однако даже

Рис. 7. Электрофорез е ПААГ с ДСН выделенных дифференциальным центрифугированием жгутиков На-1оЬасЬегшт заИпапит: неочищенные жгутики (1), фракции, полученные центрифугированием в градиенте СбСЛ (2-4).

после многократного центрифугирования электрофорез выявл присутствие высокомолекулярных примесей. Поэтому препара' жгутиков, полученные центрифугированием в цезиевом градиенте, бы. подвергнуты дальнейшей очистке при помощи электрофореза. Из ге. (рис. 7) вырезали зоны, соответствующие флагеллинам; д. иммунизации кроликов использовали как непосредственно тщателы гомогенизированный с адыовантом гель, так и экстрагированный переосажденный белок.

Полученную сыворотку тестировали методом Вестер] иммуноблоттинга, а также при помощи иммуноэлектронной микро копии.

Окрашивание нитроиеллюлозных реплик получение антисывороткой (рис. 8) выявило три полосы, соответствующие г своему расположению флагеллинам Н. заИпапит. Хотя хи иммуноблоттинга использовались препараты неочищенных жгутико реакции с другими белками не наблюдалось. Контрольная инкубация преимунной сывороткой дала отрицательный результат.

16

67 '

30

20

Рис. 8. Тестирование полученных антител методом Вестерн-иммуноблоттинга. А электрофорез в ПААГ с ДСН выделенных дифференциальным центрифугированием неочищенных жгутиков Halobacterium sali-narium. Б, В - иммунопероксидазное окрашивание нитроцеллюлозной реплики сывороткой с антителами к флагеллинам (Б) и преимунной сывороткой (В).

Электронномикроскопическое тестирование проводили методом ак называемого "постэмбеддинга", т.е. окрашивания антителами после аливки, на срезах. Недостаток этого способа состоит в том, что при орошей фиксации материала, обеспечивающей сохранность льтраструктуры, антигенные детерминанты часто становятся [едоступны либо деградируют. Поэтому для тестирования антител |бычно применяют слабую фиксацию с заливкой в гидрофильные криловые среды либо получают криосрезы. Мы фиксировали алобактерии глютаровым альдегидом и формальдегидом, взятыми в шличных соотношениях, и заливали в LR White. Места связывания нтител на срезах выявляли с помощью протеина А, коньюгированного с нм частицами коллоидного золота.

Сохранность структур на срезах оказалась несколько менее довлетворительной, чем это обычно наблюдается при такой же 1етодике у эукариот и бактерий, однако отчётливо видны жгутики и неположенные вдоль них частицы золота, указывающие места вязывания антител. Обнадёживает тот факт, что и на срезах кросс-юакция с белками клеточной стенки - также гликопротеинами, -

которую вполне можно было ожидать, крайне незначительна, ecj вообще имеет место. Кроме того, полученные антитела, по-видимом обладают хорошей авидностью, поскольку метка не смывалась со срез< в процессе последующего окрашивания цитратом свинца при рН 12, ч нередко наблюдается в подобных случаях.

Таким образом, полученный результат позволяет рассчитывать j то, что уже в ближайшем будущем удастся использовать этот метод д дальнейшей характеристики жгутикового аппарата архей. Известно, ч антитела достаточной специфичности и авидности позволяи использовать более жёсткие методы фиксации и заливки (Bendayan Zollinger, 1983, J. Histochem. Cytochem., 31:101).

Имея антисыворотку, специфически реагирующую с флагеллина\ Н. salinarium, мы решили проверить, не будет ли в аналогичных услови; реакции с флагеллинами Н. halobium и Natronobacterium magaa Окрашивания на блотах не наблюдалось. Такой результат не явил* неожиданностью, поскольку хорошо известно, что прокариотическ! жгутик в значительной степени определяет серологичесю характеристики клеток данного штамма.

ВЫВОДЫ.

1. В составе жгутикового аппарата галофильных архей впервь описана новая структура. Жгутики галобактерий значительно глуб» погружены в цитоплазму, чем это до сих пор наблюдалось у бактерий, их основания закреплены особой дисковидной пластинкой. Э дискообразная пластинчатая структура (ДПС) имеет сложное строение включает мембраноподобное образование.

2. Обнаруженная в клетках галобактерий дискообразш пластинчатая структура достаточно прочно связана с цитоплазматическс мембраной. Особые нитевидные структуры толщиной до 4-5 ш

|бнаруживаемые на срезах наряду со жгутиками, возможно, служат для акрепления ДПС.

3. Непосредственно под цитоплазматической мембраной вблизи холюсов клеток галобактерий, как и у эубактерий с полярным кгутикованием, располагается так называемая "полярная органелла". Эна существенно отличается от ДПС по своему строению и по расположению в клетке.

4. В отличие от полярной органеллы, ДПС не обнаруживает АГФазной активности при проведении цитохимической реакции по методу Вахштейна-Майзель.

5. Получены антитела к флагеллинам Halobacterium salinarium, специфически связывающиеся на срезах со жгутиками. Эти антитеза не реагируют с флагеллинами Halobacterium halobium Flx3.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. БакееваЛ.Е., Метлина А.Л., Новикова Т.М., Сперанский В.В. Ультраструктура жгутикового аппарата Halobacterium salinarium.// Доклады РАН. 1992. Т. 326. С. 914-915.

2. Bakeeva L.E., Medina A.L., Novikova Т.М., Speransky V.V. A disk-like lamellar structure as part of the flagellar apparatus of Halobacterium salinarium. "Biological Motility". International Symposium dedicated to the memory of academician G.M. Frank. Pushchino, September 25 - October 1, 1994. Abstracts. P. 275.

3. Сперанский В.В., Метлина А.Л., Новикова Т.М., БакееваЛ.Е. Дискообразная пластинчатая структура как часть жгутикового аппарата архей.// Биофизика. 1996. Т. 41. С. 159-163