Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение жгутиков галофильных архей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение жгутиков галофильных архей"

- #

^ #

/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА

На правах рукописи

СЕРГАНОВА Инна Сергеевна

ИЗУЧЕНИЕ ЖГУТИКОВ ГАЛОФИЛЬНЫХ АРХЕЙ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН, в Институте белка РАН и в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научные руководители:

кандидат биологических наук А.Л. Метлина

доктор биологических наук О.В. Фёдоров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.К. Каграманова

кандидат биологических наук В.Н. Ксензенко

Ведущая организация:

Филиал Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН г. Пущино

Защита состоится "¿У" /Ь/)[1-[/!Л 1998 г. в часов на заседании диссертационного совета К 002.96.01 по присуждению учёной степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 117071 Москва, Ленинский проспект, 33, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский проспект, 33, корпус 1).

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук

М.И. Молчанов

БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди микроорганизмов, подвижность которых осуществляется i счёт вращения жгутиков, существует группа, состоящая из представителей метаногенов, сстремальных галофилов, Thermoplasma и множества сульфат-зависимых термофилов и тертермофилов. Эти микроорганизмы ранее относили к архебактериям, а по новой 1стематике они принадлежат домену Archaea, отделенному от доменов Bacteria и Eucaria Voese et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87, 4576). Жгутиковая подвижность клеток :тречается в каждом из этих доменов. Долгое время считалось, что механизм исгериального движения аналогичен волнообразным биениям эукариотических жгутиков и веничек. Однако была доказана вращательная модель функционирования бактериального гутика: нить жгутика вращается, благодаря микромотору, встроенному в мембрану и геточную стенку, и при этом выполняет пассивную роль гребного винта (Silverman & шоп, 1974, Nature, 249, 73-74). Позднее было показано, что движение бактерий ¡еспечивается трансмембранным протонным градиентом, а не АТФ, как у эукариот ilagolev & Skulachev, 1978, Nature, 272, 280-282). Таким образом, аппараты подвижности ктерий и эукариот принципиально различаются. Жгутики архей морфологически подобны ктериальным, потому предполагали, что структурно и функционально они также дственны. Исследование структуры и свойств органелл подвижности архей началось в 84 г. с изучения жгутиков Halobacterium halobium (Alam & Oesterhelt, 1984, J. Mol. Biol., 4, 495). Результаты этой работы и последующих исследований жгутиков ряда таногенных и алкалофильных архей свидетельствуют об их значительном отличии от утиков бактерий.

Так, бактериальные жгутики состоят из единственного флагеллина (за немногими ключениями), а нити жгутиков архей у всех исследованных культур состоят из нескольких агеллинов. Транспорт флагеллинов из бактериальной клетки к растущему концу жгутика ктерий осуществляется флагеллин-специфическим путём, через канал внутри базального та и полости внутри самого жгутика (Namba et al., 1989, Nature, 342, 648-654). Жгутики кей в два раза тоньше (10-13 нм) бактериальных поэтому трудно предположить наличие у х внутренней полости. Обнаружение лидерного пептида у флагеллинов архей указывает на ычный механизм транспорта белков через мембрану и, таким образом, отличный от <териального механизма сборки нитей жгутиков архей. Для флагеллинов архей зактерны посттрансляционные модификации, связанные с гликозилированием этих IKOB. Известно, что у бактериальных флагеллинов консервативные N- и С-концевые

участки участвуют в формировании межсубъединичных контактов нити, в то же время у ранее исследованных архей обнаружена консервативность лишь Ы-концевой гидрофобной последовательности флагеллинов. Таким образом, все имеющиеся на сегодняшний день данные свидетельствуют о том, что жгутики архей по ряду свойств принципиально отличаются как от бактериальных, так и от эукариотических жгутиков.

Предыдущие немногочисленные исследования жгутиков галофильных архе{ ограничивались лишь физико-химическими и биохимическими методами изучения. Е настоящей работе список исследованных микроорганизмов значительно расширен \ исследования дополнены генетическими методами. Данная работа наряду с другими проводящимися под руководством д.б.н. О.В. Фёдорова и к.б.н. А.Л. Метлиной, позволяет расширить паши знания и приблизиться к расшифровке общего принципа строенш жгутиков, как галофильных, так и других ранее изученных архей.

Цель и основные задачи работы. Настоящая работа посвящена изучению структурь ранее не изучавшихся жгутиков галофильных архей, представителей родов На1оЬас1егшт На1о/егах, На1огиЬгит, . ЫшгопоЬас1егтт, Ма1г1а1Ьа. Были поставлены следуюцда экспериментальные задачи: (1) выделить нити жгутиков нескольких представителе! .галофильных и галоалкалофильных архей, (2) определить их белковый состав, (3 определить имеется ли гомология генов флагеллинов галофильных и других архей, (4 клонировать и секвенировать гены флагеллинов одного из наиболее интересны: представителей галоалкалофильных архей.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе исследований был* показано, что многокомпонентный состав жгутиков архей является типичным дл представителей галофильных архей. Для них характерна консервативность Ы-концевог участка флагеллинов, играющего важную роль в формировании жгутика. Показано, чт флагеллины изученных архей кодируются несколькими генами, которые, как в случа ИшпаШа magadii (ЫшгопоЬааегшт magadii), гены которой были клонированы секвенированы в настоящей работе, могут значительно отличаться по последовательное^ Обнаруженная гомология флагеллина N. magadii с пилинами бактерий, и отсутстви подобной гомологии с бактериальными флагеллинами, а также данные по структуре эти жгутиков, полученные ранее в группе надмолекулярных белковых структур Института белк РАН, позволяют сделать вывод, что аппарат подвижности архей, по-видимому, являете третьим эволюционно независимым типом аппарата подвижности клеток.

Структура диссертации. Диссертация состоит из трёх основных частей: 1) обзор

штературы, 2) экспериментальной части, 3) результатов и их обсуждения. Работа свершается выводами и списком цитируемой литературы, иллюстрируется рисунками и таблицами.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы доложены на Международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 1994), на Первой международной конференции по экстремофилам (Эсторил, Португалия, 1996), на II открытой городской конференции молодых учёных г. Пущино (Пущино, 1997), на Втором съезде биохимического общества РАН, на научной конференции Института Белка РАН (Пущино, 1997). По теме диссертации опубликовано б печатных работ. В банк последовательностей EMBL (г. Гейдельберг) помещены последовательности секвенированных генов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ субъедннччного состава жгутиков галофильных архей

Для сравнения жгутиков различных галофильных архей нами были выбраны микроорганизмы, обладающие рядом особенностей: Halobacterium volcanii - согласно последним принципам классификации относится к новому роду Haloferax, способен жить в среде с относительно низким содержанием NaCl (2,5 М); Halobacterium (Halorubrum) saccharovorum - обладает особым типом метаболизма, так как использует для роста карбогидратные соединения; Natronobacterium pharaonis 12 - является алкалофильным микроорганизмом, обитающим в среде с рН 9-10; Halobacterium salinarium, объединяемый с Halobacterium halobium в один вид, по данным ДСН-электрофореза имеет отличный от Н. halobium субъединичный состав жгутиков.

В литературе имелись данные о расположений и морфологии жгутиков галофильных архей Н. salinarium, полученные электронно-микроскопическими методами, однако, ничего не было известно о жгутиках других вышеперечисленных организмов, чья подвижность была зарегистрирована лишь методом световой микроскопии (Torreblanca et ah, 1986, System. Appl. Microbiol., 8, 89). Проведенные нами электронно-микроскопические исследования выявили наличие пучка жгутиков на полюсах клеток всех вышеперечисленных микроорганизмов. Таким образом, данные архей имеют лофотрихиальный тип жгутикования (рис. 1), описанный также для большинства метанообразующих архей. Жгутики всех исследуемых архей представляют собой типичные нитевидные структуры, наблюдаемые и у других архей.

Рис. 1. Электронно-микроскопическая фотография клетки НаЬЪааегтт (На1о/егах) \olcanii ( полярно расположенным пучком жгутиков. Масштабная линейка -100 нм.

Рис. 2. Электронно-микроскопическая фотография жгутиков На1оЬас!егтт (НЫогиЪгит) яасскагоуогит. Масштабная линейка - 100 нм.

/ : .V i

Рис. 3. Электрофореграмма белков жгутиков галофильных архей в 12%-ном ПААГ с ДСН после очистки жгутиков в градиенте СяО: 1 - Н. $аИпагтт\ 2 - Н. Уо1сапИ; 3-Я. $ассЪаго\огит\ 4 -N. рИагаоп1.ч 12.

la рис. 2 представлена электронная микрофотография очищенных жгутиков Isaccharovorum с диаметром нити 10-11 нм, соответствующем размеру жгутиков ранее зученных архей (Kalmokoff et al., 1991, J. Bacteriol. 173, 3716-3721). По данным тектрофореза в ПААГ очищенные жгутики изученных нами архей состоят из нескольких лагеллинов: трёх у Я. saccharovorum (M r = 50000, 47000, 40000) и двух у N. pharaonis 12 Лг = 84000, 41000); четырёх у Я. salinarium (Мг =30000, 29000, 27000, 25000); пяти у Я. ilcanii (Мг = 43000, 39000, 32000, 29000, 26000) (рис. 3). По молекулярным массам лагеллины Я. salinarium и Я. volcanii близки к флагеллинам Я. halobium.

2. Поиск гомологичных участков у флагеллинов галофильных anxeii

В группе К. Джаррелла (Канада) ранее было показано, что флагеллины весьма :даленных друг от друга метаногенных архей и галофильного археона Я. halobium имеют шсервативные N- концевые аминокислотные последовательности (Kalmokoff et al., 1990, ochem. Biophis. Res. Commun., 167, 154-160). Поэтому несомненный интерес представляла шытка обнаружения гомологичных участков у флагеллинов и других представителей ixeft. Оказалось, что секвенирование флагеллинов галоалкалофильных архей затруднено из-блокирования N-концевой , аминокислоты, поэтому было решено искать наличие |нсервативных участков в генах флагеллинов жгутиков методом гибридизации по 1узерну. На основе известной первичной последовательности генов флагеллинов Я. iobium I^Mj (Gerl & Sumper, 1988, J! Biol. Chem., 263, 13246-13251) были синтезированы игонуклеотиды к 5' - и 3'- концам локуса А, содержащего два (flgM, flg\2) из пяти этих нов. Методом полимеразной цепной реакции, фрагмент ДНК размером 1,2 тыс. пар

/ /

Рис. 4. Гомология между ДНК галофильн архей и генами ßgA\ и flgAl, кодирующи флагеллины H. halobium. Гибридизация Саузерну геномной ДНК архей, расщепленн рестриктазой ВатШ, фракционнированной размеру в 0,8 % агарозном геле, и радиоактив меченного ПЦР- фрагмента, содержащего ге flgAl и flgA2 га Я. halobium-. 1 - Я. salinarium, Я volcanii, 3 - N. pharaonis 12, 4 -saccharovorum.

нуклеотидов, содержащий эти гены, был получен и в дальнейшем использован в качеств зонда. Последующая Саузерн-гибридизация этого зонда с фракционированными по размер рестрикционными фрагментами ДНК изучаемых нами культур, показала, что в геномах эти архей обнаруживаются последовательности, гомологичные генам флагеллинов из I halobium RiMj. Интересно, что число и размер гибридизующихся фрагментов в случае 1 salinarium, H. volcanii были такими же, как и у Я halobium (два фрагмента длиной около 1 и 5,5 тыс. пар нуклеотидов). У Н. saccharovorum длина гибридизующихся фрагменте составляла примерно 1,3 и 0,9 тыс. пар нуклеотидов, а у N. pharaonis 12 гибридизовал« лишь один достаточно крупный (21 тыс. пар нуклеотидов) фрагмент (рис. 4). Для H. halobiu ранее было показано, что два гена флагеллинов (flgAl и flgA2), составляющие локус j находятся во фрагменте 15 тыс. пар нуклеотидов ВатШ, три остальных (flgB\,flgQ2 и flglY: входящие в локус В, картируются в меньшем (5,5 тыс. пар нуклеотидов) фрагменте. I полученной недавно карты генома относительно генетически стабильной Halobacterium s GRB следует, что в геноме этого археона так же имеется дупликация локусов, содержагщ гены флагеллинов, причем локусы разделены, по меньшей мере, 42 тысячами п нуклеотидов (Jean et al., 1994, Nucl. Acids Res., 22, 1476-1483). Наши данные не исключа! возможности дупликации генов флагеллинов в исследуемых нами галофильных археях, т как для всех культур получено по два гибридизующихся с зондом фрагмента, а единственного исключения - N. pharaonis 12, фрагмент имеет достаточно большой размер по-видимому, мог бы содержать более одного, а возможно даже семейство ген флагеллинов. Известно, что геномы большинства галофильных архей бога инсерционными элементами и крайне нестабильны, что не позволяет с достаточн уверенностью сравнивать их между собой, в особенности в организмах, принадлежал: разным родам, как например, в случае Halobacterium, Haloferax, Halorubrum, Natrialba

atronobacterium.

Таким образом, консервативность определенного участка флагеллина, по-видимому, -концевого, о которой сообщали ранее для Я. halobium и ряда метаногенов, ¡спространяется также и на жгутики изученных нами галофильных архей Я. volcanii, Н. iccharovorum, Я. salinarium и жгутики представителей галоалкалофильных архей, таких как I pharaonis 12, N. magadii. Для полного подтверждения этого вывода, а также для шьнейших детальных исследований флагеллинов галоалкалофильных архей, мы решили тонировать и секвенировать гены флагеллинов наиболее интересного представителя этих эхей Natronobacterium (Natrialba) magadii.

3. Клонирование и секвенироваиие генов флагеллинов N. mdeadii

Из-за блокирования N-концевой аминокислоты флагеллинов N. magadii определение элной аминокислотной последовательности секвенированием этих белков невозможно, еквенирование триптических фрагментов позволило частично определить аминокислотную эследовательность одного из флагеллинов жгутиков N. magadii (наши неопубликованные шные), однако из-за вырожденности генетического кода синтезированные на их основе шгонуклеотиды не гибридизовались с высокой специфичностью с хромосомной ДНК этой зхеи. Однако, возможность высокоспецифической гибридизации генов флагеллинов Я ilobium с ДНК галоалкалофильных архей, продемонстрированная нами, позволяет спользовать их в качестве зонда при клонирование фрагмента ДНК, содержащего гены лагеллинов N. magadii. Саузерн-гибридизация с хромосомной ДНК N. magadii, эработанной различными рестриктазами, выявила в каждом случае взаимодействие этого )нда с двумя фрагментами ДНК, и лишь при рестрикции ферментом EcoRX гибридизовался !щн крупный (около 21 тыс. пар нуклеотйдов) фрагмент (рис. 5). Тот факт, что почти во ;ех случаях рестрикции, наблюдается гибридизация с двумя фрагментами геномной ДНК, газывает на вероятное наличие нескольких копий генов флагеллинов в геноме N. magadii. то согласуется с раннее полученными результатами для других архей. К настоящему оменту клонированы и секвенированы гены флагеллинов жгутиков у трёх архей: (ethanococcus voltae, Methanococcus jannaschii и Я. halobium. Во всех трёх случаях лагеллины кодируются семейством гомологичных генов. Так, у М. jannaschii это три гена Jult el al., 1997, Science, 273, 1058-1072), у M. voltae 4 гена (Kalmokoff & Jarrell, 1991, J. acteriol., 173, 3716-3721), ay H. halobium это 5 генов, которые формируют два отдельных

23 (Л4 6,5

4,3 2ß 2,0 0,5

Рис. 5. Определение ра' фрагментов ДНК для клониро! генов флагеллинов N. magadii. Cay гибридизация с радиоактивно мече! фрагментом ДНК, содержащим /7gAl и y/gA2 из Halobacterium halo

локуса (Gerl & Sumper, 1988, J. Biol. Chem., 263, 13246-13251). Саузерн-гибридизация

хромосомной ДНК N. magadii, обработанной рестриктазой Psi\, показала взаимодействи

зонда с двумя фрагментами ДНК длиной 1,4 и 5,5 тыс. пар нуклеотидов. Для клонировали

нами был выбран меньший по размеру фрагмент. Для предотвращения высокого фона пр:

скрининге библиотеки нами был проведён компьютерный анализ, который дал возможност

выбрать наименее гомологичные между собой плазмиду pUC19 для использования

качестве вектора и ген flgA2 из Я. halobium, который можно использовать как зон;

Обогащённая геномная библиотека из нескольких тысяч клонов была получена в клетках I

coli JM 109. После скрининга 800 колоний идентифицировано 4 клона с идентично

вставкой размером примерно 1,4 тыс. пар нуклеотидов. Для выделенного из одного клоп

фрагмента была составлена подробная карта рестрикции (рис.6), и, после субклонирования

М13-фагах, фрагмент был полностью секвенирован. Анализ первичной последовательное

фрагмента показал, что в его состав входит один целый ген флагеллина - ßaB2, один reí

кодирующий белок без N-концевой части - flab 1, и часть ещё одного гена, соответствующг

N-концевой последовательности белка -_/7<зВЗ. Клонированные гены имеют короткий участс

гомологии в 5'- концевой части с генами флагеллинов из Я. halobium, что и позволю

провести успешное клонирование локуса из N. magadii используя в качестве зощ

галобактериальный ген. 8

Pstl

Nrul Bgia

Hindi Hindi Hindi psti Smal Nrul ВатШ.

Д

100 нт.

flab3 ^ flab2

flabl

Рис. 6. Стратегия секвенирования клонированных фрагментов ДНК N. magadii. Верхняя часть: сайты рестрикции, использованные для субклонирования фрагментов. Средняя часть: карта локуса. Гены показаны прямоугольниками. Стрелками в нижней части показаны секвенированные участки ДНК.

4. Особенности генов флагеллинов N. maeadii и кодируемых ими белков

Интересной особенностью фрагмента, содержащего гены, кодирующие флагеллины N. magadii, является наличие очень короткого двунуклеотидного спейсера между генами //аВI и //аВ2, подобные явления характерны и для других генов галофильных архей (Spiridonova el а!., 1989, Can. J. Microbiol., 35, 153-159). Неожиданным является невысокое содержание G и С нуклеотидов в секвенированном фрагменте, составляющее 53,7 %. Это меньше, чем 63 % содержание G и С, характерное для геномов галофильных архей (Lodwick et а!., 1991, System. Appl. Microbiol., 14, 352-357). К сожалению, мы не можем сказать, является ли невысокое содержание G и С характерной особенностью генов флагеллинов, поскольку на сегодняшний день известна нуклеотидная последовательность лишь ещё одного гена N. magadii, кодирующего последовательность 16SpPHK. Анализ первичной последовательности полного гена флагеллина_/7оВ2 показал, что данная последовательность кодирует белок из 259 аминокислот с молекулярной массой 26535 Да и изоэлектрической точкой 3. Этот флагеллин имеет самую длинную аминокислотную последовательность из известных на сегодняшний день флагеллинов архей.

CTGCAGACGC AGGCAGAAGC CACCGGTGAA GAGAGTACAG ATCAAGTAAG TGACCGCCTG 60

LeuGlnThrG InAlaGluAl aThrGlyGlu GluSerThrA spGlnValSe rAspArgLeu

GACATCGTCA GTGTCTCAGG GGATGTTGAT GATCCCGATG ACCCTACTCA AATCAACAAC 120

AspIleValS erValSerGl yAspValAsp AspProAspA spProThrGl nlleAsrjAsn

ATCAGTATGG TGACTGCGAC TGCGCCGGGA TCGGATCCAG TTGACTTGAA TCAAACAACG 180

IleSeijMetV alThrAlaTh rAlaProGly SerAspProV alAspLeJAs nGlnThr|Thr

GCGCAGTTCA TCGGTGAGGG TGGTGAAGAG ATGTTTAATC TTAGCCACGA GGGCGTCTTC 240

AlaGlnPhel leGlyGluGl yGlyGluGlu MetPhejAsnL euSei|HisGl uGlyValPhe

ATCAACAGCA TCCAAGGCGT CACGGATGAA CCCGATAACA ACGTCTTGAC GGAAAGTTCG 300

IleAsnSerl leGlnGlyVa IThrAspGlu ProAspAsnA snValLeuTh rGluSerSer

GACCGTGCTG AAGTTGTGTT CGAATTAGAC GGAGCCCCAG GTAGTTACGA TATTGGCTAC 360

AspArgAlaG luValValPh eGluLeuAsp GlyAlaProG lySerTyrAs pIleGlyTyr

GAAGCATTGG ATGAGAGTGA ACGGTTGACG GTTATCCTGA CGACTGACGC CGGTGCGTCC 420

GluAlaLeuA spGluSerGl uArgLeuThr VallleLeuT hrThrAspAl aGlyAlaSer

ACCGAACAGG AGATTCGCGT TCCAAGTACC TTCATTGAAG ACGAAGAATC GGTGAGACTG 480

ThrGluGlnG luIleArgVa lProSerThr PhelleGluA spGluGluSe rValArgLeu

TAGCCATGTT CACTAACGAC ACCGACGACG GCCGCGGTCA GGTGGGGATC GGCACGCTCA 540

End MetPh eThrAsnAsp ThrAspAspG lyArgGlyGl nValGlylle GlyThrLeuI

TCGTGTTCAT CGCGATGGTG CTGGTCGCTG CGATTGCTGC GGGCGTCCTG ATGAACACAG 600

leValPhell eAlaMetVal LeuValAlaA lalleAlaAl aGlyValLeu MetAsnThrA

CTGGGATGTT GCAGTCCCAG GCTGAAGCAA CTGGTGAAGA GAGTACCGAC CTTGTCTCTG 660

laGlyMetLe uGlnSerGln AlaGluAlaT hrGlyGluGl uSerThrAsp LeuValSerG

AACGGATCGA TACCACGATC GCAGTGGGTA CCGTATCCAC CCATGTGGCA GACGGTGAAG 720

luArglleAs pThrThrlle AlaValGlyT hrValSerTh rHisValAla AspGlyGluA

ACGGTGCAGA TCGCGGTGAC TTAGCGGAGA TCAGTATTGG CGTTACCGGT GCACCCGGGG 780

spGlyAlaAs pArgGlyAsp LeuAlaGluI leSerlleGl yValThrGly AlaProGlyA

С AG AT GATAT TGACCTCAAT GAGACGATAA TTCAGGTCGT CGGTCCTGAG GGGGCAGAGA 840

laAspAspIl eAspLeJAsn GluThijllel leGlnValVa lGlyProGlu GlyAlaGluA

ATCTCGTCAT GGCTGACGGA AGCAATGACA TGAGTGAAGC TGGGTGGGAC GAAACTAGCA 900

snLeuValMe tAlaAspGly SerAsnAspM etSerGluAl aGlyTrpAsp GluThrSerT

CCACCGACAT TGGGAGTACT GAGAGTACTG ACCAAGGAGA TACTGACGAC GACGTAAACG 960

hrThrAspIl eGlySerThr GluSerThrA spGlnGlyAs pThrAspAsp AspVaJjÄsnA

CCTCAAACAT CGAGAGCGGA TACTTCGCTG TCGAAAACGA AGACGGATAC TTTGTCGAGG 1020

laSerlAsnll eGluSerGly TyrPheAlaV alGluAsnGl uAspGlyTyr PheValGluG

GTAGCGATGC AGTCCTCGAT GACAACAATG GCGAACTCAC GATCGTCTTC AATCCAAAAG 1080

lySerAspAl aValLeuAsp AspAsnAsnG lyGluLeuTh rlleValPhe AsnProLysV

TCGCACCATT TGGTGAGGCT GATGATGTAA GCGGCATCAC CCCTGGAGAT CTTCATGAAG 1140

alAlaProPh eGlyGluAla AspAspValS erGlylleTh rProGlyAsp LeuHisGluA

ATGACGTCTT CGGTGCGGGC ■GACGAGGCCT CGGTCGACAT CGTCTCGCCA TCCGGTGCAA 1200

spAspValPh eGlyAlaGly AspGluAlaS erValAspIl eValSerPro SerGlyAlaT

ССАССТСССТ ССААСТСААС ТССССАЕАСС ТСТТСАСССА СССЮСТСАА ССССТСССАС 1260 ЬгТЬгБегУа 1С1иЬеиАгп ЭегРгоАзрЬ еиРЬеЗегС1 иРго01уС1и А1аУа1АгдЬ ТСТААСТССС АТТТСТТАТС ТТТССААТАА ТСАТ&ГТСАС АТССААТАСА САТСАССАСС 132 0 еиЕпс! МегРЬеТЬ гБегАзпТЬг АэрАгрАгрА

СТССССАССТ ССССАТСССТ АСССТСАТСС ТСГТСАТССС САТСОТССТС СГСОСТСССА 1380 гд01уС1пУа 1С1у11еС1у ТЬгЬеиНеУ а1РЬе11еА1 аМе«а1Ьеи Уа1А1аА1а1 ТТССТОСССС ССТАТТСАТС ААТАСООСТС ССАТССТССАС 1421

1еА1аА1аС1 уУа1Ьеи11е АзпТЬгА1аО 1уМе1Ьеиа1п

Рис. 7. Последовательность клонированного фрагмента, содержащего гены флагеллинов N. magad¡i и кодируемые ими аминокислотные последовательности. Инициирующие кодоны подчеркнуты, рамками выделены возможные сайты гликозилирования.

Особой чертой галофильных белков является большое содержание кислых аминокислот. Так, суммарное содержание Asp и Glu во флагеллинах N. magadii составляет около 25%. Подобное явление наблюдалось и у ряда других белков галофильных архей. Известно, что кислые аминокислоты располагаются главным образом на поверхности галофильных белков и могут при физиологических рН связывать больше "свободной" воды, чем другие аминокислотные остатки (Frolow et al., 1996, Nature Struct. Biology, 3, 452-457). Это вносит существенный вклад в создании гидратной оболочки, которая, вероятно, защищает эти белки от агрегации при высоких концентрациях соли. Другой возможной функцией кислых аминокислот является стабилизация нативной конформации белка за счёт образования необычно большого количества солевых связей (Dym et al., 1995, Science, 267, 1344-1346).

Молекулярная масса флагеллина, который кодируется геном )7аВ2, значительно меньше, чем молекулярные массы флагеллинов данной археи, определенные ранее методом ДСН-электрофореза (Fedorov et al., 1994, Can. J. Microbiol., 40, 45-53), что, по-видимому, обусловлено аномальным связыванием ДСН с флагеллинами галофильных архей. Нельзя исключать также вклад гликозилирования в оценку молекулярной массы белков методом ДСН-электрофореза. Так известно, что два флагеллина N. magadii гликозилированы, и в их составе были найдены глюкоза и глюкуроновая кислота (Пятибратов М.Г., 1995, Дисс. канд. биол. наук, МГУ, Москва). В аминокислотной последовательности флагеллинов FlaB2 и FlaBl нами было обнаружено, соответственно 2 и 3 потенциальных сайта N-гликозилирования Asn-X-Thr или Asn-X-Ser. В FlaBl возможные сайты гликозилирования располагаются соответственно в позициях 40, 57, 73, а в FlaB2 в позициях 105 и 158 (рис. 7).

ГХаЬХпт ПаЬ2пл1 ПаЬЗпт

ЫГТШТОПСЕедУСХОТЬСТГХЙМУЬУААХМСТЬМНГАС

ЮДЕЛТСЕЕЗ ЗОАЕАТ СЕЕЭ

Т1К2У80КЫ)1У8У8К>?В-------ВРБ0РТ01НШ:БМУТА1МазЬР!ГОХЫ(2

1ОЬуЗЕаХШТ1АУрТуЗТНУДОСЕ0СЛСЛСВЬйЕ^83;С¥ТСМ6АЬор5Ь№;

ТТЙОГЮ-----------------ЁССЕЕМГИЬвНЕ&УЕЕнВхр^Й-----

Т11Ц7УСРЕСЛЕОТ,УМЛ0СЗН1МЗЕАвИПЕТНТ101рЗТЕ311)ЙС0ГЮ0Ут ХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХ

------------------РРВНЫУЬТЕЗЗОКЙЕУУГЕЫЗС^СЗУВКУЕМХ)

ВЫХЕЗСУЕ-ДУЕЫЕОСУГУРСЗРАУХХЮЫНСЕЬТГУЕНРКУ^ГСЕЛСОУВСЗП

хххххххххххххххххххххххххххххххххххххххх^схххххххххххх

Е-----------ЗЕЕЫУ1ХТТБАСА8ТЕ0ЕХаУРЗТЕ1ЕШЕЕзукьи-

РСОЬНЕПВУГСАСОЕАВУОХУрРБСАТТЗУрЖРБХЕЗ^СИ.УЦ—Ь

202

259

260

Рис. 8. Сравнение аминокислотных последовательностей флагеллина ПаВ2 и фрагментов белков Р1аВ1 и ИзНЗ из N. magadii. Анализ выполнен с учётом консервативных замен: считаются идентичными аминокислоты из групп (О, Ы), (Е, О), (К, К), (И, У, (Ь, I, V, М).

Ген /1аИ 1 был клонирован без 5'-концевой последовательности. Длина этого неполного гена, с учетом недостающей части, значительно меньше, чем длина гена/1аВ2, и кодирует белок длинной примерно 202 аминокислоты. При сравнении аминокислотной последовательности белков, кодированных генами/?аВ2 и/1аВ\, обнаружено, что для ИаВ2 характерно наличие вставок в центральной части последовательности и небольшая гомология в С-коицевых участках (рис. 8). Несмотря на достаточно значительные различия в последовательностях, флагеллины N. magadi¡ имеют высокогомологичные участки, один из которых, М-концевой участок, найден также у флагеллинов других архей. Сравнение аминокислотной последовательности белка НаВ2 из N. magadu, с представителями флагеллинов из других архей выявило практически полную идентичность М-концевой части белков размером примерно 25 аминокислот, начиная с 14 аминокислоты (рис. 9). Вероятно этот

flab2nm flab2hh flab2mv flab2i»j

gftndtddg jfefitded]

Jkikefms

¡¡kvfeflk'

52

53 53 53

SnDLnsEEnDTTXAVgrVSTHVADGEDGADRGDr

shrqssmtnhxvsaxsnvdtsgst-------ev|

SUEQHASGllQISQVtE---MHHHS------

sneqhas qjstlqviffl---ihdhk------

flab2nm flab2hh flab2mv flab2mj

etinqvvgpegaehlv

kstmqwi------

QAV№£LS------

qthmlit------

gshdmseaggetsttdigstestdqgdtdddvffi

jpdtattllfflgt------------------таш

-bSsH-krvyiifflessykdii-----tngg---dlrffl

~ rk-кдуг .rb?s nay api.-----tt gg---evt™

asniesgyfavenedcyfvegsdan

aehftths xkg--------dhadvw

hahvewikat at-------kfgivy

tslaawnlsgg--------efgilb

ddhigelt ivfhpkvap fgeadi

DQsffl-----R-------xexv

qdagesctsah-----pvihkgjlva

qdmgsckstt-----bvihkgffl]

JPGDLHEDDYFGAGDEASVDnvSPsgA' TTHGLKAGE------evqltg rTQYgSl

Slhttsfst—tprtsitgtJ ope:

JIHASAVGLNLVPRTTVTGsfllPEF

ittsvelnsadlfsepgeap rg—

¡sktiywahvSeslk-dkhaJ г Я— p giis гтгэатylhdsky? qfflq-

paviefttSaaylstqevP m-q

Рис. 9. Сравнение аминокислотных последовательностей флагеллинов архей, кодируемых генами у7аВ2. Последовательности белков взяты из банка ЕМВЬ. Аапш - На1гопоЪас1епит тацсиШ ПаВ2 (определена нами), ПаЬЬ - НЫоЬааег'шт Ъа1оЫит Р1аВ2 (Р13075), Пату - Ме1Ьапососст уокае Р1аВ2 (М72148), Пат}-Ме[Ьапососси.ч ¡аппаксЪи ПаВ2 (иб7533). Анализ выполнен с учётом консервативных замен: считаются идентичными аминокислоты из групп (О, Ы), (Е, ()), (К, К), (И, У, \У), (Ц I, V, М).

высококонсервативный участок молекулы играет важную роль при сборке нити жгутика. Кроме того, анализ распределения гидрофобных остатков в белке FlaB2 из N. magadii показал, что N-концевой участок является гидрофобным (рис. 10), что также указывает на вовлечение его в формирование межсубъединичных контактов, так как ранее было показано, что гидрофобные контакты являются необходимыми для поддержания четвертичной структуры жгутика (Tarasov el а/., 1995, J. Protein Chem., 14, 27-31). Предсказание вторичной структуры белка FlaB2 из N. magadii показало, что для N-концевого района характерно образование протяженной а-спирали. Такая вторичная структура, не имеющая никакого

£ coll

M. voltae

I WWW*

К gonorrhoeae

Рис. 10. Распределение гидрофобных аминокислот в последовательностях флагеллинов бактерии Е. соЧ, архей N. magadii и М. voltae и пилине типа IV бактерии N. gonorrhoeae.

подобия с бактериальными флагеллинами, предсказана и для флагеллинов Н. halobium.

Интересно, что протяжённая (53 аминокислотных остатка) гидрофобная а-спираль в N-

концевой части белка обнаружена в недавно определённой трёхмерной структуре пилина

типа IV из Neisseria gonorrhoeae, также образующим нитевидные структуры (Parge et al.,

1995, Nature, 378, 32-38). В кристалле молекулы пилина образуют димеры за счёт

гидрофобного взаимодействия N-концевых а-спиралей, что, согласно предложенным

авторами моделям, свидетельствует о весьма вероятном формировании коровой часть пиля

за счёт подобных взаимодействий. Сравнение аминокислотных последовательностей белка

FIaB2 из N. magadii и пилина N. gonorrhoeae показало некоторую гомологию по всей длине 14

pilin — mJjtlqkS------г?Яа:ь"1ЯУпус№"д^ТРАУ0РУТдвШун---E 42

flab2nm pilin

лх!

¡id]

gq:

.vgtnstl eyyim-il

JtfADG^EGADB ckwpSNTS?

¡isi

»-CEsppsdI

gaddidlJe kevevkJjg

106

93

flab2run тПхОуЛоРеЯае^Ь J^ADGSHDTOEAGVJD^rsSlDIGSTgSTDQGDjjTOJviiJ 15Э

pilin VgTATjLSSgVHjjEgKGK---K^LWRRrBhgHvKWFCGSPVTR—ЯяЯдГу' 141

flab2nm sniesgyfavehedgyfvegsjgvlddnhgeltxvfhpkvflpfgeaddvsgit : 212 pilin dakdgkeidtkhlpstcrdnf^yk----------------------------- : 165

flab2nm : pgdlheddvfgagdeasvdivspsgattsvelnspdlfsepgeavrl : 259 pilin : ----------------------------------------------- :

Рис. 11. Сравнение аминокислотных последовательностей белка FlaB2 из N. magadii и шшша из N. gonorrhoeae (Р02974). Последовательность пилина взята из банка EMBL.

последовательности белков (рис. 11). В то же время не обнаруживается гомология с бактериальными флагеллинами.

Ранее было показано, что флагеллины метаногенных архей синтезируются с коротким лндерным пептидом, отсутствующим у флагеллинов бактерий. Наличие короткого лидерного пептида характерно также и для пилинов типа IV. Специфической чертой лидерной пептидазы, производящей отщепление пептида у пилинов, является узнавание инвариантного глицина, находящегося перед гидрофобным участком последовательности белка. Такой глицин (в1у11) присутствует и в белках, кодируемых генами],?аВ2 и _/7аВЗ из N. magadu (рис. 8), что позволяет нам предположить, что первые 10 аминокислот белков, по-видимому, являются лидерным пептидом, отщепляемым сходным с флагеллинами других архей и бактериальными пилинами типа IV образом. Это наблюдение, а также сходство в первичной структуре белков позволяет предположить как схожий механизм отщепленния лидерного пептида, так и транспорта флагеллинов архей и пилинов бактерий для последующей сборки жгутиков и пилей.

Выводы

1. Впервые выделены и охарактеризованы нити жгутиков галофильных архей Halobacterium salinarium, Haloferax volcanii, Halorubrum saccharovorum и Natronobacterium pharaonis 12. Показано, что эти археи имеют лофотрихиальный тип жгутикования, и что в состав их жгутиков входит несколько флагеллинов. Гены флагеллинов изученных нами галофильных архей,имеют участок гомологии с генами флагеллинов Halobacterium halobium.

2. Клонирован и секвенирован участок геномной ДНК Natronobacterium (Natrialba) magadii, содержащий один целый ген флагеллина (/7аВ2), один ген, кодирующий белок без N-концевой части (/7яВ1), и часть ещё одного гена, соответствующую N-концевой последовательности белка (/?аВЗ).

3. Показано, что общими чертами строения флагеллинов различных архей является консервативность N-концевого участка и наличие вариабельных участков в центральной части молекулы.

4. Аминокислотные последовательности флагеллинов N. magadii, как и флагеллины других архей, не обнаруживают никакой гомологии с флагеллинами бактерий, но имеют гомологию, с бактериальными пилинами.

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Serganova I.S., Polosina Y.Yu., Kostyukova A.S., Metlina A.L., Pyatibratov M.G., Fedorov O.V. Comparison of morphology and subunits composition of Halophilic archaebacterial flagella. - International Symposium "Biological Motility". Abstracts, Pushchino, 1994, p. 285.

2. Серганова И.С., Полосина Я.Ю., Костюкова A.C., Метлина АЛ., Пятибратов М.Г., Фёдоров О.В, Жгутики галофильных архей: биохимический и генетический анализ. Биохимия, 1995, т. 60, вып. 8, с. 1261-1267.

3. Fedorov O.V, Kostyukova A.S., Polosina Y.Yu., Pyatibratov M.G., Serganova I.S., Tarasov V.Yu. A Unique Apparatus of Archaeal motility. - First International Congress on Extremephiles. Book of Abstracts. Estoril, Portugal, 1996, p. 253. '

4. Серганова И.С., Серганов A.A., Метлина А.Л., Фёдоров O.B. Флагеллины галоалкачофильного археона Natronobacterium magadii кодируются семейством генов. - II открытая городская научная конференция молодых учёных города Пущино. Тезисы докладов, г. Пущино, 1997, с. 67-68.

5. Серганова И.С., Серганов A.A., Метлина АЛ., Фёдоров О.В. Клонирование и секвенирование генов, кодирующих белки жгутиков галоалкалофильного археона

Natronobacterium magadii. - Второй съезд биохимического общества РАН. Тезисы стендовых сообщений, г. Москва, ч.П, с. 358-359.

6. Серганова U.C., Серганов A.A., Метлина А.Л., Фёдоров О.В. Флагеллины галоалкалофильного археона Natronobacterium magadii кодируются семейством генов. II открытая городская научная конференция молодых учёных г. Пущино. - Сборник трудов, г. Пущино, 1997, с. 35-41.

В банк данных EMBL (г. Гейдельберг) представлены нуклеотидные и аминокислотные последовательности генов и белков, определённые в настоящей работе

(AJ225175).

Автореферат Серганопой И.С. ИЗУЧЕНИЕ ЖГУТИКОВ ГАЛОФИЛЬНЫХ АРХЕЙ

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции СЖ-005-93; том 2; 953000 - книги и брошюры.

23.02.98 г. 3. 7887Р. Т. 100 экз. Усл.печ.л. 1,0. Отпечатано с оригинала-макета в Отделе научно-технической информации Пущинского научного центра РАН. 142292 г. Пущино Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ ПНЦ РАН.