Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль А и В флагеллинов в формировании жгутика галофильного археона Halobacterium salinarum

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тарасов, Валерий Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Жгутики Архей. 7 1.1 .Морфология и функция.

1.2. Субъединичный состав.

1.3. Гены фл агелл инов.

1.4. Ультраструктура нити жгутиков и доменная организация флагеллинов.

1.5. Роль флагеллинов в структуре нити и гипотетическая модель сборки жгутиков.

2. Краткая характеристика жгутиков бактерий.

3. Краткая характеристика бактериальных пил ей IV типа. 33 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. МАТЕРИАЛЫ 39 1.1 .Химические реагенты и ферменты.

1.2. Буферы и другие растворы использованные в работе.

1.3. Среды.

1.4. Бактериальные штаммы.

1.5. Плазмиды.

2. МЕТОДЫ 41 2.1. Методы работы с ДНК.

2.1.1. Выделение плазмидной ДНК из малых объемов культуры.

2.1.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК из больших объёмов культуры.

2.1.3. Выделение хромосомной ДНК Н. salinarum.

2.1.4. Полимеразная цепная реакция.

2.1.5. Рестрикция ДНК.

2.1.6. Электрофорез в геле агарозы.

2.1.7. Очистка фрагментов ДНК.

2.1.8. Дефосфорилирование 5' -концов ДНК.

2.1.9. Лигирование ДНК.

2.1.10. Получение компетентных клеток Е. coli.

2.1.11. Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК.

2.1.12. Трансформация клеток H.salinarum.

2.1.13. Приготовление меченого зонда.

2.1.14. Гибридизация по Саузерну.

2.1.15. Определение первичной структуры ДНК.

2.2. Методы работы с РНК.

2.2.1. Выделение суммарной РНК из клеток Я. salinarum.

2.2.2. Электрофорез РНК.

2.2.3. Нозерн-гибридизация.

2.3. Экспериментальные процедуры при работе с белками.

2.3.1. Электрофорез в ДСН-ПААГ.

2.3.2. Выделение жгутиков.

2.3.3. Идентификация гликопротеинов.

2.3.4. Определение молекулярных весов.

2.3.5. Определение концентрации белка.

2.3.6. Протеолиз.

2.3.7. Получение поликлональных антител.

2.3.8. Иммуноблоттинг.

2.3.9. Электронная микроскопия.

2.3.10. Микрокалориметрические исследования. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Определение роли А или В флагеллинов Н. salinarum с использованием методики нокаута генов.

1.1. Получение мутантных штаммов Н. salinarum flgA' и flgB' с инактивированным синтезом всех А и В флагеллинов, соотвественно.

1.2. Получение мутантного штамма Я. salinarum flgAT с инактивированным синтезом А2 флагеллина.

1.3. Характеристика мутантных штаммов Н. salinarum.

2. Исследование доменной организации флагеллинов Н. salinarum. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль А и В флагеллинов в формировании жгутика галофильного археона Halobacterium salinarum"

Археи представляют одно из трех царств живой природы. В него включены метаногены, экстремальные галофилы, Thermoplasma и ряд серозависимых термофилов. По морфологии, некоторым биохимическим и физиологическим характеристикам археи сходны с бактериями. В то же время им присущи как "типично эукариотические" свойства, так и уникальные, характерные лишь для представителей данной группы (Прангишвили, 1990). С момента их открытия считалось, что жгутики у данных организмов аналогичны бактериальным. Первое сомнение возникло, когда была определена первичная структура флагеллинов Halobacterium salinarum (ранее Halobacterium halobium R1M1), поскольку никакой гомологии с бактериальными флагеллинами не было обнаружено (Gerl and Sumper, 1988). Дальнейшие исследования жгутиков архей выявили у них ряд существенных отличий от жгутиков бактерий. У архей жгутики тоньше бактериальных в два раза и, по-видимому, не имеют полого канала внутри. Их сборка, по косвенным данным, осуществляется с проксимального, а не с дистального конца как у бактерий (Sumper 1987). Жгутики архей всегда составлены из набора различающихся флагеллинов; при диссоциации распадаются на протофиламенты, а флагеллины имеют посттрансляционные модификации не характерные для бактерий, например, гликозилирование (Kalmokoff et al., 1990; Kalmokoff and Jarrell,1991; Fedorov et al., 1994; Пятибратов и др., 1996; Sumper 1987). Префлагеллины архей имеют сигнальную последовательность, чего нет у бактерий. Флагеллины архей проявляют гомологию с бактериальными пилями IV типа, а белки, предположительно включенные в синтез жгутиков - с белками системы синтеза пилей IV типа (Jarrell et al., 1996; Bayley and Jarrell, 1998 b)

Совокупность приведенных данных позволила отнести жгутики архей к отдельному, отличному от бактериального, аппарату жгутиковой подвижности (Jarrell et al., 1996). Однако на сегодняшний день нет ясного представления о процессе сборки жгутиков архей и механизме формирования их спиральной ультраструктуры. Главная причина этого кроется в неопределенности функций различных флагеллинов. У бактерий жгутик более чем на 95% состоит из флагеллина - белка, из которого собирается нить жгутика, а остальные белки (белки базального тела, белок крюка и НАР1, НАР2, НАРЗ белки) присутствуют в минорных количествах. Спиральность нити жгутика бактерий обусловлена способностью флагеллина принимать две конформации (Calladme, 1978, Jones and Aizawa, 1991). У архей, как уже было отмечено, жгутик состоит из набора различающихся флагелинов. Какие из белков являются белками нити жгутика, определяя его спиральную форму, а какие играют возможно иную роль в сборке жгутика не известно. Ситуация представляется еще более запутанной при учете того, что для разных архей количество белков, отнесенных к флагеллинам, колеблется от трех до пяти.

Нами было выдвинуто предположение, согласно которому спирализация нити жгутика архей обеспечивается ассоциацией протофиламентов различающейся длины. Протофиламенты при этом должны состоять из одного флагеллина. Для Natronobacterium magadii было показано, что, по крайней мере, один из флагеллинов образует отдельную протофиламенту. Соответственно, для формирования спирального филамента необходимо, как минимум, два флагеллина, являющихся аналогами двух конформаций бактериального флагеллина (Calladme, 1978). В случае сборки из одного флагеллина жгутик должен бы быть прямой.

Основной задачей представленной работы было выяснение роли А и В флагеллинов (Al, А2, В1, В2, ВЗ) Halobacterium salinarum в формировании нити жгутика. Проверялось выдвинутое нами предположение о механизме спирализации нити жгутиков архей. Для этого были получены мутантные штаммы Н.salinarum с различными по составу наборами А и В флагеллинов. Исследовалась доменная организация флагеллинов у штамма дикого типа и, в связи с этим, вовлеченность частей молекул флагеллина в процесс формирования полимера и его спирализацию.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Жгутики архей

Детальное изучение жгутиков архей в настоящее время проводится на представителях двух групп: метаногенах - Methanococcus voltae, и экстремальных галофилах - Halobacterium salinarum (ранее Halobacterium halobium). Разрозненая информация по другим штаммам (Aeropyrum pernix, Archaeoglobus fulgidus, Methanococcus deltae, Methanococcus jannaschii, Methanococcus maripaludis, Methanococcus thermolithotrophicus, Methanococcus vanielii, Methanoculleus marisnigri, Methanospirillum hungatei GP1, Methanospirillum hungatei JF1, Methanotermus fervidus, Halobacterium saccharovorum, Halobacterium salinarium, Halobacterium volcanii, Natronobacterium magadii, Natronobacterium pharaonis 12, Natronobacterium pharaonis (DSM 2160), Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshi, Pyrococcus woesei Sulfolobus shibatae, Thermococcus stetteri, Thermoplasma volcanium ) дополняет общую картину строения жгутиков архей.

1.1. Морфология и функция

Клетки Н. salinarum, N. magadii, N. pharaonis (на логарифмической фазе роста), М. voltae, М. thermolithotrophicus, М. hungatei, N. magadii имеют лофотрихиальное расположение жгутиков. На стационарной фазе у клеток Н. salinarum, а также у М. hungatei на всех фазах возможна амфитрихиальная локализация. Во всех случаях нити жгутиков образуют пучок, вращение которого создаёт гидродинамическое усилие, приводящее клетку в движение. В пучок входит от 5-10 нитей у Н. salinarum (Alam and Oesterhelt, 1984), M hungatei (Cruden et al., 1989) и до 25 нитей у М. thermolithotrophicus (Cruden et al., 1989), представляющих собой полужёсткую спираль. У Н. salinarum она правозакручена в норме (Alam and Oesterhelt, 1984). Параметры спирали и толщина нити имеют близкие значения среди рассматриваемых архей (таблица 1). В сравнении с бактериями нити жгутиков архей значительно тоньше 10-13 нм (20 нм у бактерий). Правозакрученность нитей Н. salinarum относится к одной из особенностей архей, так как для бактериальных жгутиков в норме характерна левозакрученная спираль.

На стационарной фазе роста у штаммма Н. salinarum Ml75, характеризующегося суперпродукцией жгутков, в культуральной среде обнаруживается значительное количество свободных жгутиков, агрегирующих в так называемые "super-flagella" состоящие более чем из 200 отдельных жгутиков.

Таблица 1. Параметры жгутиков архей

Организм длина нити, мкм толщина нити, нм амплитуда спирали, мкм условия ссылка

M.thermolithotrophicus 4,5 12,6 ±1,8 0,5М NaCl, рН 8,0 25

М. hungatei 10 9,9±0,67 0,34±0,08 0,15MNaCl, рН 7,2 25, 130

Н. salinarum 4 9,4±0,6 0,4+0,03 4М NaCl, рН 7 11

Н. saccharovorum 10-11 5

N. magadii 10±0,3 3.75М NaCl, рН9,0 3

N. pharaonis 12,2+0,3 3.75М NaCl, рН9,0 3

S. shibatae 15 36

Т. volcanium 12 36

Образование значительного количества "super-flagella" у данного штамма, по-видимому, связано с уменьшением степени гликозилирования флагеллинов приводящего к усилению агрегации жгутиков (Wieland et al., 1985). Полиморфизм жгутиков архей был отмечен в единственном случае. У Н. salinarum при изменении рН в образцах содержащих как "super-flagella", так свободные жгутики (таблица 2) (Alam and Oesterhelt, 1987). Уменьшение рН до 2,4 приводило к образованию прямых форм "super-flagella"; при увеличении до 9,2 - 9,5 появлялись "curly" формы; при 10,5 присутствовали кольцевые формы. Во всех приведенных случаях изменений направления спирали не происходило. В соответствии с направлением спирали, для Н. salinarum было показано, что вращение по часовой стрелке создает усилие толкающее клетку вперед, а вращение против часовой стрелки - тянущее в противоположном направлении без расплетания и тамблинга (Alam and Oesterhelt, 1984). Скорость движения клетки составляет 2 мкм/с для Н. salinarum, 3-10 мкм/с М. hungatei (Cruden et al., 1989) (для E. coli - около 20 мкм/с). Вращение по часовой стрелке обеспечивает более быстрое движение (2,94 + 0,34 мкм/с) в сравнение с вращением против часовой стрелки (1,59 + 0,39 мкм/с). При смене направления вращения клетка проходит через период отсутствия движения, длящийся в среднем 300 мс при температуре t=21°C.

Наличие у Н. salinarum структур аналогичных бактериальным крюку и базальному телу на конце нити жгутика остаётся под вопросом. На ультратонких срезах клеток Н. salinarum была обнаружена дискообразная пластинчатая структура, расположенная под цитоплазматической мембраной и присоединенная к выходящим из клетки жгутикам (Бакеева и др., 1992).

Таблица 2 (Alam and Oesterhelt, 1987).

Тип жгутика Знак спирали NaCl в растворе, М рн Длина волны, Мкм Амплитуда спирали, мкм угол наклона спирали нормальный правый 4 7 1,16+0,04 0,40±0,03 38±2 курчавый правый 4 9,2- 0,35±0,02 0,30±0,03 61+2 нормальный н.о. 0,8 9,5 1,02±0,02 0,33±0,02 35±2 нормальный н.о. 0,1 7 1,20±0,05 0,52±0,02 40±2 кольцевой и курчавый нормальный и прямой правый для курчавого правый 4 4 7 10,5 7 1,27±0,02 0,85±0,05 (диаметр кольца) 0,48±0,02 34±3

Позднее из клеток Н. salinarum (Kupper et al., 1994) были получены образцы жгутиков с присоединенными к ним аналогичными дисковидными "сар"-структурами. От каждой такой структуры отходило несколько жгутиков. В работах по электронной микроскопии интактных жгутиков М. hungatei и М. thermolithotrophicus (Cruden et al., 1989, Faguy et al., 1994b) сообщалось о наличии у них крюка и базального тела идентифицированных по разнице в окрашивании и толщине нити: у M. thermolithotrophicus крюк длиной 147 ±51 нм и 11,2 ± 0,9 нм в диаметре, у M. hungatei - 170 нм и 12,4 нм, соответственно. Базальное тело представляло собой пару колец: у М. thermolithotrophicus в диаметре 17,2 ± 4,9 нм, соединённых стержнем. Сообщалось также, что в препаратах жгутиков M. voltae многие жгутики имели на конце "knob" и более толстую нить в участке, соответствующем крюку (Kalmokoff et al., 1988). Тем не менее, дополнительные и более достоверные данные подтверждающие наличие у M. hungatei, M. thermolithotrophicus, M. voltae структур аналогичных крюку и базальному телу бактерий не были получены. Полярные мембраноподобные структуры, аналогичные упомянутым выше ДПС были также обнаружены в клетках T. stetteri (Gongadze etal., 1993).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Тарасов, Валерий Юрьевич

выводы

1. Показано, что флагеллины, кодируемые А и В оперонами, не являются взаимозаменяемыми. Двух флагеллинов (А1 и А2) Н. яаИпагит достаточно для формирования спирального жгутика. В случае синтеза мутантными клетками одного А флагеллина (А1) образуются жгутики прямой формы

2. Обнаружена позитивная регуляция синтеза В флагеллинов Н. яаПпагит в зависимости от синтеза флагеллинов А оперона, что указывает на синтез А флагеллинов в первую очередь и включение их в жгутик на начальной стадии сборки.

3. Показано, что все флагеллины, входящие в состав жгутиков дикого штамма Н.яаИпагит , содержат единственный структурный домен.

4. Показано, что полимерная организация жгутиков сохраняется и после разрушения третичной структуры флагеллинов в результате тепловой денатурации, что указывает на неучастие структурного домена непосредственно в межсубъединичных контактах и подтверждает определяющую роль гидрофобного Ы-концевого участка в формировании полимерной структуры жгутиков.

5. Подтверждена предложенная нами модель формирования спиральной формы у жгутика Н. яаИпагит, предусматривающая обязательное участие в сборке двух флагеллинов (А1 и А2).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тарасов, Валерий Юрьевич, Москва

1. Бакеева JI.E., Метлина А.Л., Новикова Т.М., Сперанский В.В. (1992) Ультраструктура двигательного аппарата Halobacterium salinarium. Доклады Академии наук, т. 326, N 5, с. 914-915.

2. Прангишвили Д.А. (1989) Молекулярная биология архебактерий. Тбилиси: Мецниереба, с. 5-40.

3. Пятибратов М.Г., Костюкова А.С., Тарасов В.Ю., Федоров О.В. (1993) Морфология и субъединичный состав жгутиков галоалкалофильных архебактерий. Доклады Академии наук, т. 330, N 1, с. 116-119.

4. Пятибратов М.Г., Костюкова А.С., Тарасов В.Ю., Федоров О.В. (1996) О некоторых принципах формироавния структуры жгутиков галофильных архей. Биохимия, 61, с. 1489-1497.

5. Серганова И.С., Полосина Я.Ю., Костюкова А.С., Метлина А.Л., Пятибратов М.Г., Федоров О.В. (1996) Жгутики галофильных архей: биохимический и генетический анализ. Биохимия, т. 61, N. 8, с. 1489-1497.

6. Филимонов В.В., Потехин С.А., Матвеев С.В., Привалов П.Л. (1982) Термодинамический анализ данных сканирующей микрокалориметрии. 1. Алгоритмы деконволюции сложных кривых теплопоглощения. Мол. биология, т. 16, N. 3, с. 551-562.

7. Aizawa S.-I., Vonderviszt F., Ishima R., Akasaka K. (1990) Termini of Salmonella flagellin are disordered and become organized upon polymerization into flagellar filament. J. Mol. Biol., 211, pp. 673-677.

8. Aim R.A., Mattick J.S. (1995) Identification of a gene, pilV,required for type 4 fimbrial biogenesis in Pseudomonas aeruginosa whose product possesses a pre-pilin-like leader sequence. Mol. Microbiol., 16, pp. 485-496.

9. Aim R.A., Bodero A.J., Free P., Mattick J.S. (1996) Identification of a novel gene, pilZ, essential for type 4 fimbrial biogenesis in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol., 178, pp. 46-53.

10. Aim R.A., Mattick J.S. (1997) Genes involved in the biogenesis and function of type-4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa. Gene, 192, pp. 89-98.

11. Alam M., Oesterhelt D. (1984) Morphology, function and isolation of halobacterial flagella. J. Mol. Biol., 176, pp. 459-475.

12. Alam M., Oesterhelt D. (1987) Purification, reconstitution and polymorphic transition of halobacterial flagella. J. Mol. Biol., 194, pp. 495-499.

13. Asakura S., Eguchi G., lino T. (1968) Unidirectional growth Salmonella flagella in vitro. J. Mol.Biol., 35, pp. 227-236.

14. Bartlett D.H., Frantz B.B., Matsumura P. (1988) Flagellar transcriptional activators FlbB and Flal: gene sequences and 5' consensus sequences of opérons under FlbB and Flal control. J. Bacteriol. 170, pp. 1575-1581.

15. Bayley D.P., Kalmokoff M.L., Jarrell K.F. (1993) Effect of bacitracin on flagellar assembly and presumed glycosylation of the flagellins of Methanococcus deltae. Arch. Microbiol., 160, pp. 179-185.

16. Bayley D.P., Jarrell K.F. (1998b) Further evidence to suggest that archaeal flagella are related to bacterial type IV pili. J. Mol. Evol., 46, pp. 370-373.

17. Blair D. F., Berg H. C. (1990) The MotA protein of E.coli is a proton-conducting component of the flagellar motor. Cell, 60, pp. 439-449.

18. Bode W., Blume A. (1973) Thermal transitions of Proteus mirabilis flagellin as studied by circular dichroism adiabatic differential calorimetry. FEBS Lett. 36, pp. 318-322.

19. Bradley D.E. (1980) A function of Pseudomonas aeruginosa PAO pili: twitching motility. Can. J. Microbiol., 26, pp. 146-154.

20. Bult, C.J., White, O., Olsen, G.J., Zhou, L., Fleiscchmann, R.D., Sutton, G.G., et al. (1996) Complete genome sequence of the methanogenic archaeon, Methanococcus jannaschii. Science, 273, pp. 1058-1073.

21. Calladine C.R. (1978) Change of waveform in bacterial flagella. J. Mol. Biol., 118, pp.457-459.

22. Cline, S.W., Lam, W.L., Charlebois, R.L., Schalkwyk, L.C., and Doolitle, W.F. (1989) Transformation methods for halophilic archaebacteria. Can. J. Microbiol., 35, pp. 148-152.

23. Coulton J. W., Murray R. G. (1978) Cell envelope associations of Aquaspirillum serpens flagella. J. Bacteriol., 136, pp. 1037-1049.

24. Cruden D., Sparling R., Markovetz A. J. (1989) Isolation and ultrastructure of the flagella of Methanococcus thermolithotrophicus and Methanospirillum hungatei. Applied and Environmental Microbiology, 55, pp. 1414-1419.

25. Darzins A. (1993) The pilG gene product, required for Pseudomonas aeruginosa pilus production and twitching motility, is homologous to the enteric, single-domain response regulator CheY. J. Bacteriol., 175, pp. 5934-5944.

26. Doerner K.C., White B.A. (1990) Detection of glycoproteins separated by nondenaturing Polyacrylamide gel electrophoresis using the periodic acid-Schiff stain. Anal. Biochem., 187, pp. 147-150.

27. DeLange R.F., Chang J.Y., Shaper J.H., Glazer A.N. (1976) Amino acid sequence of flagellin of Bacillus subtilis 168. J. Biol. Chem., 251, pp. 705-711.

28. DeMot R., Venderleyden J. (1994) Microcorrespondence. Mol. Microbiol., 12, pp. 333-334.

29. DePamphilis M.L., Adler J. (1971a) Fine structure and isolation of the hook-basal body complex of flagella from Escherihia coli and Bacilus subtilis. J. Bacteriol., 105, pp. 384-395.

30. DePamphilis M.L., Adler J. (1971b) Attachment of flagellar basal bodies to the cell envelope: specific attachment to the outer, lypopolysaccharide membrane and the cytoplasmic membraine. J.Bacteriol., 105, pp. 396-407.

31. Driks A., Bryan R., Shapiro L., DeRosier DJ. (1989) The organization of the Caulobacter crescentus flagellar filament. J. Mol. Biol., 206, pp. 627-636.

32. Faguy D.M., Jarrell K.F., Kuzio J., Kalmokoff M.L. (1994a) Molecular analysis of archaeal flagellins: similarity to the type IV pilin-transport superfamily widespread in bacteria. Can. J. Microbiol., 40, pp.67-71.

33. Faguy D.M., Koval S.F., Jarrell K.F. (1994b) Physical characterization of the flagella and flagellins from Methanospirillum hungatei. J. Bacteriol., 176, pp. 7491-7498.

34. Faguy D.M., Bayley D.P., Kostyukova A.S., Thomas N.A., Jarrell K.F. (1996) Isolation and characterization of flagella and flagellin proteins from thermoacidophilic archaea Thermoplasma volcanium and Sulfolobus shibatae. J. Bacteriol, 179, pp. 902-905.

35. Fedorov O.V., Khechinashvili N.N., Kamya R., Asakura S. (1984) Multidomain of flagellin. J. Mol. Biol., 175, pp.83-87.

36. Fedorov O.V., Kostyukova A.S., Pyatibratov M.G. (1988) Architectinics of a bacterial flagellin filament subunit. FEBS Lett., 1988, V. 241, pp.145-148.

37. Fedorov O.V., Pyatibratov M.G., Kostyukova A.S., Osina N.K., Tarasov V.Yu. (1994) Protofilament as a structural element of flagella of haloalkalophilic archaebacteria. Can. J. Microbiol, 40, pp. 45-53.

38. Folkhard W., Marvin D.A., Watts T.H., Paranchych W. (1981) Structure of polar pilli from Pseudomonas aeruginosa strains K and O. J. Mol. Biol., 149, pp. 79-93.

39. Forest K.T., Tainer J.A. (1997) Type IV pilus structure: outside to inside and top to bottom. Gene, 192, pp. 165-169.

40. Francis, N.R., Irikura, V.M., Yamaguchi, S., DeRosier, D.J., Macnab, R.M. (1992) Localization of the Salmonella typhimurium flagellar switch protein FliG to the cytoplasmic M-ring face of the basal body. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 89, pp. 6304-6308.

41. Fussenegger M., Rudel T., Barten R., Ryll R., Meyer T.F. (1997) Transformation competence and type-4 pilus biogenesis in Neisseria gonorrhoeae. Gene, 192, pp. 125-134.

42. Gerl L., Sumper M. (1988) Halobacterial flagellins are encoded by a multigene family. J. Biol. Chem., 263, pp. 13246-13251.

43. Gerl L., Deutzmann R., Sumper M. (1989) Halobacterial flagellins are encoded by a multigene family. FEBS Lett., 244, pp. 137-140.

44. Gill P. R., Agabian N. (1983) The nucleotide sequence of the Mr = 28,500 flagellin gene of Caulobacter crescentus. J. Biol. Chem., 258, pp. 7395-7401.

45. Goda, S.K., and Minton, N.P. (1995) A simple procedure for gel electrophoresis and Northern boltting. Nucleic Acid Research., 23, pp. 3357-3358.

46. Gongadze G.M., Kostyukova A.S., Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A. (1993) Regular proteinaceous layers of Thermococcus stetteri cell envelope. Current Microbiology, 27, pp. 3-9.

47. Guerry P., Aim R.A., Power M.E., Logan S.M., Trust T.J. (1991) Role of two flagellin genes in Campylobacter motility. J. Bacterid., 173, pp. 4757-4764.

48. Hahn H.P. (1997) The type-4 pilus is the major virulence-associated adhesin of Pseudomonas aeruginosa Gene, 192, pp. 99-108.

49. Henrichsen J. (1983) Twitching motility. Annu. Rev. Microbiol., 37, pp. 81-93.

50. Hirano T., Yamaguchi S., Oosawa K., Aizawa S. (1994) Roles of FliK and FlhB in determination of flagellar hook length in Salmonella typhimurium. J. Bacterid., 176, pp. 5439-5449.

51. Holmes, M.L., Pfeifer, F., and Dyall-Smith, M.L. (1994) Improved shuttle vectors for Haloferax volcanii including a dual-resistance plasmid. Gene, 146, pp. 117-121.

52. Homa M., Kutsukake K., lino T., Yamaguchi S. (1984) Hook-associated proteins essential for flagellar filament formation in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol., 157, pp. 100-108.

53. Homma M., Fujita H., Yamaguchi S., lino T. (1987) Regions of Salmonella typhimurium flagellin essential for its polymerisation and secretion. J. Bacteriol., 169, pp. 291-296.

54. Ikeda T., Asakura S., Kamiya R. (1985) "Cap" on the tip of Salmonella flagella. J. Mol. Biol., 184, pp. 735-737.

55. Ikeda T., Homma M., lino T., Asakura S., Kamiya R. (1987) Localization and stoichiometry of hook-associtaed proteins within Salmonella Typhimurium flagella. J. Bacteriol., 169, pp. 1168-1173.

56. Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 96, pp. 23-28.

57. Jarrell K.F., Bayley D.P., Faguy D.M. Structure, molecular sequence analisis and genetics of the flagella of the domain Archaea: Comparison with bacterial flagella. -Current Topics in Mol. Genet. ( Life Sci. Adv. ), 1993, 1, P. 15-31.

58. Jarrell K., Bayley D.P., Florian V., Klein A. (1996a) Isolation and characterization of insertional mutants in flagellin genes in the archaeon Methanococcus voltae. Mol. Microbiol, 20, pp. 657-666.

59. Jarrell K.F., Bayley D.P., Kostyukova A.S. (1996b) The archaeal flagellum: a unique motility structure. J. Bacteriol, 179, pp. 5057-5064.

60. Jones, C.J., Macnab, R.M., Okino, H., Aizava, S.-I. (1990) Stoichiometric analysis of the flagellar hook-(basal-body) complex of Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol., 212, pp. 377-387.

61. Jones C.J., Aizawa S. (1991) The bacterial flagellum and flagellar motor: structure, assembly and function. Advan. Microbial Physiology, 32, pp. 109-172.

62. Kagawa H., Owaribe K., Asakura S., Takahashi N. (1976) Flagellar hook protein from Salmonella SJ25. J. Bacteriol., 125, pp. 68-73.

63. Kalmokoff M.L., Jarrell K.F., Koval S.F. (1988) Isolation of flagella from the archaebacterium Methanococcus voltae by phase separation with Triton X-l 14. J. Bacteriol., 170, pp. 1752-1758.

64. Kalmokoff M.L., Karnauchow T.M., Jarrell K.F. (1990) Conserved N-terminal sequences in the flagellins of archaebacteria. BBRC, 167, pp. 154-160.

65. Kalmokoff M.L., Jarrell K.F. (1991) Cloning and sequencing of a multigene family encoding the flagellins of Methanococcus voltae. J. Bacteriol., 173, pp. 7113-7125.

66. Kalmokoff M.L., Koval S.F., Jarrell K.F. (1992) Relatedness of the flagellins from methanogens. Arch. Microbiolio, 157, pp. 481-487.

67. Kamiya R., Asakura S. (1974) Formation of flagella-like but straight polymer of Salmonella flagellain. J.Mol. Biol., 87, pp. 55-62.

68. Kamiya R., Asakura S., Wakabayashi K., Namba K. (1979) Transition of bacterial flagella from helical to straight forms with different subunit arrangements. J. Mol. Biol., 131, pp. 725-742.

69. Kamiya R., Asakura S., Yamaguchi S. (1980) Formation of helical filaments by copolymerization of two types of "straight" flagellins. Nature, 286, pp. 628-630.

70. Kato S., Okamoto M., Asakura S. (1984) Polymorphic transition of the flagellar polyhook from Escherichia coli and Salmonella Typhimurium. J. Mol.Biol., 173, pp. 463476.

71. Kawarabayasi, Y., Hino, Y., Horikawa, H., Yamazaki, S., Haikawa, Y., Jin-no, K., et al., (1999) Complete genome sequence of an aerobic hyper-thermophilic crenarchaeon, AeropyrumpernixKl. DNA Res., 6, pp. 83-101, pp. 145-152.

72. Kerrridge D., Hörne R. W. Glauer A. M. (1962) Structural components of flagella from Salmonella typhimurium. J.Mol. Biol., 4, pp. 563-597.

73. Kevil, C.G., Walsh, L., Laroux, F.S., Kalogeris, T., Grisham, M.B., Alexander, JS (1997) Improve, rapid Northern protocol. Biochem. Biophys.Res. Communication, 238, pp. 177-179.

74. Klenk, H.P., Clayton, R.A., Tomb, J.F., White, O., Nelson, K.E., Ketchum, K.A., et al. (1997) The complete genome sequence of the hyperthermophilic, sulphate-reducing archaeon Archaeoglobus fulgidus. Nature, 390, pp. 364-370.

75. Komeda Y. (1982) Fusions of flagellar opérons to lactose genes on a mu lac bacteriophage. J. Bacteriol., 150, pp. 16-26.

76. Komeda Y. (1986) Transcriptional control of flagellar genes in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 168, pp. 1315-1318.

77. Kostrzynska M., Betts J.D., Austin J.W., Trust TJ. (1991) Identification, characterization and spatial localization of two flagellin species in Helicobacter pylori flagella. J. Bacteriol., 173, pp. 937-946.

78. Kostyukova A.S., Pyatibratov M.G., Filimonov V.V., Fedorov O.V. (1988) Flagellin parts acquiring a regular structure during polymerization are disposed on the molecule ends. FEBS Lett., 241, pp. 141-144.

79. Kostyukova A.S., Gongadze G.M., Obraztsova A.Y., Laurinavichus K.S., Fedorov O.V. (1992) Protein composition of Methanococcus thermolithotrophicus flagella. Can. J. Microbiol., 38, pp. 1162-1166.

80. Kutsukake K., Ohya Y., lino T. (1990) Transcriptional analysis of the flagellar regulon of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol., 172, pp. 741-747.

81. Kutsukake K., Minamino T., Yokoseki T. (1994) Isolation and characterization of FliK-independent flagellation mutants from Salmonella typhimurium. J. Bacteriol., 176, pp. 7625-7629.

82. Kupper J., Marwan W., Typke D., Grunberg H., Uwer U., Gluch M., Oesterhelt D. (1994) The flagellar bundle of Halobacterium salinarium is inserted into a distinct polar cap structure. J. Bacteriol., 176, pp. 5184-5187.

83. Kuwajima G., Asaka J., Fujiwara T., Fujiwara T., Node K., Kondo E. (1986) Nucleotide sequence of the hag gene encoding flagellin of Escherichia coli. J. Bacteriol., 168, pp. 1479-1483.

84. Kuwajima G. (1988a) Flagellin domain that affects H antigenecity of Escherichia coli K12. J. Bacteriol., 170, pp.485-488.

85. Kuwajima G. (1988b) Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. J. Bacteriol., 170, pp.3305-3309.

86. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, pp. 680-685.

87. Lagenaur C., Agabian N. (1976) Physical characterization of Caulobacter crescentus flagella. J. Bacteriol., 128, pp.435-444.

88. Lagenaur C., Agabian N. (1978) Caulobacter flagellar organelle: synthesis, compartmentation, and assembly. J. Bacteriol., 135, pp. 1062-1069.

89. Lawn A.M. (1977) Comparison of the flagellins from different flagellar morphotypes of Escherichia coli. J. General Microbiol., 101, pp. 112-130.

90. Lloyd, S. A., Tang, H., Wang, X., Billings, S., Blair, D. F. (1996) Torque generation in the flagellar motor Escherichia coli: evidence of direct role for FliG but not for FliM or FliN. J. Bacteriol., 178, pp. 223-231.

91. Lowe M.A., Holt S.C., Eisenstein B.I. (1987) Immunoelectron microscopic analysis of elongation of type 1 fimbriae in Escherichia coli. J. Bacteriol., 169, pp. 157163.

92. Macnab R.M., Ornston M.K. (1977) Normal to curly flagellar transition and their role in bacterial tumbling. Stabilization of an alternative quaternary structure by mechanical force. J. Mol. Biol., 112, pp. 1-30.

93. Macnab R.M. . (1992) Genetics and biogenesis of bacteria flagella. Annu. Rev. Genet., 26, pp. 131-158.

94. Maniatis,T., Fritsch, E.E., and Sambrook, J. (1982) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

95. Martin P.R., Hobbs M., Free P.D., Jeske Y., Mattick J.S. (1993) Characterization of pilQ, a new gene required for the biogenesis of type-4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol., 9, pp. 857-868.

96. Martinez R.J., Ichiki A.T., Lundh N.P., Tronick S.N. (1968) A single amino acid substitution responsible for altered flagella morphology. J. Mol. Biol., 34, pp. 559-564.

97. Marykwas, D. L., Schmidt, S.A., Berg, H. C. (1996) Interacting components of the frlagellar motor of Escherichia coli revealed by the two-hybrid system in Yeast. J.Mol.Biol., 256, pp. 564-576.

98. Matagne A., Joris B., Frere J.-M. (1991) Anomalous behavior of a protein during SDS/PAGE corrected by chemical modification of carboxylic groups. Biochem. J., 280, pp. 553-556.

99. Matsuura S., Kamiya R., Asakura S. (1978) Transformation of straight flagella and recovery of motility in a mutant Escherichia coli J. Mol. Biol., 118, pp. 431-440.

100. Mattick J.S., Bills M.M., Anderson B.J., Daliymple B., Mott M.R., Ederton J.R. (1987) Morphogenetic expression of Bacteroides nodosus fimbriae in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol., 169, pp. 33-41.

101. Namba K., Yamashita I., Vonderviszt F. (1989) Structure of the core and central channel of bacterial flagella. Nature, 342, pp. 648-654.

102. Namba K., Vonderviszt F. (1997) Molecular architecture of bacterial flagellum. Quarterly Reveiews of Biophysics, 30, pp. 1-65

103. Nunn D.N., Bergman S., Lory S. (1990) Products of three accessory genes, PUB, PilC and PilD, are required for biogenesis of Pseudomonas aeruginosa pili. J. Bacteriol., 172., pp. 2911-2919.

104. Nunn D.N., Lory S. (1991) Product of the Pseudomonas aeruginosa gene pilD is a prepilin leader peptidase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, pp. 3281-3285.

105. Ohnishi S.T., Barr J.K. (1978) A simplified method of quantitating proteins using the biuret and phenol reagents. Anal. Biochem., 86, pp. 193-200.

106. Ottow J.C.G. (1975) Ecology, physiology and genetics of fimbriae and pili. Annu. Rev. Micribiol., 29, pp. 79-108.

107. Parge H.E., Forest K.T., Hickey M.J., Christensen D.A., Getzoft E.D., Tainer J.A. (1995) Structure of the fibre-forming protein pilin at 2.6 A resolution. Nature, 378, pp. 3238.

108. Pasloske B.L., Finlay B.B., Paranchych W. (1985) Cloning and sequencing of the Pseudomonas aeruginosa PAK pilin gene. FEBS Lett., 183, pp. 408-412.

109. Patterson-Delafield J., Martinez R.J., Stocker B.A., Yamaguchi S.A. (1973) A new fla gene in Salmonella typhimurium~flaR~and its mutant phenotype-superhooks. Arch Mikrobiol., 90, pp. 107-120.

110. Pier G.B. (1985) Pulmonary disease associated with Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: current status of the host-bacterium interaction. J. Infect. Dis., 151, pp. 575580.

111. Pleier E., Schmitt R. (1991) Expression of two Rhizobium meliloti flagellin genes and their contribution to the complex filament structure. J. Bacteriol., 173, pp.2077-2085.

112. Possot O., d'Enfert C., Pugsley A.P. (1992) Pullulanase secretion in Eschericchia coli K-121 requires a cytoplasmic protein and a putative polytopic cytoplasmic membrane protein. Mol. Microbiol., 6, pp. 95-105.

113. Privalov P.L. (1982) Stability of proteins. Proteins which do not present a single cooperative system. Adv. Protein Chem., .35, pp. 1-104.

114. Ptitsyn O.B., Finkelstein A.V. (1983) Theory of protein secondary structure and algorithm of its prediction. Biopolymers, 22, pp. 15-25

115. Russell M.A., Darzins A. (1994) The pilE gene product of Pseudomonas aeruginosa, required for pilus biogenesis, shares amino acid sequence identity with the N-termini of type-4 prepilin proteins. Mol. Microbiol., 13, pp. 973-985.

116. Roncero C., Darzins A., Casadaban M.J. (1990) Pseudomonas aeruginosa transposable bacteriophages D3112 and B3 require pili and surface growth for adsorption. J. Bacteriol., 172, pp. 1899-1904.

117. Rudel T., Scheuerpflug I., Meyer T.F. (1995) Neisseria PilC protein identified as type-4 pilus tip-located adhesin. Nature, 373, pp. 357-359.

118. Sambrock J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

119. Silverman M., Simon M. (1972) Flagellar assembly mutants in Escherichia coli. J. Bacteriol. 112, pp. 986-993.

120. Silverman M., Simon M. (1974) Rotation of flagella and mechanism of bacterial motility. Nature, 249, pp. 73-74.

121. Sosinsky, G.E., Francis, N.R., Stallmeyer, M.J.B., DeRosier , D.J. (1992) Substrusture of the flagellar basal body of Salmonella typhimurium. J.Mol.Biol., 223, pp. 171-184.

122. Southam G., Kalmokoff M.L., Jarrell K.F., Koval S.F., Beveridge T.J. (1990) Isolation, characterization and cellular insertion of the flagella from two strains of the archaebacterium Methanospirillum hungatei. J. Bacteriol., 172, pp. 3221-3228.

123. St Jean, A.S., Trieselmann, B.A., and Charlebois, R.L. (1994) Physical map and set of overlapping cosmid clones representing the genome of the archaeon Halobacterium sp. GRB. Nucleic Acid Res., 22, pp. 1476-1483.

124. Strom M.S., Lory S. (1993) Structure-function and biogenesis of the type IV pili. Annu. Rev. Microbiol., 47, pp. 565-596.

125. Sumper M. (1987) Halobacterial glycoprotein biosynthesis. BBA, 906, pp. 69-79.

126. Tang, H, H., Billings, S., Wang, X., Sharp, L., Blair, D. F. (1995) Regulated underexpression of the FliN protein of Escherichia coli and evidence for an interaction between FliN and FliM in the flagellar motor. J. Bacteriol., 177, pp. 3496-3503.

127. Tarasov V.Yu., Pyatibratov M.G., Kostyukova A.S., Fedorov O.V. (1994) Distribution of flagellins in Halobacterium halobium flagella. International Symposium ' Biological Motility". Abstracts, Puschino, p. 287-288.

128. Thomashov L.S., Rittenberg S.C. (1985) Waveform analysis and structure of flagella and basal complexes from Bdellovibrio bacteriovorus 109J. J. Bacteriol., 163, pp. 1038-1046.

129. Ueno, T., Oosawa, K., Aizawa, S.-I. (1992) M ring, S ring and proximal rod of the flagellar basal body of Salmonella typhimurium are composed of subunits of a single protein, FliF. J.Mol.Biol., 227, pp. 672-677.

130. Uratani Y., Asakura S., Imahori K. (1972) A circular dichroism study of Salmonella flagellin: evidence for conformational change on polymerization. J. Mol. Biol., 67, pp. 85-98.

131. Vassilenko K.S., Rachel R., Kostyukova A.S. (1994) Structural studies of Pyrococcus furiosus flagella. In Abstracts of the International Symposium on Biological Motility, p. 289.

132. Vonderviszt F., Kanto S., Aizawa S.-I., Namba K. (1989) Terminal regions of flagellin are disordered in solution. J. Mol. Biol., 209, pp. 127-133.

133. Vonderviszt F., Uedaira H., Kidokoro S.-I., Namba K. (1990) Structural organisation of flagellin. J. Mol. Biol., 214, pp. 97-104.

134. Vonderviszt F., Aizawa S.-I., Namba K. (1991) Role of the disordered terminal regions of flagellin in filament formation and stability J. Mol. Biol., 221, pp. 1461-1474.

135. Vonderviszt F., Ishima R., Akasaka K., Aizawa S.-I. (1992a) Terminal disorder: a common structural feature of the axial proteins of bacterial flagellum ? J. Mol. Biol., 226, pp. 575-579.

136. Wagenknecht T., DeRosier D.J., Aizawa S., Macnab R.M. (1982) Flagellar hook structures of Caulobacter and Salmonella and their relationship to filament structure. J. Mol. Biol., 162, pp. 69-87.

137. Watts T.H., Scraba D.G., Paranchych W. (1982) Formation of 9-nm filaments from pilin monomers obtained by octyl-glucoside dissociation of Pseudomonas aeruginosa pili. J. Bacteriology, 151, pp. 1508-1513.

138. Watson A.A., Mattick J.S., Aim R.A. (1996) Functional expression of heterologous type 4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa. Gene, 175, pp. 143-150.

139. Weissborn A., Steinman H.M., Shapiro L. (1982) Characterization of the proteins of the Caulobacter crescentus flagellar filament. Peptide analysis and filament organization. J. Biol. Chem, 257, pp. 2066-2074.

140. Wey L., Joys T.M. (1985) Covalent structure of three phase-1 flagellar filament proteins of Salmonella. J. Mol. Biol., 186, pp. 791-803.

141. Wieland F., Paul G., Sumper M. (1985) Halobacterial flagellins are sulfated glycoproteins. J. Biol. Chem., 260, pp. 15180-15185.

142. Yamaguchi, S., Aizawa, S.-I., Kihara, M., Isomura, M., Jones, C. J., Macnab, R. M. (1986) Genetic evidence for a switching and energy -transducing complex in the flagellar mototr of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol., 168, pp. 1172-1179.

143. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 33, pp. 103-19.

144. Выражаю свою искреннюю благодарность:моему научному руководителю Олегу Васильевичу Федорову за внимательное руководство и постоянную поддержку при выполнении этой работы;

145. Алле Сергеевне Костюковой, Михаилу Геннадьевичу Пятибратову, Елизавете Игнатьевне Тиктопуло, Sen-Lin Tang, Mike Dyall-Smith совместно с которыми была выполнена часть этой работы;