Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование структуры белков P-выступа большой субчастицы архейной рибосомы

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование структуры белков P-выступа большой субчастицы архейной рибосомы"

На правах рукописи

МИТРОШИН ИВАН ВЛАДИМИРОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ Р-ВЫСТУПА БОЛЬШОЙ СУБЧАСТИЦЫ АРХЕЙНОЙ РИБОСОМЫ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени _ ^ ^^ ^

кандидата биологических наук

Москва-2015

005563085

Работа выполнена в лаборатории структурных исследований аппарата трансляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт белка Российской Академии Наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Гарбер Мария Борисовна

кандидат физико-математических наук Габдулхаков Азат Габдрахманович

Официальные оппоненты:

Долгих Дмитрий Александрович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук, лаборатория инженерии белка, заведующий

Дмитриев Сергей Евгеньевич, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, лаборатория регуляции синтеза белка, старший научный сотрудник

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится 4 о пЛ/са^Л. 2015 г. в 4 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.7fe по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, стр. 12, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций) и на сайте www.bio.msu.ru.

Автореферат разослан Ъо сс«аЬ ^ 5,2 015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, с.__

кандидат биологических наук ~ ' И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рибосома - сложный макромолекулярный комплекс белков и рибонуклеиновых кислот, ответственный за биосинтез белка в клетках всех живых организмов. Начиная с середины прошлого века большое число работ было посвящено исследованию структуры рибосом и их компонентов, рибосомных белков и рибосомных РНК. Накопление знаний о структуре рибосом и развитие методической базы привело в начале двадцать первого века к прорыву в определении пространственных структур рибосом, сначала из прокариот, а затем и из эукариот. Эти достижения вносят огромный вклад в исследования механизма работы аппарата трансляции. Однако, несмотря на колоссальный прогресс в структурных исследованиях рибосом, имеются еще «белые пятна» в их структуре. Это связано с высокой подвижностью некоторых участков рибосомы, что затрудняет определение структуры этих участков в составе рибосомы. В ряде случаев исследования структуры изолированных компонентов, входящих в состав подвижных рибосомных участков, вносят существенный вклад в дополнение и уточнение имеющихся моделей рибосом.

В 2000 году появилась первая структура 50S субчастицы архейной рибосомы с высоким разрешением, но Р-выступ в этой модели отсутствовал полностью. Затем были определены структуры малой субчастицы бактериальной рибосомы и целой бактериальной рибосомы. Определение структур бактериального рибосомного белка L11 в комплексе с фрагментом 23 S рРНК и комплекса бактериальных рибосомных белков L10-L12NTD позволило интерпретировать электронную плотность в районе Ы2-выступа в модели бактериальной рибосомы с фактором элонгации G, а также частично визуализировать основание Р-выступа большой субчастицы архейной рибосомы. Знание структур двухдоменного фрагмента архейного рибосомного белка Р0 и комплекса архейных рибосомных белков P0-P1NTD позволило частично определить структуру Р-выступа в составе эукариотической рибосомы и дополнить модель 50S субчастицы архейной рибосомы в районе Р-выступа. Таким образом, определение структур отдельных элементов Ь12/Р-выступа способствовало визуализации этого выступа в составе рибосом. Настоящая работа является продолжением этих исследований.

Цель н задачи работы. Основной целью представленной диссертационной работы является исследование структуры компонентов бокового Р-выступа большой рибосомной субчастицы архейной рибосомы, чтобы использовать эти структурные данные для дальнейшего уточнения структуры архейной рибосомы. Для достижения этой цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Кристаллизация и определение структуры изолированного рибосомного белка Ll 1 из археи Methanococcus jannaschii (MjaLl 1).

2. Кристаллизация и определение структуры комплекса двухдоменного фрагмента архейного рибосомного белка MjaPO со специфичным фрагментом 23 S рРНК.

3. Кристаллизация и определение структуры тройного комплекса, состоящего из фрагмента рибосомного белка MjaPO, рибосомного белка MjaLl 1 и специфичного фрагмента 23 S рРНК (с антибиотиком тиострептоном и без антибиотика).

4. Анализ пространственных структур данных РНК-белковых комплексов и изолированного белка MjaLl 1.

Научная новизна. Получены кристаллы изолированного полноразмерного архейного рибосомного белка MjaLll и определена его структура. Впервые была визуализирована структура N-концевого домена этого белка. Получены кристаллы комплекса N-концевого двухдоменного фрагмента архейного рибосомного белка MjaPO (MjaPONTF) со специфическим фрагментом 23 S рРНК в присутствии и отсутствии белка MjaLll и определены структуры этих комплексов. С помощью наложения всех известных структур архейного белка РО было продемонстрировано, что специфичный для архей и эукариот домен 2 белка РО чрезвычайно подвижен, но, несмотря на высокую подвижность, этот домен не взаимодействует с рРНК. Сравнительный анализ структур MjaP0NTF-23SpPHK и MjaPONTF-MjaLl 1-23SpPHK показал, что при связывании белка MjaLll с комплексом MjaP0NTF-23SpPHK не происходит конформационных изменений в пространственной структуре фрагмента 23 S рРНК. Анализ пространственных структур архейных рибосомных белков MjaLll и MjaPONTF в комплексе с фрагментом 23 S рРНК позволил выявить структурные особенности поверхностей контакта данных белков с рРНК. Также впервые закристаллизован тройной комплекс MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK с антибиотиком тиострептоном и определена его структура. Показано, что сайт связывания тиострептона в данном тройственном комплексе расположен между 23S рРНК и N-концевым доменом белка LI 1, как и в бактериальной рибосоме.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Результаты данной работы имеют фундаментальное значение и вносят существенный вклад в понимание структурных основ функционирования Р-выступа в архейных и эукариотических рибосомах. Эти данные способствуют уточнению структуры большой субчастицы архейной и эукариотической рибосом.

В методическом аспекте данная работа будет полезна для специалистов, работающих в области препаративной биохимии и кристаллизации макромолекул, как в нашей стране, так и за рубежом.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы неоднократно докладывались на Российских и Международных конференциях. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них статей в рецензируемых научных изданиях - 4, материалов конференций - 11. В банк белковых структур PDB депонировано 5 пространственных структур (3JSY, 5COL, 5D6G, 5D8H, 5DAR).

Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах работы, а именно: постановка задач исследования, проведение генно-инженерных экспериментов, выделение белков и РНК, получение РНК-белковых комплексов, кристаллизация, решение и уточнение структур, анализ и интерпретация полученных данных.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, который включает 150 источников. Работу иллюстрируют 45 рисунков и _9_ таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Работа по определению структур компонентов Р-выступа архейной рибосомы из М. jannaschii ведется в нашей лаборатории уже более 10 лет. После того как в 2010 году нами была определена структура изолированного N-концевого РНК-связывающего фрагмента белка Р0 (Kravchenko et al., 2010), началась работа по определению структур комплексов белков Р0 и L11 с фрагментом рРНК. Определение структур этих комплексов позволяет дополнить структуру основания Р-выступа в составе архейной рибосомной 50S субчастицы и проанализировать РНК-белковые и белок-белковые контакты в этих комплексах.

В процессе выполнения данной работы появилась дополненная структура 50S субчастицы рибосомы из галофильной археи Haloarcula marismortui, в которой была частично достроена структура Р-выступа (Gabdulkhakov et al., 2013). Сравнение структур компонентов основания данного выступа из Н. marismortui и М. jannaschii позволяет определить консервативные участки взаимодействия архейных белков Р0 и LI 1 с 23S рРНК и исследовать подвижность белковой составляющей Р-выступа.

1. Кристаллизация и определение структур компонентов Р-выступа архейной рибосомы

1.1. Изолированный рибосомный белок L11 из археи М. jannaschii

В структурах 50S субчастицы рибосомы из археи Н. marismortui электронная плотность в районе N-концевого домена рибосомного белка L11 имеет низкое качество (Gabdulkhakov et al., 2013; Kavran and Steitz, 2007). Кроме того, в качестве модели для построения структуры архейного белка L11 использовалась структура бактериального белка L11 из Thermotoga maritima в комплексе с фрагментом 23 S рРНК (Wimberly et al., 1999). Гомология аминокислотных последовательностей бактериального белка L11 из Т. maritima и архейного белка L11 из Н. marismortui составляет 43%. Этого оказалось недостаточно для корректного построения модели архейного белка L11. Для бактериального белка L11 было показано, что положение его N-концевого домена относительно С-концевого домена меняется при связывании с рибосомой (Ilin et al., 2005). Поэтому кристаллизация изолированного белка LI 1 из А/. jannaschii позволяет не только определить структуру этого белка, но и проанализировать, изменяется ли положение его N-концевого домена относительно С-концевого домена в изолированном состоянии и при связывании с 23 S рРНК.

Выделение, очистка и кристаплизация белка LI 1 из М. jannaschii

Ген архейного белка L11 из М. jannaschii (MjaLll) был экспрессирован в системе Штудиера (Studier et al., 1990) в клетках штамма-суперпродуцента BL21(DE3)/pUBS520 Escherichia coli. Прогрев клеточного экстракта при температуре 75°С с последующим осаждением денатурированных белков способствовал очистке препарата белка. Хроматографическая очистка препарата белка MjaLl 1 состояла из последовательных хроматографий на гидрофобных и ионообменных носителях. С помощью указанной методики выделения и очистки был получен гомогенный и функционально активный препарат белка MjaLll (Рис. 1 А и Б).

Кристаллизация изолированного MjaLl 1 проводилась методом диффузии паров в сидячей капле. Для поиска условий кристаллизации белка использовались

коммерческие наборы условий. Первые кристаллы М]аЫ 1 появлялись через 5 дней в широком диапазоне условий. После оптимизации первоначальных условий кристаллизации были получены кристаллы белка М]аЫ1 пригодные для рентгеноструктурного анализа в 100 мМ цитрата натрия. рН 5.0, 0.1 М М§СЬ, 27%

ПЭГ 600 (Рис. 1 В).

^ 1 2 3 4 „

А Б В Г

Рис. I. (А) Электрофоретический анализ (10% ПААГ. pH 8.3) гомогенности очищенного препарата белка MjaLll. (Б) Электрофоретический анализ (10% ПААГ, pH 8.3; 10 мМ MgCl2) связывания MjaLll и MjaPONTF со специфичным фрагментом 23S рРНК длиной 74 н. о. 1-Mja23SpPHK(74); 2 - комплекс MjaLl l-23SpPHK(74); 3 - комплекс MjaP0NTF-23SpPHK(74): 4 -комплекс MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK(74). (В) Фотография кристалла изолированного белка MjaLl 1. (Г) Фотография кристаллов селенометионинового производного белка MjaL 11.

Получение и кристаллизация селенометионинового производного MjaLl 1

Наши попытки решить структуру белка MjaLll методом молекулярного замещения не увенчались успехом, поэтому было принято решение об использовании метода аномального рассеяния с атомов селена для решения фазовой проблемы. В аминокислотной последовательности MjaLl 1 содержится шесть метионинов. Замены такого количества метионинов на селенометионины достаточно для того, чтобы получить заметный аномальный сигнал.

Для получения селенометионинового производного белка MjaLl I (Se-Met MjaLl 1) ген белка MjaLll экспрессировапи в клетках штамма-суперпродуцента B834(DE3)/pUBS520 Е. coli, который ауксотрофен по метионину. Наращивание биомассы клеток проводилось на минимальной среде, в которой вместо метионина был добавлен селенометионин. Выделение Se-Met MjaLl 1 из клеток Е. coli и его хроматографическая очистка осуществлялись по схеме, разработанной для немодифицированного белка. Белок Se-Met MjaLll был закристаллизован в условиях, в которых были получены кристаллы немодифицированного белка (Рис. 1Г).

ОпреОеление структуры MiaLl 1

На синхротроне ESRF (г. Гренобль, Франция) был собран набор дифракционных данных от кристаллов MjaLll и его селенометионинового производного с разрешением 2.2 Ä и 2.9 Ä, соответственно. Кристаллическая структура белка MjaLll была решена методом аномального рассеяния на одной длине волны и уточнена при разрешении 2.2 Ä (R-фактор = 21.5% и ЯГгее-фактор = 25.3%). Координаты модели депонированы в банк белковых структур (PDB код 5COL).

1.2. Фрагмент белка РО, P0NTF, в комплексе со специфичным фрагментом 23S рРНК

N-концевой домен 1 белка РО, который консервативен среди бактерий (в бактериальном рибосомном белке L10), архей и эукариот, контактирует со спиралью Н42 23 S рРНК. Домен 2, который является вставкой в домен 1 белка РО и специфичен для архей и эукариот, в 50S субчастице архейной рибосомы расположен между С-концевым доменом белка L6, N-концевым доменом белка LI 1 и спиралями Н42-44 23S рРНК. Подвижность домена 2, обнаруженная при анализе структуры изолированного двухдоменного N-концевого фрагмента белка РО, MjaPONTF, предполагает возможность контакта этого домена со спиралью Н44 23S рРНК (Kravchenko et al., 2010). Определение структуры MjaPONTF в комплексе со специфичным фрагментом 23 S рРНК направлено на изучение детального взаимодействия доменов белка РО с 23S рРНК в отсутствии белка LI 1.

Кристаллизация MiaP0NTF-23SpPHK(95)

Для исследования взаимодействия белка РО со специфичным участком 23S рРНК использовался фрагмент белка РО из M.jannaschii (Kravchenko et al., 2010) и фрагмент 23S рРНК из М. jannaschii длиной 95 н. о. (Рис. 2А), который включал в себя спирали Н42-44 (Shcherbakov et al., 2006). Фрагмент белка Р0, MjaPONTF, содержит N-концевой РНК-связывающий домен 1 и специфичный для архей и эукариот домен 2, а С-концевой домен, ответственный за связывание димеров белка Р1, как и первые 10 аминокислотных остатков N-концевого домена 1, удалены для улучшения кристаллизации.

Продукция MjaPONTF, его выделение и последующая хроматографическая очистка проводились по разработанной ранее методике (Kravchenko et al., 2010).

Специфичный 95 нуклеотидный фрагмент 23 S рРНК (Mja23SpPHK(95)) был наработан транскрипцией in vitro с помощью Т7 РНК-полимеразы и очищен с помощью электрофореза в денатурирующих условиях в присутствии 8 М мочевины и последующей ионообменной хроматографии.

Для кристаллизации комплекс MjaP0NTF-23SpPHK(95) был получен смешением изолированных компонентов в молярном соотношении 1:1. Кристаллизация полученного комплекса проводилась методом диффузии паров в висящей капле. Поиск условий кристаллизации осуществлялся с использованием фирменного набора растворов для кристаллизации Natrix (Hampton Research). В растворе №26 через несколько дней появились микрокристаллы комплекса MjaP0NTF-23SpPHK(95). Добавление в каплю ионного детергента цетилтриметиламмония бромида (СТАВ) способствовало росту отдельных более совершенных кристаллов в форме октаэдра. Однако такие кристаллы комплекса отражали рентгеновские лучи в области низкого разрешения (около 10-20 А). Электрофоретический анализ комплекса MjaP0NTF-23SpPHK(95), взятого из капли через 14 дней после раскапывания на кристаллизацию, показал, что специфичный фрагмент 23S рРНК со временем подвергается расщеплению.

Подбор длины фрагмента 23S уРНК

Из-за того, что фрагмент Mja23SpPHK(95) в комплексе с белком MjaPONTF при кристаллизации деградировал, было принято решение уменьшить его длину.

Для определения размера минимального фрагмента 23S рРНК, который необходим для связывания с белком Р0, структура MjaPONTF (Kravchenko et al.,

2010) встраивалась в модель 50S субчастицы рибосомы из H. marismortui (Kavran and Steitz, 2007). Фрагмент спирали Н42 23 S рРНК был выбран такой длины, чтобы N-концевой домен 1 белка Р0 мог контактировать с рРНК. В ранних работах по связыванию архейного комплекса Р0-Р1 из M. jannaschii с соответствующим фрагментом 23 S рРНК показано, что удаление спирали Н43 или Н44 23 S рРНК приводит к потере связывания таких фрагментов рРНК комплексом Р0-Р1 (Shcherbakov et al., 2006). На основании вышеизложенных фактов для кристаллизации с MjaPONTF был выбран фрагмент Mja23SpPHK длиной 74 н. о. (Рис. 2А). Для получения более стабильной шпильки 5'- и З'-концы Mja23SpPHK(74) были изменены таким образом, чтобы образовывалась каноническая пара G-C.

Фрагмент Mja23SpPHK(74) синтезировался транскрипцией in vitro с линеаризованной плазмиды pUC18, содержащей матрицу, соответствующую специфичному фрагменту рРНК, с использованием Т7 РНК-полимеразы. Синтезированный фрагмент 23S рРНК был очищен от компонентов транскрипционной смеси по схеме, использовавшейся для выделения Mja23SpPHK(95).

Кристаллизация MjaPONTF в комплексе с укороченным фрагментом 23S рРНК

Образование комплексов белка MjaPONTF с фрагментом рРНК длиной 74 н. о. осуществлялось смешиванием индивидуальных компонентов комплекса как описано ранее для комплекса MjaP0NTF-23SpPHK(95). MjaPONTF образует гомогенный комплекс с Mja23SpPHK(74) (Рис. 2Б).

Полученный РНК-белковый комплекс кристаллизовали методом диффузии паров в висящей капле. Рост крупных кристаллов комплекса MjaPONTF-23SpPHK(74) наблюдался в диапазоне концентраций осаждающего реагента 7-9% (Рис. 2В).

С кристаллов комплекса MjaP0NTF-23SpPHK(74) на синхротроне BESSY 11 (г. Берлин, Германия) был снят набор дифракционных данных с разрешением 3.2 Â.

A ПВО Л А 1200

Ч.ОГ AU 1 U '„A AG/

AucAGCCAUCCUU-^ G UGCGu.

a -III III V I I ■ Í

GamUCGG.JUGGAG ÍUCGAr A I G—CA \ "

1170 G—С '210

G —С 1160 С — G Г-AG U А С

G . G—1220

Ади ■ А

С —G

С —G

_G - U____

1150 —G —С

U —А

U —А С —G С —G U • G—1230

G — С G — С 1140 — G — с—1234

Рис. 2. (А) Вторичная структура фрагмента 23S рРНК из M. jannaschii, соответствующего спиралям Н42-44, длиной 95 н. о. Черной рамкой выделен выбранный 74 нуклеотидный фрагмент. (Б) Электрофоретический анализ (10% ПААГ, рН 8.3; 10 мМ MgCl2) связывания белка MjaPONTF с Mja23SpPHK(74). 1 - Mja23SpPHK(74); 2 - комплекс MjaP0NTF-23SpPHK(74). (В) Фотография кристалла комплекса MjaP0NTF-23SpPHK(74). Результаты получены совместно с Кравченко О.В., Никоновым C.B. и Piendl W.

1 2

т

в

Определение структуры комплекса М]аР0ШР-218рРНК(74)

Для решения проблемы фаз применялся метод молекулярного замещения. Конечная модель комплекса М]аР01МТР-238рРНК(74) была уточнена до разрешения 3.3 А (Я-фактор = 24.5% и К&ее-фактор = 29.9%). Координаты атомов модели депонированы в банк белковых структур (РЭВ код 5ВбО).

1.3. Тройной комплекс MjaP0NTF-MjaLll-23SpPHK(74)

Для бактериального белка L11 установлено, что положение N-концевого домена меняется относительно С-концевого домена в процессе рабочего цикла рибосомы (Jonker et al., 2007). После связывания белка LI 1 с рибосомой N-концевой домен смещается на 21° в сторону рРНК в результате конформационных перестроек в структуре белка. Определение структуры белка MjaLl 1 в комплексе с MjaPONTF и специфичным фрагментом 23 S рРНК позволяет визуализировать основание архейного рибосомного Р-выступа и проанализировать влияние связывания белка LI 1 на структуру 23S рРНК и его взаимодействие с белком MjaPONTF.

Получение и кристаллизация комплекса MjaPONTF-MiaLl l-23SpPHK(74)

Комплекс MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK(74) был получен смешением индивидуальных компонентов. Для образования тройного комплекса к фрагменту рРНК добавляли небольшой избыток белковых компонентов, чтобы вся рРНК вошла в состав комплекса. Далее избыток белков отделяли с помощью гель-фильтрации.

Поиск условий кристаллизации комплекса MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK(74) проводился в наборе NucPro (Jena Bioscience). В условиях №23 через 5 дней появились кристаллы тройного комплекса (Рис. ЗА). От одного из кристаллов комплекса был собран набор дифракционных данных с разрешением 2.9 А на лабораторной системе рентгеноструктурного анализа PROTEUM Х8 (Brtiker).

А Б I 2 3 4 5 б В

Рис. 3. (А) Фотография кристалла комплекса М]аР0МТР-М]'аЫ 1-238рРНК(74). (Б) Электрофоретический анализ (10% ПААГ, рН 8.3; 10 мМ М§С12) гомогенности комплексов: 1 -М)а238рРНК(74); 2 - комплекс 1-238рРНК(74); 3 - комплекс М)аР0>1ТР-238рРНК(74); 4 -

комплекс М]аР0ШТ-М]а1Л 1-238рРНК(74); 5 - комплекс МУаР0ШТ-МЦа1Л 1-238рРНК(74)-тиострептон, образованный в аналитических количествах; 6 - пиковая фракция после гель-фильтрации, соответствующая М]аР0МТР-{\^аЫ1-238рРНК(74)-тиострептон. (В) Фотография кристаллов комплекса (уЦаРОШТ^аЫ 1-238рРНК(74)-тиострептон.

Определение структуры М1аР0№Р-М1аЫ 1-23БрРНК(74)

Пространственная структура MjaP0NTF-MjaLl 1-238рРНК(74) была решена методом молекулярного замещения. Структура MjaP0NTF-MjaLl 1-238рРНК(74) была уточнена до разрешения 2.9 А и значений Я-фактора = 26.6% и

Rfree-фактора = 29.7% и соответствует всем стереохимическим параметрам. Структуре комплекса MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK(74) присвоен PDB код 5DAR.

1.4. Комплекс MjaP0NTF-Lll-23SpPHK(74) с тиострептоном

В ранних исследованиях функционирования архейных рибосом in vitro было показано, что биосинтез белка у архей ингибируется после добавления антибиотика тиострептона. Было предположено, что архейный белок L11, также как и бактериальный L11, может служить мишенью для воздействия тиострептона на рибосому (Beauclerk et al., 1985).

Опираясь на эти данные, мы попробовали получить комплекс MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK(74) с антибиотиком тиострептоном. Образование комплекса с антибиотиком определяли по изменению подвижности комплекса в геле. При связывании тиострептона с тройным комплексом наблюдалось увеличение подвижности такого комплекса (Рис. ЗБ, дорожка 5). Мы предположили, что связывание тиострептона фиксирует положение LI 1NTD, за счет чего образованный комплекс становится более компактным и быстрее движется в геле.

Структура комплекса MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK(74) с тиострептоном позволяет определить место связывания этого антибиотика и оценить изменения в данном РНК-белковом комплексе при его взаимодействии с тиострептоном.

Получение и кристаллизация комплекса MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK(74)-тиострептон

Образование комплекса MjaPONTF-MjaLl 1-23SpPHK(74) с антибиотиком проходило в два этапа. Первоначально были смешаны индивидуальные компоненты для образования тройного комплекса. Стоит отметить, что антибиотик тиострептон не растворим в воде, поэтому его растворяли в диметилсульфоксиде и добавляли к предварительно образованному комплексу в пятикратном избытке. Разделение конечного комплекса, белков и антибиотика проводилось с помощью гель-фильтрации. Гомогенность очищенного комплекса MjaPONTF-MjaLl 1-23SpPHK(74)-TH0CTpenT0H была проверена электрофорезом в неденатурирующих условиях (Рис. ЗБ, дорожка 6).

После получения комплекса MjaPONTF-MjaLl 1-23 8рРНК(74)-тиострептон был проведен поиск условий его кристаллизации. Были получены кристаллы комплекса «игольчатой» формы в условиях NucPro №42 (Jena Bioscience) с добавлением детергента СТАВ. Рост одиночных крупных кристаллов наблюдался после оптимизации условий кристаллизации (Рис. ЗВ). С кристаллов комплекса MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK(74)-THOCTpenTOH на синхротроне ESRF (г.Гренобль, Франция) был собран набор дифракционных данных с разрешением 2.8 А.

Определение структуры MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK(74)-muocmpenmoH

Определение пространственной структуры комплекса MjaPONTF-MjaLl 1-23SpPHK(74) с тиострептоном осуществлялось методом молекулярного замещения. Структура MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK(74)-TH0CTpenT0H была уточнена до разрешения 2.8 А и значений R-фактора = 20.5% и Rfce-фактора = 24.5%. Координаты модели депонированы в банк белковых структур (PDB код 5D8H).

1.5. Переуточнение структуры комплекса Р0»(РШТБ)6 из археи Ругососсиэ копсонки

Определение в 2010 году структур комплекса белков Р0*(РШТО)6 из Р. Иог1созкП (РЬоРО-РШТЭ) (Ъ^апита е1 а1., 2010) и двухдоменного 1Ч-концевого фрагмента белка Р0 из М. ]аппазсЪи (КгаусЬепко е? а/., 2010) стало существенным прорывом в изучении структуры архейного Р-выступа. Нами был проведен анализ структуры комплекса РЬоРО-РШТБ и оказалось, что структура белка Р0 вписана в карту электронной плотности с ошибками, например, вместо спирали а4 белка Р0 была построена петля (Рис. 4А). Для исправления структуры белка Р0 было проведено переуточнение всей структуры комплекса РИоРО-РПМТО.

На первом этапе переуточнения были удалены около 30 аминокислотных остатков (59-89 а. о.) в стартовой структуре белка Р0. После этого осуществлялось корректное встраивание этих остатков одного за другим и расчет карты электронной плотности. Такие шаги позволили построить две а-спирали аЗ и а4 (Рис. 4А).

При перерасчете карты электронной плотности после исправления положения остатков 104-109 и 183-188 появилась дополнительная плотность в области перетяжки белка Р0. Постепенное встраивание аминокислотных остатков помогло определить полностью структуры тяжей (34 и (310, которые образуют перетяжку между доменами, и спирали а7 домена 2 белка Р0 (Рис. 4Б). На рисунке 4В с помощью наложения структур представлены основные изменения в белке Р0 после переуточнения структуры РЬоРО-РШТО.

После всех исправлений и дополнений структуры РЬоР0-Р11\ГГО значения 11-фактора были снижены с 22.0% до 20.5%, Я^е-фактора - с 26% до 25%, а стереохимические параметры структуры улучшены.

Рис. 4. (А) Наложение основной цепи спиралей аЗ-а4 белка Р0 в комплексе РО'(РШТО)б из Р. коггсозИИ до и после переуточнения структуры. (Б) Фрагмент структуры белка Р0 в комплексе РО«(Р1МТО)6 из Р. IюпсозИи в области перетяжки после переуточнения. (В) Наложение структур белка Р0 в комплексе Р0-(Р1№Т))6 из Р. ИопсозИН до и после переуточнения. На панелях (А) и (В) полипептидная цепь до переуточнения структуры окрашена серым цветом, а после переуточнения - черным.

2. Анализ структур компонентов архейного рибосомного Р-выступа 2.1. Структура изолированного рибосомного белка ¡УЦаЫ1

На Рис. 5А представлена пространственная структура белка М}аЬ 11. Это двухдоменный белок с молекулярной массой 17.5 кДа. И-концевой домен

(М]аЫШТО) содержит аминокислотные остатки 1-68 и образован двумя а-спиралями и протяженным р-листом из трех антипараллельных р-тяжей (Р1-а1-а2-р2-рЗ). Спирали а1 и а2 расположены с вогнутой стороны р-листа. Спираль а2 ориентирована поперек Р-листа и расположена в его углублении. Спираль а1 является пролин-богатой. Четыре консервативных остатка пролина расположены на внешней стороне этой спирали. Ы- и С-концевые домены белка соединены короткой перетяжкой, которая содержит всего четыре аминокислотных остатка (6901РР72). С-концевой домен (М]аЬ 11СТО) является РНК-связывающим и представляет собой компактный глобулярный домен. М]аЫ1СТБ включает в себя аминокислотные остатки 73-161, которые упакованы в четыре а-спирали. Спирали а5 и аб расположены в пространстве практически параллельно. Стоит отметить, что характерной особенностью этого домена является наличие протяженной петли аЗ-а4 (81-97 а. о.).

Рис. 5. (А) Пространственная структура изолированного рибосомного белка MjaLll, PDB код 5COL. (Б и В) Наложение структур бактериального (Т. maritima, PDB код 2K3F) и архейного (М. jannaschii, PDB код 5COL) изолированных белков LI 1 по N-концевому (Б) и С-концевому (В) доменам. Серым цветом окрашен бактериальный белок, черным - архейный.

Сравнительный анализ структур изолированного белка L11 из бактерий и архей

Гомология архейного белка MjaLll и бактериального TmaLll составляет 37%. Несмотря на низкую гомологию данных белков, их пространственные структуры довольно близки (Рис. 5 Б и В). Короткая перетяжка между доменами, состоящая всего из четырех аминокислотных остатков, содержит два консервативных остатка пролина (Рго71-Рго72, нумерация по М. jannaschii). Структуры С-концевых доменов бактериального и архейного L11 также близки по укладке (Рис. 5В). Длинная петля аЗ-а4 характерна для обоих белков и не структурирована. Отличительное свойство архейного белка LI 1 от бактериального -дополнительные 15 а. о. в С-концевой части, которые формируют спираль аб.

2.2. Анализ структур комплексов MjaPONTF со специфичным фрагментом 23S рРНК в отсутствии и присутствии MjaLl 1

Пространственные структуры комплекса белка MjaPONTF с фрагментом 23S рРНК и тройного комплекса MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK(74) представлены на Рис. 6.

Взаимодействие МЦаРОШТ с 238 рРНК не влияет на общую укладку полипептидной цепи белка по сравнению с укладкой белка в изолированном состоянии. Ы- и С-концы М]аР0МТР расположены в одном домене, а домен 2 является вставкой в домен 1. Оба домена соединены между собой перетяжкой, которая образована антипараллельным (3-листом (Р4 и (311). Домен 1 состоит из пяти а-спиралей, которые расположены по обе стороны пятитяжевого антипараллельного |3-листа. Домен 2 образован тремя двухтяжевыми антипараллельными (3-листами и двумя а-спиралями. В структурах комплексов ¡^аРОМТР со специфичным фрагментом 238 рРНК в отсутствии и присутствии 1УуаЬ11 обнаружено, что домен 2 МЦаРОШТ не образует контактов с фрагментом 238 рРНК и отстоит от этого фрагмента на расстоянии более 8 А. Этот факт опровергает ранее выдвигавшееся нами предположение о том, что домен 2 белка РО может взаимодействовать со спиралью Н44 238 рРНК (КгаусЬепко е1 а1, 2010).

Рис. 6. (А) Пространственная структура рибосомного комплекса MjaP0NTF-23SpPHK(74), PDB код 5D6G. Фрагмент рРНК окрашен серым цветом, белок - темно-серым цветом. (Б) Пространственная структура комплекса MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK(74), PDB код 5DAR. Фрагмент рРНК окрашен в серый цвет, белок P0NTF - в темно-серый, LI 1 - в черный.

При связывании с рРНК структура MjaLllNTD не меняется, а структура С-концевого домена подвергается существенным конформационным перестройкам (Рис. 7А). При взаимодействии с рРНК протяженная петля аЗ-а4 белка MjaLll, а также петля а4-а5 структурируются и принимают форму, повторяющую поверхность малого желобка спирали Н43 23 S рРНК. Спираль а5 смещается в сторону спирали аЗ и располагается вдоль желобка спирали Н43. Пространственная укладка С-концевого домена архейного белка MjaL 11 в РНК-связанном состоянии идентична укладке С-концевых доменов в структурах архейного белка HmaLll и бактериальных белков LI 1 в РНК-связанном состоянии (Рис. 7Б).

Фрагмент 23S рРНК хорошо структурирован (Рис. 6). Спирали Н43 и Н44 достаточно плотно упакованы. Спираль Н42 служит «мостиком» между спиралями Н43 и Н44 и телом рибосомы. Эта спираль представляет собой регулярную спираль в А' форме, которая прерывается только в области мотива «излом-поворот» (Klein et al., 2001). Нуклеотидные остатки An55, Ац5б и G1157 образуют выпетливание. Благодаря мотиву «излом-поворот» спираль Н42 изгибается практически на 90°.

Структура этого фрагмента рРНК не изменяется ни при связывании М]аЫ 1, ни при взаимодействии с антибиотиком тиострептоном (Рис. 13).

Рис. 7. (А) Наложение структур С-концевых доменов рибосомного белка MjaLll в свободном состоянии (черный, PDB код 5COL) и в составе комплекса MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK(74) (серый, PDB код 5DAR). (Б) Наложение структур С-концевых доменов архейных и бактериальных белков L11 в РНК-связанном состоянии: в составе бактериальных комплексов TmaLll-23SpPHK(58) (цвет 4, PDB код 1MMS) и EcoLl lCTD-23SpPHK(58) (цвет 2, PDB код 1НС8), архейного комплекса MjaPONTF-MjaLl l-23SpPHK(74) (цвет 1, PDB код 5DAR) и в составе 50S субчастицы архейной рибосомы (цвет 3, PDB код 4HUB). Для лучшего восприятия N-концевые домены TmaLll, MjaLll и HmaLll не изображены. Фрагмент рРНК представлен виде поверхности светло-серого цвета.

2.3. Взаимодействие белков архейного рибосомного Р-выступа с 23S рРНК

Анализ взаимодействия MjaLll и MjaPONTF с 23SрРНК

MjaPONTF связывается со спиралью Н42 23S рРНК около мотива «излом-поворот» с внешней стороны угла. Ранее отмечалось, что для взаимодействия белков L10 и РО с 23S рРНК необходима правильная пространственная укладка спиралей Н42-44 23 S рРНК (Diaconu et al, 2005). Область контакта белка с 23S рРНК сформирована атомами главной цепи и боковых групп, принадлежащих спиралям al, a2 и a3, а также петлям (31-а2 и (32-а3. Практически все контакты белка MjaPONTF приходятся на сахаро-фосфатный остов 23 S рРНК.

Основной участок связывания 23S рРНК с белком MjaLll расположен на спирали Н43. Во взаимодействие с рРНК вовлечены как атомы главной цепи, так и боковых групп спиралей аЗ-6 и двух петель аЗ-а4 и а4-а5 С-концевого домена L11. Аминокислотные остатки спирали а5 образуют протяженную сеть водородных связей с малым желобком спирали Н43. Структурированные петли аЗ-а4 и а4-а5, расположенные по обе стороны спирали а4, взаимодействуют с малым желобком спирали Н43 23S рРНК. В отличие от MjaPONTF, белок MjaLll образует только половину контактов с сахаро-фосфатным остовом 23 S рРНК, а остальные контакты — с азотистыми основаниями рРНК.

Площадь поверхности контакта рРНК с MjaPONTF и MjaLll примерно одинакова и составляет 1049 и 1075 Á2, соответственно. Участки связывания этих белков с рРНК расположены рядом, но MjaPONTF и MjaLll между собой практически не взаимодействуют (Рис. 6Б). Была обнаружена лишь одна слабая водородная связь между РНК-связывающими доменами обоих белков (длина водородной связи 3.4 Á). Домен 2 белка MjaPONTF не контактирует с N-концевым доменом MjaLl 1.

А

Сравнительный анализ участков взаимодействия компонентов Ь12/Р-выступа с 23S рРНК

N-концевой РНК-связывающий домен рибосомных белков L10 и РО достаточно консервативен и имеет схожую пространственную структуру (Ben-Shem et al., 2011; Diaconu et al., 2005; Kravchenko et al., 2010). С-концевой РНК-связывающий домен архейного и бактериального LI 1 также структурно консервативен (Klein et al., 2004; Wimberly et al., 1999). Взаимозаменяемость белковых компонентов основания Ы2/Р-выступа с образованием гибридной рибосомы (Nomura et al., 2006; Uchiumi et al., 2002) подтверждает их структурную гомологию и схожий способ взаимодействия с рРНК.

Haloanuta Methanococcus Saccharomyces Thermotoga

marismortui jannaschii cerevisiae maritima

Рис. 8. Анализ контактирующих поверхностей белков Р0 и LI 1 и фрагментов 23/25S рРНК. (А) Поверхность структуры N-концевых доменов белка Р0 из архей И. marismortui и М. jannaschii и эукариот S. cerevisiae. Темно-серым цветом окрашены аминокислотные остатки, контактирующие с рРНК. (Б) Поверхность структуры С-концевых доменов белка LI 1 из архей Н. marismortui и М. jannaschii и бактерии Т. maritima. Черным цветом окрашены аминокислотные остатки, контактирующие с 23S рРНК. (В) Поверхность структуры фрагментов 23/25S рРНК в районе L12/P-BbicTyna из архей Н. marismortui и М. jannaschii, эукариот S. cerevisiae и бактерии Т. maritima. Темно-серым цветом окрашены нуклеотидные остатки, контактирующие с Р0, черным

Haloarcuta marismortui

Methanococcus jannaschii

Saccharomyces cerevisiae

Haloarcula marismortui

Methanococcus jannaschii

Thermotoga maritima

- с L11. Для построения поверхностей белков и рРНК были использованы структуры с PDB кодами 4HUB, 3U5H и 1MMS, 5DAR.

Участки связывания рРНК располагаются на поверхности белков РО из Н. marismortui и М. jannaschii схожим образом (Рис. 8А). Консервативные аминокислотные остатки расположены по центру контактирующей поверхности, а неконсервативные - по периферии. Стоит отметить, что только атомы главной цепи неконсервативных остатков вовлечены во взаимодействие с рРНК. Область контакта эукариотического белка РО из Saccharomyces cerevisiae незначительно отличается от области контакта архейных РО (Рис. 8А).

Область взаимодействия архейных белков Ll 1 и бактериального Lile рРНК достаточно консервативна (Рис. 8Б). Основная область контакта этих белков расположена на спиралях аЗ и а5 и петлях аЗ-а4 и а4-а5. Остальные контакты могут варьироваться в зависимости от организма.

На Рис. 8В на поверхности фрагментов высокомолекулярной рРНК больших субчастиц рибосом из архей, бактерий и эукариот отмечены участки, с которыми взаимодействуют белки РО и/или L11. Несмотря на небольшие отличия, область контакта белков РО и Ll 1 с рРНК чрезвычайно консервативна.

2.4. Взаимодействие архейного рибосомного Р-выступа с антибиотиком тиострептоном

Пространственная структура комплекса М]аР0ШТ-М)аЕ11-238рРНК(74)-тиострептон представлена на Рис. 9.

^^ Рис. 9. Пространственная структура комплекса

ТЛ М]аР(ЖТР-М)аЫ 1-238рРНК(74)-тиострептон,

5' N. п Л РОВ код 508Н.

Область связывания тиострептона в архейном рибосомном комплексе MjaPONTF-MjaL 1 l-23SpPHK(74) расположена между спиралями Н43 и Н44 23S рРНК и N-концевым доменом белка MjaLll (Рис. 9). Этот способ взаимодействия антибиотика с данным тройным комплексом аналогичен его взаимодействию с бактериальной рибосомой (Harms et al., 2008).

Взаимодействие тиострептона с рРНК и MjaLll в комплексе преимущественно гидрофобное, через стэкинг-взаимодействия. Петля 1 тиострептона занимает место между вершиной спиралей Н43 и 44 23S рРНК и спиралью al MjaLl 1 (Рис. 9). Петля 2, за исключением QA8, наоборот, обращена в сторону растворителя. Серосодержащие тиазольные кольца петли 1 и «хвоста»

участвуют в стэкинг-взаимодействиях с азотистыми основаниями РНК и пролин-богатым участком МЦаЫ1.

Компоненты ТН74 и ^HZ6 тиострептона образуют стэкинг-взаимодействия с Рго20 и Рго19 спирали а1 белка М|аЫ 1, соответственно (Рис. 10А), а ТН21 - с нукпеотидным остатком А1205 спирали Н44 238 рРНК (Рис. 10В). Более того, ТН21 дополнительно образует одну водородную связь с сахаро-фосфатным остовом А12о5 через молекулу воды (Рис. 10В). С)А8 тиострептона контактирует с азотистым основанием Ац77 спирали Н43 238 рРНК через стэкинг-взаимодействие. Остаток А1177 образует три водородные связи с тиострептоном: с ТЬг2, ТН24 и ТНР5 (Рис. 10В). Компонент ТН214 располагается между двумя аминокислотными остатками, пролинами Рго23 и Рго27, спирали а1 белка М]аЫ1 (Рис. 10А).

Б К4

ТН214

ТН/Л4

ТРУ 13

Рис. 10. Фрагменты структуры М]аР0ШТ-М]аЫ 1-238рРНК(74)-тиострептон в области контакта тиострептона со спиралью а1 архейного (А) и бактериального (Б) белков Ы1; со спиралями Н43-44 архейной (В) и бактериальной (Г) 238 рРНК; со спиралью аб РОЫТР (Д). Тиострептон окрашен в черный цвет, архейный и бактериальный Ы1 - в светло-серый, Р01МТР - в серый, архейная и бактериальная рРНК - в темно-серый, лу - молекула воды.

С компонентами бактериальной рибосомы (нуклеотидные остатки А1078 и АП06 238 рРНК и аминокислотные остатки Рго21 и Рго22 белка Ы 1) тиострептон также взаимодействует посредством стэкинг-взаимодействий (Рис. 10 Б и Г). Основное отличие во взаимодействии с бактериальной и архейной рибосомами заключается в

17

положении «хвоста» тиострептона (Рис. 10 А и Б). В бактериальной рибосоме этот «хвост» расположен вдоль спирали а1 бактериального белка Ь11 (Рис. 10Б). В архейном рибосомном комплексе «хвост» тиострептона занимает положение, отличное от положения в бактериальной рибосоме (Рис. 10 А и Д). ОНА15 и ЭНА16 расположены в непосредственной близости от пролин-богатого участка спирали аб ¡УЦаРОШТ (Рис. 10Д). ЫН2-группа модифицированного компонента ОНА 16 отстоит на расстоянии 3.8 А от атома кислорода главной цепи белка М]'аР0ЫТР.

2.5. Подвижность компонентов основания Р-выступа архейной рибосомы

Ранее при анализе структуры изолированного М)аР0ЫТР было показано, что домен 2 подвижен благодаря гибкой перемычке (КгаусЬепко е( а1., 2010). Из-за подвижности структуру домена 2 не удается визуализировать (только спираль а7 домена 2) в составе архейного рибосомного комплекса Р1юР0-Р1>ПТ) (Рис. 4В).

Знание структур М]аР01МТР в свободном состоянии (КгаУсЬепко еС а1., 2010) и в ряде комплексов с рРНК, которые определены в данной работе, и белка Р0 из Н. тапьтогйи (ОаЬсШкЪакоу е/ а1., 2013) позволило проанализировать конформационные изменения в структуре белка Р0 в свободном от РНК и связанном с РНК состояниях. Структуры 1Ч-концевых доменов 1 и 2 при связывании с 238 рРНК не меняются. Однако при наложении структур архейного белка Р0 по Ы-концевому домену 1 выяснилось, что положение домена 2 белка Р0 отличается в каждой структуре (Рис. 11 А). Максимальная амплитуда домена 2 составляет 41°. Наиболее близкое положение к рРНК домен 2 принимает в структуре белка Р0 в составе 505 субчастицы рибосомы из Н. таштоНш, при этом он все же не взаимодействует с 238 рРНК (наименьшее расстояние от домена 2 до рРНК составляет 5 А). Наиболее удаленное положение от рРНК этот домен занимает в структуре комплекса MjaP0NTF-MjaLl 1-238рРНК(74) с тиострептоном. Домен 2 структуре изолированного MjaP0NTF находится в промежуточном положении. Подвижность домена 2 белка Р0 имеет интересную особенность - смещение домена происходит только в одной плоскости (Рис. 11Б).

Суммируя вышеизложенные данные, можно заключить, что образование комплекса белка Р0 с димерами белка Р1 и связывание Р0 с 238 рРНК не только не фиксируют домен 2 белка Р0 в определенном положении, но и не влияют на его подвижность. Биохимические эксперименты показывают, что удаление домена 2 в архейном белке Р0 приводит к ухудшению связывания фактора элонгации трансляции 2 с рибосомой, а также к снижению ГТФазной активности рибосомы и уровня синтеза полифенилаланина (Т^^апита е/ а1., 2010). Поэтому наиболее вероятно, что подвижность домена 2 белка Р0 может способствовать взаимодействию факторов элонгации с рибосомой и их более точному расположению в ГТФаза-связывающем центре.

Рис. 11. Наложение структур первых двух доменов белка РО, демонстрирующее подвижность домена 2: (А) с фрагментом 23S рРНК; (Б) без фрагмента 23S рРНК, изображение повернуто на 90° вправо. Наложение белка проводилось по домену I. Белок РО представлен: в составе 50S субчастицы рибосомы из Н. marismortui (красный. PDB код 4HUB), в изолированном состоянии (голубой и желтый, PDB код 3JSY). в комплексе с фрагментом 23S рРНК (оранжевый, PDB код 5D6G), в составе комплекса MjaPONTF-MjaLI l-23SpPHK(74) (фиолетовый и синий, PDB код 5DAR), и в составе комплекса MjaP0NTF-MjaLll-23SpPHK(74)-TnocTpenTOH (зеленый. PDB код 5D8H). Фрагмент рРНК окрашен в серый цвет.

При связывании изолированного бактериального белка L11 с 23S рРНК происходит смещение его N-концевого домена на 21° в сторону рРНК, а при взаимодействии с антибиотиком тиострептоном — дальнейшее смещение в сторону рРНК еще на 26° (Harms et al., 2008; Jonker et al., 2007). Было предположено, что бактериальный белок L11 функционирует в рибосоме как молекулярный переключатель, который регулирует взаимодействие фактора элонгации 2 с рибосомой в процессе белкового синтеза (Harms el al., 2008).

При наложении структур архейного рибосомного белка L11 оказалось, что его N-концевой домен тоже обладает определенной подвижностью (Рис. 12). Амплитуда движения N-концевого домена белка LI 1 из М. jannaschii, который был определен в составе белка в свободном состоянии и в комплексе с рРНК, составляет около 20°. Важно отметить, что положение L11NTD в составе 50S субчастицы рибосомы из Н. marismortui отличается от положения этого же домена в составе комплекса MjaPONTF-MjaLI l-23SpPHK(74) (смещение около 50°). Подвижность N-концевого домена архейного рибосомного белка L11 наводит на мысль, что архейный белок L11, подобно бактериальному аналогу, также может играть роль молекулярного переключателя на рибосоме.

Участок высокомолекулярной рРНК большой рибосомной субчастицы, который соответствует спиралям Н42-44 и входит в состав ГТФаза-связываюшего центра рибосомы, высоко консервативен (Gonzalo and Reboud, 2003). Примерно две трети нуклеотидных остатков, формирующих этот участок (1140-1235 и.о., нумерация по Мjannaschii), идентичны во всех доменах жизни. На Рис. 13 представлено наложение фрагментов пространственной структуры 23/25S рРНК (спирали Н42-44) из архей, бактерий и эукариот. Видно, что пространственная структура этого участка рРНК универсальна.

Рис. 12. Наложение структур архейного белка Ы1, связанного с фрагментом 23Б рРНК (серая поверхность). Наложение белка проводилось по С-концевому домену. Белок представлен в изолированном состоянии

(желтый. РОВ код 5СОЬ), в РНК-связанном состоянии с антибиотиком (зеленый, РОВ код 508Н) и без антибиотика (голубой, РОВ код 4Н1]В; оранжевый, РОВ код 50АК).

Рис. 13. Наложение фрагментов структур 23/25S рРНК в районе Ы2/Р-выступа: из архей Н. marismortui (оранжевый, PDB код 4HUB) и М. jannaschii в составе разных комплексов (голубой -MjaP0NTF-23SpPHK(74), PDB код 5D6G; синий и желтый -MjaPONTF-MjaLl I-23SpPHK(74), PDB код 5DAR; зеленый -MjaP0NTF-MjaLll-23SpPHK(74)-THOCTpenTOH, PDB код 5D8H), из эукариот S. cerevisiae (коричневый, PDB код 3U5H), из бактерий Thermus thermophilus (красный, PDB код 4JUX) и Deinococcus radioduram (серый, PDB код 2ZJR; темно-красный - с тиострептоном, PDB кодЗСР5).

Из литературных данных известно, что архейные рибосомные комплекс Р0-Р1 и белок LU, а также их эукариотические гомологи, могут замещать белки Ы2-выступа на бактериальной рибосоме (Nomura et al., 2006). Универсальность пространственной укладки спиралей Н42-44 23/25S рРНК (Рис. 13), а также схожие контактирующие поверхности белков Р0 и LI 1 среди всех доменов жизни (Рис. 8), служат наглядным объяснением того, почему возможна взаимозаменяемость этих белков на рибосоме. В то же время, различия в структурах архейных, эукариотических и бактериальных рибосомных белков, формирующих L12- и Р-выступы, определяют специфичность связывания бактериальных и архейных/эукариотических факторов трансляции к «своим» рибосомам.

Таким образом, результаты данной работы создают базу для понимания структурных основ функционирования Р-выступа архейных рибосом. Полученные структуры компонентов архейного бокового выступа помогают дополнить структуры большой субчастицы архейной и эукариотической рибосом. Благодаря высокой гомологии белков рибосомного Р-выступа архей и эукариот результаты структурных исследований архейных белков можно использовать для моделирования и изучения структур их эукариотических гомологов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики выделения рибосомного белка Ь11 и специфичного фрагмента 23Б рРНК из М. }аппакс]т (23БрРНК(74)), а также методики получения РНК-белковых комплексов М]аР0ШТ-23БрРНК(74), М]аР01ЧТР-М]а1Л1-238рРНК(74) и М]аР0тТ-М]а1Л1-238рРНК(74) с тиострептоном.

2. Получены кристаллы изолированного рибосомного белка Ь11 из археи М.]аппа$ски. Определена и уточнена пространственная структура М]аЫ 1 с разрешением 2.2 А. Впервые визуализирована структура И-концевого домена архейного рибосомного белка Ы1.

3. Получены кристаллы комплексов архейных рибосомных белков с фрагментом рРНК - ]УЦаР0МТР-238рРНК(74) и Р^'аР0ШТ-М]а1Л 1-238рРНК(74); определены их структуры с разрешением 3.3 А и 2.9 А, соответственно.

4. Показано, что, несмотря на большую подвижность домена 2 архейного рибосомного белка РО, этот домен не образует контактов с 23 Б рРНК. Расположенные рядом на большой рибосомной субчастице архейные белки Ы1 и РО практически не взаимодействуют между собой.

5. Анализ пространственных структур архейных рибосомных белков Ы1 и РО в комплексе с фрагментом 238 рРНК позволил выявить структурные особенности поверхностей контакта данных белков с рРНК.

6. Получены кристаллы комплекса М]аР0ШТ-М]а1Л 1-238рРНК(74)-тиострептон и определена структура этого комплекса с разрешением 2.8 А. Показано, что тиострептон связывается схожим образом, как с бактериальной, так и с архейной рибосомами. Место связывания антибиотика тиострептона с архейной рибосомой расположено между Ы-концевым доменом белка Ы1 и спиралями Н43-44 238 рРНК.

7. Переуточнена кристаллическая структура комплекса рибосомных белков РО»(РШТО)6 из археи Р. ЪопсозЪи. Исправлены спирали аЗ-а4 и достроены спираль а7 и Р-тяжи Р4 и рЮ белка РО.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ

1. Kravchenko О., Mitroshin I., Nikonov S., Piendl W.and Garber M. Structure of a two-domain N-terminal fragment of ribosomal protein L10 from Methanococcus jannaschii reveals a specific piece of the archaeal ribosomal stalk. // Journal of Molecular Biology. 2010. V. 399. P. 214-220.

2. Кравченко O.B., Митрошин И.В., Габдулхаков А.Г., Никонов С.В, Гарбер М.Б. Кристаллизация комплекса двухдоменного N-концевого фрагмента архейного рибосомного белка L10 (Р0) со специфическим фрагментом 23S рРНК. //Кристаллография. 2011. V. 56(4). Р. 751-753.

3. Mitroshin I., Gabdulkhakov A. and Garber М. The base of the ribosomal P stalk from Methanococcus jannaschii: crystallization and preliminary X-ray studies. // Acta Crystallographica. 2013. V. F69. P. 1288-1290.

4. Mitroshin I., Garber M. and Gabdulkhakov A. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of an archaeal ribosomal protein LI 1. // Acta Crystallographica. 2015. V. F71. P. 1083-1087.

Тезисы докладов на конференциях

1. Митрошин И.В., Кравченко О.В., Щербаков Д.В., Пиндл В., Никонов С.В., Гарбер М.Б. Получение и кристаллизация комплекса N-концевого фрагмента белка L10 со специфическим фрагментом 23 S рРНК. // Тезисы конференции «Биология - наука XXI века». Пущино, Россия. 2010. С. 158-159.

2. Митрошин И.В., Кравченко О.В., Пиндл В., Никонов С.В., Гарбер М.Б. Боковой И2-выступ архейной рибосомы: кристаллизация комплекса N-концевого фрагмента белка L10 со специфическим фрагментом 23S рРНК. // Тезисы конференции «Симбиоз-Россия». Нижний Новгород, Россия. 2010. С. 102-103.

3. Митрошин И.В., Кравченко О.В., Габдулхаков А.Г., Никонова Е.Ю., Шкляева А.А., Никонов С.В., Гарбер М.Б. Боковой Р1-выступ архейной рибосомы: кристаллизация N-концевого фрагмента рибосомного белка Р0 с фрагментами домена II 23S рРНК разной длины. // Тезисы симпозиума «Белки и пептиды». Петрозаводск, Россия. 2011. С. 377.

4. Митрошин И.В., Кравченко О.В., Габдулхаков А.Г., Никонов С.В., Гарбер М.Б. Кристаллизация комплексов N-концевого фрагмента архейного рибосомного белка Р0 со специфическими фрагментами 23S рРНК. // Тезисы конференции «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, Россия. 2011. С. 52.

5. Митрошин И.В., Габдулхаков А.Г., Никонов С.В., Гарбер М.Б. Кристаллизация основания архейного рибосомного Р1 выступа. // Тезисы конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Казань, Россия. 2012. С. 254-255.

6. Митрошин И.В., Габдулхаков А.Г., Никонов С.В., Гарбер М.Б. Получение и кристаллизация рибосомного РНК-белкового комплекса P0NTF-L11-23S рРНК из археи Methanococcus jannaschii. //Тезисы конференции «Симбиоз-Россия». Тверь, Россия. 2012. С. 102-103.

7. Mitroshin I., Kravchenko О., Nikonov S., Garber M. Crystallization and structural studies of PI stalk components of archaeal genus Methanococcus. // Abstract book of FEBS practical course: Advanced methods in macromolecular crystallization V. Nove Hrady, Czech Republic. 2012. V. 19(2). P. 42.

8. Митрошин И.В., Габдулхаков А.Г., Никонов C.B., Гарбер М.Б. Кристаллизация и исследование структуры архейного рибосомного РНК-белкового комплекса P0NTF-L11-23S рРНК. // Тезисы конференции «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, Россия. 2013. С. 63.

9. Митрошин И.В., Габдулхаков А.Г., Никонов С.В., Гарбер М.Б. Структурное исследование архейного рибосомного Р1 выступа. // Тезисы симпозиума «Белки и пептиды». Уфа, Россия. 2013. С. 222.

10. Митрошин И.В., Габдулхаков А.Г., Никонов С.В., Гарбер М.Б. Пространственная структура архейного рибосомного комплекса P0NTF-Lll-23SpPHK. // Тезисы конференции «Симбиоз-Россия». Иркутск, Россия. 2013. С. 294-295.

11. Митрошин И.В., Габдулхаков А.Г., Гарбер М.Б. Кристаллизация и структурные исследования полноразмерного архейного рибосомного белка LI 1. // Тезисы конференции «Биология - наука XXI века». Пущино, Россия. 2015. С. 251.

Заказ № 96-А/09/2015 Подписано в печать 28.09.2015 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:гак@с/г.ги