Исследование роли рибосомных белков L5 и L25 в формировании функционально-активной бактериальной рибосомы

Коробейникова, Анна Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование роли рибосомных белков L5 и L25 в формировании функционально-активной бактериальной рибосомы
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли рибосомных белков L5 и L25 в формировании функционально-активной бактериальной рибосомы"

На правах рукописи

КОРОБЕЙНИКОВА АННА ВАСИЛЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ L5 И L25 В ФОРМИРОВАНИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-АКТИВНОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ

РИБОСОМЫ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

4848653

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 МЮН 2011

Москва-2011

4848653

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Институте белка РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Гарбер Мария Борисовна

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук

Асеев Виктор Васильевич

доктор химических наук

Сергиев Петр Владимирович

Ведущая организация:

Филиал Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится «24» июня 2011 года в_часов на заседании совета Д 501.001.76

по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд.536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан мая 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синтез белка на рибосоме - важнейший из клеточных процессов. Уникальная структурная организация и функционирование рибосомы базируется на специфических взаимодействиях РНК и белков. В связи с этим, в рамках проблемы биосинтеза белка одной из приоритетных задач является выяснение роли отдельных компонентов рибосомы и их межмолекулярных контактов в формировании функционально-активной рибосомы. За почти полвека исследований накоплено много детальной информации о структуре рибосомы и ее компонентов, однако о принципах специфического взаимодействия РНК и белков в рибосоме до сих пор известно немного. Кроме того, большая часть имеющихся на сегодняшний день данных получена в экспериментах in vitro, которые далеко не всегда могут адекватно отражать процессы, происходящие в клетке. Поэтому изучение роли отдельных рибосомных белков в формировании и функционировании рибосомы, особенно в системе in vivo, является сегодня весьма актуальным.

Цель работы: исследование роли межмолекулярных контактов рибосомных 5S рРНК-связывающих белков L5 и L25 в сборке и функционировании рибосомы Escherichia coli.

Основные задачи работы:

- исследовать особенности специфического взаимодействия рибосомного белка L25 Е. coli и его гомологов (белков семейства СТС) с изолированной 5S рРНК,

- выяснить, необходимо ли взаимодействие белка L25 с 5S рРНК для его встраивания в рибосому in vivo,

- проверить, какой эффект оказывает отсутствие рибосомного белка L5 в клетках Е. coli на сборку in vivo большой рибосомной субчастицы,

- выяснить важность контакта с тРНК петли ß2-ß3 белка L5 для работы бактериального аппарата трансляции.

Научная новизна и практическая ценность работы. Проведено комплексное исследование специфического взаимодействия рибосомного белка L25 Е. coli и его гомологов (белков семейства СТС) с 5S рРНК. Установлено, что все пять аминокислотных остатков 5S рРНК-связывающего модуля этих белков играют ключевую роль в стабилизации уже сформированного комплекса с изолированной РНК. Доказано, что изменения, обнаруженные в белке СТС и 5S рРНК некоторых бактерий, имеют компенсаторный характер и направлены на сохранение этими молекулами способности формировать стабильный комплекс. Впервые получены данные, свидетельствующие о том, что формирование прочного контакта между белком L25 и 5S рРНК, не являясь обязательным условием для встраивания этого белка в рибосому in vivo, необходимо для его удержания в ней. Присутствие белка L25 в рибосоме приводит к увеличению стабильности ассоциации рибосомных субчастиц. Учитывая то, что белки семейства СТС являются особенностью бактериального аппарата трансляции, полученные в работе результаты могут иметь практическую ценность в разработке новых бактериостатических агентов. В данной

работе впервые продемонстрировано, что рибосомный белок L5 Е. coli строго необходим для встраивания 5S рРНК-белкового комплекса, а также белков L16, L27, L30 и L33 в большую субчастицу рибосомы in vivo. Показано, что укорочение петли ß2-ß3 белка L5, контактирующей с тРНК в Р-участке рибосомы, приводит к снижению белок-синтезирующей активности рибосом и, как следствие, к замедлению роста клеток Е. coli.

Полученные в ходе выполнения работы штаммы Е. coli и генетические конструкции могут быть использованы для дальнейших детальных исследований аппарата трансляции этой бактерии.

Струю-ура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работу иллюстрируют рисунков и таблиц. Общий объем диссертации страниц. Библиография включает названий.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи. Результаты данной работы неоднократно докладывались на российских и международных конференциях. Определенная в работе последовательность участка ДНК Aquifex aeolicus была депонирована в GenBank (Accession number EU851040).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

5S рРНК является неотъемлемым компонентом рибосом всех ныне живущих организмов. С одной стороны, эта рибосомная РНК расположена в непосредственной близости от функциональных центров рибосомы, но не принимает прямого участия в их работе. С другой стороны, большая субчастица рибосомы, реконструированная in vitro в отсутствие 5S рРНК, функционально неактивна. В связи с этим, уже более сорока лет актуален вопрос, что же делает эта РНК в рибосоме. 5 S рРНК специфически взаимодействует с несколькими рибосомными белками (например, в Е. coli - это L5, LI8 и L25). Литературные данные указывают на то, что именно эти белки в значительной степени определяют уникальное положение этой РНК в рибосоме (для обзора см. Гонгадзе и др., 2008, Успехи Биолог. Химии, 48, 105-132). Несколько лет назад в нашей лаборатории было показано, что нокаут гена рибосомного белка L5 или L18 летален для клеток Е. coli (Korepanov et al., 2007, J. Mol. Biol., 366, 11991208). В то же время, без рибосомного белка L25 клетки выживали, но росли медленнее клеток исходного штамма, a AL25 рибосомы отличались сниженной эффективностью в биосинтезе белка. Все это свидетельствует о важности 5S рРНК-связывающих белков дня работы рибосомы. Однако конкретная роль этих белков в формировании рибосомы в клетке оставалась невыясненной. В связи с этим, в рамках данной работы были проведены исследования, посвященные выяснению роли рибосомных белков L5 и L25 в сборке и функционировании рибосомы £ coli.

1. Изучение специфического взаимодействия рибосомного белка L25 Escherichia coli и его гомологов (белков семейства СТС) с 5S рРНК

1.1. Белок СТС Aquifex aeolicus не является исключением среди белков семейства

Рибосомные белки L25 Escherichia coli и TL5 Thermus ihemophilus принадлежат к семейству белков СТС, представители которого обнаружены только в бактериях (для обзора см. Гонгадзе и др., 2008). Данное семейство получило название по первому описанному представителю - основному стрессовому белку СТС (catabolite controlled) Bacillus subtilis. Белок СТС В. subtilis вырабатывается клеткой в ответ на различные типы стресса и при этом обнаруживается в рибосомной фракции клеток. Все изученные белки семейства СТС объединяет одно свойство - они способны специфически связываться с рибосомной 5S РНК. На сегодняшний день семейство белков СТС насчитывает более трехсот представителей, и все они содержат в N-концевой части молекулы так называемый «5S рРНК-связывающий домен», соразмерный и гомологичный рибосомному белку L25 Е. coli. Единственным исключением можно было считать белок СТС из гипертермофильной бактерии Aquifex aeolicus. В геноме этой бактерии, представленном в банке данных, ген ctc

ctc

228685 AATAAAGTTTTCTGATCTACQGA^GAATGCAAAjATgAGGAGAGTAAAGGTTAAGCTTTTACCAAGGAAACCCGGA

М RRVKVKLLPRKPG

228610 AGGMGAGCGACCTTAAGAGGMAAGAAGGGAAGGGTGGCTCCCTGTGGAAATTTACGGAAAGGGAGTTGAGAAT RKSDLKRKRREGWLPVEIYGKGVEN

228535 AAGCACGCCTGGATTMCGTTAAAGATTTTGCTTcarrGCCCCACGGAGAGGCtTTTCTTATTGAGGCAGAACTT

L PHGEAFLIEAEL KHAWINVKOFAS CPTERLFLLRQNL

228461 GACGGAGAAACGAGGGTTTGTCTTTTAAAGGACATTCAATTCGGTTGGCTGGGAAACAATCCCATACACATCGAC DGETRVCLLKDIQFGWLGNNPIHID TAKRGFVF#

228386 CTGTACGACCTCTCAAACGTTGAGGAAATTGAAGTGGAAGTTCCCATTGAATTGGTTGGAACACCCGCGGGTGTA LYDLSNVEEIEVEVPIEFVGTPAGV

228311 GAAGCCGGCGGAACGTTTGAACCCGTAATGCACAGATTGACAATCAAAGCTCCTCCTGCAAAGATACCCGAAAAA EAGGTFEPVMHTLTIKAPPAKIPEK

228236 ATAGTGGTTGACGTATCTGGACTCGGACTCGGAGAAGCGCTCCACGTCAGAGACATAACACCTCCCGAAGGATGT IVVDVSGLGLGEALHVRDITPPEGC

228161 ATGATCCTTGACAATCCTGAAGAAACGGTAGCGGTAGTTTACGAGCCCGAAGAAGAAGTAATAGGCGAAGAGGAG MILDNPEETVAVVYEPEEEVIGEEE

228086 ACAGGAGCAGAAGAAACGGGAGAAACGGAAGCAACTTCCTAATTGAATGGACATTAAACTAGTAGTAGGTTTAGG TGAEETGETEATS#

Рис. 1. Нуклеотидная последовательность участка ДНК A. aeolicus, определенная в данной работе. Нумерация нуклеотидов приведена в соответствии с их положением в геноме (Accession number АЕ000657). Пропущенный нуклеотид (С228501) отмечен белым символом на черном фоне. Стартовые кодоны для укороченного и полноразмерного гена ctc обозначены пунктирной и сплошной рамками, соответственно. Под нуклеотидными последовательностями приведены аминокислотные последовательности полипептидов, кодируемых соответствующими ОРС. Они расположены на разных строках для того, чтобы показать сдвиг рамки считывания соответствующей ОРС. Возможный сайт связывания рибосомы подчеркнут.

кодировал белок, лишенный первых пятидесяти остатков 5 S рРНК-связывающего домена. Такой полипептид был не способен связываться с 5S рРНК (Корепанов и др., 2004, Биохимия, 69, 749-754). Мы решили прояснить вопрос об исключительности белка СТС A. aeolicus среди белков данного семейства.

Участок генома A. aeolicus, содержащий ген ctc, был нами проанализирован. Открытая рамка считывания (ОРС) гена, депонированного в банке данных как ген ctc, начиналась с довольно редкого стартового кодона TTG (Рис. 1). Мы обнаружили дополнительную короткую ОРС. Эта ОРС кодировала полипептид, который обладал гомологией с N-концевой частью 5S рРНК-связывающего домена белков СТС. Однако две эти ОРС находились в разных рамках считывания. Данную ситуацию можно было объяснить либо мутацией в гене ctc, которая привела к кодированию дефектного белка, либо ошибкой при прочтении генома.

Соответствующий участок (-700 нуклеотидов) хромосомной ДНК A. aeolicus был нами амплифицирован и секвенирован (Рис. 1). Оказалось, что действительно один нуклеотид (С в положении 228501) был пропущен ранее при прочтении генома. Присутствие этого нуклеотида восстанавливает общую рамку для обеих указанных выше ОРС. В результате этих изменений новая ОРС (ген ctc) кодирует белок в 202 аминокислотных остатка. Такой белок содержит полноразмерный 5S рРНК-связывающий домен, гомологичный соответствующим участкам рибосомных белков L25 Е. coli и TL5 Т. themophilus. Определенная в работе последовательность участка ДНК A. aeolicus депонирована в GenBank (Accession number EU851040).

Полноразмерный белок СТС A. aeolicus был выделен, и его РНК-связывающие свойства были исследованы. Как видно на рисунке 2, в отличие от укороченного белка (дорожки 3 и 8), полноразмерный белок СТС формирует стабильный комплекс как с 5S рРНК A. aeolicus, так и с другими бактериальными 5S рРНК (дорожки 2, 5 и

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

5S рРНК -

- ТРНК

фрагмент 23S рРНК

Рис. 2. Электрофоретическин анализ РНК-связывающих свойств полноразмерного белка СТС A. aeolicus (12%-ный ПААГ, неденатурирующие условия). 1. 5S рРНК A. aeolicus; 2. 5S рРНК A. aeolicus + СТС A. aeolicus; 3. 5S рРНК A. aeolicus + Д51 СТС A. aeolicus; 4. 5S рРНК Е. coli; 5. 5S рРНК Е. coli + СТС А. aeolicus; 6. 5S рРНК Е. coli + L25; 7. (5S рРНК Е. coli + L25) + СТС A. aeolicus-, 8. 5S рРНК Т. thermophilus + Д51 СТС А. aeolicus; 9. 5S рРНК Т. thermophilus + СТС А. aeolicus; 10. 5S рРНК Т. thermophilus + TL5; 11. (5S рРНК Т. thermophilus + TL5) + СТС А. aeolicus; 12. тРНК Е. coli + СТС А. aeolicus; 13. фрагмент 23S рРНК Т. thermophilus (55 н.) + СТС А. aeolicus. Соотношение РНК:белок в инкубационных смесях 1:1.

9). Кроме того, полноразмерный белок СТС A. aeolicus конкурирует с другими белками семейства (L25 и TL5) за связывание с 5S рРНК (дорожки 7 и 11). Причем даже при эквимолярных соотношениях белок СТС A. aeolicus вытесняет белок L25 из комплекса с 5S рРНК.

Таким образом, из полученных данных следует, что ген ctc A. aeolicus кодирует белок с полноразмерным 5S рРНК-связывающим доменом и этот белок не является исключением в семействе СТС, так как он способен формировать стабильный комплекс с 5S рРНК.

1.2. Роль отдельных аминокислотных остатков белков L25 и TL5 в формировании и стабилизации их комплекса с 5S рРНК

10 лет назад были определены пространственные структуры двух представителей семейства СТС, рибосомных белков L25 Е. coli и TL5 Т. thermophilus, в комплексе со специфическим фрагментом 5S рРНК (Lu & Steitz, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 2023-2028; Fedorov et al., 2001, Acta Crystallogr. D, 57, 968-976). Сравнительный анализ структур этих комплексов показал, что в обоих белках контактирующие с РНК аминокислотные остатки можно разделить на две группы, неконсервативные и консервативные (Рис. 3) (Gongadze et al., 2005, J. Biol. Chem., 280, 16151-16156). Остатки первой группы расположены по периферии контактирующей с РНК поверхности белка и формируют доступные воде межмолекулярные водородные связи. Остатки второй группы расположены в центральной части контактирующей с РНК поверхности белка и образуют межмолекулярные водородные связи, недоступные для воды. В отличие от остатков первой группы, остатки второй группы оказались не только идентичными в обоих белках (R10/9, R19/21, Y29/31, Н85/88 и D87/90 в TL5/L25), но и строго консервативными в других белках семейства СТС. Нами было проведено детальное исследование роли указанных выше аминокислотных остатков белков TL5 и L25 во взаимодействии с 5S рРНК.

Рис. 3. Области контакта белков TL5 и L25 с 5S рРНК. Контактирующая область отмечена на поверхности белка светло-серым цветом. Положение консервативных и неконсервативных аминокислотных остатков, образующих водородные связи с РНК, указано прямоугольниками и овалами, соответственно.

Используя метод направленного мутагенеза, в гены данных белков были внесены соответствующие изменения. Мутантные формы белков были выделены, и их 5S рРНК-связывающие свойства исследованы несколькими методами.

Необходимо отметить, что в работе был использован не полноразмерный белок TL5, а его N-концевой домен (остатки 1-91) (NtdTL5), так как: 1) он обладает такими же 5S рРНК-связывающими свойствами, как и полноразмерный белок (Gongadze et al., 1999, FEBSLett., 451,51-55); 2) в комплексе только NtdTL5 взаимодействует с 5S рРНК (Fedorov et al., 2001); 3) NtdTL5 соразмерен и гомологичен белку L25, что делает сравнение результатов, полученных для двух белков, более корректным. Полученные данные суммированы в таблицах 1-2.

Табл. 1. 5S рРНК-связывающие свойства мутантных форм белка L25 и N-концевого домена белка TL5 (NtdTL5).

Замена Ki, мкМ

Контроль (татьб) wt 0.08 (0.10)

Замены неконсервативных остатков К14А; S16A; R20A; R31A; R72A; Q73A; N75A 0.12 (0.15)

S16A/R20A; K14A/Q73A 0.16 (0.20)

К14A/S16A/R20A; S16A/R20A/R72A 0.18 (0.24)

N34A 0.60

Замены консервативных остатков R10A; R19A; Н85А -1.30 (-5.00)

D87E 2.50

H85F; Y29F; D87S; D87N -

R10A/R19A -

Одновременные замены неконсервативных и консервативных остатков R19A/K14A; R19A/R20A -

R19A/Q73A; Н85А/К14А -4.00-5.00 (-)

Контроль (Ь25) wt 0.1

Замены консервативных остатков H88F -

Y31A -

D90A -

Кажущиеся константы диссоциации (ЛУ РНК-белковых комплексов определены методом сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах. В скобках указаны значения полученные в экспериментах, проводившихся в растворе с высокой ионной силой (500 мМ КС1). Знак «-» используется, если связывание РНК не детектируется при концентрации белка до 5 мкМ. Знак «;» используется при перечислении мутаций в разных белках, а «/» - при перечислении мутаций в одном белке.

Сначала был проверен эффект одиночных замен некоторых остатков обеих групп в белке ТЬ5 на его РНК-связывающие свойства (Gongadze е/ а/., 2005). Оказалось, что замена некоторых неконсервативных остатков практически не влияла

на 5Б рРНК-связывающие свойства белка. Однако замена любого из консервативных остатков приводила к сильной дестабилизации комплекса или невозможности его образования. На основании этих данных было сделано предварительное заключение о том, что именно пять консервативных остатков (вторая группа) формируют 5 Б рРНК-связывающий модуль в данном белке. Для уточнения границ 5Б рРНК-связывающего модуля белков ТЬ5 и Ь25, а также выяснения роли указанных межмолекулярных водородных связей в формировании и стабилизации РНК-белкового комплекса, были проведены более детальные исследования. Для этого был проверен эффект замены каждого из аминокислотных остатков двух указанных групп или их сочетания, а также влияние изменения ионных условий на образование и стабильность 5 Б рРНК-белкового комплекса.

Наши эксперименты показали, что замена любого (за исключением N34) неконсервативного РНК-связывающего остатка белка ТЬ5 на аланин не влияет на образование и стабильность комплекса с РНК (Табл. 1). Даже одновременная замена двух или трех остатков, при которой исключается до половины всех межмолекулярных водородных связей, образуемых этой группой остатков, практически не изменяет РНК-связывающие свойства белка (Табл. 1, Рис. 4А, Рис. 4Б, дорожка 3). Единственным исключением в этой группе является остаток N34. Эффект от замены данного остатка в №<1ТЬ5 на аланин ближе к эффекту, наблюдаемому при замене консервативного остатка (Табл. 1, Рис. 4А, Рис. 4Б, дорожки 4, 5). В этих случаях наблюдается не только сравнимое увеличение К& (в 8 и 15 раз, соответственно), но и наличие ниже полосы комплекса шлейфа свободной РНК, который указывает на диссоциацию комплекса во время электрофореза. В более чем половине известных белков семейства в данной позиции присутствует пролин. В комплексе Ь25-58 рРНК этот остаток пролина не образует водородных связей с РНК (Ьи & 81екг, 2000), тогда как N34 в ТЬ5 образует две водородные связи с РНК, одна из которых частично недоступна для растворителя (Сог^аске е/ а/., 2005). Можно предположить, что аспарагин в данной позиции белка ТЬ5 является эволюционным приобретением, увеличивающим стабильность РНК-белкового комплекса в экстремально термофильном организме.

Ранее было отмечено, что в формировании и стабилизации комплексов белков Ь25 и ТЬ5 с 5Б рРНК кроме водородных связей могут принимать участие и электростатические взаимодействия (8Ю1сИ е! а!., 1999, ЕМВО J., 18, 6508-6521; Реёогоу et а1., 2001). Учитывая то, что такие взаимодействия чувствительны к концентрации ионов в растворе, мы использовали разные концентрации КС1, чтобы оценить, насколько существенен их вклад в стабилизацию комплекса ТЬ5-58 рРНК. Оказалось, что повышение концентрации КС1 от 170 до 500 мМ практически не влияет на образование комплекса 5 Б рРНК с белком ТЬ5 дикого типа или его мутантными формами с заменами неконсервативных остатков (Табл. 1). Таким образом, полученные данные позволяют сделать следующее заключение: доступные растворителю межмолекулярные водородные связи, образованные

неконсервативными остатками, а также электростатические взаимодействия между белком и РНК не вносят существенного вклада в стабильность комплекса TL5-5S рРНК.

Рис. 4. 5S рРНК-связывающие свойства NtdTL5 и некоторых его мутантных форм. А. Кривые зависимости связывания [32Р]-меченной 5S рРНК Е. coli от концентрации белка. 1. NtdTL5, 170 мМ KCl; 2. NtdTL5 S16A/R20A/R72A, 170 мМ KCl; 3. NtdTL5 N34A, 170 мМ KCl; 4. NtdTL5 R19A, 170 мМ KCl; 5. NtdTL5 R19A, 500 мМ KCl. Б. Электрофореграмма комплексов

некоторых мутантных форм NtdTL5 с 5S рРНК (12%-ный ПААГ, неденатурирующие условия). 1. 5S рРНК coli, 2. + NtdTL5 (1:1); 3. + NtdTL5 S16A/R20A/R72A (1:1); 4. + NtdTLS N34A (1:3); 5. + NtdTL5 R19A (1:3); 6. + NtdTL5 R19A/Q73A (1:3); 7. + NtdTL5 R19A/R20A (1:3); 8. + NtdTL5 R10A/R19A (1:3). Молярные соотношения РНК:белок в инкубационных смесях указаны в скобках. Стрелкой отмечено положение РНК-белкового комплекса.

Что же касается консервативных аминокислотных остатков, образующих с РНК закрытые от растворителя водородные связи, то из полученных результатов стало очевидным, что эти остатки играют ключевую роль во взаимодействии белка TL5 с 5S рРНК. Одиночная замена каждого из остатков этой группы приводит либо к значительной дестабилизации РНК-белкового комплекса, либо к невозможности его образования (Табл. 1). Аналогичный эффект оказывают соответствующие мутации в белке L25 Е. coli (Табл. 1). Учитывая то, что эти пять указанных остатков строго консервативны в белках СТС, предполагается, что такой 5S рРНК-связывающий модуль должен быть характерен для большинства белков этого семейства.

Хотелось бы немного подробнее остановиться на нескольких моментах, касающихся роли остатков РНК-связывающего модуля исследуемых белков. Из таблицы 1 видно, что любая замена консервативных остатков Y29 и D87 в белке TL5 приводит к полной утрате белком 5S рРНК-связывающих свойств. Аналогичный результат был получен и для белка L25 (Табл. 1). Такой сильный эффект может быть объяснен тем, что уникальная ориентация боковых групп этих двух остатков на поверхности белков L25 и TL5 стабилизирована водородной связью между этими остатками (Lu & Steitz, 2000; Fedorov et al., 2001). Замена одного из этих остатков может приводить к увеличению подвижности боковой группы второго остатка, что, в свою очередь, может исключить возможность образования закрытых от растворителя водородных связей с РНК сразу для двух остатков. Одиночная замена любого из трех

других остатков РНК-связывающего модуля белка TL5 (RIO, R19 или Н85), хотя и делает комплекс существенно менее стабильным, но не исключает полностью способности такого белка связываться с 5S рРНК (Табл. 1, Рис. 4Б, дорожка 5). Мы провели замену на аланин сразу двух консервативных остатков, R10 и R19, в белке TL5 и проверили РНК-связывающие свойства такого белка. Оказалось, что такая замена приводит к полной утрате белком 5S рРНК-связывающих свойств (Табл. 1, Рис. 4Б, дорожка 8). Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что замена одного из остатков, образующих закрытые от растворителя водородные связи с РНК, приводит к дестабилизации 5S рРНК-белкового комплекса, а замена двух из них полностью исключает способность белка образовывать комплекс с РНК. К полной потере РНК-связывающей способности белка TL5 приводит также дополнительная к одиночной замене остатков RIO, R19 или Н85 замена неконсервативного остатка, образующего водородные связи с РНК. Как видно из данных, представленных в таблице 1 и на рисунке 4, комплекс с одиночной заменой остатка RIO, R19 или Н85 в белке по своей стабильности занимает пограничное положение. Внесение дополнительной замены неконсервативного остатка в такой белок или экранирование межмолекулярных электростатических взаимодействий (при увеличении ионной силы раствора) приводит к невозможности образования комплекса с РНК (Табл. 1, Рис. 4А, Рис. 4Б, дорожки 6 и 7). Такие воздействия не влияют на связывание РНК с интактным белком, но оказывают значительный эффект на взаимодействие с РНК белка с дефектом в РНК-связывающем модуле. Полученные результаты могут быть объяснены увеличением доступности внутренней области межмолекулярного контакта молекулам растворителя. Таким образом, функция внешней области контакта двух молекул (водородные связи, образованные неконсервативными остатками, и электростатические взаимодействия), по-видимому, заключается в поддержании статуса «закрытости от молекул растворителя» РНК-связывающего модуля белка.

Для того чтобы выяснить, на какой этап, образование комплекса с 5S рРНК или его диссоциацию, влияют замены группы консервативных остатков в белке TL5, мы использовали метод поверхностного плазмонного резонанса (Katsamba et al., 2002, Methods, 26, 95-104). В экспериментах был использован специфический фрагмент 5S рРНК Е. coli, иммобилизованный на сенсорном чипе. Исследования были проведены с некоторыми типичными мутантными формами NtdTL5. Оказалось, что для всех мутантных форм белка, сохранивших способность связываться с РНК, константа скорости ассоциации с РНК меняется незначительно (Табл. 2). В то же время, замена консервативного остатка в белке TL5 приводит к увеличению константы скорости диссоциации РНК-белкового комплекса в 30-50 раз (Табл. 2). Полученные результаты свидетельствуют о том, что данные остатки необходимы для стабилизации уже сформированного РНК-белкового комплекса.

Табл. 2. Кинетические константы взаимодействия №с1ТЬ5 и его мутантных форм со специфическим фрагментом 5Б рРНК.

Замена Константа скорости ассоциации, £а(х10б M"V) Константа скорости диссоциации, Ad(x10"4 s"1) KD, пМ

Контроль (NtdTL5) wt 6.19 7.95 0.14

Замена неконсервативных остатков S16A 6.45 9.04 0.14

S16A/R20A 4.66 7.12 0.12

N34A 2.45 442 18.0

Замена консервативных остатков R10A 1.20 471 38.7

Н85А 1.90 198 10.4

H85F -

D87S -

«ЛГп» - равновесная константа диссоциации

«-» - связывание РНК не детектируется при концентрации белка до 5 мкМ

На основании всей совокупности полученных данных, можно предположить, что формирование исследуемых РНК-белковых комплексов проходит, по крайней мере, в два этапа. На первом этапе (узнавание молекулами друг друга) наиболее важным для взаимодействия молекул является вся уникальная область контакта белка, а не отдельные ее элементы (аминокислотные остатки). На втором же этапе (стабилизация комплекса) ключевую роль выполняют пять остатков 5S рРНК-связывающего модуля, стабилизируя уже сформировавшийся комплекс.

1.3. РНК-связывающие свойства белков СТС с природными заменами в их 5S рРНК-связывающем модуле

При детальном анализе первичных структур белков семейства СТС мы обнаружили несколько интересных случаев природных замен одного из остатков 5S рРНК-связывающего модуля этих белков. Так, у Enterococcus faecalis (класс Bacilli) остаток консервативной аспарагиновой кислоты белка СТС заменен остатком глютаминовой кислоты (Е90). При такой замене (D87E) белок TL5 образовывал крайне нестабильный комплекс с 5S рРНК (Табл. 1). В то же время, в петле Е 5S рРНК (сайт связывания белков СТС) этого организма произошло единственное изменение: G75, азотистое основание которого взаимодействует с остатком консервативной аспарагиновой кислоты в комплексах L25-5S рРНК и TL5-5S рРНК, заменен на урацил (Рис. 5). Другой случай - замена остатка аспарагиновой кислоты на серин или аланин обнаружен в белках СТС типа Cyanobacteria. Такая замена в белках TL5 или L25 приводила к утрате ими 5S рРНК-связывающих свойств (Табл. 1). Однако одновременно с изменениями в РНК-связывающем модуле белка СТС Cyanobacteria (например, Nostoc sp.) в петле Е 5S рРНК этой группы бактерий произошли многочисленные изменения (Рис. 5). Мы предположили, что указанные случаи могут быть примерами коэволюции структур двух взаимодействующих макромолекул.

Escherichia Enterococcus Nostoc

coli faecalis sp.

G-C™ G-C68 c-e'°

,WG—С ,mG — С G-C

A G A G ,05<S и

U • А U • А и • А

G U G U А С

А G < ¡D87 А У D87E А G D87S

100G G »G G С А

А • U А • U ,МА • U

G А G А С А

С —G U • G С —G

G* U" G • U's G« U80

юи • G и С

A-U U-A МА — U

С —С U-A U-A

Рис. 5. Схемы вторичной структуры фрагментов 5S рРНК (район петли Е) некоторых бактерий. Консервативные нуклеотиды (>80% в бактериальных 5S рРНК) отмечены черными символами,

неконсервативные нуклеотиды - серыми символами. Изменения консервативных нуклеотидов показаны открытыми символами. Стрелкой указан нуклеотид, взаимодействующий с D87 белка TL5. Замены консервативной аспарагиновой кислоты в соответствующих белках СТС показаны справа от РНК.

Для того чтобы проверить это предположение белки СТС и специфические фрагменты 5S рРНК из Е. faecalis и Nostoc sp. были получены, и проверена их способность образовывать гомологические комплексы. Оказалось, что в обоих случаях образуются стабильные комплексы (Рис. 6, дорожки 5 и 8). Для сравнения в том же эксперименте проверяли связывание мутантных форм белка TL5 с соответствующими заменами (D87E или D87S) в РНК-связывающем модуле с фрагментами 5S рРНК Е. coli, Е. faecalis или Nostoc sp. Как уже отмечалось, белок TL5 с заменой D87E формирует с фрагментом 5S рРНК Е. coli крайне нестабильный комплекс (Рис. 6, дорожка 3). На это указывает наличие ниже полосы комплекса шлейфа свободной РНК и избыток белка, который требуется для того, чтобы вся РНК перешла в комплекс. Более стабильный комплекс белок TL5 D87E образует с фрагментом 5S рРНК Е. faecalis (Рис. 6, дорожка 4). Белок TL5 с заменой D87S не образует комплекса не только с фрагментом 5S рРНК Е. coli, но и с фрагментом 5S рРНК Nostoc sp. (Рис. 6, дорожки 6, 7).

Рис. 6. Электрофоретический анализ 5S рРНК-связывающих свойств белков СТС Е. faecalis и Nostoc sp. (12%-ный ПААГ, неденатурирующие условия). 1. фрагмент 5S рРНК Е. coli; 2. фрагмент 5S рРНК Е. coli + NtdTL5 (1:1); 3. фрагмент 5S рРНК Е. coli + NtdTL5 D87E (1:3); 4. фрагмент 5S рРНК Е. faecalis + NtdTL5 D87E (1:1); 5. фрагмент 5S рРНК Е. faecalis + белок СТС Е. faecalis (1:1); 6. фрагмент 5S рРНК Е. coli + NtdTL5 D87S (1:2); 7. фрагмент 5S рРНК Nostoc sp. + NtdTL5 D87S (1:2); 8. фрагмент 5S рРНК Nostoc sp. + белок СТС Nostoc sp. (1:1). Молярные соотношения РНК:белок в инкубационных смесях указаны в скобках. Стрелкой отмечено положение РНК-белкового комплекса.

Таким образом, полученные результаты указывают на то, что параллельно произошедшие изменения в белке СТС и 5S рРНК некоторых бактерий имеют компенсаторный характер и направлены на сохранение этими молекулами способности формировать стабильный комплекс.

РНК-

Все описываемые и обсуждаемые выше результаты были получены на изолированных молекулах белка СТС и 5S рРНК. Однако, как реализуются выявленные принципы специфического взаимодействия этих двух молекул в клетке, было неясно. Поэтому следующим этапом наших исследований было изучение специфического взаимодействия одного из представителей данного семейства, рибосомного белка L25 Е. coli, с 5S рРНК в системе in vivo.

2. Необходимость взаимодействия белка L25 с 5S рРНК для его встраивания в

рибосому in vivo

Рибосомный белок L25 Е. coli расположен в центральном протуберанце 50S субчастицы рибосомы (Рис. 7 А и Б) (Lotti et al., 1989, Mol. Gen. Genet., 216, 245-253), где он взаимодействует только с двумя молекулами - 5S рРНК и белком L16 (Schuwírth et al., 2005, Science, 310, 827-834). Причем, в отличие от обширного и плотного взаимодействия с 5S рРНК (см. раздел 1.2), другой межмолекулярный контакт белка L25 ограничивается несколькими водородными связями с С-концевым «хвостом» белка L16 (Рис. 7В). Недавно было обнаружено, что отсутствие белка L25 в рибосоме приводит к снижению эффективности ее функционирования (Korepanov et al., 2007). Оказалось, что такой эффект обусловлен дестабилизацией значительной части структуры центрального протуберанца большой субчастицы рибосомы (Гонгадзе, 2010, Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук). Изучая взаимодействие белка L25 с 5S рРНК, мы показали, что замена одного из остатков РНК-связывающего модуля белка приводит к невозможности образования данного комплекса in vitro. Поэтому было решено проверить, будут ли такие мутантные формы белка L25 встраиваться в рибосому in vivo.

Для этого было использовано два экспериментальных подхода:

1) В первом случае мы экспрессировали ген мутантной формы белка L25 in trans (с плазмиды) в клетках AL25 штамма, как описано в работе (Korepanov et al., 2007). Преимуществом данного подхода является его относительная простота. Однако в такой системе количество мутантного белка в клетке превышает его обычное количество примерно на 2 порядка. В связи с этим, нельзя было исключать побочные эффекты, связанные с очень высокой концентрацией свободного белка в клетке (например, неспецифическое связывание белка с РНК).

2) Во втором случае мы вносили направленные изменения непосредственно в хромосомный ген белка L25, используя метод «рекомбиниринг» (Yu et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 5978-5983). Этот подход, предложенный для данной работы А.П. Корепановым (Институт белка РАН, г. Пущино), является более трудоемким, однако при этом ген мутантной формы белка находится под контролем собственного промотора, и белка в клетке синтезируется «нормальное» количество. В качестве контроля в этих экспериментах использовался штамм MS23 (проведен через те же генетические манипуляции, что и мутантные штаммы, но содержит интактный ген белка L25).

Рис. 7. А. Положение 5S рРНК-белкового комплекса в 50S субчастице рибосомы. Б. Детальная модель структуры центрального протуберанца 50S субчастицы. В. Фрагмент структуры центрального протуберанца, иллюстрирующий взаимодействие белков L16 и L25. Для построения моделей использовали структуру рибосомы Е. coli (PDB code 2AW4) из работы Schuwirth et al., 2005.

Было проверено влияние одиночных замен в 5S рРНК-связывающем модуле белка L25 (Y31A или H88F) на встраивание этого белка в рибосому in vivo. Оказалось, что указанные мутации в белке L25, исключающие его связывание с 5S рРНК in vitro (Табл. I), не влияют на его встраивание в рибосому in vivo, ростовые характеристики и белок-синтезирующую активность бактериальных клеток. Полученные данные позволили предположить, что внесенные в белок L25 одиночные замены не полностью исключили его контакт с 5S рРНК в рибосоме. Мы решили внести сразу несколько массивных аминокислотных остатков (замены S17L/I29F/D90Y или S17L/Y31L/H88F) в область контакта белка L25 с 5S рРНК, чтобы создать стерическое препятствие для образования плотного контакта между этими молекулами. Указанные изменения в белке так же, как и одиночные замены, приводили к невозможности образования комплекса с 5S рРНК in vitro.

В случае продукции указанных мутантных форм белка с хромосомы (штаммы MS23a и MS23b) мы наблюдали сильное замедление роста клеток (Рис. 8А) в сравнении с клетками контрольного штамма MS23. Причем замена S17L/Y31L/H88F в белке оказывала на рост клеток эффект, сравнимый с нокаутом гена этого белка в хромосоме (штамм KNB800). На основании этих данных можно было предположить, что исследуемые мутантные формы белка не встраиваются в рибосому. Рибосомы из

клеток исследуемых штаммов были выделены двумя способами. В первом случае рибосомы из цитоплазмы просто осаждали центрифугированием (без очистки). Во втором случае рибосомы очищали стандартным методом - центрифугированием через плотную среду (сахарозу) в условиях высокой ионной силы. Анализ белкового

Штамм Белок Время удвоения клеток, мин

MS23 L25 wt 28

KNB800 ÛL25 79

MS23a L25 S17L/129F/D90Y 68

MS23b L25 S17L/Y31L/H88F 78

Rs KNB800 (ЛЕ-25) 7ÛS

седиментация

Rs MS23 (L25 wt)

Rs MS23a (L25 S17L/I29F/D90Y) Rs MS23b (L25 S17L/Y31L/H88F)

Рис. 8. A. Скорость роста клеток исследуемых штаммов, содержащих в хромосоме измененный ген белка L25 (среда LB, 37°С). Сравнительный анализ рибосом (Rs) из клеток штамма K.NB800 (Б) и клеток исследуемых (MS23, MS23a и MS23b) штаммов (В). Представлены профили седиментации рибосом (центрифугирование в градиенте плотности сахарозы 5-20%), на вставке -фрагмент двумерного ПААГ-электрофореза белков соответствующего препарата рибосом. Для анализа использованы препараты «неочищенных» рибосом. Отмечено положение 30S и 50S субчастиц, а также 70S рибосомы. Стрелкой указано положение белка L25 или его мутантной формы.

состава выделенных рибосом показал (Рис. 8В), что только одна из мутантных форм белка L25 (S17L/129F/D90Y) присутствует в рибосомах, причем только в препарате «неочищенных» рибосом. Этот препарат рибосом содержит приблизительно эквимолярное количество мутантного белка. Однако после стандартной очистки белок L25 S17L/I29F/D90Y в рибосомах отсутствует. В свою очередь, белок L25 S17L/Y31L/H88F не обнаруживается в обоих образцах рибосом. Следует отметить, что во всех образцах рибосом из мутантных штаммов MS23a и MS23b была нарушена стабильность ассоциации рибосомных субчастиц в сравнении с рибосомами контрольного штамма MS23 (Рис. 8В). При этом седиментационные профили мутантных рибосом были очень похожи на профиль рибосом ДЬ25 штамма (KNB80Û) (Рис. 8Б и В).

В то же время, при экспрессии генов мутантных форм белка L25 с тройными

заменами in trans в клетках AL25 штамма были получены неожиданные, но интересные результаты (Рис. 9). Один из мутантных белков (L25 S17L/129F/D90Y) в значительной степени восстанавливал рост клеток AL25 штамма (Рис. 9А). Второй мутантный белок (L25 S17L/Y31L/H88F) хотя и частично, но тоже восстанавливал

Штамм Белок, продуцируемый с плазмиды Время удвоения клеток, мин

KNB800 (ÜL25) L25 wt 45

«пустой» вектор 180

L25 S17L/I29F/D90Y 65

L25 S17L/Y31L/H88F 100

Rs KNB800 (Д1_25) 70S

седиментация

+ L25 wt

н L25 S17L/I29F/D90Y

+ L25 S17L/Y31L/H88F

I- L25 wt

ь L25 S17L/129F/D90Y

н L25 S17L/Y31L/H88F

Рис. 9. А. Скорость роста клеток штамма KNB800 (AL25), экспрессирующих in trans интактный ген белка L25 или его мутантную форму (среда LB, 37°С). Сравнительный анализ рибосом из клеток AL25 штамма (Б) и клеток этого же штамма, в которых продуцируется указанная мутантная форма белка L25 (В и Г). В секциях В и Г представлен анализ препаратов «неочищенных» и очищенных рибосом, соответственно. Компоновка панели и обозначения как на рисунке 8.

рост клеток этого штамма (Рис. 9А). Более того, оказалось, что в препаратах «неочищенных» рибосом из клеток обоих указанных штаммов мутантный белок присутствует (Рис. 9В), а после стандартной очистки - нет (Рис. 9Г). При этом образцы мутантных рибосом до очистки содержат заметно меньше диссоциированных рибосомных субчастиц, чем AL25 рибосомы (Рис. 9Б и В), а после очистки их профили седиментации выглядят примерно одинаково (Рис. 9Б и Г).

Совокупность полученных данных позволяет сделать следующие заключения. Образование специфического комплекса между 5S рРНК и белком L25 не является строго необходимым условием для его встраивания в рибосому in vivo. При значительном увеличении концентрации в клетке белка L25 с множественными мутациями, лишенного способности связываться с изолированной 5S рРНК, он встраивается в рибосому, что приводит к увеличению стабильности ассоциации рибосомных субчастиц. В то же время, указанные изменения в белке L25 значительно ослабляют его удержание в рибосоме, особенно при «физиологических» концентрациях белка в клетке. Таким образом, взаимодействие 5S рРНК и белка L25 строго необходимо для удержания этого белка в работающей рибосоме в бактериальной клетке.

3. Исследование роли рибосомного белка L5 в сборке и функционировании рибосомы Escherichia coli

Рибосомный 5S рРНК-связывающий белок L5 Е. coli локализован в центральном протуберанце большой рибосомной субчастицы (Lotti el al., 1989), как и другие компоненты 5S рРНК-белкового комплекса (5S рРНК, белки L18 и L25) (Рис. 7 А и Б). Ряд данных указывает на то, что белок L5 важен для работы аппарата трансляции. Во-первых, он присутствует в рибосомах всех ныне живущих организмов. Во-вторых, нокаут гена белка L5 летален для клеток Е. coli (Korepanov et al., 2007). В-третьих, белок L5 наряду с белком L18 необходим для образования комплекса между изолированными молекулами 5S рРНК и 23S рРНК (Spierer et al., 1979, Nucl. Acids Res., 6,1669-1682; Rohl & Nierhaus, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,729-733). Это косвенно подтверждается тем, что в структуре рибосомы 5S рРНК и 23 S рРНК взаимодействуют преимущественно через белки L5 и L18 (Schuwirth et al., 2005). В-четвертых, кристаллографические исследования рибосом и их функциональных комплексов выявили ряд межмолекулярных контактов данного белка, которые могут быть функционально важными (Yusupov et al., 2001, Science, 292, 883-896; Selmer et al., 2006, Science, 313, 1935-1942). Так, оказалось, что белок L5 взаимодействует с тРНК в Р-участке рибосомы и участвует в формировании межсубъединичного мостика Bib, взаимодействуя с белком S13. Однако, несмотря на имеющиеся данные, конкретная роль белка L5 в сборке и функционировании рибосомы все еще остается неясной. В связи с этим, в рамках данной работы были выделены следующие задачи:

- выяснить важность контакта с тРНК петли f>2-f>3 белка L5 для работы бактериального аппарата трансляции.

3.1. Получение и характеристика больших рибосомных субчастиц, собранных in vivo

в отсутствие белка L5

Ранее в нашей лаборатории был создан штамм (MS01) Е. coli с регулируемой экспрессией гена рибосомного белка L5. В данном штамме хромосомный ген белка L5 (rplE) был заменен на ген устойчивости к хлорамфениколу в присутствии плазмиды, несущей ген белка под контролем индуцибельного арабинозного промотора. Штамм MS01 был нами использован для получения клеток Е. coli, дефицитных по белку L5. Схема эксперимента представлена на рисунке 10А. Сначала клетки растили в присутствии индуктора - арабинозы. При этом белок L5

л Культивация клеток штамма МБ01

(среда 1_В, 0.2% арабинозы, 100 мкг/мл ампициллина, 37 С. до ОПш - 0,45)

¡,

Осаждение клеток

(4000 д, 10 мин, 4 С)

Суспендирование клеток

(15 объемов среды ЦВ) _|_

+арабиноза -арабиноза

I I

Культивация клеток Культивация клеток

(до ОП600 - 0.8) (до стационарной фазы роста)

0,8 J0.6 О 0,4 0,2 0

70S

50S

30S

седиментация

+арабиноза -арабиноза

70S

□

•-50S 30S

45S 70$ A 30S

0 200 400

время, мин

70S Щ

45S

30S

70S

Рис. 10. Схема эксперимента (А) и кривые роста клеток штамма MS01 (Б), выращенных в присутствии или отсутствии арабинозы. Стрелками отмечено время отбора клеток для анализа рибосом. Анализ препаратов рибосом (центрифугирование в градиенте плотности сахарозы 5-20%) из клеток до переноса (В) и после переноса (Г) в «свежую» среду (в присутствии (+) или отсутствии (-) арабинозы). Указано положение 30S, 45S, и 50S субчастиц, а также 70S рибосом.

синтезировался. Затем клетки осаждали и две одинаковые порции клеток суспендировали в «свежей» среде (с индуктором или без него). В условиях отсутствия индуктора (-арабиноза) синтез белка Ь5 должен был прекратиться, и в клетках должны были накапливаться рибосомные субчастицы, собранные в отсутствие данного белка. На рисунке 10Б видно, что рост клеток штамма МБСИ в указанных условиях довольно быстро замедляется и выходит на плато. Клетки

штамма MS01, выращенные в присутствии индуктора (+арабиноза), были использованы в качестве контроля.

Для выявления роли белка L5 в сборке большой рибосомной субчастицы нами был проведен сравнительный анализ свойств рибосом из клеток исследуемого штамма, выращенных в присутствии и отсутствии арабинозы. Для этого отбирали клетки в разное время роста (Рис. 10Б) и анализировали рибосомы из них (Рис. 10В и Г). На рисунке видно, что после прекращения синтеза белка L5 (перенос в среду без индуктора) в клетках начинает накапливаться фракция рибосомных субчастиц. К моменту, когда клетки перестают делиться (плато на кривой роста), уже не более 15% рибосомных субчастиц находится в форме 70S рибосом.

Большие рибосомные субчастицы из клеток, дефицитных по белку L5, были выделены и охарактеризованы. Они оказались неспособны ассоциировать с 30S субчастицами. Коэффициент седиментации таких субчастиц был равен 45S (±1), что приблизительно совпадает с данным параметром для субчастиц, реконструированных in vitro в отсутствие 5S рРНК и, как известно, лишенных всего 5S рРНК-белкового комплекса (Dohme & Nierhaus, 1976, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 73, 2221-2225; Selivanova et al., 1986, FEBS Lett., 197, 79-83). Мы проверили наличие 5S рРНК в исследуемых субчастицах, и обнаружили только ее следовые количества (не более

Рис. 11. Анализ белкового состава больших рибосомных субчастиц из дефицитных по белку L5 (справа) и контрольных клеток (слева) двумерным гель-электрофорезом. Стрелками на электрофореграмме отмечено положение соответствующих рибосомных белков.

5% в сравнении с контрольными 50S субчастицами). Анализ белкового состава 45S субчастиц показал, что в них в следовых количествах присутствует не только белок L5 (не более 5%), но и другие 5S рРНК-связывающиеся белки, L18 и L25 (не более 10%) (Рис. 11). Таким образом, нами было показано, что в отсутствие рибосомного белка L5 в клетках Е. coli собираются большие рибосомные субчастицы, лишенные всех компонентов 5S рРНК-белкового комплекса. При этом данный комплекс (5S рРНК, белки L18 и L25) обнаруживается в цитоплазме клеток в количестве, соизмеримом с количеством рибосом. Кроме того, нами было обнаружено, что исследуемые 45S субчастицы содержат сильно уменьшенное количество белков L16, L27, L30 и L33 (Рис. 11).

Центральный протуберанец большой рибосомной субчастицы формируется 5S рРНК-белковым комплексом, структурными элементами доменов II и V 23S рРНК

50S

L5 * /

118 ЧИР

45S -

/ L27

L25 ^

L30 *

133

и белками L16, L27, L30, L33 и L35 (Рис. 7Б). В данной работе нами впервые продемонстрировано, что in vivo рибосомный белок L5 строго необходим для встраивания в большую рибосомную субчастицу и удержания в ней всего 5S рРНК-белкового комплекса, а также других компонентов (белки L16, L27, L30 и L33) центрального протуберанца. Анализ пространственной структуры рибосомы Е. coli показывает, что белки L16, L27 и L30 образуют плотный контакт со спиралью Н38 23S рРНК, которая в свою очередь взаимодействует с 5S рРНК (Рис. 7Б). Полученные нами результаты согласуются и с некоторыми данными о том, что происходит при сборке 50S рибосомной субчастицы in vitro в отсутствие 5S рРНК. Было отмечено, что такие рибосомные субчастицы помимо 5S рРНК-связывающихся белков также лишены белка L16 (Dohme & Nierhaus, 1976), а центральный протуберанец этих частиц обладает высокой подвижностью (Selivanova et al., 1986). В связи с этим, можно заключить, что отсутствие 5S рРНК-белкового комплекса в исследуемых нами рибосомных субчастицах приводит к дестабилизации структуры их центрального протуберанца и ослаблению связывания белков L16, L27, L30 и L33 с этим участком рибосомы. Таким образом, белок L5 прямо или опосредованно влияет на формирование и стабильность целого структурно-функционального домена рибосомы.

3.2. Влияние мутаций в петле [Í2-P3 белка L5 на синтез полипептида рибосомами

in vivo и in vitro

При анализе структуры бактериальной рибосомы обнаруживается контакт между аминокислотными остатками петли Р2-РЗ белка L5 и нуклеотидами Т- и D-шпилек тРНК в Р-участке (Selmer et al., 2006). Считая, что этот контакт может быть функционально важным, мы решили проверить влияние мутаций в указанном участке белка L5 на эффективность синтеза рибосомами функционально-активного полипептвда. Для этого был проведен направленный мутагенез соответствующих аминокислотных остатков в белке L5 Е. coli, причем изменения вносились непосредственно в хромосомный ген белка. Изменения в гене белка L5, приводившие к продукции белка с одиночной (S73A или R80A) либо двойной заменой (S73A/R80A) в петле (32-(}3, практически не влияли на ростовые характеристики клеток Е. coli. В то же время, делеция четырех или восьми остатков (Д75-78 или Д73-80) в исследуемой петле белка приводила к более медленному росту клеток.

Ростовые характеристики клеток Е. coli, содержащих белок L5 с укороченной петлей Р2-РЗ (Д75-78 или Д73-80 - штаммы MS29d и MS30, соответственно), были детально исследованы (Табл. 4). В качестве контроля был использован штамм MS29 (проведен через те же генетические манипуляции, что и исследуемые штаммы, но содержит интактный ген белка L5). Оказалось, что клетки Е. coli, содержащие белок L5 с укороченной петлей Р2-РЗ, имеют холодочувствительный фенотип: разница между временем удвоения клеток мутантных и контрольного штаммов значительно увеличивается с понижением температуры культивации клеток (Табл. 4). При этом

удаление восьми остатков петли оказывает больший эффект, чем удаление четырех остатков.

Логично было предположить, что замедление роста клеток мутантных штаммов связано с дефектами в биосинтезе белка. Для того чтобы проверить так ли это, была исследована функциональная активность рибосом из этих штаммов. Оказалось, что рибосомы, содержащие белок L5 с укороченной петлей ß2-ß3 (Д75-78 или Д73-80), менее эффективно синтезируют природный полипептид как in vivo, так и in vitro (Рис. 12). Причем понижение температуры приводит к увеличению разницы в белок-синтезирующей активности контрольных и мутантных рибосом. Этот результат полностью согласуется с данными по ростовым характеристикам мутантных штаммов.

Табл. 4. Время удвоения клеток Е. coli, содержащих белок L5 с укороченной петлей ß2-ß3, в среде LB при различных температурах.

Штамм (белок) Время удвоения клеток, мин

25°С 32°С 37°C 42°C

MS29 (L5 wt) 70±2 38±1 32±1 26±1

MS29d (L5 Д75-78) 135±9 59±1 35±1 28±1

MS30 (L5 Д73-80) 160±1 76±1 43±1 34±2

ггивность ß-галактозидазы ю со ООО ООО Э О О О Б у*1 1 600 i'300 ! а 1 2 3 j*»*"*^'""" n'V ^ -*■ Wrf \ Iii tf

< О 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 '"

время, мин время, мин

Рис. 12. Синтез полипептида рибосомами (Rs), содержащими белок L5 с укороченной петлей Р2-(33, in vivo при 32°С (А) и in vitro при 25°С (Б). Активность р-галактозидазы указана в миллеровских единицах. При синтезе люциферазы в систему добавляли [HC]Leu, а синтезируемый продукт анализировали электрофорезом в ПААГ (градиент 10-20%, денатурирующие условия) с последующей авторадиографией. Стрелкой указано положение полноразмерной люциферазы. 1. Rs L5 wt; 2. Rs L5 Д75-78; 3. Rs L5 Д73-80.

На рисунке 12Б видно, что полноразмерный активный белок (люцифераза) появляется во всех случаях примерно через одинаковое время после начала синтеза. Это означает, что для осуществления полного цикла трансляции природной мРНК (включающего инициацию, элонгацию и терминацию) мутантным и контрольным рибосомам требуется одинаковое время. Однако, как видно на этом же рисунке, накопление активного белка в случае мутантных рибосом происходит в два раза медленнее. Наиболее вероятными причинами обнаруженного эффекта могут быть

увеличение частоты ошибок трансляции или нарушение процесса транслокации тРНК и мРНК в рибосоме. Анализ продуктов трансляции мРНК люциферазы контрольными и мутантными рибосомами показал, что заметных различий в количестве полноразмерных и абортивных полипептидов между ними нет (Рис. 12Б). Из этого следует, что точность трансляции рибосомами, содержащими белок L5 с укороченной петлей Р2-РЗ, не нарушена. Имеются литературные данные о том, что процесс транслокации замедляется при понижении температуры (Belitsina el al., 1975, FEBS Lett., 54, 35-38). Учитывая полученные нами результаты, можно предположить, что внесенные в петлю р2-рЗ белка L5 изменения могут влиять на процесс транслокации мРНК и тРНК в рибосоме.

ВЫВОДЫ

1. Из результатов комплексных исследований 5S рРНК-связывающих свойств рибосомного белка L25 Escherichia coli и его гомолога, белка TL5 Thermus thermophilus, следует, что:

• пять аминокислотных остатков - R10/9, R19/21, Y29/31, Н85/88, D87/90 в TL5/L25, формирующих РНК-связывающий модуль этих белков, чрезвычайно важны для стабилизации их комплекса с изолированной 5S рРНК;

• формирование прочного контакта между белком L25 и 5S рРНК не является обязательным условием для встраивания этого белка в рибосому in vivo. В то же время, этот межмолекулярный контакт необходим для прочного удержания белка L25 в рибосоме и стабильной ассоциации рибосомных субчастиц.

2. Доказано, что немногочисленные случаи одновременных природных изменений в контактирующих областях белка семейства СТС и 5S рРНК представителей класса Bacilli и типа Cyanobacteria имеют компенсаторный характер и направлены на сохранение этими молекулами способности формировать стабильный комплекс.

3. Установлено, что белок СТС Aquifex aeolicits обладает полноразмерным 5S рРНК-связывающим доменом и, таким образом, не является исключением среди белков данного семейства.

4. Впервые показано, что рибосомный белок L5 Е. coli строго необходим для встраивания 5S рРНК-белкового комплекса, а также белков L16, L27, L30 и L33 в большую субчастицу рибосомы in vivo. Из полученных данных следует, что белок L5 прямо или опосредованно влияет на формирование целого структурно-функционального домена (центрального протуберанца) бактериальной рибосомы.

5. Показано, что рибосомы Е. coli, содержащие белок L5 с укороченной петлей Р2-РЗ, менее эффективно синтезируют природные полипептиды. Сниженная функциональная активность данных рибосом не связана с увеличением частоты ошибок трансляции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Gongadze, G.M., Korepanov, A.P., Stolboushkina, E.A., Zelinskaya, N.V., Korobeinikova, A.V., Ruzanov, M.V., Eliseev, B.D., Nikonov, O.S., Nikonov, S.V., Garber, M.B., Lim, V.l. The crucial role of conserved intermolecular H-bonds inaccessible to the solvent in formation and stabilization of the TL5-5S rRNA complex // J. Biol. Chem. - 2005. - V.280. - P.16151-16156.

2. Коробейннкова, A.B., Гонгадзе, Г.М., Корепанов, А.П., Елисеев, Б Д., Баженова, М.В., Гарбер, М.Б. 5S рРНК-узнающий модуль белков семейства СТС и его эволюция // Биохимия. - 2008. - Т.73. - С. 193-201.

3. Гонгадзе, Г.М., Корепанов, А.П., Коробейннкова, A.B., Гарбер, М.Б. Бактериальные 5S рРНК-связывающие белки семейства СТС // Успехи Биолог. Химии. - 2008. - Т.48. -С.105-132.

4. Korobeinikova, A.V., Shestakov, S.A., Korepanov, A.P., Garber, M.B., Gongadze, G.M. Protein CTC from Aquifex aeolicus possesses a full-sized 5S rRNA-binding domain // Biochimie. - 2009. - V.91. - P.453-456.

5. Коробейннкова, A.B., Пиндл, В., Корепанов, А.П., Гарбер, М.Б., Гонгадзе, Г.М. Исследование взаимодействия рибосомного белка TL5 с 5S рРНК методом поверхностного плазмонного резонанса // 13-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Сборник тезисов - 28 сентября - 2 октября 2009 - С.24.

6. Корепанов, А.П., Коробейннкова, A.B., Баженова, М.Б., Шестаков, С.А., Бубуненко, М.Г., Гарбер, М.Б., Гонгадзе, Г.М. Роль 5S рРНК-связывающих белков L5 и L25 в сборке бактериальной рибосомы in vivo // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, Москва-Пущино. - Сборник тезисов - 28 сентября - 2 октября 2009 - С.250.

7. Корепанов, А.П., Коробейннкова, A.B., Максимова, Е.М., Гарбер, М.Б., Гонгадзе, Г.М. Влияние мутаций в петле ß2-ß3 рибосомного белка L5 на рост клеток Escherichia coli и свойства аппарата трансляции // 14-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Сборник тезисов - 2010 - С. 146.

8. Коробейннкова, A.B., Корепанов, А.П., Аникаев, А.Ю., Никонов, C.B., Гарбер, М.Б., Гонгадзе, Г.М. Встраивание мутантных форм рибосомного белка L25 Escherichia coli, неспособных связываться с 5S рРНК, в рибосому in vivo II 14-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». -Сборник тезисов - 2010-С.147.

9. Коробейннкова, A.B., Корепанов, А.П., Аникаев, А.Ю., Максимова, Е.М., Никонов, C.B., Гарбер, М.Б., Гонгадзе, Г.М. Влияние специфических мутаций в рибосомных белках L5 и L25 на свойства аппарата трансляции и рост клеток Escherichia coli II III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010», Нижний Новгород. - Сборник тезисов - 2010 - С.98.

Определенная в работе последовательность участка ДНК Aquifex aeolicus помещена в GenBank NCBI (Accession number EU851040).

Заказ № 245ч-А/05/2011 Подписано в печать 18.05.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 mnv.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коробейникова, Анна Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.Ю

1. Рибосомные белки: свойства, структура и эволюция.

1.1. Рибосомные белки трех доменов жизни: разнообразие, сходство и различия.

1.2. Структурные особенности рибосомных белков, отражающие их свойства.

2. Роль белков в сборке функционально-активной рибосомы.

2.1. Сборка малой субчастицы рибосомы.

2.2. Сборка большой субчастицы рибосомы.

2.3. Участие белков в ассоциации рибосомных субчастиц.

3. Участие белков в формировании функциональных центров рибосомы.

3.1. Элонгационный цикл и функциональные центры рибосомы.

3.2. Связывание мРНК.

3.3. Декодирующий центр.

3.4. Пептидилтрансферазный центр.

3.5. тРНК-связывагцие участки.

3.5.1. А-участок.

3.5.2. Р-участок.

3.2.3. Е-участок.

3. б. Участок связывания белковых факторов трансляции.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Материалы и приборы.

1.1. Химические реактивы и ферменты.

1.2. Микробиологические среды.

1.3. Штаммы и плазмиды.

1.4. Буферы.

1.5. Принадлежности.

1.6. Приборы.<

2. Методы генной инженерии, молекулярной генетики и микробиологии.

2.1. Общие методы.

2.1.1. Выделение хромосомной ДНК.

2.1.2. Полимеразная цепная реакция.

2.1.3. Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами.;.

2.1.4. Дотирование ДНК.

2.1.5. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация методом теплового шока.

2.1.6. Анализ бактериальных колоний на наличие рекомбинантной плазмиды.

2.1.7. Выделение плазмидной ДНК.

2.1.8. Осуществление замен в хромосомной ДНК Е. coli с помощью метода «recombineering».

2.1.9. Общая трансдукция бактериофагом PI.

2.1.10. Определение времени удвоения клеток Е. coli.

2.1.11. ß-галактозидазный тест.

2.2. Клонирование и секвенирование генов исследуемых РНК, белков и их мутантных форм.76>

2.2.1. Секвенирование фрагмента хромосомной ДНК A. aeolicus.

2.2.2. Клонирование гена 5S рРНК и его фрагментов.

2.2.3. Клонирование генов белков СТС А. aeolicus, E.faecalis и Nostoc sp.

2.2.4. Направленный мутагенез N-концевого домена белка TL5 Т. thermophilic.

2.2.5. Направленный мутагенез белков L5 и L25 Е. coli.

2.3. Экспрессия генов исследуемых белков в клетках Е. coli.

2.4. Создание штаммов Е. coli для исследований и работа с ними.

2.4.1. Создание штаммов Е. coli, содержащих в хромосоме мутантную форму гена исследуемого белка.

2.4.2. Получение клеток Е. coli, дефицитных по рибосомному белку L5.

3. Биохимические методы.

3.1. Электрофоретические методы анализа нуклеиновых кислот, белков и РНКбелковых комплексов.

3.2. Выделение и очистка исследуемых белков из штаммов-продуцентов Е. coli.

3.3. Получение препаратов исследуемых РНК.

3.3.1. Выделение 5S рРНК Е. coli.

3.3.2. Синтез 5S рРНК и ее фрагментов транскрипцией in vitro и их очистка.

3.3.3. Подготовка образцов РНК к экспериментам.

3.3.4. Фракционирование клеточных РЕК Е. coli.

3.4. Методы исследования РНК-белковых комплексов.

3.5. Выделение и анализ препаратов рибосом и рибосомных субчастгщ.

3.5.1. Выделение рибосом и рибосомных субчастиц из клетбк Е. coli.

3.5.2. Анализ препаратов рибосом и рибосомных субчастиц центрифугированием в градиенте плотности сахарозы.

3.6. Методы исследования функциональной активности рибосом in vitro.

3.6.1. Получение тотальной ферментной фракции из клеток Е. coli.

3.6.2. Трансляция полиуридиловой матрицы.

3.6.3. Трансляция мРНК лзоциферазы в бесклеточной системе из Е. coli.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Изучение специфического взаимодействия рибосомного белка L25 Escherichia coli и его гомологов (белков семейства СТС) с 5S рРНК.

1.1. Белок СТС Aquifex aeolicus не является исключением среди белков семейства.

1.2. Роль отдельных аминокислотных остатков белков L25 и TL5 в формировании и стабилизации их комплекса с 5SpPHK.

1.3. РНК-связывающие свойства белков СТС с природными заменами в их 5SрРНКсвязывающем модуле.

2. Необходимость взаимодействия бежа L25 с 5S рРНК для его встраивания в рибосому in vivo.

3. Исследование роли рибосомного белка L5 в сборке и функционировании рибосомы Escherichia coli.

3.1. Получение и характеристика больших рибосомных субчастгщ, собранных in vivo в отсутствие белка L5.

3.2. Влияние мутаций в петле ß2-ß3 белка L5 на синтез рибосомами полипептида. in vivo и in vitro.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование роли рибосомных белков L5 и L25 в формировании функционально-активной бактериальной рибосомы"

В клетках всех живых организмов белки синтезируются на рибосоме. ' Исследование структуры, функции и эволюции рибосомы интенсивно ведутся с 50* гг. XX века. За этот период накоплен огромный экспериментальный материал о структуре рибосомы и ее компонентов, а также о принципах ее функционирования. Однако, несмотря на это, остается еще много нерешенньгс вопросов относительно деталей протекания отдельных стадий трансляции и роли компонентов рибосомы в этом процессе. Кроме того, несмотря на недавние успехи в определении пространственной структуры рибосомы, далеко не все ясно относительно принципов специфического взаимодействия РНК и белков, лежащих в основе ее структурной организации. Об этом свидетельствует то, что количество работ, посвященных рибосоме, только возрастает. Кроме того, большая часть имеющихся на сегодняшний день данных получена в экспериментах in vitro, которые далеко не всегда могут адекватно отражать процессы, происходящие в клетке.

Рибосомы ныне живущих организмов состоят из двух неравных субьединиц (малой и большой). Одной из самых характерных морфологических особенностей большой рибосомной субчастицы любого организма является центральный протуберанец. Известно, что центральный протуберанец участвует в ассоциации рибосомных субчастиц (Lake, 1976), а у его основания расположены пептидилтрансферазный центр и тРШС-связывающие участки рибосомы (Barta et al., 1984; Moazed & Noller, 1989; Yusupov et al., 2001; Nissen et al, 2000; Selmer et al., 2006). Большую часть этого структурного элемента рибосомы формирует комплекс 5S рРНК и нескольких специфически связывающихся с ней рибосомных белков. В экспериментах in vitro было показано, что в отсутствие 5S рРНК-белкового комплекса собирается функционально неактивная большая субчастица рибосомы (Erdmann et al., 1971; Dohtne & Nierhaus, 1976b). Однако прямых данных о том, для чего нужен этот комплекс в рибосоме, до сих пор нет. Количество белков, специфически связывающихся с 5S рРНК, варьирует в разных организмах. В Escherichia coli - это три белка, L5, L18 и L25. Белки L5 и L18 обнаружены в рибосомах представителей всех доменов жизни, Бактерий, Архей и Эукариот (Gasteiger et al., 2003; Benson et al., 2008). В то же время, рибосомный белок L25 является особенностью бактерий — ген этого белка не обнаружен в известных геномах архей и эукариот. Недавно было продемонстрировано, что белки L5 и LI8 строго необходимы для выживания бактериальной клетки Е. coli (Korepanov et al., 2007). В то же время, при нокауте гена белка L25 клетки выживали, но росли медленнее, чем клетки исходного штамма, а Ь25-дефицитные рибосомы отличались сниженной эффективностью в синтезе природных полипептидов. Таким образом, все имеющиеся данные указывали на то, что 5S рРНК-связывающиеся белки чрезвычайно важны для функционирования бактериальной рибосомы. Однако их конкретная роль в формировании рибосомы в клетке оставалась невыясненной. В связи с этим, в рамках данной работы были проведены исследования, посвященные выяснению роли рибосомных белков L5 и L25 в сборке и функционировании рибосомы Е. coli.

В первой части работы были проведены детальные исследования особенностей взаимодействия 5S рРНК с белком L25 Е. coli и его гомологом, рибосомным белком TL5 Thermus thermophilic. Для этого был осуществлен направленный мутагенез аминокислотных остатков этих белков, образующих водородные связи с РНК в комплексе. Было установлено, что пять идентичных остатков в белках L25 и TL5, формирующих их 5S рРНК-связывающий модуль, чрезвычайно важны для стабилизации уже сформированного РНК-белкового комплекса. Выявленные принципы взаимодействия этих белков с изолированной 5S рРНК позволили перейти к изучению данного взаимодействия в системе in vivo. Для этого был создан ряд штаммов Е. coli, содержащих мутантную форму белка L25, лишенную способности связываться с 5S рРНК in vitro. Были изучены ростовые характеристики клеток указанных штаммов, а также эффективность встраивания мутантной формы белка L25 в рибосому in vivo. Полученные данные впервые демонстрируют необходимость образования прочного контакта между белком L25 и 5S рРНК для удержания данного белка в рибосоме, а таюке для стабильной ассоциации рибосомных субчастиц.

Во второй части работы было проверено, какой эффект на сборку большой рибосомной субчастицы оказывает отсутствие жизненно важного рибосомного белка L5 в клетках Е. coli. Впервые были получены и охарактеризованы большие рибосомные субчастицы, собранные in vivo в отсутствие этого белка. Установлено, что такие субчастицы лишены большей части компонентов ее центрального протуберанца. Кроме того, в данной работе было исследовано влияние мутаций в контактирующей с тРНК в петле ß2-ß3 белка L5 на функциональные свойства рибосом. Было показано, что в отличие от замены отдельных аминокислотных остатков делеция сразу нескольких остатков в указанной петле белка приводит к снижению эффективности функционирования рибосомы Е. coli и, как следствие, замедлению роста клеток этой бактерии.

Полученные результаты и методы, изложенные в работе, могут быть использованы не только при изучении рибосомы и ее компонентов, но и в других областях молекулярной биологии при структурно-функциональных исследованиях комплексов нуклеиновых кислот с белками.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Коробейникова, Анна Васильевна

ВЫВОДЫ

3. Установлено, что белок СТС Aquifex aeolicus обладает полноразмерным 5S рРНК-связывающим доменом и, таким образом, не является исключением среди белков данного семейства.

5. Показано, что рибосомы Е. coli, содержащие белок L5 с укороченной петлей р2-рЗ, менее эффективно синтезируют природные полипептиды. Сниженная функциональная активность данных рибосом не связана с увеличением частоты ошибок трансляции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коробейникова, Анна Васильевна, Москва

1. Бушуев, В.Н., Окон, М.С., Гудков, А.Т., Туманова, Л.Г., Гонгадзе, Г.М. Спектры 'Н-ЯМР белков большой субчастицы рибосом Escherichia coli // Препринт. — Пущино. — 1982.-Р.1-39.

2. Гаврилова, Л.П., Смолянинов, В.В. Изучение механизма транслокации в рибосомах. I. Синтез полифенилаланина в рибосомах Escherichia coli без участия гуанозин-51-трифосфата и белковых факторов трансляции // Мол. Биология. — 1971. — Т. 5. — С.883-891.

3. Гонгадзе, Г.М. Исследование дефицитных по белкам рибосомных 50S субчастиц Escherichia coli. Роль белков и РНК в формировании рибосомной субчастицы // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 1986. — Пущино.

4. Гонгадзе, Г.М., Корепанов, А.П., Коробейникова, А.В., Гарбер, М.Б. Бактериальные 5S рРНК-связывающие белки семейства СТС //Успехи Биолог. Химии. 2008. -Т.48.- С.105-132.

5. Корепанов, А.П., Гонгадзе, Г.М., Гарбер, М.Б. Основной стрессовый белок СТС Bacillus subtilis специфически связывается с рибосомной 5S РНК // Биохимия. — 2004.- Т.69. С.749-754.

6. Коробейникова, А.В., Гонгадзе, Г.М., Корепанов, А.П., Елисеев, Б.Д., Баженова, М.В., Гарбер М.Б. 5S рРНК-узнающий модуль белков семейства СТС и его эволюция // Биохимия. 2008. - Т.73. - С. 193-201.

7. Седельнпкова, С.Э. Рибосомные белки Thermus thermophilus. Выделение, физико-химические свойства и кристаллизация // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. — 1991. — Пущино.

8. Сердюк, И.Н., Агаларов, СЛ., Гонгадзе, Г.М., Гудков, А.Т., Седельникова, С.Э., Май, Р., Спирин, А.С. О форме и компактности рибосомных РНК и их комплексов с белками в растворе // Мол. Биология. — 1984. Т. 18. - С.244-261.

9. Abdurashidova, G.G., Tsvetkova, Е.А., Budowsky, E.I. Direct tRNA-protein interactions in ribosomal complexes // Nucl. Acids Res. 1991. - V. 19. - P. 1909-1915.

10. Adilakshmi, Т., Ramaswamy, P., Woodson, S.A. Protein-independent folding pathway of the 16S rRNA 5' domain // J. Mol. Biol. 2005. - V.351. - P.508-519.

11. Agrawal, R.K., Penczek, P., Grassucci, R.A. Frank, J. Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli 70S ribosome: the mechanism of translocation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V.95. - P.6134-6138.

12. Al-Karadaghi, S., Kristensen, O., Liljas, A. A decade of progress in understanding the structural basis of protein synthesis // Prog. Biophys. Mol. Biol. — 2000. V.73. - P.167-193.

13. Allers, J., Shamoo, Y. Structure-based analysis of protein-RNA interactions using the program ENTANGLE // J. Mol. Biol. 2001. - V.311. - P.75-86.

14. Ansley, S.B., Campbell, L.L., Sypherd, P.S. Isolation and amino acid composition of ribosomal proteins from Bacillus stearothermophilus // J. Bacteriol. 1969. - V.98. - P.568-572.

15. Arndt, E., Scholzen, T., Kromer, W., Hatakeyama, T., Kimura, M. Primary structures of ribosomal proteins from the archaebacterium Halobacterium marismortui and the eubacterium Bacillus stearothermophilus // Biochimie. — 1991. — V.73. P.657-668.

16. Arnold, R.J., Running, W., Reilly, J.P. Analysis of methylation, acetylation, and other modifications in bacterial ribosomal proteins // Methods Mol. Biol. 2008. - V.446. — P.151-161.

17. Arnold, R.J., Reilly, J.P. Observation of Escherichia coli ribosomal proteins and their posttranslational modifications by mass spectrometry // Anal. Biochem. 1999. - V.269. -P.105-112.

18. Bachniann, B.J. Pedigrees of some mutant strains of Escherichia coli K-12 // Bacteriol. Rev. 1972. - T.36. - P.525-557.

19. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B., Steitz, T.A. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution // Science. 2000. - V.289. - P.905-920.

20. Barta, A., Steiner, G., Brosius, J., Noller, H.F., Kuechler, E. Identification of a site on 23S ribosomal RNA located at the peptidyl transferase center. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1984. — V.81. — P.3607-3611.

21. Bear, D.G., Ng, R., Van Derveer, D., Johnson, N. P., Thomas, G., Schleich, T., Noller, H.F. Alteration of polynucleotide secondary structure by ribosomal protein SI // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - V.73. - P. 1824-1828.

22. Beauclerk, A.A., Cundliffe, E., Dijk, J. The binding site for ribosomal protein complex L8 within 23 s ribosomal RNA of Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1984. - V.259. - P.6559-6563.

23. Belitsina, N.V., Glukhova, M.A., Spirin, A.S. Translocation in ribosomes by attachment-detachment of elongation factor G without GTP cleavage: evidence from a column-bound ribosome system // FEBS Lett. 1975. - V.54. - P.35-38.

24. Belova, L., Tenson, T., Xiong, L., McNicholas, P.M., Mankin, A.S. A novel site of antibiotic action in the ribosome: interaction of everaimicin with the large ribosomal subunit //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2001. -V.98. P.3726-3731.

25. Benson, D.A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D.J., Ostell, J., Wheeler, D.L. GenBank. Nucl. Acids Res. 2008. - V.36. - D25-D30.29.

Информация о работе

Коробейникова, Анна Васильевна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Исследование роли рибосомных белков L5 и L25 в формировании функционально-активной бактериальной рибосомы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы