Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение вариаций в организации и экспрессии оперонов рибосомных белков эубактерий

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение вариаций в организации и экспрессии оперонов рибосомных белков эубактерий"

Хайруллина Гузель Анваровна

Изучение вариаций в организации и экспрессии оперонов рибосомных белков эубактерий

03.01.03 - молекулярная биология

11 АПР 2013

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2013

005051517

Работа выполнена на Факультете биоинженерии и биоинформатики Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Копылов Алексей Михайлович

Официальные оппоненты:

Сергиев Петр Владимирович, доктор химических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова", химический факультет, кафедра химии природных соединений, доцент.

Вениаминов Артемий Давидович, кандидат физико-математических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, научный сотрудник.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук.

Защита состоится «26» апреля 2013 г. в 11.00 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр. 12, МГУ, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан_ марта 2013 года.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

На экспоненциальной стадии рост клеток Е. coli прямо зависит от количества рибосом на клетку (Saito et. al., 1994) и масса рибосом составляет примерно 30 - 40% от массы клетки. Для биогенеза рибосом клетка тратит существенную часть ресурсов. Рибосома - сложно организованный супрамолекулярный комплекс, состоящий из трех молекул рРНК и 55 молекул белка; 21 белок и одна 16S рРНК входят в состав малой 30S субчастицы.

При биогенезе прокариотических 70S рибосом происходит раздельная сборка двух субчастиц. Определяющую роль в самосборке 30S субчастицы играют белки, которые первыми связываются с 16S рРНК (S4, S7, S8, S15), что приводит к формированию т. н. «структурного остова» малой субчастицы.

Синтез многих рибосомных (р-) белков сбалансирован с рРНК. Саито и коллегами (Saito et. al, 1994) был предложен механизм регуляции по типу обратной связи, когда избыток р-белка ингибирует трансляцию собственной мРНК. Это справедливо, в том числе и для стрептомицинового {sir-) оперона, регулируемого белком S7 (рис. 2).

Основные работы по изучению механизмов регуляции экспрессии îir-оперона были проведены для Е. coli, данные для других бактерий немногочисленны. Аллен (Allen et al, 2004) сравнил регуляцию для двух оперонов Vibrio cholerae. Оказалось, что механизмы не универсальны не только для типа, но даже для класса гамма протеобактерий; например, отличаются для Pseudomonas aeruginosa. Сравнение структуры генов L5 для Р. aeruginosa и Е. coli показало, что потенциальные участки взаимодействия с S8 спектиномицинового (spc-) оперона Р. aeruginosa и Е. coli не могут иметь однотипную вторичную структуру (Allen et al, 2004).

В связи с этим, исследование универсальности механизмов регуляции экспрессии оперонов р-белков эубактерий, особенно для ключевых белков сборки рибосом, является крайне актуальной задачей современной молекулярной биологии. Наиболее интересны опероны, кодирующие белки, которые первыми связываются с 16S рРНК, а именно S4 и S7 из альфа- и ^/--оперонов Е. coli, соответственно.

В задачу данной работы входило сравнительное изучение организации и экспрессии оперонов р-белков эубактерий, в частности Е. coli и ряда патогенов.

Для этого выбраны два представителя из одного типа - Proteobacteria, поскольку к нему относится вид Е. coli: один представитель того же порядка Enterobacteriales - Salmonella enterica серотип typhi (S. Typhi), и второй, но относящийся к другому порядку - V. cholera. Два других представителя: типа Firmicutes - Staphylococcus aureus и типа Actinobacteria -Mycobacterium tuberculosis также относятся к патогенам.

1

Цель и залами исследования

Цель работы - изучение геномной и оперонной организации генов, а также цистронов в оперонах р-белков патогенных бактерий из различных классов. В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:

1) Охарактеризовать расположение генов р-белков в геномах различных эубактерий;

2) Сравнить организацию генов/цистронов р-белков в оперонах различных эубактерий;

3) Охарактеризовать и исследовать экспрессию стабильных бактериальных коротких РНК (бкРНК, (sRNA)), имеющих отношение к оперонам р-белков;

4) Разработать метод для изучения кинематики рибосом на полицистронной мРНК in vivo на примере я/г-оперона Е. coli, используя ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ);

5) Сравнить дифференциальную экспрессию отдельных цистронов sir- и альфа-оперонов р-белков, ключевых для биогенеза малой субчастицы.

Научная новизна и практическая значимость работы

Проанализировано положение генов р-белков на хромосомной карте Е. coli, а также структура их оперонов для S. Typhi, М. tuberculosis, V. cholerae, S. aureus. В зависимости от эволюционных различий меняется взаимное расположение групп оперонов. Выделены опероны, которые чаще других расположены кластерами в геномах бактерий. Найдены различия в построении и составе самих оперонов. Наиболее яркий пример - альфа-оперон V. cholerae, в котором отсутствует ключевой ген регуляторного р-белка S4.

Проанализирована структура s/r-оперона для всех пяти эубактерий. Для двух близких эубактерий: Е. coli и S. Typhi (рис. 1), относящихся к одному порядку, не выявлено различий в структуре s/r-onepoiia. Но для V. cholerae (другой порядок) показано наличие дополнительной копии гена фактора элонгации EF-G, находящейся вне sír-оперона в совершенно другом участке генома. S. aureus отличается только по копийности генов EF-Tu (одна копия, а не как в Е. coli - две). М. tuberculosis отличается по копийности генов обоих факторов элонгации EF-G и EF-Tu.

В данной работе для S. Typhi, V. cholerae, S. aureus и M. tuberculosis выявлена 41 бкРНК, картированные в 15 р-оперонах. Их экспрессия показана Нозерн-блот гибридизацией: 14 бкРНК экспрессируются в зависимости от фазы роста бактерий: экспрессия некоторых значительна на стационарной фазе роста, для других она минимальна; некоторые бкРНК экспрессируются на всех стадиях роста. Для V. cholerae найдены три бкРНК (VcR_4520; VcR_4751; VcR_4371), экспрессия которых зависит от белка Hfq (РНК-связывающий бактериальный регулятор экспрессии генов).

Изучены профили представленности различных участков цистронов s/r-оперона на разных стадиях роста Е. coli. Показана активность одного из двух предполагаемых внутренних промоторов при росте на богатой среде.

Для различных физиологических условий впервые построен паттерн представленности sir-оперона. Деградосома (полинуклеотидфосфорилаза) также участвует в модуляции представленности цистронов р-белков.

Проведен анализ профилей представленности различных участков цистронов альфа-оперона на разных фазах роста Е. coli.

Публикации и апробации работы.

Работа апробирована на российских и международных конференциях "Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы" (Белгород, 2008), "Ломоносов-2009" (Москва, 2009), "Ломоносов-2011" (Москва, 2011), "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2010), "Международный конгресс по антимикробной терапии MAKMAX/ESCMID" (Москва, 2012), 3d ЕМВО Meeting (Vienna, Austria, 2011); 4th EMBO Meeting (Nice, France, 2012), 37th FEBS Congress (Seville, Spain, 2012). По материалам диссертации опубликовано 2 статьи.

Структура и объем диссертационной работы.

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен оперонам р-белков), обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 52 рисунками и 4 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 134 цитированных работ. Работа выполнена при поддержке РФФИ и ДААД.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Филогения исследуемых эубактерий

Гены р-белков эубактерий очень консервативны, но сохраняется ли такой консерватизм в геномной, оперонной и внутриоперонной структуре?

Для сравнения выбраны представители одного типа - Proteobacteria. Два вида, принадлежащих одному порядку Enterobacteriales - S. enterica серотип typhi (S. Typhi) и E. coli; один - из того же типа, но другого порядка - V. cholerae, а также по одному представителя совершенно других типов: Firmicutes - S. aureus и Actinobacteria - М. tuberculosis. Филогения выбранных видов представлена на рис. 1.

Beta Proteobacteria

Epsilon Proteobacteria

Delta Proteobacteria

Рис. 1. Неукорененное филогенетическое древо прокариот, основанное на 16S рРНК (с изменениями (Nelson et. а!.. 20001.

Мы попытались ответить на вопрос: насколько универсальна организация р-оперонов Е. coli для других эубактерий, в том числе патогенных?

Хромосомное расположение генов р-белков Е. coli.

Большинство генов р-белков было картировано около 20 лет назад. Более половины генов расположены в классическом str-spc-локусе, где они организованы в четыре оперона, содержащих от 4 до 12 генов. Остальные собраны в кластеры от одного до четырех генов и находятся в разных частях хромосомы (рис. 2). В кластерах генов .«»"-участка направление репликации и транскрипции совпадает — против часовой стрелки. Аналогичная ситуация наблюдается и для п/-участка, где все гены транскрибируются в направлении по часовой стрелке. Т.е. гены р-белков могут активно транскрибироваться одновременно с репликацией.

Ранее замечено, что гены р-белков и рРНК расположены на хромосоме не случайным образом: большая часть генов располагаются не дальше одной шестой от ориджина репликации, и всего лишь три находятся в отдалении. Такая организация позволяет синтезировать большое количество р-белков и рРНК в процессе активного роста и деления

при наличии множественных репликативных вилок, обеспечивающих многокопийность этих генов.

можно сгруппировать в блоки. Для Е. coli характерно сосредоточение оперонов примерно в левой трети от ориджина. В этом участке располагаются следующие опероны: S21, S15, L13, S10, spc, альфа, str, L28, L34, Lll, LIO, S6, S20 и S2. Некоторые опероны расположены в геноме одиночно: S16, L20, L25, S1 и L32. В скоплении оперонов можно различить два блока. Первый, располагающейся на основной цепи и содержащий 4 оперона (S6, L10, LI 1, L34), и второй, располагающийся на комплементарной цепи, состоящий из 7 оперонов (S15, L13, S10, spc, альфа, str, L28).

V. cholerae. Геном состоит из двух кольцевых и неравных по размерам хромосом: большая - приблизительно 2 961 тыс. п.н., меньшая - примерно 1 072 тыс. п.н. Практически все р-опероны, а также опероны рРНК располагаются на большой хромосоме. Также как и у Е. coli, существует участок, содержащий большинство оперонов. В отличие от Е. coli, где все опероны условно располагались с одной стороны от ориджина, у V. cholerae ориджин находится между группами оперонов. Но, как и для Е. coli, все опероны располагаются недалеко от ориджина.

Если сравнить линейные размеры обоих участков наибольшей плотности оперонов р-белков, то они примерно равны и составляют 1 300 - 1 500 тыс. п.н. Гены р-белков, располагающиеся на большой хромосоме, условно можно разделить на три блока: 1) альфа, spc, S10 - на комплементарной цепи; 2) L28, LI 1, LIO, str, S6 - на основной цепи и 3) S16, L13, S15 - на основной цепи (рис. 2). При сравнении с аналогичными участками генома Е. coli можно заметить, что первый блок имеет тот же состав, но обратный порядок; второй блок сильно видоизменился при сохранении сцепления оперонов LI 0, LI 1 ; из третьего блока только два оперона сцеплены - L13, S15. Интересно, что порядок следования оперонов для этих видов бактерий противоположный.

У V. cholerae, как и у Е .coli (кроме оперона S16), опероны L32, SI, L25 и L20 располагаются поодиночке. Оперон L20 - единственный из р-оперонов находится на малой хромосоме V. cholerae II. В геноме Е. coli этот одиночный оперон располагается на большом расстоянии от основных двух блоков.

V. cholerae - один из эволюционно близких к Е. coli видов. Оба относятся к одному типу -Proteobacteria. Тем не менее, взаимное расположение оперонов в геноме значительно изменяется в ходе эволюции.

S. aureus. Содержит одну кольцевую хромосому длиной примерно 2 879 тыс. п.н. S. aureus эволюционно гораздо более далекий представитель, чем Е. coli и V. cholerae между собой, и относится к типу Firmicutes. Данный тип таксона эубактерий известен низким процентом GC-nap.

В отличии от V. cholerae и Е. coli, р-опероны в хромосоме S. aureus не сгруппированы, а располагаются 4 блоками, которые распределены по хромосоме относительно равномерно. Первый блок - L13, альфа, spc, S10 - совпадает с аналогичным Е. coli и V. cholerae, и точно также находится на комплементарной цепи. Второй блок — S6, L25, LI 1, LIO, str - (основная цепь) также совпадает с блоком ранее описанных видов, но последовательность расположения оперонов изменена. Третий блок, состоящий из L28, S16, S2, S15 оперонов, не совпадает с блоками, описанными у Е. coli и V. cholerae. Последний блок - SI, S21, S20, L20 - располагается примерно в одном месте на хромосоме, но при этом часть оперонов находится на основной цепи — S21, L20, а другая часть - S20, S1 - на комплементарной. Похоже, что подобная группировка оперонов является случайной и их можно отнести к классу одиночных. У S. aureus имеются другие одиночные опероны: L34, L20, L32. Опероны L20 и L32 являются одиночными и в типе Proteobacteria.

Помимо перегруппировки некоторых оперонов для S. aureus показаны внутри-оперонные изменения. Наиболее яркий пример - в альфа-опероне отсутствует ген S4, являющийся классическим примером регуляторного белка Е. coli. Альфа-оперон располагается на

6

комплементарной цепи на расстоянии примерно 500 тыс. п.н. от гена S4, находящегося на главной цепи. Аналогичный пример можно привести для оперона S6, откуда переместился ген L9. Обнаружены не только перемещения генов из оперонов, но и дупликация генов. Например, в опероне S15 S. aureus найдена дополнительная копия гена L33 на расстоянии прим. 200 тыс. п.н. от оперона. Найдена дупликация гена/оперона L28.

Организация генов р-белков в оперонах разных бактерий

Регуляция экспрессии такого большого и разнообразного числа оперонов отличается для каждого оперона, но насколько отличаются механизмы регуляции для одного и того же оперона в разных видах бактерий неизвестно.

Один из простейших способов координации синтеза различных р-белков — объединение их генов в одну или несколько транскрипционных единиц. Подобное решение обеспечивает, с одной стороны, возможность эквимольного синтеза р-белков, а с другой - позволяет упростить регуляцию такого большого числа генов. Что и наблюдается в Е. coli: существуют несколько транскрипционных единиц — оперонов р-белков, которые имеют разное количество цистронов. Помимо генов р-белков некоторые опероны содержат гены белков, участвующих в транскрипции и трансляции. Например, оперон S21 содержит ген ДНК-праймазы и ген сигма-субъединицы РНК-полимеразы.

Сложность транскрипционной организации оперонов может возрасти за счет предполагаемых внутренних промоторов разной силы. Для оперона LIO Е. coli сначала было показано существование промотора перед первым геном оперона — rplJ (Post, 1979), который определяет транскрипцию четырех цистронов: rpLf-rplL-rpoB-rpoC. Через несколько лет (Fukuda, 1983; Bass, 1982) был найден внутренний промотор перед геном бета-субъединицы РНК-полимеразы, определяющий более короткий транскрипт: гроВ-гроС. Возможно, такой механизм понадобился для дополнительной регуляции РНК-полимеразы.

Регуляция экспрессии р-оперонов происходит как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Разные опероны регулируются по-разному. Оперон может иметь оба уровня регуляции, например р-оперон S10. Белок L4, цистрон которого стоит третьим в опероне S10, регулирует как транскрипцию, так и трансляцию всех одиннадцати генов/цистронов этого оперона.

На трансляционном уровне наиболее характерным является регуляция по типу обратной связи: регуляторный белок связывается либо с рРНК с образованием рибосомы, либо его избыток - с собственной мРНК, тем самым ингибируя как свой синтез, так и синтез нескольких цистронов этого оперона.

По данным Саито и коллег (Saito К. et. al, 1994) регуляция трансляции фактора элонгации EF-Tu происходит вне зависимости от предыдущих трех цистронов и его количество отличается от р-белков. Причин может быть несколько: активность внутренних промоторов, наличие в геноме Е. coli двух генов Tu - одна копия tufA в 5^-опероне (рис. 8), вторая - tufB транскрибируется отдельно. Нуклеотидные последовательности генов содержат лишь несколько нуклеотидных замен. Разница в экспрессии р-белков и Tu может быть десятикратной, при этом синтез с tufA идет в 2-3 раза более активно, чем с tuffi (Pedersen, 1976).

Для двух эубактерий одного порядка: Е. coli и S. Typhi (табл. 1, рис. 1) количество цистронов в sir-oiicpoiic одинаково. Но для обоих видов характерно наличие двух генов EF-Tu (один в составе str-oперона, второй - в другой области генома).

Вид/ген S12 S7 EF-G EF-Tu

S. aureus 1 1 1 1

E.coli 1 1 1 2

¿■.Typhi 1 1 1 2

V. cholerae 1 1 2 2

M. tuberculosis * 1 1 2 1

Таблица 1. Количество цистронов в sfr-onepoiiax Е. coli. S. Typhi. V. cholerae. М. tuberculosis и S. aureus (*по первичной структуре два гена EF-G аналогичны, но не гомологичны).

У М. tuberculosis также наблюдается дополнительный ген, но не EF-Tu, как у Е. coli, a EF-G. Для V. cholerae существует дополнительные копии обоих генов: EF-G и EF-Tu.

Можно заметить, что единообразие в составе наблюдается только для эубактрий одного порядка.

бкРНК, картированные в оперонах р-белков

Благодаря интенсивному изучению различных бкРНК найдены примеры эволюции путем дупликации, горизонтального переноса, трансформации известных РНК или случайной транскрипции.

Можно выделить три основных типа стабильных бкРНК:

1) функциональные РНК - например, тРНК

2) фрагменты РНК, устойчивые к деградации благодаря собственной структуре - например, псевдоузлы.

3) РНК, защищаемые от деградации белками или рибосомами.

Активно ведется поиск новых методов для обнаружения бкРНК; например, предложен метод выявления участков трансляционных пауз рибосом в бактериях, основанный на секвенировании фрагментов мРНК, которые защищены рибосомами от деградации (Li et. all,

2012). Оценка профилей плотности рибосом на транскриптах показала, что редкие кодоны не приводят к паузированию, в отличии от последовательностей, аналогичных Шайн-Дальгарно.

Данная работа сфокусирована на РНК из второй и третьей группы, поскольку они могут иметь регуляторную функцию.

Для создания библиотеки кДНК брали одинаковое количество суммарной РНК, выделенной из клеток патогенных бактерий на разных стадиях роста (любезно предоставленной Р. Рейнхардом и Т. Таном) и длиной от 50 до 200 н. 3'-конец РНК полиаденилировали, а 5'-конец лигировали с адаптором. Продукт, получившийся после обратной транскрипции и одноцепочечной ПЦР, клонировали в вектор pSPORTl и трансформировали Е. coli. Положительные клоны отбирали случайным образом, плазмидные вставки секвенировали и собирали в контиги с помощью пакета программ http://www.dnastar.com. последовательности картировали с использованием BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi: координаты представлены на рис. 3.

ncRNAs ncRNA/Acc. Nr США (ot) Coords. Orient. NB Gene ID

яг opeiou

MibR 5426 JQ708068 eis ¡mtisense 60 147682/147741 + EF-G(Rv0I20c)

MtbR5775 JQT08069 eis aiitisense 111 783049ҐЇ8М59 + EF-G (R\-0684)

MtbR 1S8 JQ708070 c\s antisaise IIS 145615/145762 + EF-G (R\D120c)

VÎR. 4520 HQ442133.1 mragenic 36 379469/379504 + + S7 (VC0360VEF-G (VC0361>»>

/Рис. 3. Список координат бкРНК. найденных в геноме бактерий и относящихся к оперонам р-белков. Номера

соответствуют базам данных

БОВ.Г/ЕМВІЛїепВапк

Найдено 25 бкРНК, экспрессия которых показана Нозерн-блот гибридизацией. Кроме того, были получены бмРНК из штаммов Hfq КО.

мРНК и антисмысовыми транскриптами в М. tuberculosis, иллюстрируя общий, и может быть даже общегеномный механизм транскрипционной ко-регуляции.

Для малых кДНК, полученных из РНК для различных р-оперонов, характерна транскрипция участков, комплементарных мРНК (кмРНК). Обнаружены кмРНК, принадлежащие различным оперонам четырех изучаемых видов эубактерий. Экспрессия некоторых была независимо подтверждена Нозерн-блот гибридизацией.

Картированы три кмРНК к оперону Lll М. tuberculosis. Для одного из них - MtbR 7477, была показана экспрессия Нозерн-блот гибридизацией - фрагмент длиной 60 н. экспрессируется на всех стадиях роста (рис. 5). Номурой (Kearney KR, Nomura М., 1987) был обнаружен район связывания регуляторного белка L1 с мРНК - примерно первые 100 н цистрона. MtbR 7477 картируется примерно в этой же области. Данная бкРНК может принимать участие в регуляции путем нарушения сложной вторичной структуры, образуемой мРНК, которая необходима для связывания с регуляторным белком.

Lll орегоп * MtbR 7477 M. tuberculosis

М. tuberculosis J—— SecE NusG L11 L1 5d 14d 28d 50d

SecE NusG RpIK RplA 5S rRNA ИШвИ1ИЩ|~ 120 nl

Рис. 5 Структура оперона ¿/У М. Tuberculosis. Названия генов даны снизу, сверху - названия белков. Регуляторный белок подчеркнут; регулируемые им цистроны выделены черным; не регулируемые - белым. Р - возможные промоторы; стрелками обозначены бкРНК

L10(L12) опсрон Кодирует два р-белка: L10 и L12. В отличие от других р-белков L10 и L12 образуют пентамерный комплекс в стехиометрии 1 к 4: L10-(L12)4. Помимо основной функции этого комплекса - формировать рибосомы, известно, что он специфически взаимодействует с 5'-лидерным участком мРНК оперона, выполняя регуляторную функцию. В рРНК и мРНК обнаружен мотив, узнаваемый L10-(L12)4; т. н. «kink-turn» и петля UUAA (рис. 6С) . В транскриптоме S. Typhi обнаружен StyR 55, который картирован за 133 н. от AUG мРНК L10-L12 (рис. 3, 6А). Анализ вторичной структуры StyR 55 показал на участок связывания L10-(L12)4. Т.о. StyR 55 может связывать комплекс L10-(L12)4, влияя на регуляцию оперона L10 (рис. 6 А, С)

белков. Регуляторный белок подчеркнут; регулируемые им цистроны выделены черным и серым, не регулируемые цистроны показаны белым. Цифрами показана длина межцистронов в н. Р - промотор, показанный для Е. coli.

Предполагается, что альфа-оперон имеет единственный участок узнавания р-белка S4, и что трансляция цистрона LI 7 сопряжена с трансляцией трех р-белков, цистроны которых расположены раньше.

Участок связывания S4 включает в себя лидерную последовательность и проксимальные 40 н первого цистрона S13. Участок связывания S4 с альфа- образует сложную вторичную структуру. Как и в случае участка связывания S4 с 16S рРНК - это достаточно протяженная область на 5'-конце рРНК. Структура участков связывания с 16S рРНК и альфа мРНК не похожа ни по первичной структуре, ни по гипотетической вторичной структуре (Zengel J., Lindahl L., 1994).

Предполагается, что связывание S4 с мРНК вызывает аллостерический конформационный переход в РНК, который, в свою очередь, ингибирует нормальную инициацию трансляции. Ранее показано существование двух конформаций мРНК, переход между которыми происходит достаточно медленно. Механизм репрессии трансляции представляется следующим: после связывания S4 с мРНК происходит смещение равновесия в пользу той конформации, при которой инициация трансляции невозможна.

В данной работе проведен анализ представленности различных участков цистронов альфа-оперона; она оказалась не одинаковой и различалась на разных стадиях роста. На рисунке 10Г приведены результаты представленности.

Представленность разных участков оперона для всех трех стадий роста примерно одинаковая за исключением ранней логарифмической стадии, где заметно сильное (примерно в полтора - два раза) превалирование начального участка цистрона S13. Регуляторный белок S4 узнает и связывается с данным участком мРНК; она не может транслироваться и подвергается гидролизу. В то же время S4 экранирует участок связывания и ближайшие нуклеотиды от гидролиза нуклеазами. Время жизни данного участка мРНК возрастает, что и отражается на уровне сигнала. Подобный феномен характерен только для ранней логарифмической стадии роста.

Все данные по представленности цистронов р-белков нормированы на количество рРНК. На ранней логарифмической стадии роста, в отличии от поздней и стационарной, соотношение количества мРНК к рРНК выше. На этой фазе роста идет активный синтез рибосом для обеспечения эффективного биосинтеза белка. Поскольку количество р-белков не может превышать уровень рРНК в клетке, включается процесс регуляции трансляции р-белков.

Регуляция экспрессии альфа-оперона в клетках Е. coli, мутантных по полинуклеотидфосфорилазе

При регуляции трансляции оперонов показан существенный вклад, который вносит гидролиз, а именно - функционирование деградосом. Это супрамолекулярный комплекс белков, основной задачей которого является деградация свободной РНК. Для выяснение вклада нуклеаз в регуляцию трансляции альфа-оперона были проведены эксперименты на штамме Е. coli с мутацией в гене полинуклеотидфозфорилазы.

Представленность различных участков альфа-оперона для мутантных клеток похожа на распределение, полученное для исходных клеток (рис. 10 Г, Д). Также как и в исходном штамме наблюдается превалирование начального участка цистрона S13 над всеми остальными на ранней логарифмической стадии роста, что говорит о том, что при дефиците деградации механизм регуляции сохраняется.

На ранней логарифмической стадии роста заметно, что представленность последующих трех участков становится одинаковой; по-видимому отсутствие экзонуклеазной активности выравнивает паттерн представленности.

Регуляция экспрессии альфа-оперона Е. coli в стрессовых условиях (минимальная среда)

При росте Е. coli на минимальной среде на ранней логарифмической стадии представленность начального участка цистрона SI3 не такая большая, как для клеток, растущих на богатой среде, что может говорить о других механизмах регуляции (рис. 10Е). При сравнении паттерна представленности цистронов альфа-оперона на нормальной и на минимальной средах заметно уменьшение представленности начальных участков цистронов Sil и S4 по сравнению с их концевыми участками (рис. 10Е). Возможно, что это отражает наличие рибосом, которые паузируют при терминации.

выводы

1) Найдены существенные различия в организации генов рибосомных (р-) белков в геномах, а также в организации цистронов в оперонах р-белков ряда эубактерий: Е. coli, V. cholerae, S. Typhi, M. tuberculosis, S. aureus.

2) Идентифицированы 25 стабильных бактериальных коротких РНК (бкРНК), картированных на обоих тяжах оперонов р-белков (смысловых и антисмысловых), что расширяет возможности регуляции экспрессии.

3) Для лидерной области альфа- и LlO-оперонов р-белков Е. coli, найдены смысловые бкРНК, соответствующие районам псевдоузла и мотива «kink-turn», соответственно, которые участвуют в регуляции трансляции.

4) Методом ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ) найдена повышенная представленность концевого участка цистрона EF-G, что указывает на наличие активного внутреннего промотора s/r-оперона Е. coli.

5) Повышенная представленность межцистрона S12-S7 ^г-оперона Е. coli определяется его предполагаемым участием в регуляции трансляции по типу обратной связи белком S7.

6) Изменение паттерна представленности цистронов альфа- и .s/r-оперонов мутантного штамма Е. coli рпр" указывает на участие деградосом в определении уровня представленности различных участков str мРНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Khavrullina G.A.. Raabe С.А., Ное С.Н., Becker К., Reinhardt R., Tang Т.Н., Rozhdestvensky T.S., Kopylov А.М. Transcription analysis and small non-protein coding RNAs associated with bacterial ribosomal protein operons. // Current Medicinal Chemistry. 2012. V. 19 (30). P. 5187-5198.

2. Головин А. В., Хайруллина Г. А.. Крааль Б., Копылов А. М. Идентификация нового РНК-белкового контакта в комплексе р- белка S7 с 3'- концевым фрагментом 16S рРНК Е. coll // Acta Naturae. 2012. Т. 4. № 4 (15). С. 18-25.

3. Kopylov A., Khairulina G.. Rozhdestvensky Т., Golovin A. Interface inhibitors of macromolecular interactions - ribosomal paradigm for creation of novel antibiotics. // Current Medicinal Chemistry. 2012. V.19. P. 97.

4. Kopylov A., Khavrullina G.. Raabe C., Tang Т.Н., Rozhdestvensky Т., Golovin A. Regulation of expression of bacterial str-operon through RNA structure and RNA-protein interactions. // FEBS Journal. From single molecule to system biology. Spain. Seville. 2012. V. 279 (Suppl. 1). P. 508.

5. Хайруллина Г.А.. Копылов A.M. Разработка подходов к мультиплексному анализу стрептомициновых оперонов бактерий методом ПЦР в реальном времени. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. Россия. Москва. 2012. Т. 14. №2 (Прил. 1). С. 53-54.

6. Kopylov A., Khairullina G.. Golovin.A., Tang Т., Rozhdestvensky Т. Regulation of expression of bacterial str-operon during ribosomal biogenesis. // The EMBO Meeting. France. Nice. 2012. P.4.

7. Kopylov A., Khairullina G.. Yuminova A., Reshetnikov R., Zavyalova E., Golovin.A. Nucleic acids - protein E.coli recognition: what we have learned from aptamers. // The EMBO Meeting. Austria. Vienna. 2011. P.54.

8. Хайруллина Г.А. Метод анализа движения рибосом по матрице. // Материалы докладов XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» МГУ. Россия. Москва. 2011. СЛ.

9. Хайруллина Г.А. Инверсия стабильности цистронов S7 и S12 в полицистронной мРНК стрептомицинового оперона. // Сборник тезисов 14 международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Россия. Пущино. 2010. Т. 2. С. 193-194.

10. Хайруллина Г.А. Инверсия стабильности цистронов S7 и S12 в полицистронной мРНК стрептомицинового оперона. // Материалы докладов XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» МГУ. Россия. Москва. 2010. С.1.

11. Хайруллина Г.А. Количественные параметры регуляции экспрессии стрептомицинового оперона. // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» МГУ. Россия. Москва. 2009. С. 1.

12. Хайруллина Г.А.. Головин А.В., Спиридонова В.А. RT-PCR в исследованиях регуляции дифференцированной экспрессии генов стрептомицинового оперона. // Сборник тезисов Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы». Россия. Белгород. 2008. С. 163-164.

Заказ № 456-1/03/2013 Подписано в печать 20.03.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:zak@cfr.rll

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хайруллина, Гузель Анваровна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ФАКУЛЬТЕТ БИОИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ

На правах рукописи

04201355629 Хайруллина Гузель Анваровна

ИЗУЧЕНИЕ ВАРИАЦИЙ В ОРГАНИЗАЦИИ И ЭКСПРЕССИИ ОПЕРОНОВ РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ

ЭУБАКТЕРИЙ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

(Специальность 03.01.03 - молекулярная биология)

Научный руководитель: доктор химических наук профессор А.М. Копылов

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ.....................................................................................................2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................6

Расположение генов р-белков на хромосоме Е. coli.....................................................6

Организация генов р-белков в оперонах.......................................................................6

Механизмы регуляции синтеза р-белков Е. coli...........................................................9

Сравненительный анализ четырех р-оперонов.........................................................13

Сравнение структуры оперонов...................................................................................13

Спектиномициновый оперон.....................................................................................13

Стрептомициновый оперон.......................................................................................14

Альфа-оперон..............................................................................................................16

Ы0(Ь12)-оперон.........................................................................................................18

Сравнение участков связывания р-белков S4, S8, S7 и комплекса L10(L12)4 с рРНК

..........................................................................................................................................19

Связывание р-белка S8 с рРНК.................................................................................19

Связывание р-белка S7 с рРНК.................................................................................21

Участок связывания р-белка S4 с 16S рРНК............................................................23

Связывание р-белка L10(L12) с рРНК......................................................................26

Участки связывания р-белков S4, S8, S7 и комплекса L10(L12)4 с мРНК.................30

Связывание р-белка S8 с мРНК.................................................................................30

Связывание р-белка S7 с мРНК.................................................................................34

Связывание р-белка S4 с мРНК.................................................................................39

Связывание комплекса р-белков L10(L12)4 с мРНК...............................................40

Сравнение уровня синтеза белков оперонов в условиях регуляции............................42

Уровень синтеза белков ярс-оперона........................................................................42

Уровень синтеза белков яГг-перона...........................................................................45

Уровень синтеза белков альфа-оперона...................................................................47

Предполагаемый механизм регуляции трансляции оперонов....................................48

Предполагаемый механизм регуляции трансляции spc-оперона...........................48

Предполагаемый механизм регуляции трансляции sir-оперона............................51

Предполагаемый механизм регуляции трансляции альфа-оперона......................52

Предполагаемый механизм регуляции трансляции Ы0(Ь12)-оперона................54

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................56

Филогения исследуемых эубактерий............................................................................56

Организация генов р- белков в оперонах разных бактерий....................................57

E.coli.............................................................................................................................57

V.cholerae.....................................................................................................................59

S. aureus.......................................................................................................................61

Регуляция трансляции р-оперонов...............................................................................64

Короткие РНК бактерий (бкРНК), картированные в оперонах р-белков............65

S15 и S1 опероны........................................................................................................69

L28 оперон...................................................................................................................70

S6 оперон.....................................................................................................................71

S16 оперон...................................................................................................................72

Lll оперон...................................................................................................................73

L20/thrS оперон...........................................................................................................74

L10(L12) оперон..........................................................................................................74

SlO оперон...................................................................................................................76

Spc-onepoH...................................................................................................................76

L10(L12)-onepoH (семейство ncR 55)........................................................................77

Альфа-оперон..............................................................................................................80

Sfr-оперон....................................................................................................................82

Сравнительный анализ str - и альфа оперонов эволюционно различных

микроорганизмов.............................................................................................................83

Сравнительный анализ str - оперонов различных микроорганизмов.........................84

Сравнительный анализ альфа - оперонов различных микроорганизмов...................86

Регуляция синтеза str- и альфа-оперонов на уровне мРНК.....................................88

Регуляция синтеза str- и альфа-оперонов в нормальных условиях............................88

Регуляция синтеза íír-оперона..................................................................................93

Регуляция синтеза альфа-оперона............................................................................96

Регуляция синтеза str- и альфа-оперонов в различных условиях...............................99

Регуляция экспрессии 5?г-оперона в клетках Е. coli, мутантных по

полинуклеотидфосфорилазе......................................................................................99

Регуляция экспрессии альфа-оперона в клетках Е. coli, мутантных по

полинуклеотидфосфорилазе....................................................................................101

Регуляция экспрессии sír-оперона Е. coli в стрессовых условиях (минимальная

среда).........................................................................................................................103

Регуляция экспрессии альфа-оперона Е. coli в стрессовых условиях

(минимальная среда)................................................................................................105

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...............................................................108

Используемые штаммы микроорганизмов и реактивы.........................................108

Штаммы:....................................................................................................................108

Праймеры:.................................................................................................................108

Препараты:................................................................................................................110

Используемые методы...................................................................................................111

Условия выращивания микроорганизмов...................................................................111

На твердой среде.......................................................................................................111

В жидкой среде.........................................................................................................111

Выделение нуклеиновых кислот из клеток E.coli.................................................111

Выделение тотальной РНК из клеток E.coli..........................................................112

Получение кДНК с помощью реакции обратной транскрипции с препаратов РНК

....................................................................................................................................112

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР РВ)............................113

Нозерн-блот гибридизация......................................................................................114

ВЫВОДЫ.........................................................................................................115

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................116

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

- оперон - стрептомициновый оперон яре -оперон - спектиномициновый оперон р-белки - рибосомные белки бкРНК- бактериальные короткие РНК

кмРНК- бактериальные короткие РНК комплементарные мРНК

п.н. - пара нуклеотидов;

н.о. - нуклеотидные остатки;

кДа - килодальтон;

РСА - Рентгеноструктурный анализ;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПААГ - полиакриламидный гель;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия;

ТРИС - 2-амино-2-(гидрокси-метил)-1,3-пропандиол;

ИПТГ - изопропилтиогалактозид;

ДМСО - диметилсульфоксид;

БТТ - дитиотреитол;

ТЕМЕД - М^Г^Г^Г-тетраметилзтилендиамин;

ВВЕДЕНИЕ

На экспоненциальной стадии рост клеток Е. coli прямо зависит от количества рибосом на клетку [1] и масса рибосом составляет примерно 30 - 40% от массы клетки. Для биогенеза рибосом клетка тратит существенную часть ресурсов. Рибосома - сложно организованный супрамолекулярный комплекс, состоящий из трех молекул рРНК и 55 молекул белка; 21 белок и одна 16S рРНК входят в состав малой 30S субчастицы.

При биогенезе прокариотических 70S рибосом происходит раздельная сборка двух субчастиц. Определяющую роль в самосборке 30S субчастицы играют белки, которые первыми связываются с 16S рРНК (S4, S7, S8, S15), что приводит к формированию так называемого «структурного остова» малой субчастицы.

Синтез многих рибосомных (р-) белков сбалансирован с рРНК. Саито и гамииегами [2] был предложен механизм регуляции по типу обратной связи, когда избыток р-белка ингибирует трансляцию собственной мРНК. Это справедливо, в том числе и для стрептомицинового (sir-) оперона, регулируемого белком S7 (рис. 2).

Основные работы по изучению механизмов регуляции экспрессии sir-onepoHa были проведены для Е. coli, данные для других бактерий немногочисленны. Аллен [3] сравнил регуляцию для двух оперонов Vibrio cholerae. Оказалось, что механизмы не универсальны не только для типа, но даже для класса гамма протеобактерий; например, отличаются для Pseudomonas aeruginosa. Сравнение структуры генов L5 для Р. aeruginosa и Е. coli показало, что потенциальные участки взаимодействия с S8 спектиномицинового (spc-) оперона P. aeruginosa и Е. coli не могут иметь однотипную вторичную структуру [3].

В связи с этим, исследование универсальности механизмов регуляции экспрессии оперонов р-белков эубактерий, особенно для ключевых белков сборки рибосом, является крайне актуальной задачей современной молекулярной биологии. Наиболее интересны опероны, кодирующие белки, которые первыми связываются с 16S рРНК, а именно S4 и S7 из альфа- и .sfr-оперонов Е. coli, соответственно.

В задачу данной работы входило сравнительное изучение организации и экспрессии оперонов р-белков эубактерий, в частности Е. coli и ряда патогенов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Расположение генов р-белков на хромосоме Е. coli

Все 53 гена р-белков были картированы более 20 лет назад. Более половины из них располагаются в классическом str-spc локусе, где они организованы в четыре оперона, содержащих от 4 до 12 генов. Остальные собраны в кластеры от одного до четырех генов, и находятся в разных частях хромосомы (рис. 28). В кластерах генов стрептомицинового локуса совпадает направление транскрипции - «против хода часовой стрелки». Аналогичная ситуация наблюдается и для рифампицинового локуса, где все гены транскрибируются в направлении «по ходу часовой стрелки». Гены рибосомных белков активно транскрибируются одновременно с процессом репликации, таким образом подобное расположение кластеров генов понижает вероятность столкновения ДНК- и РНК-полимераз.

Гены как р-белков, так и рРНК расположены на хромосоме не случайным образом. Большая часть генов р-белков располагаются не дальше шестой части от ориджина репликации. И всего лишь три гена находятся в отдалении от точки начала синтеза ДНК. Расположение кластеров генов р-белков в непосредственной близости к точке начала репликации может быть объяснено тем, что клетке важно синтезировать большое количество р-белков и рРНК в процессе активного роста и деления. Подобные клетки будут содержать множественные репликативные вилки, а значит, много копий этих генов.

Организация генов р-белков в оперонах

Одним из простейших способов скоординировать синтез различных р-белков -собрать их гены в одну или несколько транскрипционных единиц. Подобное решение обеспечивало бы, с одной стороны, возможность эквимолярного синтеза р белков, а с другой стороны позволило бы упростить регуляцию такого большого числа генов.

Для Е. coli мы наблюдаем проявление этих процессов в реальности. Существуют несколько транскрипционных единиц, содержащих гены р-белков -оперонов. Опероны варьируют как по длине, так и по содержанию в них цистронов.

Есть короткие опероны, содержащие в себе только 1 цистрон, такие как, например, Б20 или Ь25, и существуют полицистронные, содержащие больше десяти цистронов, например Б10 (состоит из 11 цистронов) или спектиномициновый оперон (12 цистронов). Помимо генов р-белков некоторые опероны содержат гены белков, участвующих в процессе транскрипции и трансляции. Например, оперон Б21 помимо генов р-белка Б21 содержит ген ДНК-праймазы и ген сигма-субъединицы РНК-полимеразы (рис. 1).

spc

RpmJ

S10

' S10 L3 L4 L23 L2 RdsJ RdIC RpID RplW RplB

S19 L22 S3 L16 L29 S171 RpsS RplV RpsG RplP RpmC RpsQ

thrS/L20/pheS

thrS thrS

IF31 35 t infC RpmLRpIT

T 1 fl Г" L10 U2 RNA pol RNA pol t

RplT ™L ' RpoB RpoC

L28

u L28 L331 RpmB RpmG

rpsl- rpsG fus tufA

S1

iU

cmk

S1

cmk

RpsA

Lll

L11 Ц. RpIK RplA

OzГ ^ _S6MSSbJS18 L9 t

RpsFssbRpiR Rpll

S20

rpsT

S15

SIS I RpsO pnp

pnp ,

L32 m^1

rpmF

S16

rimM TrmD L19 t

фвР rimM trrnD

L13

L13 S9 t

ф!М фэ!

S21

f-f- DNA primase sigma

фБУ dnaG

фоО

L25 ^

L25 t

rplY

L34

p>L34mpAi фшН mpA

Cp Iе- J2 ^ EF-Ts ,

фэВ tst

Рис. 1. Организация генов р-белков и оперонная структура Е. coli.

Названия генов подписаны снизу, сверху - названия белков. Регуляторный белок подчеркнут; регулируемые цистроны выделены черным, не регулируемые - белым, частично регулируемые - серым. Р -промоторы, t-терминаторы.

Еще одним дополнительным моментом в сложности организации оперонов является то, что они могут содержать внутренние промоторы разной силы [4, 5]. Для LlO-оперона E.coli сначала было показано существование промотора перед первым геном оперона - rplJ [6]. Предполагается, что в результате работы этого промотора получается транскрипт, состоящий из четырех цистронов: rplJ-rplL-rpoB-rpoC. Через несколько лет [7, 8] был найден внутренний промотор перед геном бета-субъединицы РНК-полимеразы, позволяющий получить более короткий транскрипт: гроВ-гроС. Возможно, такой механизм понадобился для регуляции количества молекул РНК-полимеразы в клетке. Также имеются некоторые доказательства в пользу того, что гены гроВ-гроС могут транскрибироваться отдельно [9].

Некоторые р-опероны частично котранскрибируются с ранее лежащих промоторов. Транскрипция LlO-оперона может происходить как с L10 промотора [10], так и с промотора, левее расположеного Lll-оперона [11]. Имеются аналогичные данные и для альфа-опрона, который экспрессируется со своего промотора и с промотора спектиномицинового (spc-) оперона.

Нахождение генов в одной транскрипционной единице, позволяет координировать синтез с каждого цистрона внутри оперона. Как известно, р-белки в составе рибосом нужны в эквимолярных количествах (за исключением белка L7/L12); можно предположить, что такая организация оперонов направлена на сохранения подобного соотношения. С этой точки зрения следует, что синтез факторов трансляции и РНК-полимеразы сцеплен с трансляцией рибосомальных оперонов. Но подвергается не настолько строгому контролю, как синтез р-белков [12, 13]. Измерения количества белков для фактора элонгации Tu и ß и субъединиц РНК-полимеразы выявили отличие в их количестве по сравнению с уровнем синтеза р-белков. Для ß и ßN субъединиц РНК-полимеразы, как было упомянуто ранее, имеется собственный внутренний промотор.

Механизмы регуляции синтеза р-белков Е. coli

Малая субчастица рибосомы Е. coli состоит из одной молекулы рРНК и 21

молекул белков. Большая субчастица, в свою очередь состоит из двух молекул РНК и

34 белками. Все гены, кодирующие рибосомные составляющие, были картированы на

хромосоме Е. coli. Более того, геном Е. coli полностью секвенирован. Все гены р-белков

9

транскрибируются в составе транскрипционных единиц, называемых оперонами. Гены р-белков и рРНК Е. coli представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Гены рибосомных белков и рРНК Е. coli

Позиция

Позиция на на карте,

Белок Ген карте, мин. Оперон Белок Ген мин. оперон

Белки 30S субчастицы Белки 50S субчастицы

S1 rpsA 21 SI LI rplA 90 L11

S2 rpsB 4 S2 L2 rplB 73 S10

S3 rpsC 73 SIO L3 ф1С 73 S10

S4 rpsD 73 Alpha LA rplD 73 S10

S5 rpsE 73 Spc L5 ф1Е 73 аре

S6 rpsF 95 S6 L6 фШ 73 ipc

S7 rpsG 73 Str L9 фЮ 96 S6

S8 rpsH 73 Spc LIO ф1Н 90 L10

S9 rpsl 69 L13 LH ф11 90 LH

S10 rpsJ 73 SIO L7/L12' ф1Ь 90 LIO

Sil rpsK 73 Alpha L13 ф1М 69 L13

S12 rpsL 73 Str L14 ф1И 73 spc

S13 rpsM 73 Alpha L15 фЮ 73 tpc

S14 rpsN 73 spc LI 6 ф1Р 73 S10

S15 rpsO 69 S15 LI 7 грЮ 73 Alpha

S16 rpsP 57 TrmD LI 8 73 spc

S17 rpsQ 73 SIO LI 9 фШ 57 trmD

S18 rpsR 96 S6 L20 ф1Т 37 L20

S19 rpsS 73 SIO L21 ф1и 69 Не определено

S20 фвТ 0 S20 L22 ф1У 73 S10

S21 rpsU 67 S21 L23 rpiw 73 S10

L24 ф1Х 73 Spc

L25 ф1У 48 L25

L27 фтА 69 Не определено

L28 фтВ 82 L28

рРНК U9 фтС 73 S10

— rrnA 87 — L30 фпШ 73 spc

— rrnB 90 — L31 фтЕ 89 Не определено

— rrnC 85 — L32 фтБ 23 L32

— rrnD 72 — L33 фтв 82 L28

— rrnE 90 — L34 rpmH 83 L34

— rrnF 57 — L35 rpml 37 L20

— rrnG 5 — L36 rpmJ 73 Spc

Замечено, что некоторые опероны помимо генов р-белков содержат гены других белков, связанных с транскрипцией или трансляцией. Многие гены р-белков и белков-субчастиц РНК-полимераз могут мутировать с приобретением устойчивости данного штамма кишечной палочки к антибиотикам. Именами этих антибиотиков стали называть опероны, содержащие гены подобных белков. К примеру, при определенных мутациях в генах белков S12, S5, ß-субчастицы РНК-полимеразы, у клеток Е. coli появляется устойчивость к стрептомицину [14, 15], спектиномицину [16, 17, 18] и рифампицину [8, 19], соответственно. И в зависимости от того, ген какого из этих белков закодирован в опероне, такое название он и получил.

Взаимодействия между р-белками обычно не однозначны из-за множества промоторов и возможности продолжения транскрипции между смежными оперонами. К при