Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследования структуры рибосомных белков из Thermus thermophilus

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследования структуры рибосомных белков из Thermus thermophilus"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

'' На правах рукописи

¡РАК АЛЕКСЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

УДК: 577. 113.5

ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ ИЗ ТИегтш ЛегторИНш

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.Б. Гарбер

Официальные оппоненты: доктор биологических наук М.А. Несмеянова кандидат биологических наук В.В. Асеев

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.В. Овчинникова РАН

Защита состоится " 7 " СШре^Я—__ 1998 г. в ¡О час. I

заседании Специализированного ученого совета Д.053.05.70 при Московско государственном университете им. М.В. Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологическо! факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

В.Н. Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение механизма биосинтеза белка является одной из важнейших задач молекулярной биологии. Для детального понимания механизма работы белоксинтезирующего аппарата клетки необходимо знание структурной организации его компонентов. Центральная роль в биосинтезе белка отведена рибосоме. Наиболее изученными являются бактериальные рибосомы и, в первую очередь, рибосомы ич Escherichia coli. Все белки из рибосом E.coh (их свыше 50) были выделены и охарактеризованы с помощью различных физико-химических методов, определены их первичные структуры. Однако попытки кристаллизации рибосомных белков из E.coh и исследования структуры этих белков методами ЯМР-спектроскопии натолкнулись на серьезные трудности. С восьмидесятых годов начались исследования рибосомных белков из двух других микроорганизмов - термофильных эубактерий: Bacillus steurolhermophihn и Thermits ihcrmophilus, белки из которых более стабильны и поэтому более перспективны для структурных исследований. В группе структурных исследований аппарата трансляции Института белка РАН ведется работа по кристаллизации и структурным исследованиям белков из T.thcrmophilus. Все рибосомные белки из этого микроорганизма были выделены и охарактеризованы. Белки S6, S8 и LI были закристаллизованы и их прост ране i венные структуры были определены. Клонирование и секвенирование генов рибосомных белков из T.lhermoplalus и получение суперпродуцентов )ТИ\ белков открыло в последние юлы новые возможности для структурных исследований. Недавно были определены <ристаллографические структуры белков 1.22 и L30. Ведутся также исследования структуры 1яда белков в растворе методами ЯМР-спектроскопии.

Настоящая работа является частью комплексных исследований структуры эибосомных белков из Т.Ihcrmoplulns и направлена па определение первичной стру.ччры 1яда белков путем клонирования и секвенирования соответствующих генов, получение птаммов-суперпродуцентов, разработку процедур выделения белков, продуцированных в слетках E.coli, кристаллизацию этих белков и их структурные исследования меюдами хлптеновской кристаллографии и ЯМР-спектроскопии

Цель работы - inyieiine сфуктуры рибосомных белков из ¡'.ihcrmophdus Основные задачи работы: клонирование генов белков L35 и S16, определение |уклеотидной последовательности генов rpsl6, rpU, гр!29 и гр!35, получение ниаммов-уперпродуцентов для белков SI0, S14, 1,4, 1.5. L29, L35, поиск условий крисюл.пшцни

''чков SI5 и L4, подбор и оптимизация условий для исследования структуры белков S15 и S19 в растворе.

Научная новизна и практическая ценность работы. Клонированы гены рибосомных белков L35 и SI6 из T.lhermophilus, определена нуклеотидная последовательность генов rps!6, rpU, гр!29 и гр/3.5, кодирующих белки S16, L4, L29 и L35 соответственно Получены штаммы-суперпродуцснты для белков S10, S14, L4, L5, L29, L35, оптимизированы условия суперпродукции этих белков. Разработаны процедуры выделения белков из суперпродуцентов. Найдены условия кристаллизации белка S15 и проведены поиски условий кристаллизации для белка L4. Оптимизированы условия для исследования структуры белков S15 и S19 в растворе методами ЯМР-спектроскопии. Получены предварительные ЯМР-спектры для белков S10, S14, S15, S16, S18, S19, L4, L23, L29, свидетельствующие о том, что структуры белков S15, S16, S18, S19 и L4 могут быть исследованы в растворе. Выделены в препаративных количествах изотонически меченые белки S15, SI9 и L4 для определения структуры этих белков в растворе. При непосредственном участии автора определена структура рибосомного белка S15 в растворе. Оказалось, что в составе белка S15 отсутствует p-структура и он является полностью а-спиральным РНК-связывающим белком. Оказалось также, что тип укладки молекулы белка S15 уникален, структурная гомология не обнаружена ни с одним из известных белков. Показана возможность определения в растворе структуры белка S15 в комплексе со специфичным фрагментом 16S рРНК. Методические разработки по приготовлению белковых образцов для структурных исследований методами ЯМР-спектроскопии представляют практический интерес для специалистов, работающих в данной области.

Структура диссертации: Диссертация состоит из трех частей: 1) обзор литературы, 2) экспериментальная часть, 3) результаты и их обсуждение. Работа завершается выводами и списком цитируемой литературы (253 ссылка). Работу иллюстрирует 2Г рисунка и таблиц. Общий объем диссертации страниц.

Апробация работы и публикации. Результаты диссертации докладывались на Шестой Международной конференции по кристаллизации биологических макромолекул (Хиросима, Япония, 1995), на Международной конференции по структурам и функциям рибосом ( Виктория, Канада, 1995), на Международной конференции "Термофиллы-96" (Атенс, США, 1996), на Семнадцатой Международной конференции "Магнитный резонанс в биологических системах" (Кейстон, США, 1996), на Международной конференции исследователей из стран Балтии, центральной Европы и бывшего Советского Союза (Прага,

(Талберг, Швеция, 1997), на Международной конференции "Узнавание биологических молекул" (Спецес, Греция, 1997), на ежегодных научных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1994, 1995, 1996, 1997). По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. В банк аминокислотных последовательностей белков помещены первичные структуры белков 516, Ь4,Ь29 и Ь35.

Обзор литературы посвящен методам оптимизации условий экспрессии генов рекомбинантных белков в бактериальных клетках, проблемам связанным с образованием телец включения и с выделением и ренатурацией белков из телец включения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава I. Клонирование и секвенирование генов рибосомных белков.

1. Определение первичной структуры белков Ь4 и Ь29.

Определение первичной структуры белков Ь4 и Ь29 проводили секвенированием соответствующих генов гр14 и гр129. Эти гены входят в состав 570 оперона (рис. 1), ранее клонированного В.В. Высоцкой из ТлИсгторкИт в плазмиду. Ген гр14 секвенировали с помощью олигонуклеотидов, синтезированных на основании известных нуклеотидных последовательностей фланкирующих его генов гр13 и гр!23. Ген гр129 секвенировался подобным образом со стороны генов гр!16 и rp.il7. Нуклеотидную последовательность транслировали в последовательность аминокислот и сравнивали с известными последовательностями гомологичных рибосомных белков из различных организмов (рис. 2, 3).

S10 (73 )

Р »" _____(t)

-он и ~ю-оа—HZZXK3-

-SIO L3 Ы 1.23 1.2 SI9 L22 S3 LI6 L29SI7

* I t=3i

1 Kb

I-1

Рис. 1. Схема SIO оперона из E.coli (Zengel & Lindhal, 1994, Progress in Nuleic Acids Res. and Mol. Biol., 47, 331-370). Ген регулятора трансляции этого оперона выделен жирной линией. Заштрихованы гены рибосомных белков L4 и L29. Стрелками указаны направления секвенирования генов белков L4 и L29 из S10 оперона T.thermophilus.

КЬ4_ _ТНЕТН МК

_ВАСЗТ МР

КЕ,4_ _ВАСЗи МР

_ЕССЫ -м

ВЬ4_ _НАЕ1И -м

ИЬ4_ _АСТАС -м

ВЪ4_ _УЕВРЭ -м

ВЗЛ_ _МСВМС -м

КЬ4 МУССЙ -м

" - ------— оД

УС1РУЬЗРЗСЕКСУААСЬРДЕ1|Р>ШИ(2\

кмоэ----йМзЕатб^вга^;»'

\ZGAN-----АдааЕпб! гакзйу

кпдрс----—' —^

КЕЙС-----ф^с

Щнкт

'кисшкр

Е1»§'«МСР131

1 I АУД

'эс

■нет

|№С яййС ■ВАС

Вкку

и

£

«АСУМЯ 1есгЫетм

Щ ей

¡ЕЕ1ЛИД(Ейб

УИт

СС£

!К-|ЕС-|ЕС-

¡ЕЕ-!С-|спс

ВС—£81

КЕЦ

рвг^-Шга Ьс

Як

щ

■и 1а

гд в»

■тс

I

Рис. 2. Гомология аминокислотной последовательности рибосомного белка Ь4 из Т.1ИегторИИиз с известными последовательностями рибосомных белков 1А из других организмов. Более темным цветом выделены наиболее консервативные аминокислотные остатки.

_29_ТНЕТН ---VRKCLlii/ KI|F1

_29_EiCST

.29_EfiCSU .29_ECCLI .29_HAEIN — --тГй -----.. iACD i'-j T 14 сит) Hr гаци

.29JOKS — EKGVI

,29_HELFY -----? ОТ*" i Kl CKEII i

.29 THEMA — NYgCI

,29_МЕТиД —KAri^Eb; G^M

29_CHLTR MGAKKNLLP^f' EK;SE

REKKRpLME^ KALKEgLFN*

LNLLRjCFN

AE VNLLqjCEK

LMABbCFN" 1 Г HAKKfliLFB

EEKKTylME

velkbJilke

RCNKKÄLFA"

FSASIl^S-CNHffgn

'E-NTAW«:

ki-KTG-ili------"

.4 Д ' "

fft

M&sgjc-cirara

VKLKm'i'is-NraElil F^I^Mdi/K-NTSIijiL'

^ ft Sgfl^LCNKWKTHCFSr

^RRCNA—

... ji«OäS

М^-Ф®-----

" ''Г®-----

'К>7ЙТТ-ЙСТ-----

«NAHYSSSVE-

¿«'^RZelgirr-

«S Щ

^ttejKRMTSC-

ilgKC^KGRVHG-

67 66 66 63 63 63 66 66 70 72

Рис. 3. Гомология аминокислотной последовательности рибосомного белка Ь29 из Т.ЛегторИНш с известными последовательностями рибосомных белков Ь29 из других организмов. Более темным цветом выделены наиболее консервативные аминокислотные остатки.

2. Клонирование и секвенирование генов белков L35 и S16.

Ген белка L35 расположен в одноименном опероне и фланкирован на 5'-конце геном фактора инициации IF-3 и на 3'-конце геном рибосомного белка L20. (рис. 4)

IF-3 (37')

Р1 t1 t2 (Р)

4=HKZ]-H-h-

IF-3 L35 L20 PheS I * J PCR fr.

Рис. 4. Схема IF-3 оперона из Ecoli (Zengel & Lindhai, 1994, Progress in Nuleic Acids Res. and Mol. Bio!., 47, 331-370). На схеме показан размер клонированного ПЦР фрагмента ДНК 1F-3 оперона из T.lhermophilus. Ниже стрелками указаны направления секвенирования фрагмента.

На основании известных N-концевых аминокислотных последовательностей белков L35 (Sedelnikova et а!., 1994, Biochemie, 76, 440-451) и L20 из T.thermophilus (Т. Холи, неопубликованные данные) были синтезированы олигонуклеотиды, принимая в расчет преимущественное использование кодонов в генах рибосомных белков из T.thermophilus (Yakhnin et al., 1990, Nucleic.Acids Res., 18, 3659). Олигонуклеотиды были вырожденными, поэтому условия ПЦР требовали оптимизации в целях уменьшения неспецифического связывания праймеров. В присутствии 2.5 мМ MgCb было получено три фрагмента ДНК:

1 Kb

210, 240 и 260 п.о. Каждый из полученных фрагментов секвенировался и велись поиски гомологии дедуцированной аминокислотной последовательности с известными последовательностями рибосомного белка Ь35. Таким образом, фрагмент 240 п.о. был идентифицирован, как фрагмент, содержащий ген белка Ь35 (рис. 5).

tñSGKWAMKTGKH

¡GSGKLKBS^YTS S¡GKGGFKHKHfiNLH ASGGEKRKCSHI. iASGKFKHKQ'NIFI SjvKKN-LIKBGS'FK, JIJEAN-<jIKHKH^FKS V^AVGNKKISRRI^FR^

,\|ssgkxlbhi|sk:

ri'GKEIsCKGRKFVfíAKFEAEF

I "■ i „.« t- » v

I—A., RHK c^lñj^Qvi iHHTIAHS

>A_. ss ra '

rr}a<RGSSI^HFSÍVAI<

pCgSCWIASPMKK

iSPCÜFKF

ILTR;$TTrv,b

T^FKRIA^NAFK;

KLI R№ К O IAC VAC KSF ISI ERT-

KIÍ

sn

PYE---

CNIK— ANIK—

ra---

PYA---

FYF---

CRA---

RLR---

FYL---

PY----

PYL---

64

65 65 64

64

65 64

64

65

64

65

Рис. 5. Гомология аминокислотной последовательности рибосомного белка Ь35 из ТЛкегторЫЫ с известными последовательностями рибосомных белков Ь35 из других организмов. Более темным цветом выделены наиболее консервативные аминокислотные

В Е.соИ ген белка Б16 грз16 находится в начале 576 оперона, за ним следует ген белка размером 21 кДа, ген белка ТгшБ и ген рибосомного белка Ь19 (рис. 6).

1 Kb

S16 (57')

^sc

S16 21k TrmD

К

ни-

L19

PCR fr.

Рис. 6. Схема S16 оперона из E.coli (Zengel & Lindhal, 1994, Progress in Nuleic Acids Res. and Mol. Biol., 47, 331-370). На схеме показан размер клонированного ПЦР фрагмента ДНК из T.íhermophilus и направление его секвенирования.

На основании известных N-концевых аминокислотных последовательностей белков из T.íhermophilus, S16 (Елисейкина и др., Биохимия 60, 1315-1323; Tsiboli et al., 1994, Eur.J.Biochem. 226, 169-177) и L19 (Т. Холи, неопубликованные данные), были синтезированы олигонуклеотиды, принимая в расчет преимущественное использование

остатки.

одонов в генах рибосомных белков из Т. ¡ИегторИНи.ч. Оптимизированные условия ПЦР юзволили получить фрагмент ДНК размером 2 т.п.о., содержащий ген грт/б. Определение [ервичной структуры гена выявило высокую гомологию белка с известными рибосомными »елками 816. (рис. 7)

S36JIHEIH

si6_E?csa

S16_E01I S16JBEIN S16HELW В16_СЖЛ R16_CYBm R16_(XCSI В16_К»ГО В16_1ШС

'ис. 7. Гомология аминокислотной последовательности рибосомного белка S16 из '.thermophilus с известными последовательностями рибосомных белков S16 из других рганизмов. Более темным цветом выделены наиболее консервативные аминокислотные статки.

'лава II. Суперэкспрессия генов рибосомных белков из T.thermophilus в клетках E.coli.

Получение штаммов-суперпродуцентов для рибосомных белков представляет собой остаточно сложную задачу, поскольку большинство рибосомных белков имеют изогочку э1) в районе 9-11. Значительное "перепроизводство" рибосомного белка в клетке приводит к ерьезным повреждениям в аппаратах репликации, транскрипции и трансляции, т.к. эти елки могут образовывать неспецифические комплексы со всеми клеточными компонентами уклеиновой природы.

Для суперэкспрессии генов использовали систему Штудиера (Studier et al., 1990, in 1ethods ofEnzymol. 185, 60-89) на основе промотора бактериофага Т7. В качестве штамма-озяина использовались клетки BL21(DE3), B834(DE3), AD494(DE3), JM109(DE3). Векторы ля экспрессии конструировались на основе плазмид рЕТПс и рЕТЗс. Гены клонировали с спользованием рестриктаз Nde I и ВагаН I.

1. Приготовление экспрессирующих векторов.

На основании известной нуклеотидной последовательности генов синтезировались лигонуклеотиды с введением точечных замен для формирования сайтов узнавания естриктаз: Nde I для начала гена (в сайте содержится инициирующий кодон ATG) и ВатН 1

IFKTTP-] ВЖР-

¡жнгеЕсщ |нааи

;ISFP--M>] FIKE—К-FINE—S-iriKE—S—Y ¡ЩПКЕ-Т-JMÏ-T-

jP^OrFKEiBEC— ESSOGBWEIWÎÎÏW-jMVNKM----------

|м|дад----------

cgi--------------

fcrem-----------

|?i!kîi-----------

jP№i4iro---------

IMHC3I»EHS------

'w;E\EKIP®CS---

88 69 £2 62

76

77 77 79 62 65

рестриктаз: Ше I для начала гена (в сайте содержится инициирующий кодон АТО) и Нат\\ позади стоп-кодона. С этими праймерами в полимеразиой цепной реакции (ПЦР), где 1 качестве матрицы использовалась хромосомная ДНК ТлЬегторЫ1ш, получали фрагмен ДНК, содержащий нужный ген. Затем фрагмент ДНК обрабатывали рестриктазами 1 клонировали в обработанную теми же ферментами плазмиду (рис. 8).

у*»'

chromosomal DNA

T.thermoptlllus

T7lac I clo/ilng sites

aene x .chromosomal у DNA

_ BanHI

Nctol BamH I

0«n» X

PCR product

Рис. 8. Схема приготовления экспрессирующих векторов для суперпродукции белков.

Скрининг рекомбинантов обычно проводили в клетках ХЬ-1 рестриктным анализом или ПЦР. Готовые конструкции секвенировались со специфичных или универсальных (Т7-ргото1ог и 11-1егтта!ог) праймеров для выявления возможных мутаций, а затем трансформировали в штаммы для экспрессии, несущие в хромосоме внедренный под контроль индуцибельного промотора ген Т7 РНК-полимеразы. Чтобы снизить токсичный эффект влияния рекомбинантных белков на физиологию клетки, для клонирования обычнс использовали вектор рЕТ11с. В эту плазмиду введен дополнительный сильный терминатор, что обеспечивает возможность осуществлять регуляцию экспрессии и избежать конститутивного синтеза рекомбинантного белка. В случае белка БЮ использовали вектор рЕТЗс. Белок БЮ при продукции в клетках /;.со/; формировал тельца включения. Субклонирование гена грхЮ в вектор рЕТЗс, позволяющий некоторый фоновый синтез в

гтсутствии индуктора Т7-промотора, вело к увеличению выхода белка в растворимой форме, (ругой подход к решению этой проблемы состоял в экспрессии гена в клетках AD494(DE3), обеспечивающих копродукцию тиоредоксина с гена trxA в отсутствии его природного осстановителя, ген которого, ¡rxli, был полностью инактивирован в хромосоме введением ранспозонов. Использование штамма AD494(DE3) в сочетании с копродукцией юлекулярных шаперонов GroELS, обеспеченной котрансформацией штамма-хозяина ополнителыгой плазмидой pGroELS, позволило увеличить выход рекомбинантного белка 10 в растворимой форме.

'2. Выращивание клеток штаммов-суперпродуцентов.

[Слетки штаммов-суперпродуцентов выращивались в различных богатых и инимальных средах з широком диапазоне температур, от 20"С до 37°С. Обычно клеткам озволяли расти до оптической плотности, соответствующей середине логарифмической азы кривой роста. В каждом отдельном случае эти значения определяли экспериментально, ни варьировали от 0 6 o.e. (для суперпродуцента белка S14) до 1.5 o.e. (для белка L4). ндукцию осуществляли добавлением IPTG, обычно 0.1-0.5 мМ, после чего клетки растили в ;чение времени, необходимого для достижения максимальной продукции белка, по не злее трех чгсов. Уровень синтеза белков оценивали электрофорезом в полиакриламидном :ле в присутствии додецил сульфата натрия ПААГ/SDS. Продукция белков составляла инимум 10% (для белка S14) и максимум более 50% (для L4) от суммарного клеточного :лка.

Oii.it показывает, что использование свежетрансформированных клеток увеличивает ювень продукции белков в сравнении с использованием трансформированных клеток, rrapui хранились в присутствии глицерина при -70"С.

тага Ш. Выделение и тестирование суперпродуцированных рибосомных белков.

I. Выделение суперпродуцированных в КсоИ белков в препаративных количествах.

Все исследуемые нами рибосомныс белки, кроме белка S10, были получены в .•творимой форме и для их выделения в неденатурирующих условиях использовали ¡работанную ранее в нашей лаборатории процедуру выделения с небольшими неиениями. Стандартная схема выделения белка выглядит так. Клетки осаждали зкоскоростным центрифуг ированием и разрушали ультразвуком, растиранием с оксидом 1юминия или под давлением во Френч-Прессе. Осветлённый клеточный лимт прогревали

5-15 мин. при 50-60 °С в буфере с 0,8 М LiCI и 150 мМ MgCl2, денатурированные белю E.coli убирали центрифугированием. Температуру и время прогрева лизата подбирали каждом отдельном случае, так как белки отличаются по способности агрегировать npi высоких температурах. Оказалось, что даже в присутствии 1,2 М LiCI некоторые белки и T.thermophilus частично соосаждаются с денатурированными белками E.coli. Использовани высокой концентрация MgCl2, предложенное нами, значительно увеличивает выхо, очищенного белка, т.к., вероятно, предотвращает неспецифическое связывание белков нуклеиновыми кислотами в клеточном экстракте. Суперпродуцированные белки и T.thermophilus очищали на колонке с CM-Sepharose или CM-Toyopearl. Для некоторых белко использовали дополнительные стадии очистки с применением Heparin-Sepharose, DEAE Sepharose, гидрофобной хроматографии на Phenyl-Sepharose и Butyl-Toyopearl, и rent фильтрации. Полученные белки далее анализировали электрофорезом в ПААГ/SDS (рис. S и методом масс-спектрометрии.

Чистота препаратов по данным масс-спектрометрии равнялась 97-99"/ Предложенные системы суперпродукции белков T.thermophilus в клетках E.coli позволяю выделять от 15 мг (S14) до 500 мг (L4) очищенного белка из 1 литра богатой культуры, чт дает возможность использовать эти системы для изотопического мечения белтов в условия ограничения субстрата.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 9. Анализ методом электрофореза в ПААГ/SDS стадий выделения рибосомного бел S15 из клеток суперпродуцента. 1. Клетки BL21/pll-15 до индукции. 2. Клетки BL21/pll-через два часа после индукции. 3. Клеточный экстракт после осаждения мембранш белков. 4. Клеточный экстракт после прогрева и осаждения белков E.coli. 5. Осадок пос центрифугирования прогретого осветленного клеточного лизата. 6. Белки, не связавшиеся CM-Toyopearl. 7. Чистый белок, полученный после хроматографии на СМ-Тоуореа 8. Маркеры молекулярного веса (самый легкий белок 14.4 кДа).

2. Тестирование суперпродуцированных рибосомных белков.

Для идентификации суперпродуцированных белков использовали метод двумерного электрофореза, а также определяли N-концевые аминокислотные последовательности рекомбинантных белков.

Для ряда белков была определена точная молекулярная масса методом масс-спектрометрии с целью выявления возможных посттрансляционных модификаций. Почти все исследуемые белки были охарактеризованы методами кругового дихроизма, что позволило оценить содержание элементов вторичной структуры в белке и сравнить с данными для гомологичных белков из E.coli. Почти во всех случаях спектры кругового дихроизма белков из T.ihermophilus были похожи на спектры соответствующих белков из E.coli, обычно белки из термофила выглядели более структурированными.

Глава IV. Кристаллизация рнбосомного белка S15.

Кристаллы белка S15 T.ihermophilus получали методом диффузии паров в висячей капле. Получены две формы кристаллов. Кристаллы в форме вытянутых линз (Рис. 10а) получали в каплях с концентрацией белка 20 мг мл"1 с 40 мМ Tris, рН7.5, и 15% от насыщения (NHt)2 S04. В капле присутствовал Ыа-цитрат в концентрации 250 мМ. Капли уравновешивали против незабуференного 38% от насыщения (NH4)2 S04, при 20°С.

Рис. 10. Фотографии кристаллов рибосомного белка S15 из T.ihermophilus. На фото слева кристалл в форме вытянутой линзы, справа - вторая форма кристаллов.

Кристаллы достигали размеров 600 мкм в длину и 180 мкм в диаметре. К сожалению, хотя кристаллы и отражали рентгеновские лучи с разрешением около 3 А рефлексы на рентгенограмме выглядели разупорядоченно, по-видимому, из-за слоистой структуры кристаллов. Была получена еще одна кристаллическая форма (рис. 106) в каплях с концентрацией белка 12 мг мл"' с 50 мМ Tris, рН7.5, и 20% от насыщения (NR,)2 S04. В капле также присутствовал Ыа-цитрат в концентрации 250 мМ Капли уравновешивали против 23% от насыщения (NH4)2 S04 с 50 мМ Tris, рН7.5, при 4°С. Кристаллы второй формы отражали рентгеновские лучи с разрешением 2.3 А, они принадлежат к пространственной группе P2i2i2| с параметрами элементарной ячейки а-32.2 А, в=58.8 A, с=95.5 Â; параметр Метьюза - Vm=2.25 А'/Да; время жизни кристаллов в рентгеновском пучке ~ 1 сутки. К сожалению, данные кристаллы имели форму тонких пластинок и все наши усилия найти условия, чтобы вырастить кристаллы толще 20 мкм не привели к желаемому результату. Поэтому было решено определять структуру белка S15 в растворе.

Глава IV. Подготовка белковых препаратов для ЯМР и результаты предварительных структурных исследований.

1. Изотопическое мечение белков.

Меченис белков проводили при выращивании клеток суперпродуцентов на минимальных синтетических средах, где источники азота, или азота и углерода (при двойном мечении) заменяли на их изотопические аналоги. Для мечения белков но азоту клетки выращивали в модифицированной среде М9, где в качестве источника азота к 1 л среды добавляли 1 г l5NH4CI и специально подобранный состав микроэлементов. Сбалансированность микроэлементов в минимальной среде позволила приблизить продукцию белков к уровню, получаемому в богатой среде LB. Для получения препаратов белков, меченых изотопически по азоту и углероду, был разработан состав среды с применением меченого n'5-c" ISOGRO препарата, представляющего собой высушенные и измельченные клетки простейших микроорганизмов, выращенных на бедных меченых средах. В среду кроме 0.8 г N15, С13 ISOGRO, в качестве источников азота и углерода на 1 литр культуры добавляли 0.8 г 15NH4C1 и 1.4 г С13 глюкозы.

2. Подбор условий для приготовления белковых препаратов и для проведения ЯМР экспериментов.

Размер белка является основным, но не единственным требованием к белку, структура которого может бьпь определена методами ЯМР. Для белков с молекулярным весом менее 8 кДа редко применяют изотопическое мечение, поскольку их структура может быть решена и с немечеными препаратами белка. В случае белков размером более 8 кДа, часто требуется изотопическое мечение. В настоящее время трехмерная структура белка рутинно решается для белков с молекулярным весом менее 18-20 кДа. Но иногда даже маленькие белки являются сложными для исследования их структур в растворе. Главной причиной неудач является агрегация белка. Варьирование условий эксперимента (концентрация белка, солевые условия, растворители, рН и температура) иногда может помочь в приготовлении образцов, не содержащих агрегатов, и в получении ЯМР-спектров.

2.1. Солевые условия.

В ЯМР экспериментах используются высококонцентированные препараты белка (1-3 мМ), часто эта концентрация является пределом растворимости белков в условиях низкой ионной силы. Применение органических растворителей недопустимымо. Удовлетворительной для ЯМР экспериментов считается концентрация соли в образце 50-200 мМ, не более. Наиболее часто используется NaCl. Наш первый объект, белок S15, в присутствии 200 мМ NaCl растворялся до концентрации не более 0.8 мМ. Мы заменили NaCl на LiCl, известный хаотроп, и смогли повысить концентрацию белка до 3 мМ. В дальнейшем, во всех ЯМР образцах мы использовали LiCl.

2.2. Влияние значения рН на результаты ЯМР исследований.

ЯМР-спектрометр регистрирует сигналы об обмене амидных протонов. Этот обмен

ускоряется с увеличением рН, а когда скорость обмена слишком высока, спектрометр не успевает регистрировать сигналы об обмене амидных протонов. Идеальным значением рН для получения спектров является 4-5. Рибосомные белки, как правило, имеют значения изоэлектрических точек 9-11; при низких значениях рН растворимость этих белков увеличивается. Обычно в препаратах использовали 50 мМ фосфатного буфера, рН 4.4. Подбирая такие нефизиологические значения рН, всегда нужно следить за возможными изменениями структурированности молекулы в сравнении с нативными условиями. Мы следили за этим с помощью ЯМР и КД спектров. Оказалось, что белок S19 становится

заметно менее структурированным при рН ниже 6. Поэтому в ЯМР экспериментах по определению структуры белка S19 мы использовали рН 6.5.

2.3. Варьирование температуры в исследованиях структуры термофильных белков в растворе.

Подобный компромисс должен быть найден и относительно температуры. Обмен амидных протонов лучше регистрируется при более высоких температурах, поэтому ЯМР-спектры лучше записывать при 30°С, чем при 20°С. С другой стороны, при 30°С белки обычно менее стабильны, чем при 20°С. В наших экспериментах использовалась температура 30°С, что не приводило к заметному ухудшению стабильности белков из экстремального термофила T.lhermophilus, оптимальная температура роста которого около 75°С. При проведении экспериментов с белком S19 мы столкнулись с протеазной примесью в образце, которая не удалялась ни одним из использованных нами методов очистки. Белок выделялся из клеток E.coli, и мы предположили, что присутствующая в препарате протеаза должна быть активна в пределах мезофильных температур. Проведение ЯМР-экспериментов при температуре 50°С позволило инактивировать протеазную активность и удержать белок стабильным в растворе в течение недель.

3. Результаты предварительных структурных исследований.

Предварительные одномерные ЯМР спектры белков S16 и S18 были получены с использованием немеченых белков, выделенных из рибосом T.thermophilus. Спектры свидетельствуют о том, что молекулы находятся в растворе в стабильном свернутом состоянии. Белок S18, по-видимому, полностью или почти полностью а-спиральный, а белок S16 содержит Р-структуру. Оба белка способны растворяться в высокой концентрации и являются кандидатами для исследования их структуры в растворе методами. ЯМР-спектроскопии.

Белки L4, L29, S10 и S14 были выделены из штаммов-суперпродуцентов. Препараты эгих белков тестировались в ЯМР-экспериментах. Одномерные спектры белков L29 и S10 свидетельствуют о том, что эти белки агрегируют в растворе даже с максимально допустимыми концентрациями солей.. Возможно, без рибосомных белков соседей и рРНК, с которыми они связываются, их молекулы частично денатурированы. Таким образом, исследование структуры изолированных белков L29 и S10 в растворе не представляется

озможным. Может быть в дальнейшем, введение в образцы специфически связывающихся с елками фрагментов РНК повлияет на сворачивание белков и снимет проблемы агрегации.

Одномерный спектр белка Б14 свидетельствует о том, что белок существует в астворе в виде олигомеров. Эксперименты по гель-фильтрации подтвердили наше редположение и показали присутствие ди-, три-, и тетрамеров белка. Белок 514 состоит из 1 аминокислотного остатка, четыре из которых являются цистеинами. Возможно, бразование межмолекулярных дисульфидных мостиков является причиной наблюдаемой лигомеризации.

Предварительные спектры белка Ь4 свидетельствуют о том, что это глобулярный елок а/р типа. Однако, из-за размеров белка (23.5 кДа) решение его структуры методами [МР требует, во-первых, дополнительного подбора условий для введения, кроме Ы15 и С13, ополнительного мечения - дейтерирования, а во-вторых, поиска новых подходов и методов ля расчета структуры крупной молекулы. Нами начаты эксперименты по кристаллизации того белка. В случае получения пригодных к рентгеноструктурному анализу кристаллов, труктуру данного белка легче будет определить кристаллографическими методами.

га

не. 11. 'Н-|5ЫНЗОС спектр рибосомного белка 519 из Т.ЛегторМих.

4. Результаты предварительных структурных исследований рибосомного белка 519. Выделенный из штамма-суперпродуцента изотопически меченый рибосомный белок 19 из ТлЪегторЫ1т был исследован в ЯМР экспериментах в концентрации 1.5 мМ в бразце с 200 мМ ЫС1 и 50 мМ фосфатного буфера, рН 6.5. Спектры записывались при 50"С.

Были записаны трехмерные (3D) HCCH-TOCSY и HCCH-COSY, TOCSY-HSQC и NOF.S" HSQC спектры на спектрометре 600 MHz (рис. 11 ). Полученные данные свидетельствуют том, что S19 - компактный глобулярный, преимущественно a-спиральный белок, настоящее время ведется обработка полученных данных и расчет структуры белка.

Глава V. Определение пространственной структуры белка SIS из T.thermophilus растворе.

S15 - один из сердцевинных РНК-связывающих рибосомных белков. Для белка S15 i li.coli было показано, что он является репрессором трансляции SI5-pnp оперона. экспериментах in vivo нами было показано, что белок S15 из T.thermophilus также способс репрессировать трансляцию S15-pnp оперона E.coli. Для белка S15 из T.thermophilus бьи определено место связывания на 16S рРНК. Белок SI5 из T.thermophilus состоит из S аминокислотных остатков (10.5 кДа), поэтому его структура может быть определе! методами ЯМР-спектроскопии.

Все препараты белка были приготовлены из штамма суперпродуцента. Первые 2 гомоядерные исследования немеченого образца показали хорошее распределение NO пиков, типичное для структурированных белков. Однако, из дальнейших исследовани нескольких пересекающихся (неразрешающихся) пиков резонансов стало ясно, что дл структурного анализа молекулы необходимы препараты изотопически меченого белк; Примерно 55 из 85 амидных кросс-пиков хорошо разрешились на 'H-,5N HSQC спектра (рис. 12).

"ш

!и»>

йш

ч»

о.

Рис. 12. 'н-15ы HSQI спектр рибосомног белка S15 и T.thermophilus.

Ч

(от)

Уширения пиков в некоторых начальных ЯМР спектрах могли быть результатом лигомеризации белка в ЯМР образце. Чтобы проверить это, мы провели эксперимент по :ль-фильтрации в условиях ЯМР образца. Белок элюировался в виде мономеров, что видетельствует об отсутствии его агрегации в растворе.

не. 13. Структура рибосоммого белка S15 из Рис. 14. 26 рассчитанных структур

thermophilus. рибосомного белка S15. Усредненная

структура выделена жирной линией.

В экспериментах было рассчитано 50 структур, 26 из них и усредненная приведены на исунке (рис. 14). Структура белка S15 из T.lhermophilus представляет собой единственный -спиральный домен (рис. 13). На N-конце молекулы присутствуют несколько гструктурированных аминокислотных остатков, за ними следует спираль I (остатки К4-14), петля I (A15-S23), спираль II (Т24-К23), петля II (V44-G54), спираль III (L55-R64) и гираль IV (L65-Q70). Аминокислотные остатки Q70-D73 формируют классический поворот грвого типа, за ним следует последняя спираль V (E75-G85). Полипептидная цепь шершается несколькими неструктурированными остатками на С-конце. В нашей структуре -концевая спираль I неплотно прилегает к основной части молекулы, хотя на обеих

спиралях I и II гидрофобные остатки обращены навстречу друг другу и способны формировать гидрофобные контакты между спиралями.

N-конец молекулы , содержащий спирали I и И, - это наименее консервативная часть молекулы. Обращенная вовнутрь гидрофобного ядра поверхность спирали II образована консервативными гидрофобными остатками, в отличие от гидрофобной, но не консервативной поверхности, обращенной к спирали I. За длинной спиралью II пептидная цепь образует наименее хорошо разрешенный район петли II, четыре из одиннадцати остатков которой представлены гистидинами. Три из этих гистидинов консервативны и обнаружены почти во всех известных последовательностях белка S15 из разных организмов. Еще несколько аминокислотных остатков в этой петле являются консервативными.. Спираль III - наиболее хорошо разрешенный район в структуре. Внутренняя часть спирали III, обращенная к спирали II, представлена консервативными остатками. Классическая спиральная структура прерывается на R64, где начинается спираль IV Зш- типа, заканчивающаяся поворотом первого типа, за которым следует заключительная спираль V, начинающаяся как спираль 3]0. Спирали IV и V участвуют в образовании гидрофобного ядра и взаимодействуют друг с другом гидрофобными поверхностями.

Рис. 15. Распределение заряда на поверхности белка 515.Темным цветом выделены районы с преобладающим положительным зарядом, светлым - с преобладающим отрицательным зарядом. Структура слева приведена в той же ориентации, что и на рисунке 13, структура справа развернута на 180°.

Белок S15 имеет высокое содержание положительно заряженных остатков на поверхности молекулы. Продолжительная положительно заряженная область экспонирована

на спиралях III и IV (рис. 15). Этот район богат аргининами. Как было показано ранее для РНК-связывающих белков, аргинины играют важную роль в белок-РНК взаимодействиях. Противоположная N-концевая поверхность белка имеет гомогенное распределение заряда. Исследования РНК-связывающих белков показали возможность стэкинг-взаимодействия между неспаренными нуклеотидами РНК и экспонированными ароматическими остатками, например, гистидинами. На поверхности S15 также экспонированы ароматические остатки: петля II, расположенная в зоне преобладания положительного заряда, содержит четыре экспонированных остатка гистидина. Остатки К64, К47 и D48, расположенные на N-коице этой петли, абсолютно консервативны. Более того, позиция Н49 в большинстве известных последовательностей представлена ароматическим остатком, а в некоторых тоследоватсльностях заменена на положительно заряженный лизин. Все эти наблюдения оворят в пользу тою, что контактирующая с РНК поверхность может быть расположена в тетле II и на С-конпах спиралей 111 и IV.

В отличии от всех других рибосомных белков, структура которых была определена, Зелок S15 полностью га-спиральный. Данный тип укладки молекулы является уникальным и ie обнаружил структурной гомологии ни с одной из известных белковых структур, а-Гпиральные элементы структуры более распространены в ДНК-связывающих белках, хотя пвестны структуры двух РНК-связывающих белков, четырехспирального ColEl Rop и фгинип-богатого пептида HIV Rev , которые, как и SI5, узнают специфические фрагменты 5НК.

Таким образом, с нашим участием была определена структура рибосомного белка 515 из T.thermophtlux и обнаружена первая полностью а-спиральная укладка рибосомного 'НК-связывающего белка.

выводы

1. Клонированы гены рибосомных белков L35 и S16 из T.thermophilus.

2. Определена нуклеотидная последовательность генов рибосомных белков L4, L29, L35 и S16 из T.thermophilus.

3. Получены штаммы-суперпродуценты рибосомных белков L4, L5, L29, L35, S10 и S14 из T.thermophilus.

4. Разработаны процедуры выделения суперпродуцированных белков L4, L5, L29, L35, S10, SI 4, S15hS19h белки выделены в препаративных количествах.

5. Получены и охарактеризованы кристаллы рибосомного белка S15 из T.thermophilus.

6. Охарактеризованы структуры белков L4, L29, S10, S14, S16, S18 и S19 из T.thermophilus в растворе методами ЯМР-спектроскопии.

7. Приготовлены изотопически меченые препараты рибосомного белка S19 и! T.thermophilus, которые были использованы для получения данных, необходимых для расчета структуры этого белка в растворе.

8. При непосредственном участии автора определена структура рибосомного белка S15 из T.thermophilus методами ЯМР-спектроскопии. Показано, что S15 - первый полностью а-спиральный рибосомный белок из всех изученных к настоящему времени.

9. Найдены условия для исследования структуры белка S15 в комплексе с фрагментом рРНК в растворе методами ЯМР-спектроскопии.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Berglund, A. Rak, A. Serganov, M. Garber and T. Hard. Solution structure of the ribosomal RNA-binding protein S15 from Thermus thcrmophilus. Nature Struct. Biol.,Vol. 4, 1 (1997), 2023.

2. Alexander Serganov, Alexey Rak, Maria Garber, Joseph Reinbolt, Bernard Ehresmann, Chantal Ehresmann, Marianne Grunberg-Manago & Claude Portier. Ribosomal protein S15 from Thermus thermophilus: cloning, sequencing, overexpression of the gene and RNA binding features of the protein. Eur. J. Biochem., 246 (1997), 291-300.

3. Natalia L. Davydova, Alexey V. Rak, Olga 1. Gryaznova, Anders Liljas, Bengt-Harald Jonsson, Helena Berglund, Torleif Hard, Maria B. Garber. Preliminary NMR studies of Thermus thermophilus ribosomal protein S19 overproduced in Escherichia coli. FEES Letters, 415(2) (1997), 155-159.

4. Garber M., Davydova, N., Eliscikina, I., Fomenkova, N., Gryaznova, O., Gryshkovskaya, I., Nevskaya, N., Nikonov, S., Rak, A., Sedelnikova, S., Serganov, A., Shcherbakov, D.. Tishchenko, S., Zheltcnosova, J., and Lilias, A., Aevarsson, A., Al-Karadaghi, S. Crystallization

and structural studies of components of the protein-synthesizing system from Thermus thermophilic. J. Cryst. Growth. 168 (1996), 301-307.

5. Garber, M., Avliyakulov, N., Gongadze, G., Gryaznova, O., Davydova, N., Eliseikina, I., Ossina, N.. Sedclnikova, S., Serganov, A., Shikaeva, O., Tishchenco, S., Vysotskaya V., Liljas, A., Jonson, B-H., Kem, D., Ehresmann В., Ehresmann C., Reinbolt, J., Portier, C. Ribosomal proteins from Thermus thermophilus. Abstract book. Frontiers in translation. Victoria (Canada), May 20-25, 1995, p. 101.

6. Garber, M., Davydova, N., Eliseikina, I., Fomenkova, N., Gryaznova, O., Gryshkovskaya, I., Nevskaya, N.. Rak, A., Sedclnikova, S., Serganov, A., Shcherbakov, D., Tishchenco, S., Vysotskaya, V., Zheltonosova, J., Liljas A., Aevarsson, A., Al-Karadaghi, S. Crystallization and structural studies of components of the protein-synthesising system from Thermus thermophilus. Collected abstracts, ICCBM-6, Hiroshima (Japan), November 12-17, 1995, p. 164.

7. Garber, M., Avliyakulov, N., Davydova, N., Eliseikina, I., Fomenkova, N., Gongadze, G., Gryaznova, O., Gryshkovskaya, I., Meshcheryakov, V., Nevskaya, N., Nikonov, S., Nikulin, A., Rak, A., Serganov, A., Shcherbakov, D., TishchenKo, S., Vysotskaya, V., Jonsson, B.-H., Liljas, A., Aevarsson, A., Al-Karadaghi, S. Purification, crystallization and structural studies of ribosomal proteins from Thermus thermophilus. Howard Hughes Medical Institute, Program and Abstracts of 1996 Meeting of International Research Scholars from the Baltics, Central Europe, and the Former Soviet Union, Prague (Czech Republic), June 23-26, 1996, p. 55.

8. Garber, M., Avliyakulov, N., Davidova, N., Eliseikina, I., Fomenkova, N., Gongadze, G., Gryaznova, O., Khairulina, A., Meshcheryakov, V., Nevskaya, N., Nikonov, S., Nikulin, A., Rak, A., Serganov, A., Shcherbacov, D., Tishchenco, S., Vysotskaya, V., Jonsson, B.-H., Al-Karadaghi, S., Runge, I., and Liljas, A. Purification, crystallization and structural studies of ribosomal proteins from Thermus thermophilus. Abstract book. Thermophiles '96. The Biology, Ecology, and Biotechnology of Thermophilic Microorganisms. Athens (USA), September 4-9, 1996, p.41.

9. Helena Berglund, Alexey Rak, Marina Garber and Torleif Hard. Structural studies of the

. ribosomal protein SI5. Thel7th International Conference on Magnetic Resonance in Biological

Systems. Keystone, Colorado (USA), August 18-23, 1996, p. 167.

10.Garber M., Davidova N., Eliseikina I., Fomenkova N., Gongadze G., Gryaznova O., Gryshkovskaya I, Meshcheryakov V., Fedorov R., Khairullina A., Nevskaya N., Nikonov S., Nikulin A., Rak A., Serganov A., Shcherbacov D., Tishchenko S., Vysotskaya V., Jonsson B.-H., Liljas A., A. Aevarsson, Al-Karadaghi S. H. Berglund, T. Hard, B.Ehresmann, Ch. Ehresmann, C.Portier. Ribosomal proteins from Thermus thermophilus: gene-cloning, crystallization, and structural studies. Structural Aspects of Protein Synthesis, Tallberg, September 17-20, 1997 (Sweden).

11.B банк данных EMBL (г. Кембридж) представлены нуклеотидные и аминокислотные последовательности генов и белков, определённые в настоящей работе