Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, кристаллизация и структурные исследования компонентов аппарата трансляции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, кристаллизация и структурные исследования компонентов аппарата трансляции"

р г Б од

1 7 ОПТ Ьэо

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БЕЛКА

На правах рукописи УДК 577.217

ГАРБЕР Мария Борисовна

ВЫДЕЛЕНИЕ , КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ И СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КОМПОНЕНТОВ АППАРАТА ТРАНСЛЯЦИИ

03.00.03 - Молекулярная биология

Диссертация

в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино, Московская область ■ 1996

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор физико-математических наук, профессор Н. С. Андреева Институт молекулярной биологии им В. А. Энгельгардта РАН доктор химических наук, академик РАН А. А. Богданов

Химический факультет Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова

доктор химических наук И. Л. Куранова

Институт кристаллографии имени А. В. Шубникова РАН

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт Биохимии имени А. Н. Баха Российской Академии Наук

Защита состоится *><> " ОНуГМ^Я- 1996 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.053.05.70 при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу : 119899 Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультету МГУ.

Диссертация в виде научного доклада разослана ■ елнТл!^1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук / В. Н. Каграманов

I. ВВЕДЕНИЕ

Зо всех живых клетках биосинтез белка происходит в рибосомах. Хроме рибосом в этот процесс вовлечено множество различных сомпоненгов: тРНК, мРНК, аминоацил-тРНК-синтетазы, ряд жстворимых белковых факторов. Понимание механизма белкового :интеза на молекулярном уровне невозможно без знания юлекулярной структуры компонентов белок-синтезирующего .ппарата. Единственный метод, с помощью которого структура :рупных белков и рибонуклеопротеидов может быть определена с томарным разрешением, это метод рентгеноструктурного анализа, (олгос время применение этого метода для структурных сследований рибосом, рибосомных белков, белковых факторов ранслядии и многих аминоацил-тРНК-синтетаз было невозможно з-за трудностей в получении высокоупорядоченных крупных ристаллов этих объектов. Перелом произошел в конце 70-х - начале 0-х годов , когда в лабораторную практику начали вводиться икроорганизмы, обитающие в экстремальных условиях среды, и в ервую очередь, термофилы. Белки и нуклеиновые кислоты из 1КИХ микроорганизмов, благодаря их повышенной стабильности, ристаллизуются гораздо легче и обычно образуют кристаллы учшего качества чем аналогичные макромолекулы из мезофильных рганизмов. Работа по выделению, кристаллизации и структурным ^следованиям компонентов аппарата трансляции из грам-грицательной экстремально термофильной эубактерии Ткегтив \ermophilus, ведущаяся в течение 15 лет в Институте белка РАН, >1ла и остается актуальной и приоритетной.

Цель настоящей работы - определение пространственной руктуры компонентов белок-синтезирующей системы.

В задачи исследования входило:

- разработка методов выделения и кристаллизации различны компонентов белок-синтезирующей системы и ТлЬегторНИив;

- участие в определении пространственной структур] закристаллизованных объектов методо рентгеноструктурного анализа.

При выполнении настоящей работы получен ряд новы приоритетных результатов: разработана схема одновременног выделения различных компонентов аппарата трансляции и биомассы ТлкегторЫ1из\ впервые получены пригодные структурным исследованиям трехмерные кристаллы 70Б рибосом ЗОБ рибосомных субчастиц; выделены в неденатурирующи условиях и охарактеризованы свыше тридцати рибосомных белко из Т-ЬкегторМЫв, двадцать шесть из них идентифицированы гомологичными белками из Е.соИ; получены пригодные рентгеноструктурному анализу кристаллы: рибосомных белков 88, Ы и Ь22, фактора элонгации О (ЕГ-й) в комплексе с ГДФ и свободной от нуклеотида форме, серил- и аспартил-тРНК-синтетаз; сотрудничестве с рядом кристаллографических групп пр непосредственном участии диссертанта определены с высоки разрешением пространственные структуры ЕГ-й (в двух формах аспартил-тРНК-синтетазы (АспРС) и рибосомных белков Ы и Э6.

Практическая ценность данной диссертационной работы, первую очередь, состоит в том, что экстремально-термофильны микроорганизм ТлкегторЫШэ был введен в лабораторную практик в нашей стране для выделения и кристаллизации различных белко! Было показано, что использование ТАкегторИНиа открывае перспективу для определения структуры рибосом и други компонентов аппарата трансляции методом рентгеноструктурно! анализа. Кроме того разработанная в диссертационной работе схел

дновременного выделения рибосом и большого числа белков из иомассы ТЛНегторНПив, а также выделенные препараты различных елков были использованы в ряде лабораторий для получения ригодных к рентгеноструктурному анализу белковых кристаллов. В астности, в Институт кристаллографии имени А. В. Шубникова АН передавались белковые фракции, содержащие каталазу и ирофосфатазу, которые после дополнительной очистки ¡¡пользовались сотрудниками этого института для кристаллизации определения пространственной структуры данных белков. В левский Институт молекулярной биологии передавались фракции, держащие различные аминоацил-тРНК-синтетазы для их очистки кристаллизации. В Институт молекулярной биологии РАН ;редавались полуочищенные препараты фенилаланил-тРНК-[нтетазы также для кристаллизации этого белка. Препараты ецифической эндонуклеазы рестрикции, термостабильной :тилазы и ДНК-полимеразы передавались в Институт »лекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН и в гститут прикладной микробиологии (Биопром), где после полнительной очистки эти ферменты использовались для генно-[женерных работ. Методические разработки по выделению и исталлизации белков, сделанные в ходе выполнения данной ссертационной работы, докладывались на семинарах и нференциях как у нас в стране, так и зарубежом. Эти разработки ли использованы рядом авторов, что отражено в цитировании.

Данная работа проводилась в течение длительного времени и в я принимали участие многие сотрудники Института белка РАН, а еже коллеги из других отечественных и зарубежных институтов, яовная часть представленных здесь результатов по выделению и металлизации белков и рибосом получена совместно с С. Ч. аларовым, И. А. Елисейкиной, Ю. М. Желтоносовой, Л. С. легниковой, С. Э. Седельниковой, С. В. Тищенко, С. Д. 1хановым, О. С. Шикаевой, В. А. Широковым, М. М. Юсуповым,

А. Д. Яремчук. Предварительные структурные исследованш полученных кристаллов в большинстве случаев делались 1 Институте белка РАН совместно с С. В. Никоновым и Н. П Фоменковой. Определение пространственных структур ЕЕ-0 ] рибосомных белков Эб и Ы проводилось совместно с сотрудникам] Института белка РАН Е. В. Бражниковым, Н. А. Невской, С. В Никоновым, Н. П. Фоменковой, Ю. Н. Чиргадзе и с сотрудникам] лаборатории профессора А. Лильяса в Лундском Университет (Лунд, Швеция) А. Аеварссоном, С. Аль Карадаги и Л. А Свенссоном. Работа по определению пространственной структур! аспартиловой тРНК-синтетазы делалась совместно с С. В Никоновым в сотрудничестве с лабораторией профессора Д. Мораса Институте молекулярной и клеточной биологии в Страсбург (Франция). Аминокислотные последовательности рибосомных белко определялись в сотрудничестве с Т. А. Мурановой (Пущински: филиал Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина : Ю. А. Овчинникова РАН), с Р. Амонсом (Лейденский Университет Нидерланды) и с Ж. Рейнболтом (Институт молекулярной клеточной биологии, Страсбург, Франция). Клонирование секвенирование и суперэкспрессия генов рибосомных белко проводились аспирантами и сотрудниками возглавляемой авторо] группы: Н. К. Авлиякуловым, В. С. Высоцкой, Н. Л. Давыдовой, С И. Грязновой, Н. К. Осиной, А. В. Раком, А. А. Сергановым, Д. I Щербаковым в сотрудничестве с лабораториями профессора Клод Портье (Институт физико-химической биологии, Париж, Франция профессора Б. Эресманна (Институт Молекулярной и клеточно биологии, Страсбург, Франция) и профессора Б.-Г. Джонссон (Умеасский университет, Умеа, Швеция). Вклад других соавторе отражен в публикациях по теме диссертации. Плодотворнс сотрудничество с французскими лабораториями было осуществлен благодаря помощи и участию профессора М. Грюнберг-Манаго. Все коллегам автор приносит благодарность за участие в совместны

заботах. Особую благодарность автор приносит академику А. С. Спирину, без постоянной поддержки которого данная работа не яогла бы проводиться. Работа выполнена при финансовой юддержке Российской академии наук, Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 93-04-21151 и 94-04-12046), Международного научного фонда (гранты МТУООО-МТУЗОО и ЛТИООО-МТЕЗОО), фонда американского Медицинского института [мени -Ховарда Хъюза (грант 75195-544703), Шведской академии гаук и Национального центра научных исследований Франции.

Выделение, кристаллизация и структурные исследования фактора элонгации G из T.thermophilus

'актор элонгации G (транслоказа) катализирует внутририбосомный ереход пептидил-тРНК вместе с кодоном мРНК из A-участка в Р-иасток (см. А. С. Спирин, 1984, Структура рибосом и биосинтез элка.). Место связывания EF-G на рибосоме было локализовано с омощью химических сшивок и иммунной электронной икроскопии. Было показано, что участок связывания EF-G ормируется, в основном, 50S субчастицей рибосомы в районе 7/Ы2-стержня. В этом же районе находятся участки связывания 1Я EF-Tu, фактора инициации 2 (IF-2) и фактора терминации 3 IF-3). EF-G связывается с рибосомой только в комплексе с ГТФ, т этом рибосома наводит ГТФазную активность на EF-G, а после [дролиза ГТФ комплекс EF-G с ГДФ теряет сродство к рибосоме.

EF-G - крупный мономерный белок с молекулярным весом :оло 80 кДа: 701 аминокислотный остаток в E.coli, 691 - в thermophilics (Ю. Овчинников, Ю. Алахов и др., 1982, FEBS Lett. 19, 130; A. Yakhnin et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 8863). В кариотических клетках аналогичную функцию выполняет фактор онгации 2 (EF-2), который несколько крупнее EF-G - около 95 кДа л. А. С. Спирин, 1984, Структура рибосом и биосинтез белка.).

1

Рис. 1. Кристаллы крупных триптических фрагментов фактора элонгации О и Е.соИ: а - кристаллы Ы-концевого фрагмента; б - кристаллы С-концевог фрагмента.

В конце 70-х годов, когда мы начали первые эксперименты п кристаллизации рибосом и ЕР-в, структурные исследовани, компонентов аппарата трансляции только начинались. В ряд лабораторий были получены кристаллы отдельных рибосомны белков, фактора элонгации. Ти (ЕГ-Ти) и некоторых аминоацш тРНК-синтетаз. Эти исследования продвигались очень медленно, основном, из-за трудностей с кристаллизацией и плохого качеств кристаллов. Большинство исследователей, и мы в том числ< пытались в то время кристаллизовать белки и рибосомы V.

Escherichia coli, т.к. эта бактерия являлась, да и сейчас является, ¡аиболее хорошо изученным и наиболее широко используемым в 1абораторной практике микроорганизмом. Наши попытки ткристаллизовать рибосомы из E.coli не дали никаких результатов. 1то касается EF-G, нам не удалось получить трехмерных кристаллов штактного белка, но мы смогли получить кристаллы крупных тротеолитических фрагментов EF-G (рис. 1), которые оказались, в тринципе,. пригодными для рентгеноструктурного анализа с эазрешением до 3.5 Ä [1, 2, З]1. К сожалению, время жизни этих кристаллов в пучке рентгеновских лучей составляло всего 4-5 часов, юсле чего дифракционное поле сужалось до 8.0 Ä.

Все наши попытки улучшить качество кристаллов были безрезультатны. В 1980 году мы решили изменить стратегию работы л перешли к выделению EF-G, а затем и других компонентов шпарата трансляции из экстремального термофила T.thermophiius. 3F-G из T.thermophiius был впервые выделен и охарактеризован в L978 году в Японии в лаборатории профессора Казиро (К. Arai, Y. Dta et al., 1978, Eur.J.Biochem. 92, 509; К. Arai, N. Arai et al., 1978, bid. 521; S. Nakamura et al., 1978, ibid. 533). Тогда же эти авторы толучили EF-G из T.thermophiius в форме микрокристаллов при !ысаливании его сульфатом аммония. В конце 1979 года штамм T.thermophiius НВ8 был любезно предоставлен нам профессором Гаиро Осима из Токийского Института наук о жизни (фирма У1ицубиси-Касеи, Япония) и мы приступили к выделению EF-G из »того микроорганизма.

Процедура выделения этого белка, описанная в работе Араи, )та и др. (1978), нас не удовлетворила из-за многостадийности и тевысокого выхода очищенного белка, поэтому мы решили эазработать новую методику. На первых стадиях очистки EF-G из

Полные ссылки на все наши работы приведены в конце диссертации.

T.íhermophilus мы использовали после небольшой модификацш процедуру, предложенную Леберманом с соавт. (R. Leberman et ¿1. 1980, Anal. Biochem. 104, 209) для выделения EF-Tu: хроматографш на ДЕАЕ-сефарозе (Фармация, Швеция) и затем гель-фильтрация hí ультрогеле АсА-44 (ЛКБ, Швеция). В модифицированной нам! процедуре (в отличие от процедуры Лебермана) клеточный экстрак' перед нанесением на колонку с ДЕАЕ-сефарозой освобождался oí рибосом с помощью высокоскоростного центрифугирования, чт< улучшало качество хроматографии и позволяло одновременно < факторами элонгации выделять рибосомы из биомассь T.thermophilus. После этой процедуры препарат EF-G с чистотой 50 70% дочищали на колонке с гидроксиаппатитом [4].

В дальнейшем препаративная хроматография безрибосомногс клеточного экстракта T.thermophilus на колонке с ДЕАЕ-сефарозо! стала использоваться нами также для выделения аминоацил-тРНК синтетаз, в результате чего была разработана весьма рациональна} схема разделения (см. рис. 2), которая позволяет одновременнс выделять рибосомы, факторы элонгации, аа-тРНК-синтетазы и ря; других белков из биомассы T.thermophilus [15]. Ценные препарать белков из T.thermophilus использовались как в нашем институте, та! и в ряде'других институтов в Москве, Киеве и Новосибирске.

Несвязоешиеся ¿елки

Номера фракций

Рис. 2. Разделение белков из биомассы T.thermophilus на ДЕАЕ-сефарозе.

Разработанная нами окончательная методика выделения ЕР-в озволяет получать интактный белок с чистотой не ниже 97-98% >ис. 3). Процедура очистки состоит из четырех стадий: 1,-онообменная хроматография на ДЕАЕ-сефарозе; 2.-гель-фильтрация а ультрогеле АсА-44; 3.-адсорбционная хроматография на здроксиаппатите; 4.-гидрофобная хроматография на Бутил -эеперле 650Э (Toyo-Soda, Япония).

с. 3. Гомогенность использовавшихся для кристаллизации, препаратов ЕГ-в ТЛНегторМ1и» (гель-электрофорез в присутствии вБв).

Использование этой методики позволяет из килограмма омассы выделить 20-30 мг электрофоретически гомогенного белка, я воспроизводимого получения хорошо кристаллизующихся епаратов ЕР-в очень важным оказалось введение последней 1дии очистки на гидрофобной смоле Бутил-Тоеперл 650Э.

Поиск условий кристаллизации показал, что хотя ЕР-в из Негторкйт в микрокристаллической форме легко может быть пучен при высаливании различными солями в широком диапазоне , получить кристаллы пригодные к рентгеноструктурному шизу удается только из концентрированных растворов белка (20-мг/мл) при низкой ионной силе (20 тМ имидазол-НС1) в узком

диапазоне рН от 7.8 до 8.2 [5]. На рисунке 4. представлен фотография кристалла EF-G.

Кристаллы принадлежат к ромбической системi пространственная группа Р212121, параметры элементарной ячейю а=76.2 A; b=107.6 А; с=117.1 А [6]. Число молекул в элементарнс ячейке, вычисленное на основании параметра Мэтьюза, Vm, равно • В независимой части ячейки находится одна молекула белка, рентгеновских лучах кристаллы дают равномерное поле отражений пределом разрешения 2.8 А.

Рис. 4. Кристалл фактора элонгации в из ТНеттив ¡кегторкИив.

Самая большая трудность при работе с этой кристалличеы формой состоит в том, что малейшие добавки каких-л] соединений к маточной жидкости, в которой кристаллы вырос приводят к растворению или растрескиванию кристаллов. ! кристаллы невозможно перенести из маточной жидкости в как

i6o другой раствор. Чтобы переносить кристаллы в капилляры и мачивать их в растворах тяжелоатомных соединений, мы изработали специальную процедуру сшивания этих кристаллов в ipax глютарового альдегида [33]. Поиск изоморфных [желоатомных производных вышеописанных кристаллов занял ¡сколько лет. Эта работа проводилась совместно с лабораторией руктурного анализа Института белка под руководством профессора >. Н. Чиргадзе. Свыше 40 различных соединений тяжелых эталлов было испробовано, но практически ни один реагент не дал :тинно изоморфных производных, что повидимому, связано с лсокой внутримолекулярной подвижностью белка. Отсутствие зроших изоморфных производных в течение долгого времени не 53воляло решить проблему фаз и получить интерпретируемые фты электронной плотности. Первый успех пришел благодаря ^пользованию дифракционных наборов низкого разрешения для шболее удачных производных. Были ипользованы два эоизводных на основе метилмеркурацетата (ММА) и одно эоизводное на основе гексахлорплатината калия. Ю. Н. Чиргадзе с »трудниками были получены карты электронной плотности с «решением около 8.0 А, на которых после применения метода ильтрации (A. Urzhumtsev, 1990, Acta cryst. 46, 114), молекула G-актора выделяется достаточно четко [17]. Эти данные позволили зидеть форму молекулы, её многодоменное • строение и даже эедварительно определить расположение N-концевого ГТФ-шзывающего домена. Позднее к этой работе подключилась также ведская кристаллографическая группа под руководством рофессора А. Лильяса в Лундском Университете. На базе мученных в группе Ю. Н. Чиргадзе результатов и новых лсококачественных наборов дифракционных данных для нативных шести тяжелоатомных изоморфных производных кристаллов ■анные были собраны в Лунде на пространственном детекторе ирмы Сименс) в 1992 году удалось получить карты электронной

плотности ЕР-О с разрешением 3.2 А. Эти данные позволш установить, что молекула состоит из пяти доменов. Структу] самого крупного ГТФ-связывающего домена была решена благода] совмещению его с хорошо изученным ГТФ-связывающим домене ЕР-Ти. ГТФ-связывающие домены двух факторов элонгац! гомологичны по первичной структуре и имеют сход» пространственное строение. Однако в ЕР-в ГТФ-связывающий дом( крупнее и имеет дополнительные структурные элементы (см.рис. 5'

О-дбмен в ЕР-Ти в-домен в ЕЕ-й

Рис. 5. Сравнение ГТФ-связывающих доменов в ЕР-Ти и ЕГ-в.

В 1994 году определение структуры ЕР-0 без связанно нуклеотида было завершено с разрешением 2.8 А и совместн статья была опубликована в ЕМВО J. [25]. На рис. 6. представле пространственная структура ЕР-в.

Молекула состоит из 5 доменов и имеет вытянутую фор: благодаря тому, что один из доменов (а именно, домен 4) необыч выдвинут по отношению к остальной части белка. Домены 1 и гомологичны по своей структуре двум доменам ЕР-Ти, хотя,как у; упоминалось выше, домен 1 (О-домен) существенно больше в-доме

Ти-фактора и имеет некий дополнительный субдомен (в1), который возможно играет роль нуклеотид-обменивающего фактора, которую в случае ЕР-Ти выполняет ТБ-фактор.

ас. 6. Структура ЕК-й.

Одновременно с нами в группе профессора Стейца в Йельском ниверситете (США) была определена пространственная структура Р-в в комплексе с ГДФ (<1. СглгогкотузИ ег а1., 1994, ЕМВО <7.13, 561) при разрешении 2.7 А. Нам недавно также удалось получить эупные кристаллы этого бинарного комплекса, используя в 1честве осадителя монометиловый эфир полиэтиленгликоля ШЕРЕОбооо» Пика). Дифракционные данные для таких шсталлов были собраны на синхротроне ЭЕЭУ (Гамбург) и руктура ЕР-в в комплексе с ГДФ была решена методом

молекулярного замещения с разрешением 2.4 Ä [35]. Было проведено тщательное сравнение "пустой" и связанной с ГДФ молекул EF-G [34]. В целом эти две формы очень похожи, хотя некоторые специфические изменения вблизи места связывания с ГТФ и в интерфейсе между доменами обнаружены. На основе пространственных структур EF-G и EF-Tu было проведено сравнение аминокислотных последовательностей всех ГТФаз,

взаимодействующих с рибосомой, и было обнаружено, что все эта белки содержат домены G и II. Возможно эти 2 домеш представляют собой консенсусный структурный блок, которые нужен для взаимодействия с рибосомой. Недавно в лаборатории Шпринцла в Германии (персональное сообщение) было показано, чт< EF-Tu, утративший домен III, т.е. состоящий всего из 2-х доменов, С и II, способен гидролизовать ГТФ в отсутствие рибосомы. Причел скорость гидролиза таким урезанным фактором выше, чем i нативного EF-Tu в комплексе с кирромицином. Таким образоа оказывается, что домены G и II составляют полную ГТФазу, а доме] III нужен для регуляции ГТФазной активности, чтобы он, проявлялась только при взаимодействии с рибосомой. Что касаетс: EF-Tu, его структура определена теперь уже в трех функциональны: состояниях: в бинарных комплексах с GDP (М. Kjeldgaard, J Nyborg, 1992, J.Mol.Biol. 223, 721) и с GDPNP ( М. Kjeldgaard et al. 1993, Structure 1, 35; H. Berchtold et al., 1993, Nature 365, 126) и тройственном комплексе с GDPNP и тРНК (Р. Nissen et al., 199Е Science 270, 1464). Неактивная ГДФ-форма EF-Tu, которая н связывает тРНК, гораздо менее компактна с некоей пустотой центре молекулы. Конформация активной ГТФ-формы EF-T отличается" тем, что все домены в молекуле сближены взаимодействуют между собой. При наложении структуры EF-Tu н структуру EF-G выяснилось, что расположение доменов в молекул EF-G без связанного нуклеотида или в комплексе с ГДФ совпадает

расположением доменов в ГТФ-форме EF-Tu. Причем это касается не только 2-х гомологичных доменов G и И, но и домена V, который пространственно занимает в молекуле EF-G то место, где в EF-Tu расположен домен III. Т. е. трехдоменная молекула EF-Tu неплохо вписывается в то пространство, которое в EF-G занимают домены I, [I и V (исключая G' субдомен). И между всеми этими доменами в EF-j (в ГДФ-форме или без нуклеотида) есть контакты аналогично тому, что наблюдается для ГТФ-формы EF-Tu. Возможно, что такое ;ходство конформаций для противоположных по составу бинарных комплексов EF-G и EF-Tu связано с тем, что эти два фактора в своей 1ктивной (ГТФ) форме взаимодействуют с рибосомой на фотивоположных стадиях элонгационного цикла : EF-Tu ¡заимодействует с посттранслокационной рибосомой, а EF-G - с фетранслокационной. Пока структура EF-G в комплексе с ГТФ не >ешена, мы не знаем какие конформационные изменения фоисходят в молекуле при связывании ГТФ и похожа ли активная |)орма EF-G на неактивную форму EF-Tu. Вполне возможно, что акое сходство будет обнаружено. Кроме доменов G и II, омологичных соответствующим доменам EF-Tu, в EF-G есть еще ;омены III, IV и V. Структура домена III, к сожалению, решена пока ¡е полностью из-за плохого качества карт электронной плотности в том участке. Мы пытались обойти эту трудность, сделав набор ифракционных данных при температуре -170°С. Однако нам не далось получить лучшего качества электронной плотности, [овидимому этот участок полипептидной цепи обладает большой одвижностью. Видны спирали и ß-структурные стренды, но эединения между ними пока не описаны. Домен V, С-концевой омен, имеет структуру характерную для многих РНК-связывающих елков, особенно близка его структура к структуре рибосомного елка S6, которая недавно была решена нашей же объединенной оссийско-шведской командой. Это ß-лист, состоящий из 4-х непараллельных ß-стрендов, и с одной стороны этого ß-листа

расположены 2 а-спирали ("расщепленный Р-а-Р мотив"). Возможно домен V каким-то образом взаимодействует с РНК. И наконец наиболее интересный и необычный домен IV. Этот домен выдвинут i как бы отстоит от остальной части молекулы. Из-за такогс расположения этого домена длина молекулы EF-G составляет 120 А Домен IV также состоит из 4-х стрендного Р-листа (смешанно« типа, т.к. есть и параллельные и антипараллельные стренды) и 2-5 а-спиралей. Эти элементы вторичной структуры образуют левую Р-а р суперспираль, что встречается в белках очень редко. По свое! структуре домен IV также похож на один из рибосомных белков, hi белок S5 (рис. 8). Кроме того он очень похож на один из домено) белка ДНК-гиразы (АТФаеа, которая суперспирализует ДНК), чт< было впервые отмечено А. Мурзиным (A. Murzin, 1995, Nat иг Struct. Biol. 2, 25).

Домен IV в EF-G

С-домен в Si

Рис. 7. Топология домеиа IV в EF-G в сравнении с рибосомным белком S5.

Наиболее интересные и функционально важные свойства молекулы EF-G были обнаружены после того как группа Ниборга в Дании определила структуру тройственного комплекса EF-I"u:GDPNP:tRNA (Р. Nissen et al., 1995, Science 270, 1464). Сказалось, что структура EF-G:GDP может быть почти полностью ;овмещена со структурой тройственного комплекса EF-Tu:GTP:tRNA рис. 8). При этом домен IV расположен пространственно там же где тходится антикодоновая часть тРНК в тройственном комплексе. Золее того, когда было посчитано по специальной программе >аспределение зарядов на поверхности EF-G, то оказалось, что юверхность одной стороны молекулы имеет сходство с юверхностью молекулы тРНК. Эта сторона молекулы EF-G не [росто отрицательно заряжна, но отрицательные заряды на ней в айоне домена IV расположены в виде полосок подобно полоскам юсфатных групп на поверхности тРНК. Эта сторона молекулы EF-G ак бы имитирует тРНК.

В тройственном комплексе EF-Tu:GDPNP:tRNA антикодон аходится на одном конце, а G-домен - на другом, и это позволяет ятикодону взаимодействовать с mRNA, которая связывается на 30S ибо со мной субъединице где-то в районе между платформой и 1авным телом субъединицы, тогда как сам EF-Tu связывается на 3S рибосомной субъединице в основании L7/L12 стержня, риблизительное расстояние между этими участками совпадает с шмером тройственного комплекса и с размером молекулы EF-:GDP. В составе тройственного комплекса акцепторный конец >НК расположен далеко от пептидил-трансферазного центра, >торый находится где-то в районе белка LI. Повидимому, после [ссоциации тРНК от EF-Tu ориентация аминоацильного конца лжна измениться, и он должен сдвинуться к птидилтрансферазному центру. После выхода EF-Tu:GDP из [босомы EF-G:GTP может связаться с тем же местом на 50S

ЕР-ТиЧЗОРМРаа-ОиЧА ЕР-ССОР

Рис. 8. Структуры (а) ЕР-Ти:ООРОТ.Ч1ША и (б) ЕР-в-МТ)?.

субчастице в основании 1>7/1Л.2 стержня. Как при этом буде расположен домен IV пока сказать трудно. Мы имеем сейчг структуру только для ГДФ-формы ЕР-в. Связывается же рибосомой ГТФ-форма ЕР-в, конформация фактора в которс повидщяому, должна чем-то отличаться от его конформации в ГД<3 форме и соответственно от конформации комплекса Е] Ти:вОРИР:ШЫА. Дальнейшая работа будет направлена I определение структуры ЕЕ-0:0БРМР из ТЛкегторНИиэ (ш гомологичных ему белков из других организмов в ГТФ форме).

Кристаллизация и структурные исследования серил- и аспартил-тРНК-сиитетаз из Т .thermophilus

фундаментальном процессе передачи генетической информации от уклеиновых кислот к белкам особую роль играет стадия линоацилирования. На этой стадии устанавливается соответствие ежду молекулой тРНК и соответствующейей аминокислотой, элки, катализирующие аминоацилирование тРНК, называют шноацил-тРНК-синтетазами (сокращенно, ааРС). Во всех живых штках 20 различных энзимов (по крайней мере, по одному для шдой аминокислоты) катализируют прикрепление аминокислоты соответствующей ей молекуле тРНК в высоко специфичной ¡ухступенчатой реакции, вовлекающей аминокислоту, АТФ и 'НК:

aaRS + аа + ATP aaRS-(aa-AMP) + PPi aaRS-(aa-AMP) + tRNA -» aa-tRNA + aaRS + AMP Несмотря на большие различия в размерах молекул и в их рвичных структурах все ааРСазы могут быть разделены по руктурным и функциональным особенностям на два класса, I и II, десять членов в каждом (G. Eriani et al., 1990, Nature 347, 203; . также обзоры D. Moras, 1992, Trends Biochem. Sei. 17, 159; S. sak, 1993, Current Opinion Struct. Biol. 3, 39). К первому классу тосятся ааРСазы, в аминокислотных последовательностях которых исутствуют 2 характерных мотива: HIGH и KMSKS (жирным »ифтом выделены остатки инвариантные во всех белках). Все ?Сазы класса I аминоацилируют тРНК по 2' гидроксилу рибозы ацевого аденозина и являются мономерными (а) или годимерными (аг) белками с молекулярной массой мономера от 34 110 кДа.

Классификация аминоацил-тРНК-синтетаз из Е.соИ

(Б. Могаэ, 1993, ВюскШе 75, 651).

Класс I Класс II

2' ОН 3' ОН (исключая Фен)

Лей а Гис а2

Илей а Про «2

Вал а Сер <*2

Цис а Тре

Мет а2

Глу а Асп а2

Глун а Асн <*2

Арг а Лиз «2

Тир «2 *Гли а2р2

Трп «2 Ала 014

Фен «202

* в Т.ШегторЬПиз Гли а2

Белки, относящиеся к классу II имеют либо димерное (а.2 либо тетрамерное строение (а4 или (Х2Р2) и аминоацилируют тРНК и 3' гидроксилу рибозы концевого аденозина (исключение составля£ ФенРС). В аминокислотных последовательностях ааРСаз класса . обнаружены 3 характерных мотива: 1)...Р...; 2)...ГОХЕД). И/НХХХР; 3). ,.ОХСХОХЕ11... (только один из аминокислотам остатков является инвариантным в каждом случае). При это первый мотив встречается только в семи из десяти РСаз класса II, именно, в белках аз типа, и вовлечен в димеризацию этих РСа Внутри каждого класса ааРСазы делятся на три подгруппы, которые входят наиболее сходные по структурным свойствам и I гомологии аминокислотных последовательностей белки (см таблицу Пространственные структуры ряда ааРСаз, относящихся к дву разным классам, были расшифрованы и были выявлен структурные особенности характерные для этих белков. Во первы было подтверждено модулярное строение всех ааРСаз: э' многодоменные белки и разные функции (катализ и узнаван]

тРНК) выполняются разными доменами. Во вторых, было показано, что каталитические домены ааРСаз классов I и 1Г построены по разному, но внутри каждого класса все ааРСазы имеют каталитический домен построенный по одному типу.

В ааРСазах класса I оба консервативных мотива, KMSKS и HIGH, ассоциированы с каталитическим доменом, основным структурным блоком которого является параллельный Р-слой с фланкирующими а-спиралями ("Россман-фолд" - структура, обнаруженная во многих белках, связывающих нуклеотиды). Оба консервативных мотива вовлечены в связывание универсального субстрата АТФ. Добавочные домены либо вставлены между двумя консервативными мотивами, либо добавлены к С-концу каталитического домена. В классе II основой каталитического цомена является антипараллельный Р-слой, и два консервативных мотива также существенным образом вовлечены в связывание АТФ.

В 1989 году были впервые определены пространственные ¡труктуры двух ааРСаз: ТирРС (P. Brick et al., 1989, J.Mol.Biol. 208, 13) и ГлнРС (в виде комплекса с соответствующей тРНК: М. Rould it al., 1989, Science 246, 1135). Мы в это время совместно с группой Д. Тукало из Киевского института молекулярной биологии только фиступили к выделению и кристаллизации ааРСаз из n.thermophilus. В 1990 году, нам удалось получить пригодные к юнтгеноструктурному анализу кристаллы двух ааРСаз, [ринадлежащих к классу II: СерРС и АспРС [12, 13].

Кристаллы АспРС были выращены из раствора, содержащего в ¡ачестве осадителя формиат натрия (рис. 9а). Кристаллы СерРС ыли получены из раствора, содержащего смесь сульфата аммония с 1ПД (рис. 96).

В том же 1990 году пространственная структура СерРС из E.coli ыла решена и опубликована группой С. Кусака из Европейской

а б

Рис. 9. Кристаллы СерРС (а) и АспРС (б) из T.thermophilus.

лаборатории молекулярной биологии, Гренобль (S. Cusack et al. 1990, Nature 347, 249). Это было событием, т. к. впервые был! определена структура синтетазы, относящейся ко втором; подклассу. Впервые прямым методом было показано, что i каталитическом домене синтетаз второго подкласса отсутствуй Россман фолд и ядром домена является антипараллельный Р-слой Уникальной особенностью СерРС является её N-концевой домен который представляет собой длинную суперспираль из 9 аминокислотных остатков (рис. 10). Позднее было показано, что эт

суперспираль участвует в узнавании и связывании тРНК (V. Biou et al., 1994, Science 263, 1404).

Получив кристаллы СерРС из T.thermophilus, мы решили сотрудничать с группой С. Кусака для определения структуры этого гомологичного белка. Предварительные кристаллографические исследования СерРС из T.thermophilus были проведены нами совместно с сотрудниками украинского Института молекулярной биологии (Киев) и Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) в Гренобле [12]. Было показано, что данные кристаллы стабильны в рентгеновском пучке не менее недели при комнатной температуре. Кристаллы принадлежат к пространственной группе P2j с параметрами элементарной ячейки а=87.1 А, Ь=126.9 А, с=63.5 А и Р=109.7° и способны отражать рентгеновские лучи с разрешением до 2.0 А. Впоследствии эти кристаллы были использованы кристаллографической группой EMBL (Гренобль) совместно с группой М. Тукало (Украина) для определения пространственной структуры СерРС из T.thermophilus при разрешении 2.5 А (М. Fujinaga et al., 1993, J.MoLBiol. 234, 222) и ¡уш определения структуры комплексов СерРС с АТФ и с серил-1денилатом, который синтезировался в кристаллах при вымачивании их с АТФ, серином и Mn2+ (Н. Belrhali et al., 1995, Structure 15, 341), но в этих структурных исследованиях мы не тринимали участия.

Предварительные структурные исследования АспРС были ¡деланы нами в Институте белка РАН совместно с группой С. В. Зиконова [13]. Было показано, что орторомбические кристаллы финадлежат к пространственной группе P2i2j2i с параметрами 1чейки а = 61.4 A, b = 156.1 А и с = 177.3 А. Эти кристаллы также ¡ыли очень стабильны в рентгеновском пучке (время жизни более гедели при комнатной температуре). Очень быстро были получены

Рис. 10. Структура субъединицы СерРС. (S. Cusak et al., 1993, The Translationa Apparatus, p. 1-12, ed. by K. Nierhaus et al., Plenum Press, New York).

изоморфные производные кристаллов с соединениями ртути, золот) и иридия. Структуру АспРС было решено определять совместно ' группой проф. Дино Мораса из Института молекулярной j клеточной биологии (Страсбург, Франция), в которой в течени длительного времени исследовалась АспРС из дрожжей. Набор* дифракционных данных от нагивных и модифицировании: кристаллов были собраны С. В. Никоновым в Страсбурге и им ж были получены интерпретируемые карты электронной плотности однако расшифровка этих карт была отложена на два года из-з отсутствия первичной структуры данного белка. В течение двух ле в группе Дино Мораса велась работа по клонированик секвенированию и суперэкспрессии гена АспРС из T.thermophilus Poterszman et al., 1993, FEBS Lett. 325, 183). Только поел окончания этой работы молекулярная модель белка была построев и структура АспРС при разрешении 2.5 А была опубликована [24

[с. 11. Сравнение структуры АспРС из ЭассЬаготусез сегеу1з1ае и из \hermophilus. А - структура мономеров. В - доменная организация молекул. С -руктурный элайнмент.

Несколько ранее в лаборатории Дино Мораса была определена пространственная структура эукариотической (дрожжевой) АспРС в комплексе с соответствующей тРНК (M. Ruff et al., 1991, Science 252, 1682). Сравнение структур бактериальной и эукариотической АспРСаз выявило как принципиальное сходство этих белков, так и существенные различия в их строении (рис. 11).

АспРС является гомодимером (аг), как и большинство ааРСаз класса II. Молекула мономера АспРС из дрожжей может быть разделена на каталитический район и N-концевой антикодон-узнающий домен. Прокариотичесая АспРС содержит кроме того большой "вставленный" домен, который обеспечивает дополнительные взаимодействия с акцепторной рукой тРНКАсп.

4. Выделение и кристаллизация рибосом,

рибосомных субчастиц и индивидуальных рибосомных белков из T.thermophilus

4.1. Кристаллизация 70S рибосом и 30S рибосомных субчастиц из T.thermophilus

Рибосомы представляют собой чрезвычайно крупные не имеющие

внутренней симметрии рибонуклеопротеидные частицы сложного

состава с молекулярной массой 2.3 - 4.0 х 106 Да. Рибосомы во всех

живых клетках построены из двух неравных по размеру субчастиц:

малой и большой. В бактериальных клетках это 30S (малая) и 50S

(большая) рибосомные субчастицы, которые при ассоциации

образуют 70S рибосому. Первые попытки кристаллизации рибосом t

были предприняты в начале 80-х годов. В качестве объекта были выбраны бактериальные рибосомы, т.к. их легче выделять и они к тому времени были уже хорошо охарактеризованы биохимически, особенно рибосомы E.coli. В 1980-1982 гг. в группе Ады Йонат были получены микрокристаллы 50S рибосомных субчастиц из Bacillui stearothermophilus и 70S рибосом из E.coli (см. обзор В. Широкова i

М. Гарбер, 1991, Успехи биологической химии XXXII, 50 [46]). Эти кристаллы были непригодны для структурных исследований, но это было первое доказательство кристаллизуемости рибосом. Кристаллы 50S рибосомных субчастиц из B.stearothermophilus были позднее существенно улучшены и" используются в настоящее время группой к. Йонат для структурных исследований. Наилучшие кристаллы эолыпой рибосомной субчастицы, отражающие рентгеновские лучи с разрешением 2.8 А, были позднее получены в той же группе из фхебактерии Haloarcula marismortui (Н. Hope et al., 1989, Acta :rystallogr. 45, 90).

Трехмерные кристаллы малых рибосомных субчастиц впервые ¡ыли получены в нашей группе, и главной причиной успеха был )ыбор T.thermophilus в качестве источника рибосом [7]. 30S шбосомные субчастицы из T.thermophilus оказались чрезвычайно табильными. Они не содержат рибонуклеазной активности и охраняют свою целостность в растворе (при +4° С) в течение [литёльного времени. Кристаллы палочковидной формы (рис. 12) :егко образуются в достаточно концентрированных растворах этих убчастиц в присутствии 12.5-17% МПД, 25 мМ MgCl2, 75 шМ ГН4С1, 200 mM КС1, 20 тМ трис-HCl (рН 7.5). Позднее такие же ристаллы были получены в группе Ады Йонат и используются этой руппой для структурных исследований (Н. Hope et al., 1989, Acta rystallogr. 45, 190). В нашей группе была получена также другая ристаллическая форма 30S рибосомных субчастиц из T.thermophilus 10]. Кристаллы гексагональной формы (рис. 12) вырастали в тех же словиях, что и палочковидные. Их возникновение зависело, тавным образом от качества препарата. Было показано, что эти ристаллы способны отражать рентгеновские лучи с разрешением не

Рис. 12. Палочковидные (а) и гексагональные (б) кристаллы рибосомных 30 субчастиц из Т. thermophilus.

менее 12 Ä. К сожалению, вырастить крупные кристаллы 30 рибосомных субчастиц гексагональной формы пока никому н удалось.

Трехмерные кристаллы целых 70S рибосом из T.thermophilu были впервые получены в Институте белка РАН Карповой Сердюком (Е. Карпова, и др. 1986, ДАН СССР 289,1263). В наше группе немного позднее удалось получить более совершенны пригодные для рентгеноструктурных исследований кристаллы 70 рибосом из Т.thermophilus [8]. Этот результат был получен nocj

разработки специального метода очистки рибосом. В традиционную методику очистки были введены две дополнительные стадии: центрифугирование через плотную "подушку" (сахароза + СзС1) и хроматография на колонке с гидрофобной смолой (3. Гогия и др., 1986, Мол. Биол. 29, 519; С. Траханов, неопубликованные данные). Препараты рибосом, полученные таким способом, отличаются высокой гомогенностью и легко кристаллизуются (В. А. Широков, 1994, Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук, Институт белка РАН, Пущино). Процесс кристаллизации заключался в следующем. Рибосомы (10 мг/мл) диализовали против 10% МПД в 20 мМ трис-НС1 (рН 7.5), М&С12, 75 шМ ЫН4С1, 200 тМ Кс1, 1тМ ДТТ, 0.1 мМ ЭДТА ( буфер А) при +4°С. Через несколько дней образовывался осадок тонких пластинчатых микрокристаллов, который удаляли центрифугированием. Раствор рибосом продолжали диализовать против того же буфера, но с 15% МПД, в течение 2-3 недель. За это время образовывалось довольно много мелких и не очень хорошо ограненных кристаллов, которые собирали центрифугированием, промывали 10% МПД в буфере А и растворяли в том же буфере. Крупные бипирамидальные кристаллы рибосом выращивали из полученного раствора методом "висящей капли" против 10-15% МПД в буфере А. Кристаллы обычно появлялись в течение недели и за месяц вырастали до размера 0.5 мм X 0.5 мм X 0.3 мм (рис. 13).

Для доказательства рибосомной природы кристаллов использовали ряд тестов: аналитическую седиментацию рибосом и их РНК, двумерный электрофорез и 'электрофорез с додецил сульфатом натрия в полиакриламидном геле,

электронномикроскопический анализ тонких срезов кристаллов и растворенных кристаллов. Анализировалась также функциональная активность растворенных кристаллов в системе бесклеточного синтеза полифенилаланина. Было показано, что кристаллы

о ^ ;

Рис. 13. Кристаллы 70S рибосом из T.thermophilus.

действительно содержат 70S рибосомы, которые по всем параметрам не отличаются от исходных [8].

Предварительные кристаллографические исследования кристаллов 70S рибосом были сделаны на синхротроне LURE во Франции совместно с лабораторией проф. Д. Мораса (Страсбург, Институт молекулярной и клеточной биологии). Дифракционное поле кристаллов имеет предел разрешения 17-20 Ä. Были определены пространственная группа P4!2j2 или Р4з2^2 и параметры элементарной ячейки а=Ь=510 Ä и с=378 Ä [11]. Плотность кристаллов (после обработки глутаровым альдегидом), измеренная в градиенте плотности перколла , равна 1.12 г/см3. Это означает, что в объеме элементарной ячейки содержится 8 рибосом, а в независимой части ячейки - 1 рибосома. Параметр Мэтьюза Vm = 4.5 А3/Да. Это говорит о не очень плотной упаковке частиц в кристалле, что не удивительно для частиц такого размера. Кристаллы обладают достаточно высокой механической прочностью и радиационной стабильностью. Время жизни кристаллов в синхротронном пучке при 0°С составляло 6 часов с сохранением

разрешения около 20 А. Этого времени, однако, достаточно для получения всего 2-3-х рентгенограмм. Это создает большую трудность с получением наборов дифракционных данных: либо надо использовать много кристаллов для получения одного полного набора данных, либо надо продлевать время жизни кристалла, охлаждая его в струе жидкого азота до -170°С. В обоих случаях возникают серьезные технические трудности, которые отрицательно сказываются на качестве дифракционных наборов.

Получение пригодных к рентгеноструктурному анализу кристаллов - это только первый, хотя и принципиально важный этап работы. Кристаллографические исследования таких крупных надмолекулярных структур как рибосома наталкиваются на серьёзные технические трудности на каждом этапе. В процессе этих исследований приходится развивать новые методические подходы как при наборе данных, так и при решении проблемы фаз. Такая работа под силу только крупным хорошо финансируемым международным коллективам. Больших успехов в самое последнее время добилась израильско-немецкая группа Ады Йонат, которой удалось получить интерпретирумую карту электронной плотности для 50S рибосомных субчастиц из H.marismortui при разрешении около 9 А (J. Thygesen et al., 1996, принято к публикации в J.Cry st.Growth ). В нашем институте кристаллографические исследования интактных рибосом и рибосомных субчастиц были на некоторое время, к сожалению, приостановлены в связи с отсутствием необходимого оборудования и с рядом других трудностей. В то же время мы добились хороших результатов в структурных исследованиях отдельных рибосомных белков. Эта работа направлена на постепенное построение молекулярной модели рибосомы на уровне высокого разрешения.

4.2. Выделение и идентификация отдельных рибосомных белков из ТЛкегторкИив

В состав бактериальных рибосом входят 3 молекулы РНК (23Б, 168 и 5Б) и свыше 50 индивидуальных рибосомных белков. Рибосомные белки из ТЛкегторкИив никем не были охарактеризованы, в то время, когда мы начали работать с рибосомами из этого организма. Номенклатура для этих белков была впервые дана в работе 3. Гогия и др. (1986) на основе их разделения в двумерном электрофорезе по аналогии с номенклатурой для рибосомных белков из Е.соИ. Каждому белку был . присвоен номер в соответствии с его подвижностью в полиакриламидном геле в стандартных условиях электрофореза по Калтшмидту и индекс ТЬ или ТБ, для белков из большой или малой рибосомных субчастиц, соохя&гственно (рис. 14). Были разработаны процедуры экстракции белд&зв' из рибосом и их препаративного разделения на колонках в неденатурирующих условиях [9]. К настоящему времени 15 белков из малой рибосомной субчастицы и 16 белков из большой рибосомной субчастицы ТЛИегторНИив удалось выделить в неденатурирующих условиях [27, 30]. .Еще 11 белков из большой рибосомной субчастицы были очищены до гомогенного состояния с помощью обратно-фазной хроматографии в системе НРЬС [27].

Совместно с Институтом биоорганической химии РАН и с Лейденским Университетом (Нидерланды) нами были определены полные аминокислотные последовательности рибосомных белков Ы и Б6 (К. Атопз et а1. & Б. 8ес1е1гпкоуа, 1993, Л. Ргог. СЪет. 12, 725 и [21]). Совместно с Институтом молекулярной и клеточной биологии (Страсбург, Франция) была определена полная аминокислотная последовательность белка в8 [19]. 26 рибосомных белков из ТлЬегторкИив было идентифицировано с гомологичными белками из Е.соИ на основе сравнения их. Л-концевых аминокислотных последовательностей и ряда других свойств [27, 30].

Рис. 14. Картина разделения рибосомных белков из ТЛЬегторЬИиз с помощью двумерного гель-электрофореза.

Идентификация всех белков малой рибосомной субчастицы ТлНегторНИив была недавно сделана группой Т. Чоли в Греции (Р. ТэШоИ et а1., 1994, ЕигЛ.Вюскет. 226, 169). Авторы этой работы не ставили своей целью разработку методов препаративного выделения рибосомных белков из ТЛНегтор/гИиэ в неденатурирующих условиях. Они провели аналитическое разделение белков с помощью обратно-фазной хроматографии в системе НРЬС и определили Ы-концевые аминокислотные последовательности всех выделенных белков. Эти результаты несомненно будут очень полезны всем работающим с рибосомами и рибосомными белками из ТлкегторНИиэ, в том числе и нашей группе (такая тотальная идентификация рибосомных белков была неприемлема для нас из-за своей дороговизны).

Идентификация рибосомных белков из T.thermophilus [27, 30]

Номенклатура рибосомных белков из 60S рибосомной субчастицы T.thermophilus (по подвижности в двумерном гель-электрофорезе)

Общепринятая Номенклатура Общепринятая

номенклатура рибосомных белков из номенклатура белков из 30S рибосомной белков из малой

большой субчастицы рибосомной

рибосомной T.thermophilus (по субчастицы

субчастицы подвижности в

двумерном гель-электрофорезе)

TL1 — L2 TS3 — S3

TL2 — LI TS4 — S4

TL3 — L3 TS5 — S5

TL4 — L5 TS6 — S7

TL6 — LH TS7 — S8

TL7 — L6 TS9 — S6

TL8 — L9 TS10 — S9

TL11 — L7/L12 TSU — Sil

TL11* — (L7/L12)4L10 TS12 — S12

TL12 — L16 TS15 — S17

TL24 — L27 TS16 — S15

TL26 — L30 TS17 — S16

TL29 — L35 TS19 — S19

4.3. Кристаллизация и структурные исследования рибосомных белков

Структурные исследования рибосомных белков начались в конце 70-х годов, и первая кристаллическая структура фрагмента рибосомного белка L7/L12 из E.coli была опубликована группой А. Лильяса в 1980 году (М. Leijonmark et al., 1980, Nature 286, 824). Больше никому не удалось получить кристаллов рибосомных белков из E.coli, поэтому в начале 80-х годов начали использовать для кристаллизации рибосомы и рибосомные белки из умеренно термофильной грамположительной эубактерии Bacillus stearothermophilus. В результате были закристаллизованы белки S5,

L6, L9, L30 (см. обзор М. Garber et al., 1992 [56]), однако структурные исследования этих белков натолкнулись в то время на серьёзные трудности в связи с невозможностью получения приемлемых тяжелоатомных изоморфных производных. Единственным белком, структуру которого удалось определить в 1986 году, стал L30 - один из самых маленьких рибосомных белков (8 кДа). Удивительным оказалось сходство топологии белка L30 с топологией определенной ранее структуры С-концевого глобулярного фрагмента белка L7/L12 (К. Wilson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 7251). Оба белка содержали так называемый "расщепленный ß-a-ß мотив". Тогда же Лильясом было высказано предположение, что этот структурный мотив может оказаться характерным для многих других рибосомных белков.

Ускорение в структурных исследованиях рибосомных белков началось с 1992 года: за последние четыре года были определены структуры белков S5, S6, S17, LI, L6, L9 и L14 (см обзор A. Liljas & М. Garber, 1995 [76]). Эти работы были сделаны в группах В. Рамакришнана и С. Байта (США) на белках из B.stearothermophilus и в нашей группе совместно с группой А. Лильяса в Лундском университете на белках из T.thermophilus. Успех в определении структур рибосомных белков из B.stearothermophilus, закристаллизованных десять лет тому назад, пришел благодаря получению суперпродуцентных штаммов для этих белков, что сняло проблемы с выделением этих белков в необходимых количествах и позволило получать тяжелоатомные изоморфные производные, благодаря введению остатков цистеина в полипептидную цепь или благодаря выращиванию суперпродуцентных клеток на среде с селенометионином.

Что касается рибосомных белков из T.thermophilus, разработка процедур экстракции и выделения этих белков в неденатурирующих условиях позволила нам провести поиск условий для их

кристаллизации, в результате чего были получены кристаллы белков Ь6 [9], Ы [14] и Б6 [16]. Кристаллы белков Б6 и Ы оказались пригодными для рентгеноструктурного анализа при высоком разрешении. Структурные исследования этих белков были проведены совместно с группой структурных исследований рибосомных белков Института белка РАН и с лабораторией молекулярной биофизики Лундского Университета (Швеция).

Белок вб состоит из 101 аминокислотного остатка и является самым кислым белком из ЗОЭ рибосомных субчастиц ТЛИегторкИиа (р1 = 6.6). Первые кристаллы этого белка, полученные Агаларовым и Елисейкиной (С. Агаларов и И. Елисейкина, 1989^Биополимеры и клетка 5, 77), не были пригодны к рентгеноструктурному анализу из-за разупорядоченности, наблюдавшейся в рентгенограммах. После изменения условий кристаллизации (ЫаС1 в кристаллизационной смеси был заменен на КР) нам удалось получить кристаллы вб (рис. 15), которые были пригодны к структурному анализу с высоким разрешением [21].

Рис. 15. Кристаллы рнбосомиого белка Б6 из ТЛНегторкИиз.

Однако в течение длительного времени не удавалось получить тяжелоатомных изоморфных производных этих кристаллов: вымачивание кристаллов S6 с любыми тяжелоатомными реагентами приводило не только к изменению параметров элементарной ячейки, но и к изменению пространственной группы кристаллов: С222, а=106.7, Ь=52.8, с=41.0 А переходило в С222ь а=106.8, Ь=52.7, с=82.2 А. Число молекул в независимой части элементарной ячейки при этом удваивалось. Одной из возможных причин такого перехода могло быть вращение молекулы белка в кристалле, возможно, в результате конформационной нестабильности белка. Мы предположили, что причиной такой нестабильности может быть слишком жесткая процедура экстракции белка S6 из рибосомных субчастиц. Эта процедура, включала в себя обработку 30S рибосомных субчастиц T.thermophilus 50% этанолом в смеси с 1М NH4C1 при 60° С. Мы заменили эту процедуру на более мягкую экстракцию белка 6М LiCl при 4° С. Кристаллы, полученные из белка, экстрагированного 6М LiCl, были идентичны по всем параметрам ранее полученным кристаллам S6, однако эти кристаллы оказались более устойчивыми и мы смогли получить их изоморфные производные с двумя соединениями ртути. После этого структура белка была определена очень быстро при разрешении 2 А [21].

Молекула S6 состоит из одного домена и может быть описана как два "расщепленных р-а-р мотива". Данный структурный мотив встречается в белках, обладающих различными функциями, интересно однако, что этот мотив присущ многим РНК-связывающим белкам (см. обзор A. Liljas & М. Garber, 1995, Current opinion in Struct. Biol. 5, 721 [ 7b]). К настоящему времени определены структуры девяти рибосомных белков [76]. Шесть белков из этих девяти содержат в своих структурах "расщепленный р-а-р мотив" (рис. 17).

Рис. 16. Структура рибосомного белка Б6 из ТлкегторЫ1ив.

Практически все рибосомные белки взаимодействуют с рибосомной РНК. Возможно такая частота встречаемости "расщепленного р-а-(3 мотива" связана именно с РНК-связывающей функцией рибосомных белков. Возможно также, что многие РНК-связывающие белки эволюционировали от одного древнего гена. Хотя гомология по аминокислотным последовательностям даже для разных рибосомных белков очень слаба, структурная гомология может быть законсервирована сильнее, чем гомология последовательностей.

Топология белка Э6 оказалась идентичной топологии РНК-связывающего домена эукариотического белка ША - компонента малой ядерной РНП частицы (зп1ШР) [21]. Недавно структура ША

была определена в комплексе со специфическим фрагментом РНК (С. Oubridge et al., 1994, Nature 372, 432). Было показано, что во взаимодействии с РНК участвует экспонированная поверхность р-

слоя. Можно предположить, что подобный способ связывания РНК осуществляется и белком S6.

Белок L1 - один из самых крупных рибосомных белков (228 ак). Этот белок расположен в 50S рибосомной субчастице в так называемом "L1-ребре" напротив L7/L12 стержня. L1 относится к числу сердцевинных рибосомных белков, которые связываются с рибосомной РНК независимо, сильно и специфически. Помимо связывания с 23S рРНК белок L1 способен связываться с двухцистронной мРНК, кодирующей два рибосомных белка, L1 и L11, и репрессировать таким образом свой собственный синтез и синтез белка L11. Кристаллы белка L1 из T.thermophilus принадлежат к пространственной группе P2i2j2 и пригодны к рентгеноструктурному анализу при высоком разрешении (рис. 18) [14]. Определение пространственной структуры этого белка натолкнулось на серьезные трудности и заняло свыше 5 лет. Оказалось, что даже нативные кристаллы L1, приготовленные из разных препаратов белка, отличаются по параметрам элементарной ячейки на 0.5-1.0%, а по дифракционным интенсивностям (dF/F) до 25% при высоком разрешении. Вымачивание кристаллов с тяжелоатомными реагентами также приводило к неизоморфизму, поэтому изоморфные производные этих кристаллов так и не были получены.

Чтобы выйти из тупика в структурных исследованиях, мы клонировали ген rpll из ДНК T.thermophilus и получили суперпродуцент [31]. Рекомбинантный L1 был выделен и закристаллизован в тех же условиях, что и естественный белок, выделенный из рибосом. Кристаллы L1, выделенного из суперпродуцента, принадлежали к той же пространственной группе P2i2i2. Однако, сравнение наборов дифракционных данных для кристаллов есгественного и рекомбинангного L1 показало, что dF/F увеличивалось линейно от 11% при низком разрешении до 25.9%

Рис. 18. Кристаллы рибосомного белка 1Л из ТЛкегторЫЫа.

при разрешении 2.2А. Вымачивание кристаллов рекомбинантного белка с тяжелоатомными реагентами также приводило к нарушению изоморфизма кристаллов. Было получено несколько мутантных форм белка, в которых определенные остатки серина или глутамина были замещены на остаток цистеина [31]. К сожалению, эти мутантные белки плохо кристаллизовались. Только один из них, 8ег179СузЬ1, удалось закристаллизовать в виде комплекса с Иа-мерсалилом (ртутьсодержащий реагент). В конце концов, С. В. Никонову удалось разработать специальный подход, который позволил решить фазовую проблему на основе комбинированного использования наборов дифракционных данных, полученных от нативных кристаллов естественного Ы и от тяжелоатомных производных рекомбинантного Ъ1. Структура Ы была решена и уточнена до разрешения 1.8 А [32].

Рис. 19. Структура рибосомного белка Ы из ТлНегторЫ1иэ.

Молекула белка Ы состоит из двух доменов (рис. 21). Ы- и С-концы молекулы расположены в домене I, который включает в себя остатки 1-67 и 160-228, а домен II (68-159) находится как бы внутри первого домена. Домен I содержит вышеописанный "расщепленный Р-а-Р мотив": трехстрендный (Р1, р8, Р9) антипараллельный р-слой и одна а-спираль (а 7). На Ы-конце в домене I находится а-спираль (а1), которая расположена отдельно от глобулярной части белка и ассоциирована со спиралью а2 и стрендом РЮ с помощью гидрофобных взаимодействий и солевого мостика между Ьув13 и 01и31. Домен II содержит две а-спирали на. каждой стороне четырехстрендного параллельного Р-слоя. Данная топология, так называемый "Россманн фолд" (параллельный Р-слой с

фланкирующими а-спиралями), была найдена во множестве белков, включая нуклеотид-связывающие домены многих дегидрогеназ и киназ, однако в структуре рибосомного белка Россманн фолд обнаружен впервые.

4.4. Клонирование, секвенирование и суперэкспрессия генов рибосомных белков из T.thermophilus Определение полных и N-концевых аминокислотных последовательностей (э&ыного числа рибосомных белков из T.thermophilus позволило нам клонировать гены 25 рибосомных белков, которые сгруппированы в нескольких оперонах: S10, spc и L11 (рис.20, см. обзор В. Высоцкой и М. Гарбер [66]). Гены рибосомных белков S3, S8, S14, S17, S19, LI, L3, LH, L14, L24, L22, L23, L30 были секвенированы и для многих из этих белков были получены суперпродуценты [28, 29, 31 и неопубликованные данные], что существенно облегчает работу по выделению рибосомных белков в количествах, необходимых для поиска условий их кристаллизации и для проведения структурных исследований.

Самая главная проблема, которую пришлось преодолевать при получении суперпродуцентов - токсичность рибосомных белков из T.thermophilus для клеток E.coli. Ранее Рамакришнан и Герчман (V. Ramakrishnan & S. Gerchman, 1991, J. Biol. Chem. 266, 880) описали получение суперпродуцентов рибосомных белков из другой термофильной бактерии B.stearothermophilus. Они также столкнулись с токсичностью продуцируемых рибосомных белков для клеток хозяина. Повидимому токсический эффект связан с высокой РНК-связывающей способностью рибосомных белков. Использование системы Штудиера (Studier et al., 1990, Methods Enzymol. 185, 60), которая была специально разработана для экспрессии токсичных белков, позволило группе Рамакришнана добиться успеха в

S20 (О')

S20

SI (21') P.P.

S2 (41)

(P)

J

S2

EF-Ts

L32 (23')

P,P2 (t)

L32

L20 (37')

Л.

и

L25 (48') t, (P) (t) P

S16 (57')

TJI

(t)

JL

IF-3 L35 L20 L25 S16 21K TrmD L19

S21 (67') S15 (69')

P,P2_ Wis_ _t P, t, P2 _tj

L

ТГ

S21 DNA primase sigraa SI 5 Pnp

L13 (69') str (73')

(P) (« P rt„AlPt„A2 Ct)

T~

L13 S9 S10 (73') Patt

"OI

S12 S7

EF-G

EF-TuA

(t)

JI_II_IL

L4 L23 L2

S10 L3 SPC (73')

P_II_II_IUI1I_II_I [

SI9 L22

II_I LILT

S3 LI6 L29 S17

JUL

JCZJF

L14 L24 L5 S14 S8 L6 L18 S5 L30 L15 SecY L36

Alpha (73') L28 (82') L34 (83')

P t P_(t) PjP2

" U U LI I_I

S13 Sll S4 alpha L17

Lll (90') L10 (90')

P P att

L28 L33 L34 RnpA t

Lll LI S6 (95')

(P)_(t)

I_II_II_II I

S6 ORF S18 L9

I_I L

L10 LI 2 beta

beta'

4

Рис. 20. Схема расположения гевов рибосомных белков в оперонах в E.coli.

получении суперпродуцентов для рибосомных белков из ВМеагогНегторЫ1ив. Это строго регулируемая экспрессионная система хозяин/вектор. Штамм-хозяин содержит ген Т7 РНК-полимеразы под контролем индуцируемого промотора, тогда как вектор содержит участок связывания для Т7 РНК-полимеразы. Система Штудиера позволяет сначала нарастить клетки хозяина, а затем включить синтез продуцируемого белка. Мы также использовали эту систему и смогли получить суперпродуценты для белков Б7, Б8, 812, Б19, Ь1, ЬЗ, Ь11, Ь22, Ь23 [28, 29, 31 и неопубликованные данные].

4.5. Выделение рибосомных белков ТЛЬегторЫЫз из

суперпродуцентов и кристаллизация некоторых из этих белков

Выделение термостабильных рибосомных белков,

суперпродуцированных в клетках Е.соИ, было существенно облегчено тем, что кратковременный прогрев белковых экстрактов при 65-70° С приводил к денатурации и выпадению в осадок большей части белков клетки-хозяина [28, 31]. После этой процедуры большинство суперпродуцированных рибосомных белков могло быть очищено в одну или две стадии с помощью колоночной хроматографии.

Наиболее существенная трудность при выделении почти всех суперпродуцированных рибосомных белков из ТЛкегторЫЫв -освобождение белковых препаратов от примесей РНК. Из-за высокой РНК-связывающей способности рибосомных белков почти все они присутствуют в клеточном экстракте в виде труднодиссоциируемых комплексов с РНК. Добавление достаточно высоких концентраций солей к неочищенным белковым препаратам мешает их связыванию с ионообменными смолами, поэтому в каждом конкретном случае приходится подбирать условия для удаления. РНК из препарата белка. Такие условия были подобраны для всех перечисленных

выше сунерпродуцированных белков, а белки S7, S8 и L22 были закристаллизованы. Кристаллы белков S8 (C.B. Тищенко, 1995, Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук, Институт белка РАН, Пущино) и L22 [29]оказались пригодными к рентгеноетруктурному анализу (на рис. 22 представлены кристаллы рибосомного белка S8). В настоящее время структурные исследования этих белков проводятся совместно с группой С. В. Никонова в Институте белка РАН и с лабораторией А. Лильяса в Швеции.

Рис. 21. Кристаллы рибосомного белка S8 из T.thermophilus, суперпродуциро-ванног" в клетках E.coli.

5. Перспективы дальнейших струк'турных исследований компонентов аппарата трансляции

За последние годы в структурных исследованиях аппарата трансляции достигнут впечатляющий прогресс. Были определены структуры нескольких аминоацил-тРНК-синтетаз и комплексов этих белков с соответствующими тРНК; определены структуры факторов элонгации: EF-Tu:GDPNP, EF-Tu:GDPNP:tRNA, EF-Tu:EF-Ts, EF-G :GDP и EF-G без нуклеотида; недавно была определена структура фактора инициации IF-3; кроме определенных нами структур белков LI и S6 из рибосом T.thermophilus, группами В. Рамакришнана и С. Байта были определены структуры белков L6, L9, L14, S5 и S17 из рибосом Bacillus stearothermophilus . Не прекращается работа по определению структуры рибосом и рибосомных субчастиц и в этом направлении также достигнуты успехи: получена карта электронной плотности при разрешении около 9 Ä для 50S рибосомных субчастиц из H.marismortui; с помощью метода криоэлектронной микроскопии удалось существенно уточнить модель рибосомы, а также визуализовать три молекулы тРНК, расположенные в А-, Р- и Е-участках на рибосоме. Результаты структурных исследований уже сейчас позволяют понять многие детали механизма биосинтеза белка. В то же время ещё немало белых пятен в этой области, которые предстоит исследовать и которые несомненно будут интенсивно исследоваться в ближайшие годы. Наши ближайшие планы включают продолжение структурных исследований фактора элонгации Q в его активной форме в комплексе с нерасщепляемыми аналогами ГТФ, а также других факторов трансляции и рибосомозависимых ГТФаз. Мы планируем продолжать работу по кристаллизации и структурным исследованиям рибосомных белков. Наиболее интересным и перспективным направлением мы считаем сейчас структурные исследования комплексов рибосомных белков со специфическими фрагментами РНК. Работа по кристаллизации

комплексов трех рибосомных белков Ll, S8 и S15 со специфическими фрагментами РНК уже ведется в нашей группе. Эти три белка являются репрессорами трансляции и имеют сродство не только к рибосомной РНК, но и к собственной мРНК. Определение структуры соответствующих комплексов , по нашему мнению, должно внести существенный вклад не только в построение молекулярной модели рибосомы, но и в понимание принципов РНК-белкового узнавания и в понимание деталей механизма биосинтеза белка.

6. Выводы

В настоящей диссертационной работе получены следующие основные результаты.

1. Разработана схема препаративного выделения рибосом, факторов элонгации и аминоацил -тРНК-синтетаз из биомассы T.thermophilus.

2. Закристаллизован фактор элонгации G из T.thermophilus в двух формах: без связанного нуклеотида и в комплексе с ГДФ. Кристаллы использованы (при участии диссертанта) для

- определения пространственной структуры EF-G с разрешением 2.8 Â (в свободной от нуклеотида форме) и 2.4 Â (в ГДФ-форме).

3. Получены трехмерные кристаллы 70S рибосом и 30S рибосомных субчастиц из T.thermophilus.

4. Препаративно выделены в неденатурирующих условиях 15 белков из малой и 16 белков из большой рибосомных субчастиц T.thermophilus.

5. Идентифицированы с гомологичными рибосомными белками из E.coli 26 рибосомных белков из T.thermophilus.

6. Получены кристаллы рибосомных белков S6 и L1. Кристаллы использованы (при участии диссертанта) для определения

пространственных структур этих белков с разрешением 2.0 А и 1.8 А, соответственно.

7. Клонированы гены рибосомных белков, расположенные в S10, spc и L11 оперонах в T.thermophilus. Большая часть этих генов секвенирована, часть из них суперэкспрессирована в E.coli.

8. Выделены из суперпродуцентов и закристаллизованы рибосомные белки S8 и L22. Кристаллы используются в настоящее время для структурных исследований этих белков.

9. Закристаллизованы серил- и аспартил-тРНК-синтетазы из T.thermophilus. Кристаллы обоих белков использованы для определения их пространственных структур с разрешением 2.5 А. Структура аспартил-тРНК-синтетазы определена при непосредственном участии диссертанта.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Л. С. Решетникова, И. В. Савченко, М. В. Гарбер. (1978). Кристаллизация триптических фрагментов фактора элонгации G из E.coli. ДАН СССР 243, 523-525.

2. М. Б. Гарбер, Л. С. Решетникова. (1981). Кристаллизация С-концевого триптического фрагмента фактора элонгации G из E.coli. Биоорганическая

. химия, 7, 1419-1422.

3. L. S. Reshetnikova, М. В. Garber, N. P. Fomenkova, S. V. Nikonov, Yu. N. Chirgadze. (1982). Crystallographic study of the large tryptic fragments of elongation factor G from E.coli. J.MolBiol. 160, 127-132.

4. M. Б. Гарбер, Л. С. Решетникова. (1981). Выделение протеолитически модифицированного фактора элонгации G из Thermus thermophilus. Биоорганическая химия 8, 1572-1574.

5. L. S. Reshetnikova and М. В. Garber. (1983). Crystallization of elongation factor G from an extreme thermophile, T.thermophilus HB8. FEBS Lett. 154, 149-150.

6. Yu. N. Chirgadze, S. V. Nikonov, E. V. Brazhnikov, M. B. Garber, L. S. Reshetnikova. (1983). Crystallographic study of elongation factor G from Th.thermophilus HB8. J.Mol.Biol. 168, 449-450.

7. М. М. Юсупов, С. Д. Траханов, В. В. Барынин, В. JI. Боровягин, М.~ Б. Гарбер, С. Е. Седельникова, О. М. Селиванова, С. В.Тищенко, В. А. Широков, И. М. Единцов. (1987). Кристаллизация 30 S рибосомных субчастиц из T.thermophilus. Доклады АН СССР 292, 1271-1274.

8. S. D.Trakhanov, М. М. Yusupov, S. С. Agalarov, М. В. Garber, S. N. Ryazantsev, S. V. Tischenko, V. A. Shirokov. (1987). Crystallization of 70 S ribosomes and 30 S ribosomal subunits -from Thermus thermophilus. FEBS Lett. 220, 319-322.

9. S. E. Sedelnikova, S. C. Agalarov, M. B. Garber, M. M. Yusupov. (1987). Proteins of the Thermus thermophilus ribosome. FEBS Lett. 220, 227-230.

10. M. M. Yusupov, S. V.Tischenko, S. D. Trakhanov, S. N. Ryazantsev, M. B. Garber. (1988). A new crystalline form of 30S ribosomal subunits from T.thermophilus. FEBS Lett. 238, 113-115.

11. S. Trakhanov, M. Yusupov, M. Shirokov, M. Garber, A. Mitschler, M. Ruff, J.-C. Thierry, D. Moras. (1989). Preliminary X-ray investigation of 70S ribosomes crystals from Thermus thermophilus. J. Mol. Biol. 209, 327-328.

12. M. B. Garber, A. D. Yaremchuk, M. A. Tukalo, S. P. Egorova, C. Berthet-Colominas and R. Leberman. (1990). Crystals of seryl-tRNA synthetase from Thermus thermphilus. Preliminary crystallographic data. J. Mol. Biol. 213, 631-632.

13. M. B. Garber, A. D. Yaremchuk, M. A. Tukalo, S. P. Egorova, N. P. Fomenkova and S. V. Nikonov. (1990). Crystals of threonyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus. Preliminary crystallographic data. J. Mol. Biol. 214, 819-820.

14. S. Ch. Agalarov, I. A. Eliseikina, S. E. Sedelnikova, N. P. Fomenkova, S. V. Nikonov and M. B. Garber. (1990). Crystals of protein LI from the 50S ribosomal subunit of Thermus thermophilus. Preliminary crystallographic data. J. Mol. Biol. 216, 501-502.

15. M. B. Garber S. Ch. Agalarov, I. A. Eliseikina, S. E. Sedelnikova, S. V. Tishchenko, V. A. Shirokov, M. M. Yusupov, L. S. Reshetnikova, S. D. Trakhanov, M. A. Tukalo, A. D. Yaremchuk. (1991). Purification and crystallization of components of the protein-synthesizing system from Thermus thermophilus. J.Cryst..Growth 110, 228-236.

16. S. E. Sedelnikova, S. Ch. Agalarov, I. A. Eliseikina, N. P. Fomenkova, S. V. Nikonov, M.B.Garber, L.A.Svensson, A.Liljas. (1991). Crystals of protein S6

from the 30S ribosomal subunit of Thermus thermophilus. J. Mol. Biol. 220, 549-550.

17. Ю. H. Чиргадзе, E. В. Бражников, С. В. Никонов, Н. П. Фоменкова, М. Б. Гарбер, А. Г. Уржумцев, В. Ю. Лунин, Н. Ю. Чиргадзе, Ю. В. Некрасов. (1991). Кристаллическая структура рибосомного фактора G из бактерий Thermus thermophilus при низком разрешении!!. Доклады академии наук

■ СССР, 320, 2, 488-491.

18. О. S. Shikaeva, S. Е. Sedelnikova, N. P. Fomenkova, S. V. Nikonov, М. В. Garber. (1993). Crystals of protein L30 from the 50S ribosomal subunit of Thermus thermophilus. Preliminary crystallographic data. J. Mol. Biol. 230, 1309-1310.

19. J. Reinbolt, I. Eliseikina, S. Sedelnikova, M. B. Garber, C. Ehresmann, B. Ehresmann. (1993). The complete amino acid sequence of ribosomal protein S8 from Thermus thermophilus. Journal of Protein Chemistry, 12 (1), 79-83.

20. G. M. Gongadze, S. V. Tishchenko, S. E. Sedelnikova, M. B. Garber. (1993). Ribosomal proteins, TL4 and TL5, from Thermus thermophilus form hydrid complexes with 5S ribosomal RNA from different microorganisms. FEBS Lett. 330 (1), 46-48.

21. M. Lindahl, L. A. Svensson, A. Liljas, S. Sedelnikova, I. A. Eliseikina, N. P. Fomenkova, N. Nevskaya, S. V. Nikonov, M. B. Garber, , T. A. Muranova, A. I. Rykunova and R. Amons. (1994). Crystal structure of the ribosomal protein S6 from Thermus thermophilus. EMBO J., 13, 1249-1254.

22. J. Zheltonosova, E. Melnikova, M. Garber, J. Reinbolt, D. Kern, B.

/

Ehresmann, C. Ehresmann. (1994). Threonyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus purification and some structural and. kinetic properties. Biochimie, 76, 71-76.

23. M. Delarue, A. Poterszman, S. Nikonov, M. Garber, D. Moras and J.C.Thierry. (1994). Crystal structure of a prokaryotic aspartyl tRNA-synthetase. EMBO J., 13, 3219-3229.

24. M. Б. Гарбер, Ю. M. Желтоносова, А. Айверсон, А. Лильяс. (1994). Новые кристаллические формы фактора элонгации G из экстремального термофила Thermus thermophilus. Доклады Академии Наук, 336 (2), 252253.

25. A. Aevarsson, Е. Brazhnikov, М. Garber, J. Zheltonosova, Yu. Chirgadze, S. A1 Karadaghi, L. A. Svensson and A. Liljas. (1994). Three-dimensional

structure of the ribosomal translocase: elongation factor G from Thermus thermophilus. EMBO J., 13, 3669-3677.

26. В. С. Высотская, У. Ф. Насибулин, В. Н. Уверский, К. С. Василенко, Н. В. Нарижнева и М. Б. Гарбер. (1994). Сруктурные свойства рибосомного белка S8 из экстремального термофила Thermus thermophilus. Биоорган, химия, 21 (7), 492-497.

27. S. Е. Sedelnikova, О. S. Shikaeva, N. К. Avlijakulov, Т. A. Muranova, L. F. Markova, I. A. Kashparov, М. В. Garber. (1994). Proteins from the Thermus thermophilus ribosome. Purification of proteins from the large ribosomal subunit. Biochimie, 76, 440-451.

28. V. Vysotskaya, S. Tischenko, M. Garber, J. Reinbolt, D. Kern, M. Mougel, C. Ehresmann and B. Ehresmann. (1994). The ribosomal protein S8 from Thermus thermophilus VK1. Sequencing of the gene, overexpression of the protein in Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 223, 437-445.

29. N. L. Davydova, O. L. Gryaznova, О. V. Mashchenko, V. S. Vysotskaya, B.-H. Jonsson, S. A1 Karadaghi, A. Liljas, M. B. Garber. Ribosomal protein L22 from Thermus thermophilus: sequencing, overexpression and crystallisation.

(1995) FEBS Letters, 369, 229-232.

30. И. А. Елисейкина, С. Ч. Агаларов, Т. А.Муранова, Л. Ф. Маркова, И. А. Кашпаров, Н. К. Авлиякулов, М. Б. Гарбер. (1995). Препаративное выделение белков из рибосомных 30S субчастиц Thermus thermophilus в недеаатурирующих условиях. Биохимия, 60 (10), 1720-1730.

31. Н. К. Осина, И. А. Елисейкина, С. В. Никонов, М. Б. Гарбер и Б.-Г. Джонсон. (1995). Суперэкспрессия гена рибосомного белка L1 из Thermus thermophilus и кристаллизация рекомбинантного белка. Доклады РАН, 345, 114-115.

32. S. Nikonov, N. Nevskaya, I. Eliseikina, N. Fomenkova, A. Nikulin,N. Ossina, M. Garber, B.-H. Jonsson, C. Briand, A. Svensson, A. Aevarsson, A. Liljas.

(1996). Crystal structure of the KNA-binding ribosomal protein LI from Thermus thermophilus. EMBO J., 15, 1350-1359.

33. M. Garber, N. Davydova, I. Eliseikina, N. Fomenkova, O. Gryaznova, I.Gryshkovskaya, N. Nevskaya, S. Nikonov, A. Rak, S. Sedelnikova, A. Serganov, D. Shcherbakov, S. Tishchenko, J. Zheltonosova and A. Liljas, A. Aevarsson, S. Al-Karadaghi. (1996). Crystallization and structural studies of

components of the protein-synthesising system from Thermus thermophilus. J. Cryst. Growth,

34. A. Liljas, A. Aevarsson, S. Al-Karadaghi, M. Garber, J. Zheltonosova & E. Br(izhnikov. (1995) Crystallographic studies of elongation factor G. Biochem.Cell Biol., 73, 1209-1216.

35. S. Al-Karadaghi, A. Aevarsson, M. Garber, J. Zheltonosova & A. Liljas (1996) The structure of elongation factor G in complex with GDP: conformational flexibility and nucleotide exchange. Stucture, 4, 555-565.

Материалы диссертации докладывались на научных конференциях Института белка РАН (1991, 1994, 1995 гг.), на двусторонних конференциях Франция-СССР (Перигор, 1988 г.) и Франция-Россия (Конкарно, 1992 г.) по физико-химическим основам жизни, на 3-ей, 4-ой, 5-ой и 6-ой международных конференциях по кристаллизации биологических макромолекул (Мерилэнд, США, 1989 г.; Фрайбург, ФРГ, 1991 г.; Сан Диего, США, 1993 г.; Хиросима, Япония, 1995 г.), на международной конференции по аппарату трансляции (Берлин, ФРГ, 1992 г.), на международной конференции по структуре и функции рибосом (Виктория, Канада,

1995 г.), на международной конференции "Наследие А. Н. Белозерского" (Москва, 1995 г.), на конференции участников международной прграммы фонда Ховарда Хьюза (Прага, Чехия,

1996 г.), на международной конференции по термофилам (Джорджия, США, 1996 г.).

Абстракты сообщений на конференциях: la. М. В. Garber, S. Ch. Agalarov, I. A. Eliseikina, S. E. Sedelnikova, S. V. Tischenko, S. D. Trakhanov, V. A. Shirokov, M. M. Yusupov. Purification and crystallization of components of the protein-synthesizing system from Thermus thermophilus. - Abstracts of the Third International Conference on Crystallization of Biological Macromolecules. August 13-19, 1989, Washington, D.C., L 25, p. 39. 2a. S. Ch. Agalarov, S. E. Sedelnikova, I. A. Eliseikina, and M. B. Garber. Isolation and crystallization of ribosomal proteins from Thermus thermophilus. - Abstracts of the Third International Conference on Crystallization of

Biological Macromolecules. August 13-19, 1989, Washington, D.C., P 24, p. 96.

3a. S. Trakhanov, V. Shirokov, M. Yusupov, M. Garber, J.-C. Thierry, D. Moras, E. Pebay-Peroula, M. Roth. Crystallization and preliminary X-ray and neutron diffraction investigation of 70S ribosomes from Thermus thermophilus. -Abstracts of the Third International Conference on Crystallization of Biological Macromolecules. August 13-19, 1989, Washington, D.C., P 31, p. 103.

4a. M. A. Tukalo, A. D. Yaremchuk, M. B. Garber. Isolation and crystallization of seryl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus. - Abstracts of the Third International Conference on Crystallization of Biological Macromolecules. August 13-19, 1989, Washington, D.C., P 11, p. 83. 5a. V. A. Shirokov, M. M. Yusupov, S. D. Trakhanov, S. N Ryazantsev, Y. V. Sergeev, S. V. Tischenko, M. B. Garber and V. D. Vasiliev. New crystalline forms of 70S ribosomes and 30S ribosomal subunits from Thermus thermophilus. - Abstracts of the Third International Conference on Crystallization of Biological Macromolecules. August 13-19, 1989, Washington, D.C., P 30, p. 102. 6a. Yu. V. Sergeev, V. A. Shirokov, S. N. Ryazantsev, V. D. Vasiliev, S. D. Trakhanov, M. M. Yusupov, S. V. Tischenko. and M. B. Garber. Electron microscopy analysis of crystals of 70S ribosomes and 30S ribosomal subunits from Thermus thermophilus. - Abstracts of the 12th European Crystallographic Meeting. August 20-29,1989, Moscow, p.401. 7a. V. A. Shirokov, S. D. Trakhanov, M. M. Yusupov, S. V. Tischenko, S. N. Ryazantsev, Yu. V. Sergeev, M. B. Garber, V. D. Vasiliev, A. Mitschler, M. Ruff, J.-C. Trierry and D. Moras. Crystallization and preliminary X-ray investigation of ribosomes from Thermus thermophilus. - Abstracts of Internat. Symp. "Molecular organization of biological structures", Juno 19-24, 1989, Moscow, p. 248. 8a. I. A. Eliseikina, S. Ch. Agalarov, S. E. Sedelnikova, N. P. Fomenkova, S. V. Nikonov, M. B. Garber and A. Liljas. Crystallization and structural study of protein LI from the 50S ribosomal subunit of Thermus thermophilus. - Poster Abstracts. Crystal Growth of Biological Macromolecules. A FEBS Advanced Lecture Course. University of Freiburg (Germany) August 18-24, 1991, P 63. 9a. S. E. Sedelnikova, S. Ch. Agalarov, I. A. Eliseikina, N. P. Fomenkova, S. V. Nikonov, M. B. Garber and A. Liljas. Ribosomal proteins from Thermus

thermopkilus for crystallographic studies. - Poster Abstracts. Crystal Growth of Biological Macromolecules. A FEBS Advanced Lecture Course. University of Freiburg (Germany) August 18-24, 1991, P 65. 10a. A. D. Yaremchuk, S. P. Egorova, V. N. Mel'nik, M. B. Garber and M. A. Tukalo. Purification and crystallization of the aminoacyl-tRNA synthetases from Thermus thermopkilus. - Poster Abstracts. Crystal Growth of Biological Macromolecules. A FEBS Advanced Lecture Course. University of Freiburg (Germany) August 18-24, 1991, P 56. 11a. M. Garber, S. Agalarov, I. Eliseikina, E. Melnikova, S. Sedelnikova, O. Shikaeva, Yu. Zheltonosova. Purification and crystallization of aminoacyl-tRNA synthetases, elongation factors and ribosomal proteins from Thermus thermophilus. - Abstract book. International Conference on The Translational Apparatus (in memoriam of H. G. Wittmann). Berlin, October 31st-November 5th, 1992, p. 41.

12a. E. Brazhnikov, Yu. Chirgadze, M. Garber, I. Eliseikina, N. Fomenkova, N. Nevskaya, S. Nikonov, S. Sedelnikova, A. Zdanov, Yu. Zheltonosova, A. Aevarsson, C. Briand, A. Liljas, M. Lindhal, A. Svensson. Crystallographic analysis of proteins involved in protein synthesis. - Abstract book. International Conference on The Translational Apparatus (in memoriam of H. G. Wittmann). Berlin, October 31st-November 5th, 1992, p. 91. 13a. M. Garber, Yu. Chirgadze, E. Braznikov, I. Eliseikina, N. Fomenkova, N. Nevskaya, S. Nikonov, S. Sedelnikova, Yu. Zheltonosova. Crystallization of proteins involved in protein synthesis. - Abstract book of the Fifth International Conference on Crystallization of Biological Macromolecules San-Diego, California (U.S.A.), August 8-13, 1993., P 22. 14a. M. Garber, N. Avliyakulov, G. Gongadze, 0. Gryaznova, N. Davydova, I. Eliseikina, N. Ossina, S. Sedelnikova, A. Serganov, O. Shikaeva, S. Tishchenko, V. Vysotskaya, A. Liljas, B.-H. Jonsson, D. Kern, B. Ehresmann, C. Ehresmann, J. Reinbolt, C. Portier. Ribosomal proteins from Thermus thermophilus. - Abstract book. Frontiers in Translation. Victoria (Canada), May 20-25, 1995, p. 101. 15a. N. Davydova, O. Gryaznova, B.-H. Jonsson, A. Liljas, M. Garber. Cloning and overexpression of genes for ribosomal proteins S19, L22 and L23 from Thermus thermophilus. - Abstract book. Frontiers in Translation. Victoria (Canada), May 20-25, 1995, p. 103.

16а. М. Garber, N. Davydova, I. Eliseikina, N. Fomenkova, O. Gryaznova, I.Gryshkovskaya, N. Nevskaya, S. Nikonov, A. Rak, S. Sedelnikova, A. Serganov, D. Shcherbakov, S. Tishchenko, J. Zheltonosova, and A. Liljas, A. Aevarsson, S. Al-Karadaghi. Crystallization and structural studies of components of the protein-synthesising system from Thermus thermophilus. -Collected abstracts, ICCBM-6, Hiroshima (Japan), November 12-17, 1995, p. 164.

17a. M. Garber, N. Avliyakulov, N. Davydova, I. Eliseikina, N. Fomenkova, G. Gongadze, O. Gryaznova, I. Gryshkovskaya, V. Meshcheryakov, N. Nevskaya, S. Nikonov, A. Nikulin, A. Rak, A. Serganov, D. Shcherbakov, S. Tishchenko, V. Vysotskaya, B.-H. Jonsson, A. Liljas, A. Aevarsson, S. Al-Karadaghi. Purification, crystallization and structural studies of ribosomal proteins from Thermus thermophilus. - Howard Hughes Medical Institute, Program and Abstracts of 1996 Meeting of International Research Scholars from the Baltics, Central Europe, and the Former Soviet Union, Prague (Czech Republic), June 23-26, 1996, p. 55.

Обзоры и самообзоры:

16. M. Б. Гарбер. Рибосомальные белки и методы их изучения. (1968). Успехи

современной биологии 65, 341-361 (Наука, Москва). 26. М. Б. Гарбер. (1978). Подготовка белков к ренгеноструктурному анализу.

Успехи современной биологии. 86, 432-446 (Наука, Москва). 36. М. М. Yusupov, М. В. Garber, V. D. Vasiliev, A. S. Spirin. (1991). Thermus

thermophilus ribosomes for crystallographic studies. Biochimie 73, 887-897. 46. В. А. Широков, M. Б.Гарбер. (1991). Кристаллизация рибосом и перспективы структурных исследований. Успехи биологической химии XXXII, 50-62. (Наука, Москва). 56. М. В. Garber, S. Ch. Agalarov, I. A. Eliseikina, N. P. Fomenkova, S. V. Nikonov, S. E. Sedelnikova, O. S. Shikaeva, D. Vasiliev, A. S. Zdanov, A. Lilijas, L. A. Svensson. (1992). Ribosomal proteins from Thermus thermophilus for structural investigations. Biochimie 74, 327-336. 66. В. С. Высоцкая, M. Б. Гарбер. (1995). Регуляция экспрессии генов рибосомных белков Escherichia coli. Успехи биологической химии, 35, 67. 95. (ОНТИ ПНЦ РАН Пущино). 76. A. Liljas and М. Garber. (1995) Ribosomal proteins and elongation factors. Current opinion in structural biology, 5, 721-727.