Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизма функционирования декодирующего центра рибосомы прокариот с использованием дезоксирибоаналога матричного полинуклеотида и аминогликозидных антибиотиков

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизма функционирования декодирующего центра рибосомы прокариот с использованием дезоксирибоаналога матричного полинуклеотида и аминогликозидных антибиотиков"

ордена ленина и ордена дружбы народов академия наук украинской сср институт молекулярной биологии и генетики

На правах рукописи

ГРОЙСМАН Ирина Семеновна

УДД 577.217.532+577.18.02

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМ йУНКЦЮНИРОВтМ /ЩОДИРУЩЕГО ЦЕНТРА РИБОСОМЫ ПРОКАРИОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДЕЗОКСИРИЕОАНАЛОГА МАТРИЧНОГО ПОЛИНУШШОТИДА и АМИНОГЛЖОЗИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ

03.00.03 - молекулярная биологин

Автореферат диссертации на соискание ученой степени канонвата биологических наук

Киев-1991

Работа выполнена в отделе механизмов трансляции генетической информации Института молекулярной биологии и генетики АН УССР

Научные руководители: член-корреспонвент АН УССР,

доктор биологических наук А.В.Епьская

кандидат биологических наук А.П.Потапов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

О.О.Фаворова

кандидат химических наук Е.А.Скрипкин

Ведущее учреждение Институт биоорганической

химии Сибирского отделения АН СССР

Защита состоится "" рУСТ \ 199 \ г. в ¡Р часов

на заседании специализированного совета Д 016.11.01 Института молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу: 252627, Киев-143, ул. Заболотного, 150.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики АН УССР

Автореферат разослан "'¿О « С-ЕуИтЯбрЯ 1991 г.

Ученый секретарь

доктор медицинских наук О Т.И. Бужиевская

специализированного совета ¡Щ. м,и

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Реализация генетической информации, т.е. перевод нуклеотидной последовательности генов в аминокислотную последовательность белков происходит многостадийно. От точности передачи информации на, каждой, стадии зависит жизнь всего организма. Не является исключением и последний в этой цепи процесс • декодирование матрицы на рибосоме. К.настоящему времени выяснены основные этапы этого процесса, их последовательность. Однако многие молекулярные механизмы, обеспечивающие высокую степень точности при большой скорости протекания реакций, остаются неясными. Овна из нерешенных на сегодняшний день проблем - это механизм, благодаря которому достигается необходимая специфичность отбора аминоацил-тРНК на рибосоме, программированной матрицей. Отбор аминоацил-тРНК на рибосоме определяется кодон-антикодоновыми взаимодействиями, однако сами по себе эти взаимодействия не могут обеспечить необходимую надежность протекания процесса. Предложено несколько схем усиления специфичности ко^он-антикодоновых взаимодействий на рибосоме (Нор^еЫ, 1974,1980; Е\1г1апй. еЪ а1., Шило, 1974; РоЪароу, 1982). Одна из них - гипотеза о стереоспе-цифической стабилизации правильных кодон-антикодоновых комплексов предполагает прямое взаимодействие декодирующего центра рибосомы с еахарофосфатным остовом кодон-антикодонового дуплекса (Потапов, 1982,1985). Очевидно, что при таком механизме работы рибосомы изменение структуры декодирующего центра рибосомы так же, как и изменение сахарофосфатного остова кодона или антикодона, долшо существенно влиять на эффективность и точность процесса трансляции. В этой связи представляет интерес изучение особенностей декодирования пезоксирибополинукяеотидбв, как штриц с измененным еахарофосфатным остовом.

Дель и задачи исследования. Цель настоящего исследования заключается в экспериментальной проверке предположения о существенной роли сахарофосфатного остова кодон-антикодоновой пары в процессе трансляции. Для этого исследовали чувствительность бактериального аппарата трансляции к изменению сахарофосфатного остова матрицы и вариации этой чувствительнссти под действием ряда факторов,,и частности связанных с изменением структуры рибосомы.

В этой связи задачами работы были.

1. Сравнительное изучение трансляции рибо- и дезоксирибо-матрицы в бесклеточных белоксинтезирующих системах ил различных прокариот.

2. Изучение воздействия ряда факторов: аминогликозидных антибиотиков, повышенной концентрации ионов магния, мутаций в рибосомном белке SX2,- на эффективность трансляции полиСат ) и неоднозначность трансляции поли(и ).

3. Изучение некоторых особенностей действия аминогликозидных антибиотиков на прокариотическую систему трансляции.

Научная новизна и теоретическая ценность работы. Показана возможность трансляции дезоксирибоматрицы поли(с№ ) в присутствии аминогликозидных антибиотиков в бесклеточных системах трансляции ИЗ В. subtilis, Т. ther1 ophiias наряду с E.coli. Системы белкового синтеза из указанных прокариот характеризуются выраженной специфичностью к структуре сахарного остатка матрицы, которая в зависимости от условий трансляции может быть изменена по принципу "либо рибо-, либо дезоксирибоматрица".

Полученные в работе результаты позволяют заключить, что весьма различные по своей природе факторы, изменяющие точность трансляции поли(0 ), изменяют и эффективность трансляции поли(<1'Г Прослеживается отчетливая положительная корреляция между неоднозначностью трансляции рибонунлеотидной матрицы и эффективностью трансляции ее деэоксирибоаналога. По мере увеличения глубины индукции ошибок декодирования поли(V ) в ряду неомицин > канамицин > стрептомицин, возрастания концентрации каждого антибиотика и повышения в среде содержания ионов магния, а также при переходе от гиперточных рибосом с мутацией в белке 512 к исходным рибосомам имеет мссто пропорциональное увеличение эффективности поли (¿Т )~завис1шо'го синтеза полифенилаланина. Обнаруженная корреляция изменений точности трансляции рибонуклеотидной матрицы и эффективности трансляции дезоксирибонуклеотидной матрицы, скорее всего, отражает фундаментальную взаимосвязь указанных процессов. В соответствии с гипотезой стереоспецифической стабилизации ко-дон-антикодоновых комплексов эту взаимосвязь определяет способ функционирования декодирующего центра рибосомы, а именно, его

взаимодействие с сахарофосфатным остовом кодон-антикодоновых пар как с единым целым.

Анализ совместного влияния стрептомицина и дезоксистрепто-мин-содержащих антибиотиков неомицина и канамицина на систем трансляции из е.coli свидетельствует в пользу единого механизма их действия и направленности последнего на один и тот же функциональный участок рибосомы.

Результаты работы имеют теоретическое значение в плане выяснения механизма функционирования декодирующего центра рибосом прокариот, роли сахарофосфатного остова кодон-антикодоиовой пары в процессе отбора аминоацил-тРШ на рибосоме, а также некоторых, особенностей действия аминогликозипных антибиотиков на прокарио-тическую систему трансляции. Изучение трансляции дезоксирибомат-рицы может представлять и определенный практический интерес для разработки биотехнологических долгоработающих бесклеточных систем синтеза белка непосредственно на ДНК-штрице.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы ( 214 названий)/ Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, совержит 21 рисунков.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на II двустороннем симпозиуме СССР-США "Структура эукариотического генома и регуляция его экспрессии" (Тбилиси, 1989 г.), Международном симпозиуме "Регуляция транскрипции" (Рига, 1989 г.), X двустороннем симпозиуме СССР-Франция "Организация и экспрессия эука-.риотическпго и прокариотического генома" (Каев, 1990) и представлены в б губликациях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Бактериальную биомассу получали согласно Миллеру (Миллер, 1976). Бесклеточные белоксинтеэирующие системы (фракция ü—iX) ) из различных штаммов E.coli и B.subtiLis (штаммы, содержащие мутацию в рибосомном белке SI2 были любезно предоставлены Л. Исакссоном, Упсальский университет, Швеция) получали по метоэу ( Rofcerbs & Petterson, 1970), используя для

отделения эндогенных низкомолекулярньк компонентов хроматографию на сефадексеg-25. Клетки бактерий разрушали растиранием с ai2o7.

Трансляцию полинуклеотидов проворили в инкубационной смеси объемом 50 мкл, содержащей 30 мМ трис- HCl (pH 7,6). 75 мМ KCl, ацетат магния (переменной концентрации), 2 мМ АТР, 0,1 мМ GTP (в некоторых экспериментах использовалась "полимикс" система, предложенная Курландом ( Kurland et al.,I982)), а также 12 мМ креатинфосфат, 1,5 мкг креатинфосфокиназы, 1-2 мМ дитиотреитол, i aggq ев. фракции б-50 , 25 мкг суммарной тРШ из e.coli 20 мкг поли( U) или поли( ат )(для системы трансляции из Е. coli 20 мкг поли( U) или 2 мкг поли( d.T. ).!, 60 мкМ /^С/фенилаланин или 60 мкМ /^С/лейцин. При трансляций одноцеиочечной формы ДНК фага MI3 в смеси присутствовали:полкнй набор аминокислот (20 мкМ), 10 мкМ -метионин и 20 мкМ нромицип. Пробы инкубировали 60 мин при 37 °С.

Электрофорез продуктов трансляции проводили в ПААГ по методу Лемши ( Larnnli, 1970). Длительность электрофореза 16 ч при напряжении 50 В и силе тока 10-15 мА на установку. После электрофореза гель окрашивали, высушивали и делали его радиоавтограф на рентгеновской пленке, по которому можно судить о положении меченного продукта на геле.

Трансляцию полинуклеотидов в системе из therniopiiiiua проводили в смеси, содержащей 50 мкг 70S рибосом, любезно предоставленных .В.В.Широковым (Ин-т белка, Пущино), 100 мкг /14С/фе-нилаланил-тРНК, 40 мкг поли( и ) или 8 мкг поли( ¿'f ), 100 мМ хш4С1, 20 мМ ;MsCl2,1 мМ дитиотреитол, 20 мМ Трис-HCi (pHg5 о^

7 5), прединкубированную при 25 °С и дополненную 60 мкг ферментной фракции, 3, мМ АТР, 0,4 мМ gep.IO мкМ /14С'/фенилаланином, 20 мкг суммарного препарата тРНК из E.coli. Конечны?, оЗъем смеси составлял ,50 мкл. Синтез фенилаланкна проводили при 65 °С . 65 мин.

Олиголейцины, образующиеся в системе трансляции, разделяли с помощью нисходящей хроматографии на бумаге №-1^ в растворителе н-бутанол-уксуеная кислота-вода (78:5:17).

Рис. I. Зависимость

включения /14С/фенилаланина в продукт трансляции полнот) от концентрации ионов магния в присутствии: неомицина (о), канамицина (V), стрептомицина (а) и без антибиотика (•) в бесклеточной системе биосинтеза белка из Е.соИ миЕ-бОО. По горизонтали -концентрация Ше2+, мМ

результаты исследования и их обсуждение

I. Сравнительное изучение трансляции поли(ц) и поли( dl) в бесклеточных прокариотических системах трансляции

Бесклеточная система трансляции из E.coli обладает выраженной чувствительностью к структуре сахарофосфатного остатка матриц. Трансляция пезоксирибоматрицы поли( <Ы ) невозможна при условиях, благоприятных оля трансляции ее рибоаналога поли(И ). Усложнение композиции солевого состава системы - использование "полимикс" буфера - качественно не изменило ситуации и не сделало возможной трансляцию поли( dT ). Введение в систему повышенного количества полиаминов спермина и с перш пина (но не путресцина), увеличение концентрации ионов магния несколько стимулировало считывание по-ли(<1Т ), но эффективность декодирования деэоксирибоматрицы оставалась довольно низкой. И лишь внесение в систему антибиотика делало возможным эффективную трансляцию поли(<1Т ). Эффективность трансляции, вызываемая исследованными антибиотиками, распределялась следующим образом: в присутствии неомицина > канамицина > стрептомицина (рис. I). Действие указанных антибиотиков носит высокоспецифичный характер и не может быть воспроизведено более просто организованными полиаминами.

Сущестьенннм параметром, характеризующим трансляцию, является

i s

X

ч

CS

X ш

>а

1,6

с,8

0,4

точность. Особенно остро этот вопрос стоит при трансляции дезо-ксирибоматриц.,Во-первых, было важно ¡характеризовать этот параметр, чтобы показать, что трансляция дезоксирибоматриц не альтернативный путь полимеризации аминокислот в присутствии другого типа матриц, а трансляция, подчиняющаяся правилу генетического кода; во-вторых, условия, в которых происходит трансляция дезокси-рибома[триц, известны как благоприятные для ошибок декодирования рибонуклеотидньк матриц. Литературные данные, касающиеся этой проблемы, немногочислены, но довольно единообразны. Работы, выполненные на гетеродезоксирибополинуклеотидах, свидетельствуют о том, что спектр аминокислот, включаемых в.продукт их трансляции, в. присутствии нёомицина совпадает с показанием для их рибоанало-гов в отсутствие антибиотиков. Проведенный нами анализ показал, что количество ошибочно включаемого лейцина в продукт трансляции полиСат ). в присутствии антибиотиков не превышает уровень ошибочного включения лейцина в продукт трансляции поли( и) без антибиотика (табл. I). •

Таблица I *

Ошибочное включение/4С/лейцина' в продукг трансляции поли( и) и поли( ¿1) в присутствии антибиотиков: стрептомицина, канамицина, неомицина в бесклеточной системе трансляции из е.оон (мне-боо)

Антибиотик 'поли( и) ■ поли(■ ат)

лейцин, .пмоль фенил-аланин, пмоль лейцин фенил-аланин лейцин, пмоль фенил-аланин пмоль лейцин , фенил-аланин

Без антибиотика 10,9 107 0,10 ^ _

Стрептомицин 24,0 73,0 0,3о 2,5 149 0,017

Канамицин 19,0 48,0 0,40 3,8 167 0,023

Неомицин 17,4 •24,0 0,73 12,2 236 0,052

" В таблице представлены максимальные значения количеств ошибочно включаемой аминокислоты при условиях (концентрация ионов магния и антибиотика), наиболее благоприятных для такого включения.

Таким образом, по-видимому, не только сохраняется кодовая специфичность при трансляции дезоксирибоматрину, но и точность этой трансляции достаточно высока.

Однако для того, чтобы говорить об "осмысленности" трансляции дезоксирибоматрицы необходимо проверить возможность трансляции генов. В качестве гетерополимерной дезоксирибоматрицы мы использовали одноцепочечную форму ДНК фага MI3, являющуюся дезокси-рибоаналогом мРНК. этого фага. Трансляция этой матрицы в отсутствие антибиотика была невозможной. Антибиотик неомицин стимулировал эту трансляцию. Среди продуктов трансляции этой матрицы присутствовал высокомолекулярный полипептид (мол,вес около 20-30 кД), количество которого зависело от концентрации ионов магния. При низких концентрациях магния его появление стимулировалось внесением в систему трансляции предобразованной üiet-rPHIC Это свипетельствует в пользу неслучайного характера считывания данной матрицы в присутствии неомицина, осуществляемого, по-видимому, начиная с инициаторного ДНК-кодона. Таким образом, основные закономерности трансляции поли( d'i), по-видимому, характерны и для гетерополинуклеотидной ДНК-матрицы.

Трансляция дезоксирибоматрицы наблюдалась ранее в'бесклеточной белоксинтезирующей системе только одного представителя прокариот - грам-отрицательной бактерии E.coli. Для изучения степени универсальности выявленных закономерностей нами была предпринята попытка трансляции поли( dl) в белоксинтезируюцих системах из других прокариот. Как показали исследования, трансляция полиС dl) становится возможной в бесклеточной системе трансляции из грам-по-ложительных бактерий B.subtiiis в присутствии неомицина или канамицина, а также в системе трансляции термофильных: бактерий т.th.ermophiius в присутствии неомицина (рис. 2). Трансляционная активность бесклеточных белоксинтезирующих: систем из различных прокариот ( E.coli, B.subtiiis, Г. thermophiius ) В отношении

матриц поли(и ) и поли( ЛИ), несмотря на ряд особенностей, качественно сходны. В отсутствие антибиотика возможна трансляция лишь рибонуклеотидной матрицы поли( и), но не ее дезоксирибоаналога поли( dl). При добавлении антибиотипа во всех трех случаях отмечена резкая стимуляция матричной активности поли(аТ ) на фоне существенного угнетения трансляции поли( и). Иными словам!, все три

л ч о

о

0

1

поли( ад )

8

поли (и )

поли( аз?)

поли( и)

X

О) §

10 15 20

Концентрация

Рис.2. Зависимость включения /^С/фенилаланина в

продукт трансляции поли( и ) (□,■) И ПОЛИ(йГ) (о,») от концентрации ионов магния в присутствии антибиотика неомицина (■,•) и без антибиотика (а,о) в бесклеточной системе трансляции из Т.-ъьегторЬ-Низ (А) и в.зиЪ-ьшс (Б)

тестированные системы белкового синтеза характеризуются выраженной специфичностью к структуре сахарного остатка матрицы и возможностью изменения этой специфичности по принципу "либо рибо-, либо дезоксирибоматрица".

2. Изучение корреляции между точностью трансляции полиС и) и эффективностью трансляции поли(.йТ ) .

Гипотеза стереоспецифической стабилизации кодон-антикодоновых комплексов постулирует прямое взаимодействие декодирующего центра рибосомы с сахарофосфатным остовом кодон-антикодоновой пары, как с единым целым (Потапов, 1982,1985). Согласно данной гипотезе, возможность декодирования дезоксирибоматрицы, например поли( йт), связана с необходимостью изменения стереоспецифичности декодирующего центра рибосомы ( его реформация ), что, скорее всего, должно приводить к увеличению частоты ошибок отбора аминоацил-тРНК при трансляции соответствующего рибонуклеотидного аналога поли( и).

Известно, что аминогликозидные антибиотик» стрептомицин, канамицин и неомицин, повышенная концентрация ионов магния, мутации в рибосомном белке si2 способны изменять точность трансляции поли( U) в бесклеточной системе биосинтеза белка из е. coli. Эти же антибиотики и повышенная концентрация ионов ms гния стимулируют трансляцию поли( dT ).

Мы попытались комплексно изучить влияние указанных факторов, изменяющих точность трансляции поли( U) на эффективность трансляции поли( dr) с целью выявления предполагаемой корреляции между глубиной индукции ошибочного включения лейцина в продукт трансляции поли( U) и эффективностью поли( dT )-эависимого синтеза лоли-фенилаланина.

Влияние мутаций в рибосомном белке SI2 на эффективность трансляции поли( dT) исследовали в бесклеточных белоксинтезирущих системах из дикого штамма ХАс и трех производных от него изоген-ных штаммов üb 455, uL 4-77,uL 435с м"тацией в белке312! rpsL 224 rpsL 282, rpsL 1204 соответственно. Наличие мутаций проверяли по чувствительности систем трансляций из различных штаммов к стрептомицину.

Оценку эффективности трансляции поли( dT) в бесклеточной системе из указанных штаммов проводили в тех же условиях, что и трансляцию поли( U), но в присутствии 50 мкМ неомицина (рис. 3). Для всех мутантньк штаммов эффективность трансляции поли( dl) не превышала таковой для поли( и). Для исходного же штамма наблюдалось обратное соотношение - эффективность трансляции поли( dT) в 2 раза превосходила эффективность трансляции поли( и). Указанное соотношение эффективностей трансляции поли( и) и поли( dl) устойчиво воспроизводилось в широком диапазоне концентраций ионов магния. Таким образом, эффективность трансляции поли( dT) рибосомами с мутацией в белке si2 ниже, чем исходными рибосомами. Мутации, уменьшающие частоту ошибок при выборе антикодона, также уменьшают способность рибосом к считыванию "ошибочного" дезоксирибокодона комплементарным антикодоном.

Два штамма: дикий ХАс и штамм с мутацией ipaL 224, характеризующийся наибольшей точностью трансляции поли( U), были выбраны для изучени;>степени корреляции между ошибочным прочтением полир) матрицы и эффективностью трансляции поли( dT). Активность бескле-

Концентрация мМ

Рис. 3. Зависимость включения / С/фенилаланина в продукт трансляции поли( и) и полис ¿т) от концентрации ионов магния: А - в бесклеточной системе трансляции из исходного штамма Мс; Б,В,Г - в бесклеточных системах трансляции из штаммов с мутацией в белке Б12» иЬ 453, и!, 477, иЬ соответственно; (•) - в отсутствие антибиотика, (о) - в присутствии мкм неомицина

точных систем из указанных штаммов в поли( и)-зависимом синтезе полифенилаланина в отсутствие антибиотика была примерно одинаковая. На рис. 4 показано влияние неомицина, канамицина, стрептомицина на эффективность и точность трансляции поли( и) в обоих изучаемых штаммах. В присутствии неомицина и канамицина показатель точности трансляции поли( и) был соответственно в 2 и 1,5 раза

sr

и

о -t"

s

X cd tt

d §

r.

0) •P-

0) 03 Й s

c3

r-1 (H

А Б

1 1 .-• — •

Антибиотик, мкМ

ca 4

CO §

X

0>

t

0) N

I

ts

Рис. 4. Зависимость включения /^О/фенилаланина (л),

^О/лейцина (*) в поли( и )-зависимый продукт трансляции и показателя точности трансляции поли( U) I 0) от концентрации антибиотиков неомицина (А,Б); канамицина (В,Г); стрептомицина (Д,Е); в бесклеточных системах биосинтеза белка из штаммов В.coli (А,В,Д - ХАс, Б,Г,Е - uL 435)

рыше для системы из мутированного штамма, чем из дикого. Практически такая же разница наблюдалась для эффективности трансляции Поли( ¿Т) (рис. 5).

Стрептомицин не оказывал влияние на трансляцию поли( и) а не стимулировал трансляцию поли( йт) в бесклеточной системе из штамма-мутанта, тогда как в системе из дикого штамма стрептомицин стимулировал как трансляцию поли( <Ш), так и ошибочное

о Антибиотик, мкМ

& Рис. 5. Зависимость включения /14С/фенилаланина в

Р продукт трансляции поли( <И) от концентрации антибиотиков: неомицина (•); канамицина (А).;, стрептомицина (о) в бесклеточных системах из штаммов йеооН (А - ХАс, Б - цъ 433)

включение лейцина в продукт трансляции поли( и) (рис. 4 и 5).

Важно отметить, что влияние, оказываемое антибиотиками на эффективность и точность трансляции поли( и) так же, как и на эффективность декодирования поли( <1Т ) описывается одним рядом: неомицин > канамицин > стрептомицин. Это справедливо для обеих тестированных систем, хотя система трансляции из дикого штамма была более чувствительной к действию антибиотиков.

Влияние концентрации ионов магния на показатель точности трансляции полиС и) и эффективность трансляции псли( сЗТ) представлено на рис. 'б. В обоих случаях стимуляциокный эффект наблюдался в диапазоне концентраций ионов магния 19-31 мМ, и был более ярко выражен для системы трансляции из дикого, чем из мутированного штамма.

Полученные результаты позволяют заключить, что весьма различные по своей природе факторы, ■ изменяющие точность трансляции по-ли(и ), изменяют и эффективность декодирования полнот ). Прослеживается отчетливая положительная корреляция между неоднозначностью трансляции рибонумеотидной матрицы и эффективностью трансляции ее дезоксирибоаналога. По мере увеличения глубины индукции-

[3

к

к и

4

я g

5

<D

о

'rf

« g

зо

20

10

9-9 «

-О-О-

-cT

?o X о

31

к <a о

0

1

19 25 31 7 19 2?

•s

Концентрация üe^'1' , мМ """

Рис. 6. Зависимость включения /^О/фенилаланина (о) в продукт трансляции_пели( dl) и показателя точности трансляции поли (а ) ( о ) от концентрации ионов магния в бесклеточннх системах трансляции из штаммов s. coli (А - X/w, Б - uL 4-33)

ошибок декодирования поли( U) в ряду неомицин > канамицин > стрептомицин, возрастании концентрации каждого антибиотика и по-выгаения в среле концентрации ионов магния, а также при переходе от гиперточных рибосом с стацией в белке SI2 к исходным рибосомам имеет место пропорциональное увеличение эффективности псли(аТ) тависииого синтеза полифенилаланина. Обнаруженная корреляция изменения точности трансляции рибонуклеотияной матрицы и эффективности трансляции дезоксирибонуклеотивной матрицы, вряд ли случайна,скорее всего они отражают фундаментальную взаимосвязь 'указанных процессов Эту взаимосвязь определяет способ функционирования декодирующего центра рибосомы,а именно: его взаимодействие с сахарофосфатным остовом коаон-антикодонового комплекса как единым целым.

Эта точка зрения находит свое подтверждение в наблюдаемых особенностях действия антибиотиков и. ионов магния, 3 каждом конкретном случае,особенно ярко это прослеживается для антибиотиков, один и тот же агент вызывает закономерное и согласованное изменение сразу нескольких параметров системы: угнетение включения фе-нилаланина и.наоборот,стимуляцию включения лейцина в продукт трансляции пплй(и ) и фенилаланина в продукт трансляции поли(аг )• Слецует отметить,что эффективность трансляции поли(dl )в'присутст-Г!!И антибштш« вполне соизмерила с' эф^ктишостьк трансляции

Б

«

®

псли(О ) в его отсутствие. Иными словами, наблюдаемый эффект не связан с инактивацией каких-либо компонентов системы трансляции,а отражает изменение критериев отбора кодон-антикодоновых пар.

Влияние указанных антибиотиков опосревовано воздействием на рибосому, о чем свидетельствует зависимость глубины эффекта от структурного состояния рибосомного белка 812,а также данные других авторов. Поэтому, отмеченные изменения отбора кодон-антикодоновых комплексов,по-видимому,определяются деформацией структуры рибосомы и, в первую очередь, их декодирующего центра. Б результате комплекс рибокодона поли( и) с комплементарным антикодоном тРНК №е утрачивает свойство явной функциональной предпочтительности.Комплекс же "рибокодона" поли( и) с ошибочным неспецифичным антикодоном тРНК 1,611 и в еще большей мере комплекс ошибочного "дезоксирибо-кодона" поли( ой?) с комплементарным антикодоном (тРШП1е) узнаются и использувтся рибосомой с резко возросшей эффективностью.Это свидетельствует об оценке рибосомой структуры кодон-антикодоновых комплексов и изменении правил таком оценки в пользу некоторых нес-

V

тандартных их вариантов.

3. Некоторые особенности действия антибиотиков неомицина,канамицина,стрептомицина на процесс декодирования

Результаты воздействия трех исследуемых нами антибиотиков: неомицина, канамицина, стрептомицина на бесклеточную систецу трансляций в основном сходны. Однако ряд отличий все же существует, особенно между характером воздействия стрептомицина и дезоксистреп-тамшс о,держащих аминогликозидов неомицина и канамицина. В отличие от стрептомицина в действии неомицина и канамицина прослеживается более одной составляющей. При малых концентрациях антибиотиков хорошо выражена специфичность их действия на систему трансляции,состоящая в резком изменении параметров декодирования поли( и) и поли ( <М?). С увеличением концентрации неомицина и канамицина наблюдается неспецифическая инактивация всех изучаемых активностей системы. Это согласуется со сведениями о 'наличии на 70Б рибосоме одного места связывания для стрептомицина и более одного для неомицина и канамицина. Существуют и некоторые количественные различия в действии стрептомицина и канамицина или неомицина. Так, абсолютное количество ошибочно включаемого лейцина в продукт трансляции поли(и )

If

в присутствии стрептомицина больше, чем в присутствии неомицина или канамицина, однако процентное содержание его в полипептиие меньше. Канамицин и неомицин оказались более сильными стимуляторами трансляции поли( ¿Т ) и ингибиторами трансляции поли(и ), чем стрептомицин. Это в какой-то степени может быть связе-но с различной локализацией указанных антибиотиков на рибосоме и воздействием их на различные ставии трансляции. Так, показано, что стрептомицин оказывает более сильное воздействие на отбор аминоацил-тРНК на рибосоме,особенно, на ставию повторной коррекции "proofreading" тогда как дезоксистрептамины воздействуют как на стадию отбора аминоацил-тРНК, так и на стадию транслокации. Влияние дезоксист-рептаминов на транслокацию было показано как в случае ингибирова-ния трансляции рибоматрицы, так и при стимуляции трансляции дезо-ксирибоматрицы. Мы показали, что стимуляция ошибок трансляции по-ли(и ) в присутствии дезоксистрептаминов также связана с воздействием на стадию транслокации. Таким образом, изменение в конфор-мации декодирующего центра рибосомы, вызываемое антибиотикам! и имеющее значение эля иодон-знтикоэонорого взаимодействия, также мояет быть существенным аля транслокации.

Влияние стрептомицина и дезоксистрептаминов на различные стадии элонгации, возг.;стно, связано с тем, что их действие направлено на разные области рибосомы, принимающие участие в тРНК-рибоссм-ных взаимодействиях. Мы изучили совместное действие антибиотиков неомицина и стрептомицина, канамицина и стрептомицина на параметры трансляции поли(U ) и поли(<1Т ). Простого суммирования эффектов действия двух антибиотиков не наблюдалось ни при стимуляции трансляции поли('-1Т ), ни при ингибировании трансляции поли(и ), ни при стимуляции ошибочного включения лейцина в продукт трансляции п.оли(и ) (рис. 7). Таким образом, действие этих антибиотиков,скорее всего, направлено на овин участок рибосомы.

Исслезуя концентрационную зависимость действия антибиотиков на трансляцию поли(Ч ) и поли(ат ),определяли константу диссоциации антибиотика из функционально значимого сайта его связывания на рибосоме. Для этого использовали простейшую кинетическую модель соответствующую схеме Еоттса-Моралеса для ферментативной реакции в присутств.т ингибиторов или активаторов. Результаты вычисления представлены в таблице. Представленные в таблице константы диссоциации для канамицина и стрептомицина довольно хорошо соответствуют

Канамицин, шН

тд Рис. 7. Зависимость включения /^С/фенилаланина (А,В) и / С/лейцина (Б,Г) в продукт трансляции поли( и ) и поли( dl) (d,b) в присутствии антибиотика стрептомицина (•i*,8) и без него от концентрации антибиотика нео-

мицина(А,Б) и канамицина (В,Г) в бесклеточной системе трансляции из E.coli ИВЕ 600

описанным в литературе, измеренным с помощью меченых аналогов антибиотиков. Это говорит о возможности использования выбранного нами метода для вычисления констант диссоциации антибиотиков. Полученные результаты свидетельствуют об одновременном присутствии обоих антибиотиков на рибосоме: стрептомицина и канамицина или неомицина. Это означает, что функционально значимые сайты связывания этих антибиотиков на рибосоме различны и вместе с тем

взаимозависимы, так как присутствие стрептомицина на рибосоме увеличивает константу связывания для неомицина и канамицина.

Таблица. Константы диссоциации антибиотиков из

функционально значимых сайтов на рибосгме

Константа диссоциации х 10

антибиотика из рибосомы,вычисленная для сайта связывания,ответственного:

Антистатик - за ингибирование трансляции поли®) за стимуляцию трансляции полиС'1'

Неомицин 0,12 0,23

Неомицин в присутствии 0,042 0,092

стрептомицина

Канамицин 2,7 9,3

Канамицин в присутствии 0,87

стрептомицина 1,0

Стрептомицин 1,03 0,61

вызолы

1.Бесклеточные системы белкового синтеза из В. subtilis,

T. thompphilus, подобно системам из Е. coli, характеризуются выраженной специфичностью к структуре сахарного остатка матриц и возможностью изменения этой специфичности по принцип;/ "либо рибо-, либо дезоксирибоматрица".

2. Трансляция поли( dï) в бесклеточной белоксинтезирующей системе из е.coli в присутствии антибиотиков неомицина,канамицина, стрептомицина характеризуется эффективностью и точностью не меньшими, чем при трансляции поли(и ) в отсутствие антибиотиков. Показана возможность образования высокополимерного продукта при трансляции одноцепочечной формы .JWK фага MI3.

3. Обнаружена положительная корреляция между эффективностью трансляции дечоксирибоматрицы поли(dT ) и неоднозначностью трансляции ее рибоаналога поли(0 ) в присутствии различных факторов: аминогликозидных антибиотиков неомицина,канамицина и стрептомицина , повышенной концентрации ионов магния, мутаций в рибосомном белке SI2,котор&е,по-видимому,влияют на взаимодействие декодирующего центра рибосомы с кодон-антикодоновым комплексом,как единым целым.

4. Увеличение количества ошибочно включаемого лейцина в продукт трансляции полиШ ) и лоли( йТ) в присутствии антибиотика стрептомицина, по-видимому, вызвано стимуляцией связывания лейцил-тРНК с рибосомой, тогда как неомицин и канамицин воздействуют к на стадию транслокации.

5. Анализ совместного влияния антибиотиков неомицина и стрептомицина, канамицина и стрептомицина на систему трансляции свидетельствует в пользу единого механизма их действия, направленного на один и тот же функциональный участок рибосомы.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Potapov А.Р. , Groisman I.S, . El'sleaya A.V. Correlation between poljCü) nisreading end poly(dl) translation efficiency in E.coli cell-free system // Biochioie. - 1990. - V.72. -

P. W-349.

2. Гройсман И.С., Потапов А.П. Влияние мутац.:й белка Escherichia coli на эффективность трансляции дезоксирибополинуклеотид-ной матрицы полиТdl ) // Биополимеры и клетка. - 1969. - Т. 5,

У 6. - С. T0I-I04. ^

3. Гройсман И.С., Потапов А.П. Изучение корреляции между точностью трансляции поли(Ч ) и эффективностью декодирования поли(4Г) в бесклеточных белонсинтезипущих системах ^Escherichia coli //Биополимеры и клетка. - 19Б9. - Т. 5, Ii 5. - С. 70-75.

4. Potapov А.P., Groisman I.S., Soldatkiin К.A., Kovalchuk О.V., El'staja A.V. The role of a oodon-anticodon sugarphosphate backbone in aminoacyl-tRNA selection at the ribosone // IJth International tBBA workshop. - Vancouver (Canada),1909.-P.TU-54.

5. El'ekaya A,V., Potapov A.P., Soldatkin K.A., Groisman I.S., Koval1chuk O.V. Study cn molecular oechanisms of aainoacyl-tEIlA selection at the ribosome П I9th Ueeting of the Federation of European Biochemical Bocietes.-Rone С Italy),1989.-P. TH-026.

6. Potapov A.P., Soldatkin K.A., Soldatkin A.P., Shulga N.I. Ovcharenko Q.V., Groieaan I.S., Eovalchuk O.V. On the role of su-gerphosphate baekbaaes of template and tliHA in the г1Ьозота1 decoding aechaniam // International Symposiua "Molecular organization of biological structures".-Moscow,I9Ö9.-Part II.-P.2

Иода, в печ. 19.07.91. Формат 60x84/16. Бумага тип. Офс.печать. Уол.печ.л.1,1С. Усл.кр.-отт.1,16.Уч.-изд.л.1,0.Тираж 100 экз. Зак. 50:- • Бесплатно.

СтШчаШИо И'Шатйтутё'ШтёттШй~Ш УССР'. ~ 252601 Киев 4, ГСП, ул. Репина, 3