Термодинамические и кинетические параметры взаимодействия транспортной РНК с А сайтом 70S рибосомы Escherichia coli: роль 37 нуклеотида

Коневега, Андрей Леонидович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Термодинамические и кинетические параметры взаимодействия транспортной РНК с А сайтом 70S рибосомы Escherichia coli: роль 37 нуклеотида
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Термодинамические и кинетические параметры взаимодействия транспортной РНК с А сайтом 70S рибосомы Escherichia coli: роль 37 нуклеотида"

На правах рукописи

КОНЕВЕГА Андрей Леонидович

ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ И КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТРАНСПОРТНОЙ РНК С А САЙТОМ 70S РИБОСОМЫ Escherichia coli: РОЛЬ 37 НУКЛЕОТИДА

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза белка Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН (г. Гатчина).

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Катунин Владимир Иванович.

доктор физико-математических наук Тулуб Александр Александрович,

Ведущая организация:

доктор биологических наук Шварцман Александр Львович.

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова. Химический факультет.

Защита состоится "_"_2005 г. в_ часов на заседании

диссертационного совета Д 212.229.25 при Санкт-Петербургском государственном политехническом университете по адресу: 195251, Санкт-Петербург, ул. Хлопина, д. 5, Факультет медицинской физики и биоинженерии СПбГПУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.

Автореферат диссертации разослан "_"_2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук Власова О.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Трансляция последовательности мРНК в полипептидную цепочку, происходящая на рибосомах, является важнейшим этапом реализации генетической информации. Присоединение очередной аминокислоты определяется комплементарностью между кодоном мРНК и антикодоном тРНК. Однако же, высокую точность трансляции, реализуемую in vivo, не удается объяснить на основании простых физико-химических расчетов, исходя из энергий водородных связей между тринуклеотидами кодона мРНК и антикодона тРНК. Очевидно, что в процесс декодирования должны быть вовлечены дополнительные механизмы повышения точности отбора корректных кодон-антикодоновых комплексов в А сайте рибосомы. На настоящий момент хорошо изучены основные механизмы контроля декодирования, осуществляемые рибосомой, а также определены отвечающие за них структурные элементы. С другой стороны, имеются многочисленные указания на то что каноническая, эволюционно консервативная структура другого участника процесса декодирования -молекулы тРНК - также вносит существенный вклад в повышение специфичности кодон-антикодонового взаимодействия на рибосоме.

Наибольшее внимание в этой связи привлекает структура антикодоновой петли тРНК, характеризующаяся как асимметрией расположения пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, так и присутствием модифицированных нуклеотидов. Эксперименты in vivo, а также изучение кодон-антикодонового взаимодействия в простых модельных системах in vitro показали существенность наличия модифицированного основания с 3' стороны от антикодона для эффективности кодон-антикодонового взаимодействия.

Очевидно, что для дальнейшего понимания молекулярного механизма функционирования тРНК при декодировании генетической информации (и роли отдельных структурных элементов тРНК в этом процессе) необходимо систематическое количественное изучение взаимодействия тРНК с мРНК в декодирующем (А) сайте рибосомы в модельной системе, максимально приближенной к ситуации, реализуемой in vivo.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлись изучение молекулярных механизмов декодирования генетической информации на рибосоме на уровне взаимодействия дрожжевой фенилаланиновой тРНК с А сайтом 70S рибосомы E. coli и выявление роли модифицированного пурина в 37 положении тРНК в кодон-антикодоновом взаимодействии.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи.

1. Получить препараты дрожжевой тРНК""1 с различными нуклеотидами в 37 положении путем транскрипции in vitro соответствующих генов на специально сконструированных плазмидах.

2. Изучить кинетические и термодинамические параметры кодон-антикодонового взаимодействия пептидил-тРНК№ с различными нуклеотидами в 37 положении с А сайтом 70S рибосом Е. coli.

3. Методами престационарной кинетики изучить модельное кодон-

PQC. НАЦИОНАЛЬНАЯ МБЛИОТЕКА

snsüt

антикодоновое взаимодействие в растворе при отсутствии рибосом.

4. Изучить влияние аминогликозидного антибиотика паромомицина на взаимодействие пептидил-тРНК с А сайтом рибосом.

5. Методами престационарной кинетики изучить взаимодействие аминоацил-тРНК с А сайтом 70S рибосом. Исследовать влияние нуклеотида в 37 положении TPHKPhe на кинетику реакций гидролиза GTP фактором элонгации EF-Tu и синтеза дипептида fMetPhe.

Научная новизна. Впервые исследована роль 37-го нуклеотида тРНК в кодон-антикодоновом взаимодействии в модельной системе [пепт-тРНК*А сайт 70S рибосомы] Измерены кинетические и равновесные константы кодон-антикодонового взаимодействия лепт-тРНК в А сайте рибосомного комплекса, определены его термодинамические параметры.

Впервые показано, что наличие пурина в положении 37 стабилизирует кодон-антикодоновое взаимодействие пепт-тРНК в А сайте рибосомы благодаря усилению стэкинг-взаимодействия. При этом установлено, что посттранскрипционная модификация пурина не вносит дополнительного вклада в энтальпию взаимодействия, т.е. не участвует в усилении стэкинга.

Впервые изучено влияние аминогликозидного антибиотика паромомицина на взаимодействие пепт-тРНК с А сайтом рибосомы.

Впервые установлено, что пепт-тРНК с различными нуклеотидами в 37 положении требуют привлечения разного количества ионов магния при образовании кодон-антикодонового комплекса с мРНК в А сайте рибосомы.

Для изучения престационарной кинетики взаимодействия двух тРНК с комплементарными антикодонами впервые применена методика остановленного потока. При этом показано, что для образования аналога кодон-антикодонового комплекса вне рибосомы привлечения дополнительных ионов магния не требуется.

Практическая значимость. Результаты работы дают существенно новую информацию для понимания механизма работы сложной молекулярной системы синтеза белка на рибосомах, также получены данные о механизме действия аминогликозидного антибиотика паромомицина. Полученные результаты могут быть использованы при интерпретации имеющихся в литературе данных рентгеноструктурного анализа бактериальных рибосом.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Международной конференции "tRNA 2000", 18th International tRNA Workshop, (Кембридж, Великобритания, 2000); 4-ой и 5-ой конференциях молодых ученых Отделения молекулярной и радиационной биофизики ПИЯФ РАН, (Гатчина, 2003,2004); Международной конференции "RNA-2003", 8th Annual Meeting of the RNA Society (Вена, Австрия, 2003); Международной конференции "The tRNA World", 20th International tRNA Workshop (Банц, Германия, 2003); 8-ой Международной Пущинской школе-конференции "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Пуриновое основание в 37 положении тРНК стабилизирует связывание тРНК в А сайте рибосомы за счет усиления стэкинг-взаимодействия и вовлечения дополнительных ионов магния при формировании комплекса тРНК*рибосома.

2. Аминогликозидный антибиотик паромомицин значительно стабилизирует связывание тРНК в А сайте и устраняет зависимость сродства тРНК от концентрации ионов Мg2+.

3. Для кодон-антикодонового взаимодействия в растворе при отсутствии рибосом не характерна зависимость константы диссоциации от концентрации ионов Мg2+.

4. Природа 37 нуклеотида тРНК влияет на скорость гидролиза GTP фактором элонгации EF-Tu.

5. Применение химерных молекул тРНК с заменами 37 нуклеотида и модельной системы [пепт-тРНК*А сайт 70S] позволяет провести сравнительное изучение и количественно охарактеризовать вклад 37 нуклеотида тРНК в кодон-антикодоновое взаимодействие. Использованные методы престационарной кинетики позволяют определить константы скоростей реакций взаимодействия аа-тРНК с А сайтом и определить лимитирующую роль реакции гидролиза GTP для химерных видов тРНК^.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на_

страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и

обсуждение, выводы. Материал иллюстрирован_рисунками и_

таблицами. Библиографический указатель включает_публикаций.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Обзор литературы. Рассмотрены современные данные по взаимодействию тРНК с А сайтом рибосомы в цикле элонгации. Обсуждаются механизмы, реализуемые рибосомой для селекции тРНК и структурные данные, полученные методами рентгеновской кристаллографии и криоэлектронной микроскопии. Приведены данные, сопоставляющие консервативные элементы антикодоновой петли с функционированием тРНК при осуществлении кодон-антикодонового взаимодействия.

Глава II. Материалы и методы. В работе проведено сравнительное изучение дрожжевых фенилаланиновых тРНК с различными нуклеотидами в 37 положении. Использовали следующие виды тРНК (в скобках приведены используемые далее обозначения): нативная дрожжевая TPHKPhe (Y37), содержащая в 37 положении Y-основание (уайбутин, модифицированный гуанин); четыре вида полученных in vitro транскриптов тРНК, содержащих в 37 положении гуанин - тРНК№ (Y37G), аденин, урацил или цитозин -TPHKPhe (Y37A), (Y37U), (Y37C), соответственно (см. рис. 1А); дрожжевую тРНК^ (Y37-) с отщепленным без разрыва сахарофосфатного остова Y-основанием (Katunin, 1994).

Для количественного определения тРНК, связанной с рибосомами,

применяли метод связывания рибосомных частиц высокоаффинными нитроцеллюлозными мембранами с последующим анализом количества радиоактивномеченой ([14С], [3Н]) тРНК на сцинтилляционном спектрометре.

Поскольку формирование комплекса [тРНК*тРНК] характеризуется гашением флуоресценции Y-основания дрожжевой тРНК™°, для изучения кинетики образования комплекса применяли метод остановленного потока.

Престационарную кинетику реакций гидролиза GTP и синтеза дипептида исследовали методом погашенного потока, анализируя радиоактивномеченые продукты реакций на сцинтилляционном спектрометре (изотопы 14С, 3Н) или методом авторадиографии (32Р).

2.1. Получение набора плазмид и синтез транскриптов тРНК "'. Плазмида p67YF0, содержащая ген дрожжевой фенилаланиновой тРНК под промотором РНК-полимеразы бактериофага Т7 (Sampson, 1988), была любезно предоставлена проф. О. Уленбеком (Prof. O.C. Uhlenbeck, Northwestern University, Evanston, IL, USA). Сайт-специфические замены G37A, G37T, G37C в гене тРНК были введены путем мутагенеза in vitro (с применением полимеразной цепной реакции) и подтверждены секвенированием плазмидной ДНК. Немодифицированные транскрипты тРНК были получены путем ферментативного синтеза in vitro с применением Т7 РНК-полимеразы. Обогащение аминоацил-тРНК ([14C]Phe-TPHKPhe) составляло 1400-1700 пмоль Phe /1 ед. А260. Все виды изучаемых аа-тРНК были полностью активны в реакциях цикла элонгации (образование тройного комплекса с EF-Tu и GTP, матрично-зависимое связывание с А сайтом рибосомы, активация и гидролиз GTP, синтез пептидной связи и последующая EF-G-зависимая транслокация пепт-тРНК).

Рис. 1. А. Структура антикодоновой петли дрожжевой тРНСв (Y37). Б. Пространственная структура антикодоновой петли тРНК и кодона мРНК в декодирующем центре рибосомы, полученная методом

анализа (Yusupov, дрожжевой тРНК^

рентгеноструктурного 2001). Выделены два кодона мРНК и основание Слева показан фрагмент тРНК в Р сайте.

Y37

2.2. Изучение кодон-антикодонового взаимодействия пептидил-тРНК в А сайте. 70S рибосомы Е. coli образовывали инициаторный комплекс, в Р сайте которого связана инициаторная fMet-TPHK'Met, а в А сайте экспонирован кодон UUU гетерополимерной мРНК (соответствующий фенилаланину). Таким образом формируется функциональное состояние рибосомы, в котором она готова к первому раунду удлинения пептидной цепи. Далее, РИе-тРНК™8 в составе тройного комплекса с фактором элонгации EF-Tu и GTP связывается с рибосомой, после чего происходит

синтез пептидной связи. В Р сайте полученного претранслокационного комплекса связана деацилированная тРНК'м°', а в А сайте - вновь синтезированная пептидил-тРНК, fMetPhe-TPHKphe, состоящая из дипептида fMetPhe и изучаемой тРНКт° Комплексы стабилизировали повышением концентрации ионов Мд2+, очищали от низкомолекулярных компонентов ультрацентрифугированием через градиент плотности сахарозы и хранили при -80°С (Коневега, 2004). После образования комплекса вся пепт-тРНК связана с рибосомами. При определенных условиях пепт-тРНК обратимо диссоциирует из рибосомного комплекса в раствор, а вновь установившийся равновесный уровень определяется стабильностью кодон-антикодонового взаимодействия тРНК в А сайте.

Изучение стабильности пепт-тРНК в А сайте проводили в буфере ТАКМх (50 мМ Трис-HCI, рН 7.5, 70 мМ NH4CI, 30 мМ KCI, X мМ MgCI2). Количество связанной с А сайтом радиоактивномеченой пепт-тРНК измеряли путем адсорбции рибосом на высокоафинных нитроцеллюлозных фильтрах (0.45 мкМ, Sartorius). Количественный анализ проводили на сцинтилляционном спектрометре Packard Liquid Scintillation Analyzer 2500TR. Из полученных кинетических кривых рассчитывали (МНК, программное обеспечение Scientist, Micromath Inc.) константы скоростей диссоциации (koff) из А сайта и ассоциации (kon) с А сайтом. Поскольку взаимодействие пепт-тРНК с рибосомами является обратимым, константы равновесия могут быть определены как Kd= koff/ kon

Термодинамические параметры связывания пепт-тРНК с 70S рибосомами определяли из линейных зависимостей Вант-Гоффа ln(K<j) = AH7RT-AS7R, где ДН° и AS° - изменение стандартной энтальпии и энтропии, a R - газовая постоянная. Значения ДС вычисляли из экспериментально определенных величин Kd при 310 К в соответствии с уравнением AG°=RT,ln(K<)).

2.3. Изучение взаимодействия тРНК с взаимно комплементарными антикодонами. Для изучения престационарной кинетики формирования бимолекулярного комплекса [тРНКт°(У37)*тРНКа|и2] применяли метод остановленного потока. При связывании взаимно комплементарных антикодонов двух тРНК происходит сближение основания Y37 дрожжевой тРНК™° с серосодержащей модификацией основания mnm5s2U34 TPHKGlu2, что приводит к гашению флуоресценции основания Y37.

Измерения проводили на спектрометре SX. 18MV Stopped-flow spectrometer (Applied Photophysics Inc.). Возбуждение флуоресценции Y-основания проводили при длине волны 325 нм. Использовали временное окно (2 мс-10 с). Каждая кинетическая кривая является усреднением не менее 8 экспериментов. Константы скорости диссоциации бимолекулярного комплекса вычисляли, аппроксимируя кинетические кривые экспоненциальной зависимостью (МНК, программное обеспечение Scientist и GraphPad Prism). Константы скорости ассоциации рассчитывали из соответствующих кинетических кривых с использованием уравнения для

бимолекулярной обратимой реакции А + В С, где А - TPHKPhe(Y37), В -тРНКеи2 и С - их комплекс. При расчетах использовали значения кок, определенные из независимых экспериментов. Поскольку связывание является обратимым, равновесные константы диссоциации определяются как Kd = k0(( / kon.

2.4. Изучение кинетики реакций синтеза дипептида и гидролиза GTP.

Престационарную кинетику реакций гидролиза GTP фактором элонгации EF-Tu в составе тройного комплекса [ЕР-Ти*[7-32Р]ОТР*РЬю-тРНКте] и синтеза дипептида fMetPhe изучали методом погашенного потока. Использовалась установка Quench Flow (KinTek Instruments), время реакции варьировали от 2 мс до 100 с. Измерения проводили при температуре 20°С в полиамин-содержащем буфере TAKM35S05P8, (50 мМ Трис-HCI, рН 7.5, 70 мМ NH4CI, 30 мМ KCI, 3.5 мМ МдС12, 0.5 мМ спермидин, 8 мМ путресцин) (Gromadsky, 2004).

При анализе реакции гидролиза GTP использовали меченный радиоактивным изотопом препарат [y-32P]GTP; продукты реакции ([y-32P]GTP и [32Р]Р1) разделяли тонкослойной хроматографией (PolyGram CEL 300 PEI, Macherey-Nagel) и определяли долю гидролизованного GTP. Использовали систему для беспленочной авторадиографии GS-525 Molecular Imager System и программное обеспечение для денситометрии Molecular Analyst v.1.5 (Bio-Rad). При анализе реакции синтеза дипептида использовали радиоактивномеченые аминокислоты ([14C]Phe и [3H]Met). Продукты реакции разделяли высокоэффективной жидкостной хроматографией (LiChrospher 100 RP-8, Merck) и проводили количественный анализ на сцинтилляционном спектрометре. Кинетические кривые реакций получали, исходя из количества GTP, гидролизованного за время реакции (либо [14С]-Рпе, включенного в состав дипептида за время реакции). Наблюдаемые константы скорости реакции (kow) определяли, аппроксимируя кинетические кривые экспоненциальной функцией (МНК, GraphPad Prism, v.3.00).

Главы III-IV посвящены изложению результатов и их обсуждению.

3. Изучение взаимодействия пепт-тРНК с А сайтом 70S рибосом. Для количественного изучения влияния нуклеотида в 37 положении тРНК на параметры кодон-антикодонового взаимодействия в А сайте была выбрана наиболее близкая к in vivo система. Исследовались свойства нативного субстрата А сайта 70S рибосомы, пептидил-тРНК, синтезированной in situ. Стабильность А-сайтового связывания пепт-тРНК (занимающей гибридное АУР состояние (Moazed, 1989) значительно ниже, чем у Phe-TPHKPhe в А/А состоянии (Semenkov, 2000). Это позволило проводить корректные измерения кинетики ее диссоциации до достижения равновесного уровня в достаточно широком диапазоне экспериментальных условий.

3.1. Природа 37 нуклеотида влияет на стабильность пепт-тРНК в А сайте. Изучение диссоциации претранслокационных комплексов (0.2 мкМ), образованных различными видами дрожжевой тРНК™°, в буфере ТАКМю при 37°С показало значительную разницу в стабильности связывания пепт-

тРНК в А сайте в зависимости от нуклеотида в 37 положении (рис. 2). Времена полураспада комплексов различаются более чем на порядок (от 4-5 минут (У3711.У370) до =50 минут (У37). Кроме того, равновесные константы диссоциации нативной тРНКрИе (У37) (К„=(7.6 ± 0.8)10-8 М) и транскрипта тРНК™9 (У37С) (Кй=(2.0 ± 0.4)10 6 М) различаются более чем на два порядка величины, причем этот эффект является следствием того, что меняются константы скоростей как ассоциации тРНК с А сайтом, так и диссоциации тРНК из А сайта. Перечисленные результаты указывают на значительное влияние, оказываемое 37-ым нуклеотидом на взаимодействие

Рис. 2. Влияние 37 нуклеотида дрожжевой тРНКрИе на стабильность пепт-тРНК в А сайте рибосомы. Нативная пепт-тРНКРИв (У37) (•), пепт-тРНК (У37С) (■), (У37А) (□), (У3711) (А) и (У37С) (Д) Измерения проводили при 37°С в буфере ТАКМ10.

3.2. Термодинамические параметры взаимодействия пепт-тРНК с А сайтом рибосомы. Структура антикодона тРНК стабилизируется стэкинг-взаимодействием между нуклеотидами 34-39 антикодоновой петли, которое может быть дополнительно усилено наличием модификации 37 нуклеотида (ваепдег, 1984). Удаление модификации или замена пурина пиримидином должно ослаблять стэкинг-взаимодействие (что характеризуется повышением энтальпии взаимодействия) и таким образом дестабилизировать кодон-антикодоновый дуплекс. Для проверки этого предположения были определены термодинамические параметры А-сайтового связывания для пепт-тРНК с заменами 37 нуклеотида.

Зависимости величин К от температуры измеряли в буфере ТАКМ при 10 мМ Мд2+, за исключением нативной пепт-тРНКрИе (У37) (измерения проводили при 6 мМ Мд2+) и пепт-тРНК™6 (У37-) (20 мМ Мд2+), поскольку при 10 мМ концентрации ионов Мд2+ стабильность соответствующих пепт-тРНК в А сайте была слишком высока или слишком мала для достоверного измерения равновесного уровня связывания. Линейный характер зависимостей 1°д(Ка) от 1°д[Мд2+] (см. пункт 3.3) позволяет определить соответствующие значения К для пепт-тРНКрИе (У37) и (У37-) при 10 мМ Мд2+ путем экстраполяции.

Стабильность связывания пепт-тРНК в А сайте уменьшалась с увеличением температуры для всех видов тРНК (показано для нативной ТРНК™е (У37) на рис. ЗА и тРНК (У3711) на рис. ЗБ). Немодифицированные пепт-тРНК с пурином в положении 37 связывались с А сайтом, как минимум, в 10 раз слабее, чем нативная пепт-тРНК. Построение зависимостей Вант-

пепт-тРНК с А сайтом рибосомы.

Гоффа (линейная зависимость 1од(Ка) от обратной температуры, рис. 4) показало, что углы наклона полученных зависимостей для нативной тРНК (У37) и транскриптов тРНК с пуриновыми основаниями в положении 37 очень близки, что указывает на близкие значения ДН0 (см. таблицу 1). Замена же 37 основания на пиримидин (У3711, У37С) либо удаление 37 основания (У37-) значительно меняют угол наклона. Значения ДН0 для тРНК с пиримидинами в 37-ом положении оказываются на 30 ккал/моль выше, чем для тРНК с пуриновыми основаниями.

Рис. 3. А. Кинетика диссоциации нативной дрожжевой пепт-тРНКри° (У37) (ТАКМ6, сверху вниз: 0, 29, 31, 33, 35, 37 и 39°С). Б. Кинетика диссоциации пепт-тРНКри° (У3711) (ТАКМ10, сверху вниз: 15, 20, 23, 26, 30, 34 и 37°С).

Таким образом, замена пурина в 37 положении на пиримидин приводит к значительному ослаблению стэкинг-взаимодействия в кодон-антикодоновом дуплексе, тогда как отсутствие посттранскрипционной модификации в37 заметного влияния на стэкинг-взаимодействие не оказывает.

Рис. 4. Зависимость К А-сайтового взаимодействия от обратной температуры для нативной дрожжевой пепт-тРНКри° (У37) (ТАКМб) (•) и экстраполяция к 10 мМ Мд2* (*); пепт-тРНК (У37-) (ТАКМ20) (О) и экстраполяция к 10 мМ Мд2*(0); пепт-тРНК (У370) (■), (У37А) (□), (У3711) (А) и(У37С) (Д)(ТАКМ10).

Значения ДБ0 для А-сайтового взаимодействия, определенные из зависимостей Вант-Гоффа, отрицательны для всех типов пепт-тРНК, что указывает на неблагоприятный энтропийный вклад в изменение свободной энергии формирования кодон-антикодонового дуплекса (см. таблицу 1). Вклад энтропийной составляющей особенно значителен (ТДЭ0 от -40 до -33 ккал/моль при 310 К) для пепт-тРНК, имеющих пурин в 37 положении; замена пурина на пиримидин повышала энтропийную составляющую до -7 ккал/моль, а удаление У-основания - до -6 ккал/моль.

Таблица 1

Термодинамические параметры взаимодействия пепт-тРНК™6 с А сайтом

пепт-тРНК [Мд2*],мМ дн°, ккал*моль-1 дс *, ккал*моль-1 ДБ", кал*моль-1*К-1 ТДБ" (310 К), ккал*моль-1

У37 6 -47 ±4 -8.5 ± 0.3 -125 ±11 -39 ±4

У37** 10 -47 ±4 -10.0 ±0.3 -120 ±11 -37 ±4

У370 10 -47 ±6 -6.9 ± 0.3 -128 ±19 -40 ±6

У37Д 10 -42 ±2 -8.6 ±0.1 -107 ±6 -33 ±2

У37и 10 -15 ±2 -8.2 ±0.1 -21 ±6 -7 ±2

У37С 10 -15 ±1 -8.1 ±0.1 -22 ±4 -7± 1

у ** 10 -14 ±1 -7.4 ± 0.1 -19 ±2 -6±1

-У 20 -14 ±1 -8.6 ± 0.1 -15 ±2 -5±1

* Значения Дб° вычислены из экспериментально определенных Ка при 310 К в соответствии суравнением ДЗ°=ЯТ*1п(Ка).

** Данные получены экстраполяцией соответствующих значений К на основании линейной зависимости !од(Ка)=Д+п*!од[Мд ] (см. пункт 3.3, рис. 5).

3.3. Роль ионов Мд2+ во взаимодействии пепт-тРНК с А сайтом.

Из литературы известно, что ионы Мд2+ играют важную роль в процессе взаимодействия тРНК с рибосомой. Нами были изучены равновесные и кинетические параметры взаимодействия тРНК с А сайтом при различных концентрациях ионов Мд2*. Стабильность связывания всех видов тРНК с А сайтом уменьшается с понижением концентрации Мд2+ (рис. 5). Для достижения одного и того же значения К для пепт-тРНК с пиримидином в 37 положении (У3711, У370) или тРНК (У37-) требуется присутствие более высокой концентрации ионов Мд2*, чем для пурин-содержащих пепт-тРНК (У37, У37Д, У370).

Для равновесной системы связывания пепт-тРНК с рибосомами вида 705*(Мд2)а+пепт-тРНК™'*(Мд2+)ь+п*Мд2+ 705-пепт-тРНК™'* (Мд2+)с верно соотношение: ^-!од(Кф) / Щ1од[Мд2+]) = п, где п=о-(а+Ь) (коэффициент линейной зависимости !од(Ка) от !од[Мд2*], см. рис. 5) - количество ионов магния, привлекаемое при формировании комплекса [708*пепт-тРНКРИе].

Рис. 5. Зависимость К А-сайтового взаимодействия пепт-тРНКРИе от концентрации ионов Мп2\ пепт-тРНК"" (У37) (•), (У37С) (■), (У37А) (□), (У3711) (А), (У37С) (Д), (У37-) (О) и (У37С) в присутствии 10 мкМ паромомицина

Для нативной дрожжевой пепт-тРНКт° измеренное значение п (5 ионов Мд2+) совпадает с полученным ранее для пепт-тРНК™9 из E.coli (Semenkov, 2000). Для тРНК, имеющей аденин в 37 положении (Y37A), п = 5 , однако в случае немодифицированного гуанина п = 4, а замена на пиримидин или удаление Y-основания (Y37U, Y37C, Y37-) приводят к уменьшению п до 3. Таким образом, наличие пуринового основания в 37 положении антикодоновой петли тРНК приводит к привлечению дополнительных функционально важных ионов Мд2+ при формировании конечного стабильного кодон-антикодонового комплекса. Данный подход дает нам информацию об изменении общего числа ионов Мд2+ при формировании комплекса, однако структурное расположение этих ионов неизвестно.

3.4. Влияние паромомицина на взаимодействие пепт-тРНК с А сайтом. Анализ опубликованных ранее рентгеноструктурных данных выявил три иона Мд2+, расположенных в декодирующем центре рибосомы, локализованном на 30S субчастице, причем два из них связаны с основаниями А1492 и А1493 в спирали 44 16S рРНК. Показано также, что эти ионы могут быть специфически замещены аминогликозидным антибиотиком паромомицином (Од^, 2001). Мы предположили, что такое замещение может помочь в идентификации структурного расположения ионов магния, для связывания которых важно присутствие пуринового основания в 37 положении тРНК. Для проверки этого предположения было изучено взаимодействие пепт-тРНК с А сайтом рибосом при различных концентрациях ионов Мд2+ в присутствии 10 мкМ паромомицина. Паромомицин сильно стабилизировал А-сайтовое связывание всех видов пепт-тРНК: Kd тРНК (Y37) уменьшалась с 80 нМ до 1 нМ, a Kd тРНК (Y37C) уменьшалась с 2000 нМ до 25 нМ (37°С, 10 мМ MgCI2). Примечательно, что в присутствии паромомицина связывание пепт-тРНК с А сайтом оказалось не только более прочным, но также и практически не зависящим от концентрации ионов Мд2+ (показано для (Y37C) на рис. 5). Это указывает на то, что связывание паромомицина оказывает более сложное влияние на структуру декодирующего центра, нежели просто замещение сайтов связывания ионов Мд2+ в 44 спирали 16S рРНК.

3.5. Роль ионов Mg2t в кодон-антикодоновом взаимодействии при отсутствии рибосом. Другим возможным объектом локализации ионов Мд2+, участвующих в формировании координационных связей при кодон-антикодоновом взаимодействии тРНК с рибосомами, может являться сама молекула тРНК. Данные рентгеноструктурного анализа выявили несколько ионов Мд2+ в определенных участках молекулы тРНК (Shi, 2000). При этом часть ионов связана относительно прочно и участвует в формировании третичной структуры тРНК, тогда как другая часть, по-видимому, осуществляет лишь некоторую тонкую настройку структуры в районе участка связывания. Последние могут, в числе прочего, влиять и на формирование кодон-антикодонового комплекса при взаимодействии с рибосомой. В том случае, если именно ионы, ассоциированные с молекулой тРНК, приводят к

наличию зависимости кодон-антикодонового взаимодеиствия от концентрации Мд2+, логично было бы ожидать сохранения такоИ же зависимости и при имитации кодон-антикодонового взаимодействия в системе без рибосом. С целью проверки данного предположения была применена безрибосомная модельная система - взаимодействие двух тРНК с взаимно комплементарными антикодонами (Grosjean, 1976). Методом остановленного потока изучали кинетику формирования комплекса тРНКРИе из дрожжей (антикодон 5'-GmAAY37-3') и глютаминовой тРНК°'и2 из Е. coli (антикодон 5'-mnm5s2UUCm2A37-3'). Образование бинарного комплекса характеризуется гашением флуоресценции основания Y37 дрожжевой тРНКРИе (рис. 6А, 4). Диссоциация комплекса характеризуется сенсибилизацией флуоресценции основания Y37 (рис. 6А, 2 и 3).

2 3 -2.3 -2.1 -1.9 -1.7 -1.5

Время, с log [Mg!*]

Рис. 6. Образование комплекса тРНКт° (Y37) с tPHKGIU2 (E. coli). А. Кинетические кривые, изменение флуоресценции основания Y37. 1. Контроль: отсутствие изменения флуоресценции при взаимодействии дрожжевой тРНКт° (Y37) с TPHKGIU2 (некомплементарный антикодон 5'-CCG-3'). 2. Диссоциация комплекса при добавлении тРНКт° из E.coli. 3. Диссоциация комплекса при его разбавлении в 2 раза. 4. Формирование комплекса [тРНКт° (Y37)*TPHKGIU2]. 5. Контроль: отсутствие изменения флуоресценции при взаимодействии TPHKPhe (E. coli), не имеющей флуорофора (Y-основания) с тРНК01"2 (E. coli). Б. Зависимость К от концентрации ионов Мд2+ для комплекса [тРНКт°

взято из рис. 5).

Таблица 2

Кинетические и равновесные параметры образования комплекса [ТРНКРИв(У37)«ТРНК3|и2]. Измерения проводили в буфереТАКМХпри 10.5°С

[МдСУ, мМ к«, с"1 kon, с 1-мкМ-1 Kd, М

5 0.73 ± 0.01 1.00 ±0.01 (0.73 ±0.01 *10-6

10 0.64 ± 0.01 1.23 ±0.01 (0.52 ±0.01 *10-6

15 0.59 ±0.01 1.37 ±0.01 (0.43 ± 0.01 )*10-6

20 0.56 ± 0.01 1.38 ±0.01 (0.40 ± 0.01 )*10-8

25 0.55 ±0.01 1.34 ±0.02 (0.41 ± 0.01 )*10-6

При 10 мМ Мд2

10.5°С измеренные величины kon= 1.2 с-1-мкМ-1,

koff=0.64 с-1 и, соответственно, Kd = 0.52 рМ, что близко к значению,

(Y37)*TPHK ] (О) (10.5°С) и для комплекса [А сайт^пепт-тРН^ОЗ/')] (•) (37°С,

полученному ранее (Огс^еап, 1978). Изменение концентрации МдС12 в диапазоне 5-25 мМ не привело к значительному изменению К< (см. таблицу 2). Тангенс угла наклона полученной зависимости 1од(Кс1) от 1сд[Мд2+] равен 0.3 (рис. 6В). Следовательно, образование кодон-антикодонового комплекса в растворе при отсутствии рибосомы не приводит к изменению числа ионов Мд2+, связанных с молекулой тРНК.

3.6. Кинетика взаимодействия пепт-тРНК с А сайтом. Структура 37 нуклеотида тРНК оказывала также влияние и на константы скоростей диссоциации (ксИ) и ассоциации (ксп) пепт-тРНК с А сайтом. При 37°С и 10 мМ Мд2+ пепт-тРНК с пиримидином в 37 положении быстрее связываются с А сайтом и быстрее диссоциируют из А сайта по сравнению с пуринз7-содержащими пепт-тРНК. Анализ температурных зависимостей показывает, что значения к^ увеличиваются с повышением температуры (рис. 7А). При этом угол наклона зависимостей Аррениуса примерно одинаков для всех типов тРНК, из чего следует, что энергии активации и энтальпии (Еа и ДН*) реакции диссоциации близки по своим значениям, а различия в константах скоростей связаны в основном с разницей в энтропиях активации.

Рис. 7. Температурные зависимости констант скоростей диссоциации (А) и ассоциации (Б) для пепт-тРШС9 (У37) (•), ТАКМв; (У370) (■), (У37А) {□), (У3711) (А), (У37С) (Д), ТАКМ10 и (У37-) (О),ТАКМ20.

Для пепт-тРНК с пиримидинами в 37 положении константы скорости ассоциации (ксп) также увеличиваются с повышением температуры (рис. 7Б). Неожиданным оказался тот факт, что значения ксп для пурин37-содержащих тРНК (У37, У37в, У37А) уменьшались с повышением температуры. Константа скорости простой бимолекулярной реакции (зависящей от скорости диффузии) должна увеличиваться с повышением температуры. Однако возможно, что реакция связывания состоит из двух (или более) стадий и за быстрой бимолекулярной реакцией связывания следует относительно медленная конформационная перестройка одного или двух лигандов. В случае, если такая перестройка является лимитирующей стадией, наблюдаемая аномальная температурная зависимость может иметь отношение именно к этому конформационному изменению.

4. Взаимодействие аминоацил-тРНК с А сайтом 70S рибосом Е. coli.

Функциональные проявления особенностей структуры антикодоновой петли тРНК следует ожидать не только в равновесном ее связывании (т.е. при образовании кодон-антикодонового комплекса тРНК с мРНК per se), но также и в кинетике многостадийного (рис. 8) взаимодействия аминоацил-тРНК с А сайтом рибосомы.

Для повышения точности трансляции при отборе корректных аа-тРНК в А сайте рибосомы реализуется стратегия кинетической коррекции, основанная на различии скорости гидролиза GTP для корректного и некорректного субстратов (Gromadsky, 2004)

аатРНК

Рис. 8. Кинетическая схема взаимодействия аа-тРНК с А сайтом 70S рибосомы в цикле элонгации (Rodnina, 2001)

Очевидно, что консервативная структура антикодоновой петли тРНК была отобрана в процессе эволюции, исходя из принципа ее максимальной эффективности в процессе декодирования. В связи с этим возникает вопрос: как природа 37 нуклеотида дрожжевой тРНКте влияет на элементарные этапы взаимодействия аа-тРНК с А сайтом 70S рибосомы? В рамках известной кинетической схемы взаимодействия аа-тРНК с А сайтом рибосомы (Rodnina, 2001, см рис 8) было проведено изучение кинетики реакций гидролиза GTP элонгационным фактором EF-Tu и синтеза дипептида для Phe-TPHKPhe с различными нуклеотидами в 37 положении

4.1. Влияние 37 нуклеотида тРНК на гидролиз GTP. Изучение престационарной кинетики реакции гидролиза GTP фактором элонгации EF-Tu показало, что скорость реакции существенно зависит от типа нуклеотида в 37 положении Рпе-тРНКте (рис. 9А) При концентрации инициаторных рибосомных комплексов равной 1 мкМ константа скорости гидролиза GTP для нативной дрожжевой тРНКте (Y37) составляет (15±1) с-1, а для транскриптов тРНКте (Y37G) - (4 2±0 6) с-1, (Y37A) - (7.7±0 8) с'1, (Y37U) -(2.1±0.1) с-1 и для (Y37C)- (1 9±0 2) с-1.

Для всех видов аа-тРНК были измерены константы скорости гидролиза GTP в присутствии увеличивающейся концентрации инициаторных

рибосомных комплексов (0.5-4 мкМ), соответствующие кривые титрования приведены на рис. 9Б. При насыщающих концентрациях рибосомных комплексов наблюдаемые константы скорости (карр) гидролиза GTP значительно отличаются, в зависимости от того, какой нуклеотид расположен в 37 положении тРНКРИе. Для нативной дрожжевой Рпе-тРНК™9 Vmax, вычисленная из полученной концентрационной зависимости, составляет (120±40) с-1 (20°С), что совпадает со значением, полученным для нативной РИе-тРНКте из Е. coli, (110±25) с-1 (Gromadsky, 2004).

Рис. 9. А. Кинетика гидролиза вТР фактором элонгации ЕР-Ти. Б. Зависимость наблюдаемой константы скорости гидролиза СТР от концентрации рибосом. РЬе-ТРНКи",(У37) (•),(У37С) (1)„(У37А) (□), (У3711) (А), (У37С)(Д).

4.2. Влияние 37 нуклеотида тРНК на реакцию синтеза дипептида.

Были изучены кинетические параметры реакции синтеза дипептида ИМ^РИе для РИе-тРНКРИе с различными нуклеотидами в 37 положении. Для всех видов [14С]РИе-тРНКРИе конечный уровень синтеза дипептида достигал 95-98%. Кинетические кривые реакции синтеза дипептида для всех исследованных РИе-ТРНКРИв имеют высокую воспроизводимость и хорошо аппроксимируются экспоненциальной функцией.

Скорость синтеза дипептида также сильно зависит от типа нуклеотида в 37 положении РИе-тРНКРИе. При 1 мкМ концентрации рибосом наблюдаемая константа скорости синтеза пептидной связи для нативной дрожжевой [14С]РИе-ТРНКРИв(У37) составляет (9.5±0.8) с-1, для тРНКРИе (У37в) -(2.9±0.1) с \ У37А - (5.5±0.4) с \ У37и - (1.9±0.1) с-1 и для У37С-(2.2±0.2) с-1.

Анализ измеренных кинетических параметров реакций гидролиза вТР и синтеза дипептида показывает, что в данных экспериментальных условиях для всех видов немодифицированных транскриптов дрожжевой тРНКРИе гидролиз вТР является скорость-лимитирующей реакцией. Уменьшение скорости гидролиза вТР элонгационным фактором ЕР-Ти в комплексе с немодифицированными транскриптами может быть связано как с увеличением скорости диссоциации кодон-распознающего комплекса к2 (на что указывают данные, полученные в системе [пепт-тРНК*А сайт]), так и с уменьшением скорости активации ГТФазы (если верна гипотеза о передаче сигнала из декодирующего центра рибосомы в в-домен фактора ЕР-Ти путем конформационной перестройки молекулы аа-тРНК (ЯоСпта, 2001).

выводы

1. Пуриновое основание в 37 положении тРНК стабилизирует кодон-антикодоновое взаимодействие в А сайте рибосомы путем усиления стэкинг-взаимодействия в кодон-антикодоновом дуплексе. Замена пуринового основания на пиримидиновое приводит к увеличению энтальпии взаимодействия на =30 ккал/моль. Наличие посттранскрипционной модификации гуанина с З'-стороны от антикодона не усиливает стэкинг-взаимодействие в комплексе тРНК*мРНК, но, скорее, стабилизирует

. структуру антикодоновой петли.

2. Наличие пуринового основания с З'-стороны от антикодона способствует привлечению функционально важных ионов Мд2+ при формировании кодон-антикодонового дуплекса. Для тРНК™°, имеющей в 37 положении У-основание (нативная тРНК) или замену на аденин, при формировании комплекса с А сайтом требуется привлечение 5 ионов магния. Замена 37 основания на немодифицированный гуанин снижает число ионов магния до 4, а замена на пиримидиновые основания (и, С) или удаление У-основания в 37 положении снижает число ионов магния до 3.

3. Аминогликозидный антибиотик паромомицин значительно стабилизирует связывание пептидил-тРНК в А сайте рибосомы и устраняет зависимость сродства тРНК к А сайту от концентрации ионов Мд2+.

4. Кодон-антикодоновое взаимодействие в модельной системе без рибосом (взаимодействие двух тРНК с комплементарными антикодонами) не зависит от концентрации ионов Мд2+. Конформационные изменения, происходящие в молекуле тРНК при осуществлении кодон-антикодонового взаимодействия, не приводят к возникновению дополнительных участков связывания ионов Мд2+.

5. Формирование кодон-антикодонового дуплекса в А сайте рибосомы происходит в две стадии: за быстрым этапом начального связывания следует обусловленное наличием пурина в 37 положении относительно медленное изменение конформации антикодоновой петли.

6. Природа 37 нуклеотида тРНК влияет на скорость гидролиза вТР элонгационным фактором ЕР-Ти. Замена У-основания на аденин снижает скорость гидролиза вТР с 15 с-1 до 7.7 с-1, на гуанин -до 4.3 с-1, а замена на пиримидин - до значения 2 с-1. Указанные замены 37-го нуклеотида приводят также к значительному снижению скорости синтеза дипептида 1Ме1*РИе. Для всех видов немодифицированных транскриптов тРНК скорость синтеза дипептида лимитируется предшествующей реакцией гидролиза вТР.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Konevega A.L, Soboleva N.G., Makhno V.l., Semenkov Y.P., Wintermeyer W., Rodhina M.V., Katunin V.l. Purine bases at position 37 of tRNA stabilize codon-anticodon interaction in the ribosomal A site by stacking and Mg2+-dependent interactions // RNA. -2004. -Vol. 10, N. 1, - P.90-101.

2.Коневега А.Л., Махно В.И., Семенков Ю.П., Винтермайер В., Роднина М.В., Катунин В.И. Механизм стабилизации кодон-антикодонового взаимодействия в А сайте 70S рибосом Escherichia coli, индуцируемый пуриновым основанием в 37 положении тРНК. Препринт ПИЯФ - 2555.-Гатчина. - 2004. -34с.

3.Соболева Н. Г., Махно В. И., Коневега А. Л., Семенков Ю.П., Катунин В. И. Влияние модифицированного нуклеотида в положении 37 на взаимодействие аминоацил-тРНК с А сайтом 70S рибосомы // Молекулярная биология. - 2003. - Т. 37, №1, - С.121-127.

4.Коневега А.Л., Катунин В.И. Влияние нуклеотида в 37 положении тРНК на кодон-антикодоновое взаимодействие в А сайте 70S рибосомы // Тезисы докладов 8-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", - Пущино. - 2004. - С. 16-17.

5.Konevega A.L., Soboleva N.G., Makhno V.l., Semenkov Y.P., Rodnina M.V., Wintermeyer W., Katunin V.l. Role of base 37 in tRNA in stabilizing codon-anticodon interaction on the ribosome // Abstracts of 20th lnternational tRNA Workshop "The tRNA World", Banz, Germany. - 2003.- P.VI-1.

6.Konevega A.L., Makhno V.l., Semenkov Y.P., Wintermeyer W., Rodnina M.V., Katunin V.l. Role of base-37 in tRNA in stabilizing codon-anticodon interaction on the ribosome // Abstracts of 8th Annual Meeting of the RNA Society, Vienna, Austria. - 2003. - P.330.

7.Konevega A.L, Katunin V.l. Role of the nucleotide 37 in tRNA in the mechanism of decoding on the ribosomes // Abstracts of 19th lnternational tRNA Workshop "The tRNA World", Shanghai, China. - 2002. - P.Vlll-3.

8.Konevega A.L., Katunin V.l. Effect of the nucleotide-37 on the interaction of tRNAPhe with P site of Escherichia coli ribosomes // Abstracts of 18th tRNA Workshop "tRNA 2000", Cambridge, UK. - 2000. - P.6a-91.

Отпечатано в типографии ПИЯФ РАН

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 331, тир. 100, уч-изд. л. 1; 6.12.2004 г.

»--745

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Коневега, Андрей Леонидович

Список сокращений.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Введение.

1.2. Декодирование генетической информации на рибосоме.

1.2.1. Цикл элонгации.

1.2.2. Селективность взаимодействия.

1.2.3. Кинетическая схема взаимодействия аминоацил-тРНК с А сайтом.

1.2.4. Механизм взаимодействия аа-тРНК с А сайтом.

1.2.5. Точность декодирования. Стабилизация кодон-антикодонового взаимодействия и механизм индуцированного соответствия.

1.3. Строение бактериальных рибосом.

1.3.1. Пространственная структура бактериальных рибосом.

1.3.2. Структурные исследования декодирующего центра.

1.3.3. Конформационные изменения декодирующего центра 30S субчастицы.

1.4. Структура транспортной РНК.

1.4.1. Модифицированные нуклеотиды тРНК.

1.5. Методы получения препаративных количеств мутантных тРНК для биофизических и биохимических исследований.

1.6. Влияние модификаций 37 нуклеотида тРНК на кодон-антикодоновое взаимодействие.

1.6.1. Упрощенные модельные системы без рибосом.

1.6.2. Взаимодействие между двумя тРНК с комплементарными антикодонами как модель кодон-антикодонового взаимодействия.

1.6.3. Взаимодействие антикодоновых шпилек тРНК с рибосомами.

1.6.4. Взаимодействие тРНК с рибосомами.

1.7. Использование немодифицированных транскриптов для изучения структурно-функциональных особенностей тРНКрг,е.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Термодинамические и кинетические параметры взаимодействия транспортной РНК с А сайтом 70S рибосомы Escherichia coli: роль 37 нуклеотида"

Актуальность проблемы. Трансляция последовательности мРНК в полипептидную цепочку, происходящая на рибосомах, является важнейшим этапом реализации генетической информации. Присоединение очередной аминокислоты определяется комплементарностью между кодоном мРНК и антикодоном тРНК. Однако же, высокую точность трансляции, реализуемую in vivo, не удается объяснить на основании простых физико-химических расчетов, исходя из энергий водородных связей между тринуклеотидами кодона мРНК и антикодона тРНК. Очевидно, что в процесс декодирования должны быть вовлечены дополнительные механизмы повышения точности отбора корректных кодон-антикодоновых комплексов в А сайте рибосомы. На настоящий момент - хорошо изучены основные механизмы контроля декодирования, осуществляемые рибосомой, а также определены отвечающие за них структурные элементы. С другой стороны, имеются многочисленные указания на то что каноническая, эволюционно консервативная структура другого участника процесса декодирования -молекулы тРНК - также вносит существенный вклад в повышение специфичности кодон-антикодонового взаимодействия на рибосоме.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось изучение молекулярных механизмов декодирования генетической информации на рибосоме на уровне взаимодействия дрожжевой фенилаланиновой тРНК с А сайтом 70S рибосомы E.coli и выявление роли модифицированного пурина в 37 положении тРНК в кодон-антикодоновом взаимодействии.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи.

1. Получить препараты дрожжевой TPHKPhe с различными нуклеотидами в 37 положении путем транскрипции in vitro соответствующих генов на специально сконструированных плазмидах.

2. Изучить кинетические и термодинамические параметры кодон-антикодонового взаимодействия пептидил-тРНКрг,е с различными нуклеотидами в 37 положении с А сайтом 70S рибосом Е. coli. ц» 3. Методами престационарной кинетики изучить модельное кодон-антикодоновое взаимодействие в растворе при отсутствии рибосом.

5. Методами престационарной кинетики изучить взаимодействие аминоацил-тРНК с А сайтом 70S рибосом. Исследовать влияние нукпеотида в 37 положении тРНКрг,е на кинетику реакций гидролиза GTP фактором элонгации EF-Tu и синтеза дипептида fMetPhe.

Научная новизна. Впервые исследована роль 37-го нукпеотида тРНК в кодон-антикодоновом взаимодействии в модельной системе [пепт-тРНК*А сайт 70S рибосомы]. Измерены кинетические и равновесные константы кодон-антикодонового взаимодействия пепт-тРНК в А сайте рибосомного комплекса, определены его термодинамические параметры.

Впервые установлено, что пепт-тРНК с различными нуклеотидами в 37 положении требуют привлечения разного количества ионов магния при образовании кодон-^ антикодонового комплекса с мРНК в А сайте рибосомы.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Международной конференции "tRNA 2000", 18th International tRNA Workshop, (Кембридж, Великобритания, 2000); 4-ой и 5-ой конференциях молодых ученых Отделения молекулярной и радиационной биофизики ПИЯФ РАН, (Гатчина, 2003, 2004); Международной конференции "RNA-2003", 8th Annual Meeting of the RNA Society (Вена, Австрия, 2003); Международной конференции "The tRNA World", 20th International tRNA Workshop (Банц, Германия, 2003); 8-ой Международной Пущинской школе-конференции "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004).

Основные положения, выносимые на защиту.

2. Аминогликозидный антибиотик паромомицин значительно стабилизирует связывание тРНК в А сайте и устраняет зависимость сродства тРНК от концентрации ионов Мд2+.

3. Для кодон-антикодонового взаимодействия в растворе при отсутствии рибосом не характерна зависимость константы диссоциации от концентрации ионов Мд2+.

4. Природа 37 нуклеотида тРНК влияет на скорость гидролиза GTP фактором элонгации EF-Tu.

Список сокращений.

1. Нуклеиновые кислоты ДНК-дезоксирибонуклеиновая кислота; РНК - рибонуклеиновая кислота; пДНК - плазмидная ДНК; тРНК - транспортная РНК; мРНК - матричная РНК; рРНК- рибосомная РНК;

TPHKPhe(Y37) - нативная фенилаланиновая тРНК из дрожжей;

TPHKPhe(Y37-) -дрожжевая тРНК^® с отщепленным Y-основанием;

TPHKPhe(Y37G) - немодифицированный транскрипт дрожжевой тРНКрг,е;

TPHKPhe (Y37A), (Y37U), (Y37C) - немодифицированные транскрипты тРНКрг,е, имеющие в 37 положении замену гуанина на аденин, урацил или цитозин; тРНК™"*, TPHKLeu, тРНК61*, тРЫК61"2 - формилметиониновая, лейциновая, глициновая, глютаминовая транспортные РНК;

Phe-TPHKPhe, Met-rPHK™"*1, Leu-TPHKLeu - аминоацилированные тРНК; аа-тРНК - аминоацил-тРНК; пепт-тРНК - пептидил-тРНК;

ASL - антикодоновая шпилька тРНК (anticodon stem loop).

2. Нуклеозиды

N - любой нуклеозид; G - гуанозин; А - аденозин;

U-уридин; С-цитидин; Т-тимидин; yW, Y - уайбутозин, гипермодифицированный гуанозин;

Ч» - псевдоуридин; I - инозин; Q - кьюозин; ш2А - 2-метиладенозин; ш6А - 6-метиладенозин i6A - 1М-6-(А2-изопентенил)-аденозин', тв216А-М-6-(А2-изопентенил)-метилтиоаденозин; m1l - 1-метилинозин; m1G - 1-метилгуанозин; m7G - 7-метилгуанозин

GTP - гуанозин-5'-трифосфат; UTP - уридин-5'-трифосфат; GDP - гуанозин-5'-дифосфат

3. Мононуклеотиды АТР - аденозин-5'-трифосфат; СТР - цитозин-5-трифосфат; GMP - гуанозин-5-монофосфат;

4. Аминокислоты

Phe - фенилаланин; fMet - формилметионин; Glu - глутаминовая кислота; Тгр - триптофан; [3H]Met - метионин, меченный изотопом водорода [3Н]; [uC]Phe - фенилаланин, меченный изотопом углерода [14С]; а.к. - аминокислота;

Ser - серин; Ala - аланин; Pro - пролин; Leu - лейцин;

Туг - тирозин; Ile - изолейцин; Arg - аргинин; Gly - глицин;

5. Рибосомы и их субчастицы.

30S - малая рибосомная субчастица; 70S - полная бактериальная рибосома;

50S - большая рибосомная субчастица.

6. Прочие обозначения

EF-Tu, EF-Ts, EF-G, IF1, IF2, IF3 - белковые факторы трансляции; А сайт - акцепторный сайт 70S рибосомы; Р сайт - донорный сайт 70S рибосомы; Е сайт - выходной сайт 70S рибосомы;

Ка - равновесная константа ассоциации; Ка - равновесная константа диссоциации; коп - константа скорости ассоциации; koff - константа скорости диссоциации;

Т - температура; t - время реакции;

Рт - пуромицин; ' Par - паромомицин;

Трис - трис(гидроксиметил)метиламин; ДТТ, DTT - дитиотреитол;

ТХУ - трихлоруксусная кислота; ТФУ - трифторуксусная кислота;

РОРОР - 1,4бис-2(5-фенилоксазолил)бензол; РРО - 2,5-дифенилоксазол;

ЭДТА, EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота;

IPTG - изопропил-р-О-тиогалактозид; р-МЭ - ß-меркаптоэтанол;

БСА, BSA - бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin);

ЖХВД, HPLC - система для высокоэффективной жидкостной хроматографии (High performance liquid chromatography system);

FPLC - система для быстрой белковой хроматографии (fast protein liquid chromatography); FRET - флуоресцентный резонансный перенос энергии (fluorescence resonance energy transfer);

ПЦР - полимеразная цепная реакция.

7. Спектрофотометрические параметры. А-длина волны (нм);

А26о - оптическая плотность при Л =260 нм; А28о - оптическая плотность при Л=280 нм;

1 ед. А26о (1 ед. А28о) - количество вещества, которое при растворении в 1 мл растворителя создает в последнем оптическую плотность А2бо=1 (А28о=1).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Коневега, Андрей Леонидович

Общие выводы.

1 Пуриновое основание в 37 положении тРНК стабилизирует кодон-антикодоновое взаимодействие в А сайте рибосомы путем усиления стэкинг-взаимодействия в кодон-антикодоновом дуплексе. Замена пуринового основания на пиримидиновое приводит к увеличению энтальпии взаимодействия на =30 ккал/моль. Наличие посттранскрипционной модификации гуанина с З'-стороны от антикодона не усиливает стэкинг-взаимодействие в комплексе тРНК*мРНК, но, скорее, стабилизирует структуру антикодоновой петли.

2. Наличие пуринового основания с З'-стороны от антикодона способствует привлечению функционально важных ионов Мд2+ при формировании кодон-антикодонового дуплекса. Для тРНКРЬе, имеющей в 37 положении У-основание (нативная тРНК) или замену на аденин, при формировании комплекса с А сайтом требуется привлечение 5 ионов магния. Замена 37 основания на немодифицированный гуанин снижает число ионов магния до 4, а замена на пиримидиновые основания (и, С) или удаление У-основания в 37 положении снижает число ионов магния до 3.

6. Природа 37 нуклеотида тРНК влияет на скорость гидролиза вТР элонгационным фактором ЕР-Ти. Замена У-основания на аденин снижает скорость гидролиза вТР с 15 с'1 до 7.7 с"1, на гуанин - до 4.3 с"1, а замена на пиримидин - до значения 2 с"1. Указанные замены 37-го нуклеотида приводят также к значительному снижению скорости синтеза дипептида fMet•Phe. Для всех видов немодифицированных транскриптов тРНК скорость синтеза дипептида лимитируется предшествующей реакцией гидролиза СТР.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Konevega A.L., Soboleva N.G., Makhno V.I., Semenkov Y.P., Wintermeyer W., Rodnina M.V., Katunin V.i. Purine bases at position 37 of tRNA stabilize codon-anticodon interaction in the ribosomal A site by stacking and Mg2+-dependent interactions // RNA. - 2004. - Vol. 10, N. 1, - P.90-101.

2. Коневега А.Л., Махно В.И., Семенков Ю.П., Винтермайер В., Роднина М.В., Катунин В.И. Механизм стабилизации кодон-антикодонового взаимодействия в А сайте 70S рибосом Escherichia со//, индуцируемый пуриновым основанием в 37 положении тРНК. Препринт ПИЯФ - 2555. Гатчина. - 2004. -34с.

3. Соболева Н. Г., Махно В. И., Коневега А. Л., Семенков Ю.П., Катунин В. И. Влияние модифицированного нуклеотида в положении 37 на взаимодействие аминоацил-тРНК с А сайтом 70S рибосомы// Молекулярная биология. - 2003. - Т. 37, №1, — С.121—127.

4. Коневега А.Л., Катунин В.И. Влияние нуклеотида в 37 положении тРНК на кодон-антикодоновое взаимодействие в А сайте 70S рибосомы // Тезисы докладов 8-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", - Пущино. - 2004. - С. 16-17.

5. Konevega A.L., Soboleva N.G., Makhno V.I., Semenkov Y.P., Rodnina M.V., Wintermeyer W., Katunin V.I. Role of base 37 in tRNA in stabilizing codon-anticodon interaction on the ribosome // Abstracts of 20th International tRNA Workshop "The tRNA World", Banz, Germany. - 2003,- P.VI-1.

6. Konevega A.L., Soboleva N.G., Makhno V.I., Semenkov Y.P., Wintermeyer W., Rodnina M.V., Katunin V.I. Role of base-37 in tRNA in stabilizing codon-anticodon interaction on the ribosome II Abstracts of 8th Annual Meeting of the RNA Society, Vienna, Austria. - 2003. - P.330.

7. Konevega A.L., Katunin V.I. Role of the nucleotide 37 in tRNA in the mechanism of decoding on the ribosomes // Abstracts of 19th International tRNA Workshop "The tRNA World", Shanghai, China. - 2002. - P.VIII-3.

8. Konevega A.L., Katunin V.I. Effect of the nucleotide-37 on the interaction of tRNAPhe with P site of Escherichia coli ribosomes // Abstracts of 18th tRNA Workshop "tRNA 2000", Cambridge, UK. - 2000. - P.6a-91.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Коневега, Андрей Леонидович, Санкт-Петербург

1. Kurland, C.G., Ehrenberg, М. Growth-optimizing accuracy of gene expression // Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1987. -Vol. 16, N - P. 291-317.

2. Parker, J. Errors and alternatives in reading the universal genetic code // Microbiol. Rev. 1989. -Vol. 53, N 3. - P. 273-298.

3. Rodnina, M.V., Wintermeyer, W. Fidelity of aminoacyl-tRNA selection on the ribosome: kinetic and structural mechanisms // Annu. Rev. Biochem. 2001. -Vol. 70,-P. 415-435.

4. Ramakrishnan, V. Ribosome structure and the mechanism of translation // Cell. 2002. -Vol. 108, N4.-P. 557-572.

5. Спирин, A.C. Структура рибосомы и биосинтез белка./. Москва: Высшая школа. 1986. Р. 303.

6. Саминский, Е.М. Трансляция генетического кода на рибосомах./. Санкт-Петербург: СПбГТУ. 2000. Р. 88.

7. Wintermeyer, W., Rodnina, М. Ribosomal protein synthesis./. In Polyamides and Complex Proteinaceous Materials I (Steinbüchel, A., Fahnestock, S.R., eds.), Vol. 7, pp. 1-25. 10 vols. Weinheim: WILEY-VCH. 2002. - P. 1-25.

8. Pape, Т., Wintermeyer, W., Rodnina, M.V. Complete kinetic mechanism of elongation factor Tu-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A site of the E. coli ribosome // EMBO J. 1998. -Vol. 17, N 24. - P. 7490-7497.

9. Rodnina, M.V., Wintermeyer, W. Ribosome fidelity: tRNA discrimination, proofreading and induced fit // Trends Biochem. Sei. 2001. -Vol. 26, N 2. - P. 124-130.

10. Nissen, P., Hansen, J., Ban, N., Moore, P.B., Steitz, T.A. The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis // Science. 2000. -Vol. 289, N 5481. - P. 920-930.

11. Rodnina, M.V., Wintermeyer, W. Peptide bond formation on the ribosome: structure and mechanism // Curr Opin Struct Biol. 2003. -Vol. 13, N 3. - P. 334-340.

12. Роднина, M.B., Семенков, П., Завельсберг, А., Катунин, В.И., Песке, Ф., Вильден, Б., Винтермайер, В. Механизм транслокации тРНК на рибосоме //

13. Молекулярная биология. 2001. -Vol. 35, N 4. - Р. 655-665.

14. Crick, F.H. Codon-anticodon pairing: the wobble hypothesis // J. Mol. Biol. 1966. -Vol. 19, N2.-P. 548-555.

15. Jaskunas, S.R., Cantor, C.R., Tinoco, I., Jr. Association of complementary oligoribonucleotides in aqueous solution // Biochemistry. 1968. -Vol. 7, N 9. -P. 3164-3178.

16. Ferscht, A. Structure and Mechanism in Protein Science./ (Cantor, C.R., Ed.). New York: W.H. Freeman and Company. 1999. P. 632.

17. Hopfield, J.J. Kinetic proofreading: a new mechanism for reducing errors in biosyntheticprocesses requiring high specificity // Proc Natl Acad Sci U S A. 1974. -Vol. 71, N 10. -P. 4135-4139.

18. Ninio, J. Kinetic amplification of enzyme discrimination // Biochimie. 1975. -Vol. 57, N 5. - P. 587-595.

19. Thompson, R.C., Stone, P.J. Proofreading of the codon-anticodon interaction on ribosomes // Proc Natl Acad Sci USA.- 1977. -Vol. 74, N 1. P. 198-202.

20. Ruusala, T., Ehrenberg, M., Kurland, C.G. Is there proofreading during polypeptide synthesis? // Embo J. 1982. -Vol. 1, N 6. - P. 741-745.

21. Eccleston, J.F., Dix, D.B., Thompson, R.C. The rate of cleavage of GTP on the binding of Phe-tRNA.elongation factor Tu.GTP to poly(U)-programmed ribosomes of Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1985. -Vol. 260, N 30. - P. 16237-16241.

22. Thompson, R.C. EFTu provides an internal kinetic standard for translational accuracy // Trends Biochem. Sci. 1988. -Vol. 13, N 3. - P. 91-93.

23. Thompson, R.C., Dix, D.B. Accuracy of protein biosynthesis. A kinetic study of the reaction of poly(U)-programmed ribosomes with a lucyl-tRNA2-EF-Tu-GTP complex. II J. Biol. Chem. 1982. -Vol. 257, N 12. - P. 6677-6682.

24. Krab, I.M., Parmeggiani, A. EF-Tu, a GTPase odyssey // Biochim. Biophys. Acta. 1998. -Vol. 1443, N 1-2.-P. 1-22.

25. Louie, A., Ribeiro, N.S., Reid, B.R., Jurnak, F. Relative affinities of all Escherichia coli aminoacyl-tRNAs for elongation factor Tu-GTP // J. Biol. Chem. 1984. -Vol. 259, N 8. -P. 5010-5016.

26. Gouy, M., Grantham, R. Polypeptide elongation and tRNA cycling in Escherichia coli: a dynamic approach // FEBS Lett. 1980. -Vol. 115, N 2. - P. 151-155.

27. Rodnina, M.V., Pape, T., Fricke, R., Kuhn, L., Wintermeyer, W. Initial binding of the elongation factor Tu.GTP.aminoacyl-tRNA complex preceding codon recognition on the ribosome // J. Biol. Chem. 1996. -Vol. 271, N 2. - P. 646-652.

28. Ogle, J.M., Brodersen, D.E., Clemons, W.M., Jr., Tarry, M.J., Carter, A.P., Ramakrishnan, V. Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit // Science. 2001. -Vol. 292, N 5518. - P. 897-902.

29. Rodnina, M.V., Fricke, R., Kuhn, L., Wintermeyer, W. Codon-dependent conformational change of elongation factor Tu preceding GTP hydrolysis on the ribosome // EMBO J. -1995. -Vol. 14, N 11. P. 2613-2619.

30. Stark, H., Rodnina, M.V., Rinke-Appel, J., Brimacombe, R., Wintermeyer, W., van Heel, M. Visualization of elongation factor Tu on the Escherichia coli ribosome // Nature. 1997. -Vol. 389, N 6649. - P. 403-406.

31. Rodnina, M.V., Pape, T., Savelsbergh, A., Mohr, D., Matassova, N.B., Wintermeyer, W.

32. Stark, H., Rodnina, M.V., Wieden, H.J., Zemlin, F., Wintermeyer, W., van Heel, M. Ribosome interactions of aminoacyl-tRNA and elongation factor Tu in the codon-recognition complex // Nat Struct Biol. 2002. -Vol. 9, N 11. - P. 849-854.

33. Kothe, U., Wieden, H.J., Mohr, D., Rodnina, M.V. Interaction of helix D of elongation factor Tu with helices 4 and 5 of protein L7/12 on the ribosome // J. Mol. Biol. 2004. -Vol. 336, N 5. - P. 1011-1021.

34. Gromadski, K.B., Rodnina, M.V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome // Mol. Cell. 2004. -Vol. 13, N 2. - P. 191-200.

35. Semenkov, Y.P., Rodnina, M.V., Wintermeyer, W. Energetic contribution of tRNA hybrid state formation to translocation catalysis on the ribosome // Nat. Struct. Biol. 2000. -Vol. 7, N 11.-P. 1027-1031.

36. Pape, T., Wintermeyer, W., Rodnina, M. Induced fit in initial selection and proofreading of aminoacyl-tRNA on the ribosome // EMBO J. 1999. -Vol. 18, N 13. - P. 3800-3807.

37. Katunin, V.I., Muth, G.W., Strobel, S.A., Wintermeyer, W., Rodnina, M.V. Important contribution to catalysis of peptide bond formation by a single ionizing group within the ribosome 11 Mol. Cell. 2002. -Vol. 10, N 2. - P. 339-346.

38. Precup, J., Ulrich, A.K., Roopnarine, O., Parker, J. Context specific misreading of phenylalanine codons // Mol. Gen. Genet. 1989. -Vol. 218, N 3. - P. 397-401.

39. Koshland, D.E. Application of a theory of enzyme specificity to protein synthesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1958. -Vol. 44, N P. 98-104.

40. Ogle, J.M., Carter, A.P., Ramakrishnan, V. Insights into the decoding mechanism from recent ribosome structures // Trends Biochem. Sci. 2003. -Vol. 28, N 5. - P. 259-266.

41. Green, R., Noller, H.F. Ribosomes and translation //Annu Rev Biochem. 1997. -Vol. 66, N-P. 679-716.

42. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B., Steitz, T.A. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution // Science. 2000. -Vol. 289, N 5481. - P. 905-920.

43. Wimberly, B.T., Brodersen, D.E., Clemons, W.M., Jr., Morgan-Warren, R.J., Carter, A.P., Vonrhein, C., Hartsch, T., Ramakrishnan, V. Structure of the 3uS ribosomai subunit// Nature. 2000. -Vol. 407, N 6802. - P. 327-339.

44. Cate, J.H., Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Earnest, T.N., Noller, H.F. X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes // Science. 1999. -Vol. 285, N 5436. -P. 2095-2104.

45. Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Baucom, A., Lieberman, K., Earnest, T.N., Cate, J.H., Noller, H.F. Crystal structure of the ribosome at 5.5 E resolution // Science. 2001. -Vol. 292, N5518.-P. 883-896.

46. Yusupova, G.Z., Yusupov, M M., Cate, J.H., Noller, H.F. The path of messenger RNA through the ribosome//Cell. 2001. -Vol. 106, N 2. - P. 233-241.

47. Ogle, J.M., Murphy, F.V., Tarry, M.J., Ramakrishnan, V. Selection of tRNA by the ribosome requires a transition from an open to a closed form // Cell. 2002. -Vol. 111, N 5. - P. 721-732.

48. Carter, A.P., Clemons, W.M., Jr., Brodersen, D.E., Morgan-Warren, R.J., Hartsch, T., Wimberly, B.T., Ramakrishnan, V. Crystal structure of an initiation factor bound to the 30S ribosomal subunit // Science. 2001. -Vol. 291, N 5503. - P. 498-501.

49. Jovine, L., Djordjevic, S., Rhodes, D. The crystal structure of yeast phenylalanine tRNA at 2.0 E resolution: cleavage by Mg2+ in 15-year old crystals II J. Mol. Biol. 2000. -Vol. 301, N 2. - P. 401-414.

50. Shi, H., Moore, P.B. The crystal structure of yeast phenylalanine tRNA at 1.93 E resolution: a classic structure revisited // RNA. 2000. -Vol. 6, N 8. - P. 1091-1105.

51. Goldgur, Y., Mosyak, L., Reshetnikova, L., Ankilova, V., Lavrik, O., Khodyreva, S., Safro, M. The crystal structure of phenylalanyl-tRNA synthetase from thermus thermophilus complexed with cognate tRNAPhe // Structure. 1997. -Vol. 5, N 1. - P. 59-68.

52. Yokoyama, S., Nishimura, S. Modified nucleosides and codon recognition./. In tRNA: Structure, biosynthesis and function (Soil, D.G., RajBhandary, U.L., eds.), pp. 207-233. Washington, D.C.: ASM Press. 1995. - P. 207-233.

53. Moazed, D., Noller, H.F. Binding of tRNA to the ribosomal A and P sites protects two distinct sets of nucleotides in 16 S rRNA // J. Mol. Biol. 1990. -Vol. 211, N 1. - P. 135145.

54. O'Connor, M., Brunelli, C.A., Firpo, M.A., Gregory, S.T., Lieberman, K.R., Lodmeli, J.S., Moine, H., Van Ryk, D.I., Dahlberg, A.E. Genetic probes of ribosomal RNA function // Biochem. Cell. Biol. 1995. -Vol. 73, N 11-12. - P. 859-868.

55. Yoshizawa, S., Fourmy, D., Puglisi, J.D. Recognition of the codon-anticodon helix by ribosomal RNA // Science. 1999. -Vol. 285, N 5434. - P. 1722-1725.

56. Holley, R.W., Apgar, J., Everett, G.A., Madison, J.T., Marquisee, M., Merrill, S.H., Penswick, J.R., Zamir, A. Structure of a Ribonucleic Acid // Science. 1965. -Vol. 147, N -P. 1462-1465.

57. Sprinzl, M., Horn, C., Brown, M., loudovitch, A., Steinberg, S. Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes // Nucl. Acids Res. 1998. -Vol. 26, N 1. - P. 148-153.

58. Sprinzl, M., Vassilenko, K.S. (2003). Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes. http://www.uni-bayreuth.de/departments/biochemie/trna/.

59. Quigley, G.J., Teeter, M.M., Rich, A. Structural analysis of spermine and magnesium ion binding to yeast phenylalanine transfer RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. -Vol. 75, N 1.-P. 64-68.

60. LaRiviere, F.J., Wolfson, A.D., Uhlenbeck, O.C. Uniform binding of aminoacyl-tRNAs to elongation factor Tu by thermodynamic compensation // Science. 2001. -Vol. 294, N 5540.-P. 165-168.

61. Auffinger, P., Westhof, E. Location and distribution of modified nucleotides in tRNA./. In Modification and editing of RNA (Grosjean, H., Benne, R., eds), pp. 569-576. Washington, D.C.: ASM Press. 1998. - P. 569-576.

62. Marck, C., Grosjean, H. tRNomics: analysis of tRNA genes from 50 genomes of Eukarya, Archaea, and Bacteria reveals anticodon-sparing strategies and domain-specific features // RNA. 2002. -Vol. 8, N 10. - P. 1189-1232.

63. Bjork, G.R. Biosynthesis and function of modified nucleosides./. In tRNA: Structure, Biosynthesis, and Function (S14II, D., RajBhandary, U., eds.), pp. 165-206. Washington, D.C.: ASM Press. 1995. - P. 165-206.

64. Limbach, P.A., Crain, P.F., McCloskey, J.A. Summary: the modified nucleosides of RNA // Nucleic Acids Res. 1994. -Vol. 22, N 12. - P. 2183-2196.

65. Rozenski, J., Crain, P.F., McCloskey, J.A. The RNA Modification Database: 1999 update // Nucleic Acids Res. 1999. -Vol. 27, N 1. - P. 196-197.

66. Grosjean, H., Benne, R. Modification and editing of RNA./. Washington, D.C.: ASM Press.- 1998. P. 596.

67. Komine, Y., Adachi, T., Inokuchi, H., Ozeki, H. Genomic organization and physical mapping of the transfer RNA genes in Escherichia coli K12 // J. Mol. Biol. 1990. -Vol. 212, N4.-P. 579-598.

68. Bjork, G.R. The Role of Modified Nucleosides in tRNA Interactions./. In Transfer RNA in Protein Synthesis (Hatfield, D.L., Lee, B.J., Pirtle, R.M., eds.). Boca Raton, FL: CRC Press.-1992. -P.

69. Curran, J.F. Modified nucleosides in translation./. In Modification and editing of RNA (Grosjean, H., Benne, R„ eds.), pp. 493-516. Washington, D.C.: ASM Press. 1998. - P. 493-516.

70. Bjork, G.R., Ericson, J.U., Gustafsson, C.E., Hagervall, T.G., Jonsson, Y.H., Wikstrom, P.M. Transfer RNA modification //Annu Rev Biochem. 1987. -Vol. 56, N - P. 263-287.

71. Wilson, R.K., Roe, B.A. Presence of the hypermodified nucleotide N6-(delta 2isopentenyl)-2-methylthioadenosine prevents codon misreading by Escherichia coli phenylalanyl-transfer RNA II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. -Vol. 86, N 2. - P. 409413.

72. Bouadloun, F., Srichaiyo, T., Isaksson, L.A., Bjork, G.R. Influence of modification next to the anticodon in tRNA on codon context sensitivity of translational suppression and accuracy // J. Bacterid. 1986. -Vol. 166, N 3. - P. 1022-1027.

73. Li, J., Esberg, B., Curran, J.F., Bjork, G.R. Three modified nucleosides present in the anticodon stem and loop influence the in vivo aa-tRNA selection in a tRNA-dependent manner II J Mol Biol. 1997. -Vol. 271, N 2. - P. 209-221.

74. Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J.M., Hagervall, T.G., Bjork, G.R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications // EMBO J. 2001. -Vol. 20, N 17. - P. 4863-4873.

75. Agris, P.F. Decoding the genome: a modified view // Nucleic Acids Res. 2004. -Vol. 32, $ N 1.-P. 223-238.

76. Grosjean, H., Houssier, C., Romby, P., Marquet, R. Modulatory role of modified nucleotides in RNA loop-loop interaction./. In Modification and editing of RNA (Grosjean, H., Benne, R., eds.), pp. 113-134. Washington, D.C.: ASM Press. 1998. - P. 113-134.

77. Crain, P.F., Rozenski, J., McCloskey, J.A. (2004). The RNA Modification Database. http://medlib.med.utah.edu/RNAmods.

78. Vacher, J., Springer, M., Buckingham, R.H. Functional mutants of phenylalanine transfer RNA from Escherichia coli // EMBO J. 1985. -Vol. 4, N 2. - P. 509-513.

79. Koski, R.A., Clarkson, S.G., Kurjan, J., Hall, B.D., Smith, M. Mutations of the yeast SUP4 tRNATyr locus: transcription of the mutant genes in vitro II Cell. 1980. -Vol. 22, N 2 Pt 2. -P. 415-425.

80. Bruce, A.G., Uhlenbeck, O.C. Enzymatic replacement of the anticodon of yeast phenylalanine transfer ribonucleic acid // Biochemistry. 1982. -Vol. 21, N 5. - P. 855861.

81. Katunin, V., Soboleva, N., Mahkno, V., Sedelnikova, E., Zhenodarova, S., Kirillov, S. Effect of the nucleotide-37 on the interaction of tRNA(Phe) with the P site of Escherichia coli ribosomes // Biochimie. 1994. -Vol. 76, N 1. - P. 51-57.

82. Scaringe, S.A. Advanced 5'-silyl-2'-orthoester approach to RNA oligonucleotide synthesis // Methods. Enzymol. 2000. -Vol. 317, N - P. 3-18.

83. Scaringe, S.A. RNA oligonucleotide synthesis via 5'-silyl-2'-orthoester chemistry II Methods. 2001. -Vol. 23, N 3. - P. 206-217.

84. Sherlin, L.D., Bullock, T.L., Nissan, T.A., Perona, J.J., Lariviere, F.J., Uhlenbeck, O.C., Scaringe, S.A. Chemical and enzymatic synthesis of tRNAs for high-throughput crystallization // RNA. 2001. -Vol. 7, N 11. - P. 1671-1678.

85. Milligan, J.F., Groebe, D.R., Witherell, G.W., Uhlenbeck, O.C. Oligoribonucleotide synthesis using 17 RNA polymerase and synthetic DNA templates // Nucleic Acids Res. -1987. -Vol. 15, N 21. P. 8783-8798.

86. Sampson, J.R., Uhlenbeck, O.C. Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1988. -Vol. 85, N 4. - P. 1033-1037.

87. Ravetch, J., Grafla, J., Crothers, D.M. Thermodynamic and kinetic properties of short RNA helices: the oligomer sequence AnGCUn // Nucleic Acids Res. 1974. -Vol. 1, N 1. - P. 109-127.

88. Labuda, D., Striker, G., Grosjean, H., Porschke, D. Mechanism of codon recognition by transfer RNA studied with oligonucleotides larger than triplets // Nucleic Acids Res. 1985. -Vol. 13, N 10. - P. 3667-3683.

89. Uhlenbeck, O.C. Complementary oligonucleotide binding to transfer RNA // J Mol Biol. -1972. -Vol. 65, N 1. P. 25-41.

90. Thiebe, R., Zachau, H.G. A specific modification next to the anticodon of phenylalanine transfer ribonucleic acid II Eur J Biochem. 1968. -Vol. 5, N 4. - P. 546-555.

91. Pongs, O., Reinwald, E. Function of Y in codon-anticodon interaction of tRNA Phe II

92. Biochem Biophys Res Commun. 1973. -Vol. 50, N 2. - P. 357-363.

93. Eisinger, J. Complex formation between transfer RNA'S with complementary anticodons // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971. -Vol. 43, N 4. - P. 654-861.

94. Grosjean, H.J., de Henau, S., Crothers, D.M. On the physical basis for ambiguity in genetic coding interactions// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. -Vol. 75, N 2. - P. 610-614.

95. Eisinger, J., Gross, N. The anticodon-anticodon complex // J Mol Biol. 1974. -Vol. 88, N 1.-P. 165-174.

96. Grosjean, H., Takada, C., Petre, J. Complex formation between transfer RNAs with complementary anticodons: use of matrix bound tRNA // Biochem Biophys Res Commun. 1973. -Vol. 53, N 3. - P. 882-893.

97. Grosjean, H., Soli, D.G., Crothers, D.M. Studies of the complex between transfer RNAs with complementary anticodons. I. Origins of enhanced affinity between complementary triplets // J. Mol. Biol. 1976. -Vol. 103, N 3. - P. 499-519.

98. Moras, D., Comarmond, M.B., Fischer, J., Weiss, R., Thierry, J.C., Ebel, J.P., Giege, R. Crystal structure of yeast tRNAAsp // Nature. 1980. -Vol. 288, N 5792. - P. 669-674.

99. Borer, P.N., Dengler, B., Tinoco, I., Jr., Uhlenbeck, O.C. Stability of ribonucleic acid double-stranded helices // J. Mol. Biol. 1974. -Vol. 86, N 4. - P. 843-853.

100. Craig, M.E., Crothers, D.M., Doty, P. Relaxation kinetics of dimer formation by self complementary oligonucleotides // J Mol Biol. 1971. -Vol. 62, N 2. - P. 383-401.

101. Agris, P.F. The importance of being modified: roles of modified nucleosides and Mg2+ in RNA structure and function // Prog. Nucleic. Acid. Res. Mol. Biol. 1996. -Vol. 53, N - P. 79-129.

102. Ashraf, S.S., Ansari, G., Guenther, R., Sochacka, E., Malkiewicz, A., Agris, P.F. The uridine in "U-turn": contributions to tRNA-ribosomal binding // RNA. 1999. -Vol. 5, N 4. -P. 503-511.

103. Ashraf, S.S., Guenther, R., Agris, P.F. Orientation of the tRNA anticodon in the ribosomal P-site: quantitative footprinting with U33-modified, anticodon stem and loop domains // RNA. 1999. -Vol. 5, N 9. - P. 1191-1199.

104. Ashraf, S.S., Guenther, R.H., Ansari, G., Malkiewicz, A., Sochacka, E., Agris, P.F. Role of modified nucleosides of yeast tRNAPhe in ribosomal binding // Cell Biochem. Biophys. -2000. -Vol. 33, N 3. P. 241-252.

105. Ashraf, S.S., Sochacka, E., Cain, R., Guenther, R., Malkiewicz, A., Agris, P.F. Single atommodification (0->S) of tRNA confers ribosome binding // RNA. 1999. -Vol. 5, N 2. - P. 188-194.

106. Yarian, C., Marszalek, M., Sochacka, E„ Malkiewicz, A., Guenther, R., Miskiewicz, A., Agris, P.F. Modified nucleoside dependent Watson-Crick and wobble codon binding by tRNALysUUU species // Biochemistry. 2000. -Vol. 39, N 44. - P. 13390-13395.

107. Phelps, S.S., Malkiewicz, A., Agris, P.F., Joseph, S. Modified nucleotides in tRNA(Lys) and tRNA(Val) are important for translocation // J. Mol. Biol. 2004. -Vol. 338, N 3. - P. 439444.

108. Smith, C., Schmidt, P.G., Petsch, J., Agris, P.F. Nuclear magnetic resonance signal assignments of purified 13C.methyl-enriched yeast phenylalanine transfer ribonucleic acid // Biochemistry. 1985. -Vol. 24, N 6. - P. 1434-1440.

109. Stuart, J.W., Koshlap, K.M., Guenther, R., Agris, P.F. Naturally-occurring modification restricts the anticodon domain conformational space of tRNA(Phe) // J. Mol. Biol. 2003. -Vol. 334, N 5. - P. 901-918.

110. Ghosh, K., Ghosh, H.P. Role of modified nucleosides in transfer ribonucleic acid. Effect of removal of the modified base adjacent to 3' end of the anticodon in codon-anticodon interaction // J Biol Chem. 1972. -Vol. 247, N 11. - P. 3369-3375.

111. Ghosh, K., Ghosh, H.P. Role of modified nucleoside adjacent to З'-end of anticodon in codon-anticodon interaction // Biochem Biophys Res Commun. 1970. -Vol. 40, N 1. - P. 135-143.

112. Hall, K.B., Sampson, J.R., Uhlenbeck, O.C., Redfield, A.G. Structure of an unmodified tRNA molecule// Biochemistry. 1989. -Vol. 28, N 14. - P. 5794-5801.

113. Kintanar, A., Yue, D., Horowitz, J. Effect of nucleoside modifications on the structure and thermal stability of Escherichia coli valine tRNA // Biochimie. 1994. -Vol. 76, N 12. - P. 1192-1204.

114. Yue, D., Kintanar, A., Horowitz, J. Nucleoside modifications stabilize Mg2+ binding in Escherichia coli tRNA(Val): an imino proton NMR investigation // Biochemistry. 1994. -Vol. 33, N 30. - P. 8905-8911.

115. Серебров, В., Василенко, K.C., Холод, Н.С., Киселев, Л.Л. Ионы Мд2+ по-разному влияют на физические свойства TPHKPhe и транскрипта ее гена // Молекулярная Биология. 1997. -Vol. 31, N 5. - Р. 894-900.

116. Serebrov, V., Vassilenko, К., Kholod, N., Gross, H.J., Kisselev, L. Mg2+ binding and structural stability of mature and in vitro synthesized unmodified Escherichia coli tRNAPhe // Nucleic Acids Res. 1998. -Vol. 26, N 11. - P. 2723-2728.

117. Maglott, E.J., Deo, S.S., Przykorska, A., Glick, G.D. Conformational transitions of an unmodified tRNA: implications for RNA folding // Biochemistry. 1998. -Vol. 37, N 46. - P. 16349-16359.

118. Shelton, V.M., Sosnick, T.R., Pan, Т. Altering the intermediate in the equilibrium folding of unmodified yeast tRNAPhe with monovalent and divalent cations // Biochemistry. 2001.v'oi. 40, N 12. P. 3629-3638.

119. Harrington, K.M., Nazarenko, I.A., Dix, D.B., Thompson, R.C., Uhlenbeck, O.C. In vitro analysis of translational rate and accuracy with an unmodified tRNA // Biochemistry. -1993. -Vol. 32, N 30. P. 7617-7622.

120. Nazarenko, I.A., Harrington, K.M., Uhlenbeck, O.C. Many of the conserved nucleotides of tRNA(Phe) are not essential for ternary complex formation and peptide elongation // EMBO J. 1994. -Vol. 13, N 10. - P. 2464-2471.

121. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual././ 2nd edit (Grosjean, H., Benne, R., Eds.). Washington, D.C.: Cold Spring Harbour Laboratory Press. 1989. P. 1659.

122. Birnboim, H.C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant Plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979. -Vol. 7, N 6. - P. 1513-1523.

123. Davanloo, P., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., Studier, F.W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1984. -Vol. 81, N 7. - P. 2035-2039.

124. Grodberg, J., Dunn, J.J. ompT encodes the Escherichia coli outer membrane protease that cleaves T7 RNA polymerase during purification // J. Bacterid. 1988. -Vol. 170, N 3. - P. 1245-1253.

125. Cayama, E., Yepez, A., Rotondo, F., Bandeira, E., Ferreras, A.C., Triana-Alonso, F.J. New chromatographic and biochemical strategies for quick preparative isolation of tRNA // Nucleic Acids Res. 2000. -Vol. 28, N 12. - P. E64.

126. Rodnina, M.V., Semenkov, Y.P., Wintermeyer, W. Purification of fMet-tRNA*"* by fast protein liquid chromatography // Anal. Biochem. 1994. -Vol. 219, N 2. - P. 380-381.

127. Rodnina, M.V., Wintermeyer, W. GTP consumption of elongation factor Tu during translation of heteropolymeric mRNAs // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1995. -Vol. 92, N 6. -P. 1945-1949.

128. Nirenberg, M., Leder, P. RNA codewords and protein synthesis. The effect of trinucleotides upon the binding of sRNA to ribosomes. // Science. 1964. -Vol. 145, N 3639. - P. 13991407.

129. Kirillov, S.V., Makhno, V.l., Odinzov, V.B., Semenkov, Y.P. The mechanism of codon-anticodon interaction in ribosomes. Heterogeneity of tRNA complexes with 70-S ribosomes of Escherichia coli // Eur J Biochem. 1978. -Vol. 89, N 1. - P. 305-313.

130. Caiogero, R.A., Pon, C.L., Canonaco, M.A., Gua.'erzi, C.O. Selection of the rnRNA translation initiation region by Escherichia coli ribosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1988. -Vol. 85, N 17. P. 6427-6431.

131. Gromadski, K.B., Wieden, H.J., Rodnina, M.V. Kinetic mechanism of elongation factor Ts-catalyzed nucleotide exchange in elongation factor Tu // Biochemistry. 2002. -Vol. 41, N 1. - P. 162-169.

132. Wieden, H.J., Gromadski, K„ Rodnin, D., Rodnina, M.V. Mechanism of elongation factor (EF)-Ts-catalyzed nucleotide exchange in EF-Tu. Contribution of contacts at the guanine base // J. Biol. Chem. 2002. -Vol. 277, N 8. - P. 6032-6036.

133. Peske, F., Savelsbergh, A., Katunin, V.I., Rodnina, M.V., Wintermeyer, W. Conformational changes of the small ribosomal subunit during elongation factor G-dependent tRNA-mRNA translocation // J Mol Biol. 2004. -Vol. 343,. N 5. - P. 1183-1194.

134. Roughton, F.J.W. // Proc. R. Soc. 1934. -Vol. B115, N 1. - P. 475.

135. Chance, B. // J. Franklin Inst. 1940. -Vol. 229, N 455. - P. 613-637.

136. Bernasconi, C.F. Relaxation kinetics./. Washington, D.C.: Academic Press. 1976. P.

137. Ling, M.M., Robinson, B.H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview//Anal. Biochem. 1997. -Vol. 254, N 2. - P. 157-178.

138. Kirsch, R.D., Joly, E. An improved PCR-mutagenesis strategy for two-site mutagenesis or sequence swapping between related genes // Nucleic Acids Res. 1998. -Vol. 26, N 7. -P. 1848-1850.

139. Moazed, D., Noller, H.F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome // Nature. 1989. -Vol. 342, N 6246. - P. 142-148.

140. Odinzov, V.B., Kirillov, S.V. Interaction of N-acetyl-phenylalanyl-tRNAPhe with 70S ribosomes of Escherichia coli // Nucleic Acids Res. 1978. -Vol. 5, N 10. - P. 3871-3879.

141. Соболева, Н.Г., Махно, В.И., Коневега, А.Л., Семенков, П., Катунин, В.И. Влияние модифицированного нуклеотида в положении 37 на взаимодействие аминоацил-тРНК с А-сайтом 70S рибосомы // Молекулярная биология. 2003. -Vol. 37, N 1. - Р. 121-127.

142. Saenger, W. Principles of nucleic acid structure./. Springer Advanced Texts in Chemistry (Cantor, C.R., Ed.). New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo: Springer-Verlag. 1984. P. 556.

143. Kirillov, S.V., Semenkov Yu, P. Non-exclusion principle of Ac-Phe-tRNAPhe interaction with the donor and acceptor sites of Escherichia coli ribosomes IIFEBS Lett. 1982. -Vol.148, N 2. P. 235-238.

144. Noll, M., Noll, H. Structural dynamics of bacterial ribosomes. V. Magnesium-dependent dissociation of tight couples into subunits: measurements of dissociation constants and exchange rates //J. Mol. Biol. 1976. -Vol. 105, N 1. - P. 111-130.

145. Pape, T., Wintermeyer, W., Rodnina, M.V. Conformational switch in the decoding region of 16S rRNA during aminoacyl-tRNA selection on the ribosome // Nat. Struct. Biol. 2000. -Vol. 7.N2.-P. 104-107.

146. Vicens, Q., Westhof, E. Crystal structure of paromomycin docked into the eubacterial ribosomal decoding A site // Structure. 2001. -Vol. 9, N 8. - P. 647-658.

147. Li, J., Esberg, B., Curran, J.F., Bjork, G.R. Three modified nucleosides present in the anticodon stem and loop influence the in vivo aa-tRNA selection in a tRNA-dependent manner//J. Mol. Biol. 1997. -Vol. 271, N 2. - P. 209-221.

148. Sundaram, M., Durant, P.C., Davis, D.R. Hypermodified nucleosides in the anticodon of tRNALys stabilize a canonical U-turn structure // Biochemistry. 2000. -Vol. 39, N 41. - P. 12575-12584.

149. Cabello-Villegas, J., Winkler, M.E., Nikonowicz, E.P. Solution conformations of unmodified and A(37)N(6)-dimethylallyl modified anticodon stem-loops of Escherichia co/i tRNA(Phe> // J. Mol. Biol. 2002. -Vol. 319, N 5. - P. 1015-1034.

150. Perret, V., Garcia, A., Puglisi, J., Grosjean, H., Ebel, J.P., Florentz, C., Giege, R. Conformation in solution of yeast tRNA(Asp) transcripts deprived of modified nucleotides // Biochimie. 1990. -Vol. 72, N 10. - P. 735-743.

151. Laing, L.G., Draper, D.E. Thermodynamics of RNA folding in a conserved ribosomal RNA domain // J. Mol. Biol. 1994. -Vol. 237, N 5. - P. 560-576.

152. Wintermeyer, W., Savelsbergh, A., Semenkov, Y.P., Katunin, V.I., Rodnina, M.V.

153. Mechanism of elongation factor G function in tRNA translocation on the ribosome // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2001. -Vol. 66, N - P. 449-458.

154. Sherlin, L.D., Uhlenbeck, O.C. Hasty decisions on the ribosome // Nat Struct Mol Biol. -2004. -Vol. 11, N 3. P. 206-208.

155. Rodnina, M.V., Fricke, R., Wintermeyer, W. Transient conformational states of aminoacyl-tRNA during ribosome binding catalyzed by elongation factor Tu // Biochemistry. 1994. -Vol. 33, N 40. - P. 12267-12275.

156. Wintermeyer, W., Zachau, H.G. Fluorescent derivatives of yeast tRNAPhe // Eur J Biochem. 1979. -Vol. 98, N 2. - P. 465-475.

157. Jelenc, P.C., Kurland, C.G. Nucleoside triphosphate regeneration decreases the frequencyof translation errors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. -Vol. 76, N7.-P. 3174-3178.

158. Niedhardt, F.C., Umbarger, H.E. Chemical composition of Escherichia coli.l. In Escherichia coli and Salmonella typhimuirum. Cellular and Molecular Biology. (Niedhardt, F.C., ed), pp. 3-6. Washington, D.C.: ASM Press. 1996. - P. 3-6.

159. Gromadski, K B., Rodnina, M.V. Streptomycin interferes with conformational coupling between codon recognition and GTPase activation on the ribosome // Nat Struct Mol Biol. 2004. -Vol. N - P.

160. Cleland, W.W. Partition analysis and the concept of net rate constants as tools in enzyme kinetics // Biochemistry. 1975. -Vol. 14, N 14. - P. 3220-3224.

Информация о работе

Коневега, Андрей Леонидович
кандидата физико-математических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.02

Диссертация

Термодинамические и кинетические параметры взаимодействия транспортной РНК с А сайтом 70S рибосомы Escherichia coli: роль 37 нуклеотида - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы