Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия фрагмента фенилаланиновой тРНК из дрожжей, содержащего антикодоновую петлю, с 3OS субчастицами и 7OS рибосомами Esherichia coli

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия фрагмента фенилаланиновой тРНК из дрожжей, содержащего антикодоновую петлю, с 3OS субчастицами и 7OS рибосомами Esherichia coli"

РГВ од

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

па правах рукописи , ИЕХАЙ Сергей Анатольевич

УДК 577.2.17.347

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФРАГМЕНТА ФЕШШЛАКИНОВОЙ тРНК ИЗ ДРОЖЖЕЙ, СОДЕРЖАЩЕГО АНТИКОДОНОВУЮ -ПЕТЛЮ, С 30S СУБЧАСТИЦАЖ И 703 РИБОСОМАМИ ESCHERIOHIA СОЫ.

G3.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой стешни кандидата физико-математических наук

Санкт-Петербург 1993

ГаОота выполнена в лаборатории биополимеров Отделения молекулярной и радиационной отфизики Петербургского института' идерной физики им.Б.П.Константинова РАК.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

вед.н.с. Е.М.Саминский.

Остальные оппоненты: доктор физико-математичиских наук,

Рапопорт В.Л.

доктор медицинских наук, Гвйцхоки В.О.

Ведущая организация: Новосибирский институт биоорганической химии СО PAII (г.Новосибирск).

Защита диссертации состоится 1994 Г. в йВ

часов на заседании специализированного Совета Д 063.38.23 при СПОГТУ по адресу: С-Петербург, ул.Политехническая, д.29, корп.2.

С диссертацией можно ознакомжшзя в библиотеке Санкт-Петербургского государственного технического университета.

Автореферат разослан Ч 1993 г.

Ученый ■ секретарь специализированного совета

0. Л. Власова

Актуальность проблемы. К настоящему времени уже ясно, что взаимодействие тРНА о рибЬсомой - это одно из наиболее ватых событий в процессе биосинтеза белка. Происходит быстрый прогресс в понимании того, какие участки на рибосоме вовлечены во взаимодействие с тРНК. Было установлено, что на рибосоме расположены два функциональных участка для связывания аминоацил-и пептидал-тРНК (А и Р сайты). Позже был обнаружен участок для связывания деацллировэнной ' тРНК, получивший название выходного или Е сайта. Также накашиваются данные о том, как эти участки или сайты физически расположены на рибосоме. Несомненно, что взаимодействие тРЖ с рибосомой многоцентровое, причем различные центры могут быть задействованы при связывании тРНК на различных сайтах рибосомы. Известно, что тРНК взаимодействует областью антикодоновой шпильки с 16?. РНК,' мРНК и ркоосомшми белками в районе щоли малой субчаотицы; СОА-кокец тРНК взаимодействует с 23S РНК в Р-и А-сайтах. Концевой аденозин вносит значительный вклад при связывании тРНК на Е-сайте. Вероятно, взаимодействия ь отдельных центрах относительно независима друг от друга благодаря гибкости молекулы тРНК и/или относительной подвижности взаимодействующих участков рибосомы, а переключение отдельных центров и является двинущей силой элонгации. Несмотря на очевидную важность дли понимания механизма элонгации, данных о том, какие центры внутри тРНК взаимодействуют с рибосомой, крайне мало. До того момента, как бала предпринята работа, представленная в настоящей диссертации, были локализованы только области, которыми тГНК'взаимодействует с Р сайтом малой 30S, субчастицы рибосом. Однако ничего не было известно о налетии и распределении центров взаимодействия на уровне отдельных нуклеотадов тРНК, отличных от уже упоминавшихся CCA-somja и антикодона, при связывании тРНК на Р- и А - сайтах аелой 70S рибосомы.

ife/ью нсатощей работ является выяснение вопроса о расггре-'делении внутри молокулн тРНК центров взаимодейстзия ее с Р-и А-сайтами рибосом Escherichia coli и, в частности, локализация центров взаимодействия тРНК, расположенных внутри рнтикодопсбой

шпильки с Р-оаЙтом рибосом.

Задачи работы заключаются в следующем:

I ). Количественно изучить взаимодействие изолированной зчтикодо-иовой шпильки с 30S субчастицамм и 703 рибосомами и сравнить его с тековым для кнтактной тРНК с тем, чтобы определить вклад шпильки ь свободную энергию взаимодействия целой тРНК с 70S рибосомой.

2). 11рипотовить модифицированные аналоги изолированной антикодоновой шпильки» такие, чтобы модификация затрагивала отдельные нуклеотида в стебле шпильки.

3). Изучить связывание модифицированных шпилек с 30S субчастицами и 70S рибосомами. Сравнение полученных данных с данными для взаимодействия интактной изолированной шьильки позволит определить расположение центров взаимодействия, поскольку модификация отдельного центра мо:кет принести к сильному уменьшению свободной энергии взаимодействия полученного аналога с рибосомой.

Научная новизна и теоретическая ценность работ. Количественное изучение взаимодействия тРНК и ее производных с рибосомами невозможно было провести без выяснения условий, в которых достигается равнозеоие при связывании лигандов с рибосомами. В противном случае нельзя было бы достоверно определить константу равновесного связывания и, следовательно, вычислить величину свободной энергии взаимодействия. Имевшиеся в литературе данные о связывании фрагментов антикодоновой шпильки различных тРЯН бнли получены либо в чисто качественных экспериментах, либо в условиях, когда связывание явно не- достигало равновесия. Поэтому в настоящей работе были специально выяснены условия.в которых достигается равновесие при связывании тРНК и ее фрагментов с рибосомами. Б результате этого впервые измерена истинная константа ассоциации фрагмента, содержащего антикодоновув шпильку с ЗОВ и 70S рибосомами и определен вклад антикодоновой сиильки в свободную рнергию связывания TPHKPhe на Р-и А-сайтах рибосомы. Впервые показано, что шпилька вносит 85% в свободную энергию ьзаим-дцейсгвия целой тРНК с Р-сайтом, то есть большая часть центров взаимодействия сосредоточена внутри этой области тРНК.

BreDEs;e покззано, что внутри антикодоновой шпильки нуклеотид

ГЛ2, расположенный в стебле шпильки, вносит существенный рклзд во взаимодействие последней с 30S субчэстицей и с 703 рибосомой. Изучение и затем сравнение сродства анадох'оп антикодоновой шпильки, модифицированных в полокешш 42, познолило установить, что этот нуклеотид образует контакт с рибосомой: что контакт этот не Уотсон-Крикоьского типа.

Результата данной работы имеют существенное теоретическое значение, поскольку установлен ранее никем не описаний центр взаимодействия тРНК с. сайтом 70S рибосомы, которой расположен вне уже известных антккодоновых и 3'-кошевых ССА-нуккеетидсв. Дальнейшее изучение этого центра помоют понять детали механизма элонгации.

По теме диссертации опубликована I статья я теьисы четырех докладов. Результаты долокены на VI симпозиуме СССР-Италия (Ленинград, 1988), на X Советско-Французском симпозиуме (Киев, 1990), на X Русско-Германском симпозиуме (Суздаль, 1993).

' ООъзж раб от 127 страниц, в том числе 17 рисунков и 2 таблицы. Диссертация состоит из .введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (1'37 ссылок). Во введении излагаются и обсуждаются сушесткувдке б литературе дзкные о структуре тРИК-связывающих участков на рибосомах из Sschcrichia coït, о центрах'взаимодейстьия тРШ с рибосомой, расположенных внутри молекулы тРЩ. Обсуждаются метода! изучения таких центров и ограничения применимости этих методов, з частности, ограничения применимости термодинамических, данных для выяснения распределения энергга по центрам смзнрония нативной молекулы. В методической части описано ев я1 ленки

Php

дрожжевой тИПС , приготовление . ее изолированной С&-нуклестидной знтикодоновой шпильки,

А28 А G А3-Од и Gm A A Y А 0 U G43 Меченной фосйором 'Аг?. Я также производных этой шпильки, укороченных на один или два яуклеотида с 5' или 3' конца, или с модвфачировоуиым 3*-хсвцт'м нуклеотлдом. Описаны метода изучения разновесы :го свяг-мсыгия укороченных производных тРЬК с рибосомами. 3 рьидоле "й^аульч-птн

исследования" описаны данные изучения равновесия и кинетики всакшдействия изолированной антикодоновой шпильки с рибосомами Eaanertchia coli и их 3CS субчастицами. Определен вклад шпильки в связывание целой тРНК на 70S рибосомах. Приведены данные изучения стехиометрии связывания шпильки с рибосомами. В заключительной части раздела представлены данные ш изучению взаимодействия с рибосомами укорочегошх и модифицированных производных фрагмента, содержащего онтикодоновую шпильку. В "Обсуждении результатов" проводится анализ и интерпретация полученных данных, а также сравнение их с данными из литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ К ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Кгшепит взаимодействия 1б-нуклеотЮного фрагяенш(Р1б) с ЗОБ суОчасгащат. Прежде всего требовалось выяснить условия, при которых достигается равновесие при связывании PI5 с 30S субчастицеми, программированными пола(V). Для 'этого изучали кинетику ассоциации FI5 с ЗОБ-голи (U) и кинетику диссоциации комплекса FI5-30S-nojm(U). Сказалось, что еоличипы константы скорости ассоциации для трех температур (0°С, ?,0°С и 37°С). практически совпадают и равны k+=(2,3±0,3)-Ю4 М~1сГ1. Диссоциацию комплекса FI5-30S-nojm(U), полученного преинкубацией лиганда с рибосомами и матрицей в течение ночи при 0°С и 5 часов при

20°С, наблюдали после добавления 50-кратного избытка немеченой Php

деацилироьэнной тРШС . Однако,, мы обнаружили, что как при низкой' температуре инкубации, так и при высокой температуре происходит постепенная деградация комплекса, даже находящегося в условиях равновесия. Особенно сильно зтот эффект отражался на кривой при 0°С, поскольку в этом случае диссоциация вообще была не видна на фоне такой деградации. Нам удалось стабилизировать комплекс путем добавления в инкубационную смесь БСА до концентрации ¿00 мкг/мл. Это позволило нам получить кривые диссоциации и определить константы скорости диссоциации, которые оказались равны ^2,9*0,1 )»1(Г6 с"'1 при 0°С и (2,9-1 ) 'Ю-4 с-1 при 20°С. Полученнче величины констант скоростей реакции позволяют оценить величину константы равновесия, как отношение k+/k_. При 20°С это 07H0ü»Hi!0 равно 7,9-Ю7 М-', в' при 0°С ' : - 8-Ю8 М-1. Полученные

величины констант скоростей реакции использовали для вычисления т - характеристического времени установления равновесия и считал!, что равновесие устанавливается за время 3 - Б х (см., например Pingoud et, al.d'EBS Lett.-1973.-30, N1.-F.1-5)). Дпя наименьших рабочих концентраций оценки дали -i порядка i часа при 0°С и 5 - 15 мин при ?.0°С и 37°С.

2. Связывание 15-нунлеотидного фрагмент с 30S субиоагтрлч в условиях равновесия при различных твтертурах. В настоящее время из литературных данных хорошо известно, что в условиях избытка рибосом над лигрндом или при низких концентрациях лиганда происходит связывание'исключительно с Р сайтом рибосом. Связано это с тем, что константа ассоциации тРНК, а также и ее фрагментов с Р-сяйтом рибосом на один - дез порядка выше, чем соответствующая константа связывания с А- и Е- сайтами. Для определения констант равновесного связывания PI5 с Р-сайтом на ЗСК-поли (U) мы, как и в работе Нозе S.J. et al. (J.Mol.Biol.-1983.-167.-P.103-117), инкубировали' небольшое количество фрагмента (0,5 - 1 смоль) с переменным количеством субчастиц. На рис Л приведены данные для связывания Фрагмента при трех температурах (зависимость доли связанного фрагмента или тРНК от логарифма свободной концентрации рибосом, обозначаемой R). Пунктиром показаны изотермы Лэнгмюра для реакции второго порядка. Видно, что аппроксимируются только данные, полученные в присутствии ВСА. Поэтому теоретические кривые построены по методу наименьших квадратов только по точкам, иолученшм в присутствии БСА. Величины констант связывания фрагмента приведены а таблице I. При 2ü°0 • величина Ка близка с: стномсник k+/R_, что является подтверждением того, что мы достигли истинного равновесия. При 0°С отношение констант скоростей в 5 - 8 роз превышает измеренные величины К^ (См. п.1 и табл.1). Б то же время экстраполяция данных при .37 0 и ггри 20°С к 0°С дает величину 3-10° М"1. Последнее значение мы и считаем чаиболео близким к истинной константа равновесия при 0°0.

- о %

Рис Л.Определение констант равновесия при связывании 115 о ЗОБ-голи(U): 1-время инкубации 3,5 ч при 0"Сб 3,4-й часа при ЙО°С; 5,6-40 минут при 37 С, I,3,5-инкубация в присутствии БСА. Пробы объемом J00 мкл содержали 0,5-й,5 имоля F15 (Й0-200 Бк) и 1-1000 нМ 30S субчастиц.

Рис.2. Связывание 7'phkph" с 30S-nojm(U) (I) и 703~поли(17) (3) и PI5 с VOS-ncjm(U) (3). Условия оксп'еримента такие же, как и в подтшои к рисЛт.и8а исключением связывания тРНК* е с 70S-no.mi(U). В вюм случае инкубацию проводили 8 чесов при 20 С с БСА в пробах, объемом 500 мкл.

3. Взаимодействие 1Б-нуклеотиЛного фрагмент и дрожжевой

тРНКс Р сайтом 70S рибосом. Для того, чтобы оценить вклад

антикодоновой шпильки в связывание целой тРНК с Р~сайтом 30S и

Piip

VOS рибосом было изучено связывание целой тРНК и Р15 о Р-сайтом 7QS рибосом. Из рис.2 видно, что константа ассоциации фрагмента с 70S рибосомой (6,4-Ю7 М-1) близка к константе

TiVtp 7

ассоциации тРНК1 1 с 3QS субчастицами (5-10' M ), а также к константе ассоциации фрагмента с 30S субчастицами (6«10 M . Табл.1В то же врэмя сродство целой тРНК с 70S рибосомами приблизительно выше в 30 раз (2мО9 М-1 при 20°С, рис.2, Данные, гризеденные в табл.1,, показывают, что вклад центров, расположенных вне антикодоновой шпильки в свободную

Php

энергия овязьмания тРНК с Р-сайтом 30S субчастиц составляет

-'\ь кй^моль при 20°С. Таким образом, центры, находящиеся внутри аатикодоксвоЯ шпильки, вносят около 66% в свободную рк??гех> сйя?ыгания целой молекул! сРКК.

ру.й Габлина i

Связывание PIft и тРНК .с Р-сайтом 303 и 7CS рибосом при различной температуре.

Рибосомы

Лпганд

Ка.10"

U-1

ЛСО ДОо'* ¿AGO кДж/моль

зоа

3CS 30S 70S 70S

37°с

F15

3.4

20°с

F15

TPHKïhs FIS

TPHKFhe

Л.0-0.А 5.0-0.6

6.4-0.5 .-45.3 -55,1

200-25

-54

- 63.8

-8,7

303

0°С

FI5

от 10 до 30

ûi\G -разница мевду свободной анергией связывания проиг-родаой F1& и свободной энергией исходного фрагмента Л5.

3. Число лют святдания F15 m 302 суочааыи-хт и -ГСП риаосолш. Лля изучения связывания (фрагмента на А смйтг рибосом проводили эксперименты в условиях избытка лигпнда над рибосома -ми. в нашей работе mi; использовали препарат 30S субчастиц и VUS рибосом, выделенных согласно Ulrlliov et al.(NucJeic АсШ Rea.-i9Sùa-8.- p.183-196) и способных связать до двух молекул рйй-трнк из дроаакеИ на субчаотявд или рибосому (Катункн и Кириллов, Молекуляр. биология.-1934.-18, .4 4.-с. J4C4).

Кривая связывании F1U,■представленная кз ркс.З, гока?квя?-7, п"г л

Ус, hv-h"

г

Рис.3.Связывание F15 с......

30S-ноли(U)при 20°C(1)i.to же в тгрисутствии I-IO _5М тетрациклина (2) и 1°Т0 M едеина (3); 4- контрольные прооы без гтоли(и). Концентрация 30S субчасгиц 20-80 нМ, . время инкубации-2 часа. Сплошными линиями показан результат графического разложения изотермы.

Рис.4. "Связывание FIS с 708-поли(Ч;: 1-проба содержали £0-80 нМ 70S рибосом; 2-тс же в присутствии 1>10 M тетрациклина Инкубацию проводили 2 ч при 20 С. Сплошными линиями показан результат графического разложе-•ния изотермы.

избытйе F15 над рибосомами связывается до 1,8 молекулы фрагмента на 30S субчастицу, поскольку зависимость /С от 9 экстраполируется к N) =1.8 (данные представлены в координатах Скэтчарда i>/С от-? , где - доля рибосом, заполненных лигандом, а.С -свободная концентрация лиганда).' Графическое разложение кривой Скэтчарда по методу Weder et al.(Eur.J.Blochem.-1974.-42.-P.475-481) дает константы.сродства с сильным и слвбым местом (6*1 )<107 и (0,4-0,1 ) -Ю7 к~' при 20°С. Более сильная константа близка к таковой для связываний фрагмента в избытке 30S субчзстиц (Табл.1). Из рис.4 видно, что фрагмент способен связываться на двух местах 70S рибосом. Величины констант ассоциации, полученные по методу Weder et al. (1974) равны (¿D-IoV1 и <0.4*1)-IO7 М-1 и близки к таковым для связывания с 30S-roxm(U). 'Г&хке видно, что антибиотик тетрациклин, специфически подавляющий связывание с А-сайтом рибосом, не влияет на связывание фрагмента с "сильным" сайтом на 70S рибосомах, что дополнительно

подтверждает то, что 'фрагмент связывается с Р- и А- сайтами рибосомы. Также подтверждает это результат ингибирования связывания антибиотиком эдегагом, который специфически подавляет связывания тРНК на Р-и А-сайтах рибосомы (Рис.З).

4. Связывание произбоЗдаг 1Б-ну1иетидного фрагмент с Р-сай.юя риДосол. Для изучения роли яуклеотидов, участвующих в фсрмироватш стебля шпильки, были приготовлены аналоги фрагмента антикодоновой шпильки, укороченные на один или .два нуклеотида с 5' или 3' стороны с помощью фосфодиэстеразы из селезенки или из окешого яда, соответственно. Кривые связывания, этих аналогов представлены ка рис.5. Видно (см. также ^абл.2), что отрыв Б*-концевого нуклеотида не влиял на сродство полученного фрагмента, в то время как отрыв З'-концевсго нуклеотида уменьшал' сродство в 15 раз. Тот же результат был получен, когда 3'-концевой нуклеотид был удален путем окисления периодатом и последующего ^-элиминирования лизином (Табл.2).

После присоединения любого из четырех нуклеотидов с 3'-стороны к 14-нуклеотидному фрагменту, лишенному 3'-концевого нуклеотида, сродство полученного фрагмента к 30S субчастицам (рис.6) и 70S рибосомам (не показано) восстанавливалось до исходной величины. Это показывает, что сильное падение сродства в результате отщепления нуклеотида не является результатом повреждения фрагмента, который, очевидно, оставался интзктным. Кроме того, данные показывают, что даже присоединение цитидина, комплементарного 5'-концевому аденозину, не изменяло сродство фрагмента к 30S субчастицам. Связывание производных 15-нуклеотидного фрагмента, у которых 3'-концевой нуклеотид был окислен периодатом, а также окислен и затем восстановлен боргидридом, оставалось тем же, что и у исходного фрагмента (табл.2). Независимость сродства F15 к рибосоме от его вторичной структуры, т.е. от наличия или отсутствия аденозина на 5'-конце, а также и от наличия или отсутствия комплементарного взаимодействия между этим.адонозином и 3'-концевым нуклеотидом, является очень веским аргументом в пользу того, что последний

У о D/ L." V

о# * •

%

л -S—l lili-1—

1бМ 10°

Рис.5.Связывание с ЗОБ -поли(С) Р15 (О ) и его производных,укороченных на один . ( Л) шш два

( о ) нуклеотида с 3' -стороны им на один ( V ) или дав (Л ) нуклеотида с 5'-стороны с помощью фосфо-даостеразы из селезенки шш из змеирого яда,соответственно. Условия екопериманта- , как в ;;одпаси к рис. I.

R. 11

Рис.6. Связывание с 30S-noJ¡n(U) производных Р1Б, полученных путем присоединения нуклеотида с 3' стороны к Р14(3'). Показано присоединение С(Ь.), U(o), A(Q) и G(v ). Условия эксперимента такие же, как в подписи к рио.1.

взаимодействует с рибосомой непосредственно. Внутри самого нуклеотида за взаимодействие очевидно ответственна не рибоза (не влияет ео окисление и восстановление) и не фосфатные группы, а также и не те группы, которые принимают участие в■комплементарном Уотсон-Криковском взаимодействии.

Удаление прздоонцевих нуклеотидов как с 5*-стороны, так и с 3'- стороны уменьшало сродство получавшегося 13-иуклеотидного фрагмента в обоих случаях одинаково б 5 раз по сравнению со сродством соответствующего I4-нуклеотидного фрагмента (рис.15, Тйбп.2). Это на позволило сделать быеод о том, как взаимодействуют предаокцавне нуклеотида - прямо или путем влияния на концсрмьцию датикодсношй шпильки.

Связывание укороченных SOS-поли(U) при сгс.

Таблчца 2 производных F15 с

Лиганд

ка.ю-»-1

AG

АС

кДж/моль

AAG

F15 F15p F15ox F150X- ■red 15.4x2. 15.4x2. 10.0x3, 9.0-.?. OOQO -47.5 -56.6

F14(3' W=U,U, )pNp A,G ic.cfe. .5

F14(3' F14(3' ) >P 1.0x0. 1.0*0. ,2 .2 -40.6 -49.7

F13(3' ) 0.2-0. ,r -36.6 -45.7

F14(5' ) 15.4*2. ,0 -47.5 -56.6

F13(5 * ) 3.1±0. 5 -43.5 -52.6

6.5

1С. 9 О

4.0

ДАа -разшща мэзду свободной енергией связывания производной У15 и свободной энергией исходного фрагмента F1b. F15oir - Р15, у которого 3'-концевая рибоза окислена периодьгом, F15ox-red - то :ке, но с дополнительной редукцией боргидридом, как описвно в работе Leppla.S.H. et al. (1968). Р14(Э')Р - - это P14Î3') с 3'-фосфатной групой, который был приготовлен путем удаления З'-концевого нуклеогида у F15 периодатом и лизином по Kinjo, M. et al. (1986).

S. В работе, представленной в настоящей дьх:сертаи,ии,%неж показано, что фрагмент, содержащий антикодоновую шпильку, связывается 'с рибосомами так ке, кек и интактная тРИК^*5: имеются два сайта, сродство обоих лигандов одинаково на каждом из них (по данным прямых измерений и конкуренции). Сходни также и кинетические характеристики процесса. Связывание не более слабом сайте подавляется тетрациклином, как и в работе Klrillov et al.(1983). Поэтому логично предположить, что более сильно связывающий сайт является частью Р-сайта, а болче слабо связывающий - частью А - сайта. Сходство кинетических и равновесных характеристик свяснсанля Flo и тРКК доказывает, что последняя Н'т в?о!этодействует с ЗОЗ-полиШ) никакими центрами, лежащими виг,-области, сое-ть^гг^тг;уг!цей Ft 5 <вн« ¡127 - N12 в структуре тРКК),

т.е. вывод, сделанный ранее в работе Уленбека с сотр. (Rose et al., 1983), полностью подтверждается. Мы показала, что

сродство Фрагмента к целой 70S рибосомеs 30 раз меньше соответствующей величины для тРШИш. Это изменение в данном случае может считаться небольшим и означает, что большая часть центров для связывания тРНК с Р-сайтом сосредоточена в области N27-N42. Этот вывод является существенным и отличается от вывода, сделанного в Улебекэм с сотр., которые полагали, что интактная тРНК связывается с 70S рибосомами значительно сильнее, чем фрагмент (Rose et al., 1983).

Сродство изолированной антикодоновой шпильки к 30S-poly(U), по крайней мере на Р -сайте, оказалось намного выше (около IcAr1), чем величина сродства модельного кодон-антикодонового взаимодействия в растворе (около Ю6 М~1 для взаимодействия двух" тРНК с комплементарными антикодонами (Grosjean et al.,1976); ато означает, что сама шпилька с большой долей вероятности взаимодействует с 30S оубчр.стицами и 70S рибосомами дополнительными центрами (помимо нуклеогидов антикодона). Мы показали, что 3' концевой нуклеотид фрагмента антикодоновой шпилыш, соответствующий (¡42 в структуре интактной тРНКИ1е, по всей вероятности , является одним из таких центров и вносит около порядка величины в константу связывания шпилыш Р15 ( или около 13% в свободную анергию взаимодействия) с рибосомой. С большой долей вероятности „ можно утверждать, что и в составе интактной тРНК G42 образует контакт с рибосомой. Возможность такого контакта хорошо согласуется с данными по изучению скорости медленного тритаевпго обмана в пуринах tfíík- (Parber and Cantor, Proc. Natl. Acad. sol.usa.-1980.-77.-P.5135-5139). Поскольку специфичность этого нуклеотида оказалась не существенной, тс очевидно, что данный результат не мог быть получен путем замены отдельных нуклоотидов в тРНК.. Вопрос о том, какой именно контакт образует G42, пока что не шяскен.

вывода

1. Изучено связывание фрагмента CF15), содержащего антикодоновую шпильку тРНК№е из дрожжей с 30S и 70S рибосомами из E.colJ, програшированными матрицей noraî(U).

а) Установлены условия, в которых достигается рявновесие фрагмента при связывании с рибосомами.

б), Определена свободная энергия взаимодействия фрагмента с Р-сайтом 30S и 70S рибосом. Установлено, что фрагмент вносит около 85% в свободную энергию взаимодействия, т.е. болыиая часть центров взаимодействия тРНК с рибосомой сосредоточена в области N27-N42 тРНК.

в), , Изучена стехиометрия связывания фрагмента с рибосомами. Выяснено, что и на 30S субчэстицах и на 70S рибосомах фрагмент связывается на двух сайтах, Р и А.

2. Изучено связывание производных фрагмента Р15, укороченных с 5' и 3' стороны, а также модифицированных на З1-конце.

а) Установлено, что 3'-концевой нуклеогид вносит значительный вклад во взаимодействие фрагмента с рибосомами4 (около 13% в свободную энергию взаимодействия).

б) Показано, что для взаимодействия важно наличие нуклеотида, а его специфичность не важна, и что З'-конц'евая и предконцевая фосфатные.группы не принимают участия в этом взаимодействии.

Список работ, опубликованных по тема диссертации

1. S.A.NeKhal, Е.М.Samlnaky (1988) "Binding of yeast tRKAphe anticocton arm to Escherichia, ccll 30S and 70S rlboaomes". Abstr. VI USSR-Italy Meeting. P.118.

2. Ifexafi O.A., Самшский Б.M (1989) "Связывание фрагмента фенилаланиновой тРНК дрожжей, содержащего антикодоновую петлю с 30S и 70S рибосомами £.со11".Виополим. и клетка, т.5, jé 2, с.63.

3. S.A.Neklial, Parienoy D.V., Samlnaky Е.М. (1990) "Interaction or yeast tRNA^e- and its fragments with' poly(U) programmea rlboaomes from E.coll". Abstr. X Soviet -French Slmposlum, Kiev,,

4. S.A'.Naklial, Parienoy D.V., Samlnaky Е.М. (1991) "Interaction of yeast tRNA№e and Its fragnenta with poly(U) programmed rlbosoroes from E.coll".Abstr. XIV tRNA Workshop, Rydzlne, Poland, F.195. .

5. S.A.NeKhal, Parfenov D.V., Samlnaky E.M. (1993) "tRNA regions which, contact with, the rlbosomal poly(U)- programmed P slte".Abatr. X Ruasian-Geiraan Slmposiun (Suzdal, 1Э93).

И'П ПИЯ®, вак.??9, тирЛОЙ, уч.-изд,л.0,8;14/ХП-19ЭЗг.

Бесплатно