Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация сайтов на 50S рибосоме. Термодинамика взаимодействия участков тРНК с Р-сайтом

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация сайтов на 50S рибосоме. Термодинамика взаимодействия участков тРНК с Р-сайтом"

С.1

Санкт-Петербургский государственный технический университет

На права* рукописи У7ДС 577,212

ПАРФЕНОВ Дмитрий Владиленович

ИДЕНТИФИКАЦИЯ САЙТОВ НА 50Э РИБОСОМЕ. ТЕРМОДИНАМИКА ВЗАШОДЕЙСТЕШ УЧАСТКОВ тРНК С Р-СЛЯТОМ

(03.00.02 - биофизика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на сойскание ученой степени кандидата физико-математических наук

Санкт-Петербург - 1993

Работа выполнена в лаборатории биополимеров Отделения молекулярной и радиационной: биофизики Петербургского института ядерной физики FAH.

Научный руководитель: доктор биол. наук Е.М. Саминский. Официальные оппоненты:

Доктор физ.-мат. В.Л. Рапопорт, Санкт-Петербургский государственный университет.

Доктор мед. наук B.C. Гайцхоки, Институт экспериментальной медицины, Санкт-Петербург. . ■

Ведущее учрездение - Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН.

Защита состоится " _19^ г. в //Зз часов на

заседании специализированного совета Д 063.38.23.

С. диссертацией можно ознакомиться в библиотеке С-ГЮГТУ.

Учений секретарь специализированного совета Власова О.Л.

Актуальность проблемы.

Биосинтез бэлка на -рибосомах интенсивно изучается укэ более тридцати лет. Несмотря на это, из-за чрезвычайкой сложности объекта изучения существует еще множество пробелов в понимании молекулярных механизмов этох^о процесса. Неизвестно, б частности, какими участками и в какой последовательности молекула тРНК связывается с рибосомой в процессе трансляции. С какими элементами рибосомы она при этом взаимодействует. Происходят ли при этом какие-нибудь изменения конформации молеку.ш тРНК и рибосомы.

В связи с этим представляет интерес изучение термодинамики и кинетики взаимодействия тРНК и ее фрагментов с 705 рибосомой и ее субчастицами, что позволяет определить как центры взаимодействия молекулы тРНК с рибосомой, так и получить информацию об участках рибосомы, на которых такие взаимодействия происходят.

Основные задачи работы.

1. Разработать модельную систему, 'позволяющую изучать взаимодействие деацилироЕанной тРНК с 5GS субчастицей.

2. Изучить структуру сайтов связывания деацилироьагеюй тРШ на 50S субчастице и их связь с сайтами на 70S рибосоме.

3. Определить центры (или более протякекные участки) молекулы деацижровашюй тРКК, которнми она связнвается на Р-сайте рибосом.

Научная новизне результатов.

Впервые показано:

I) сайт быстрого обратимого сьязь'вшгля двааил^юваннзй тРНК на B0S субчастице не является частью F-сайте или А-с.чПта,

s представляет собой E-сайт, или,по крайней мере ,эго часть;

2) деацилированная тРНК имеет на 50S субчастице участок для связывания,помимо E-сайта, который является частью Р-сайта;

3) в матричио-зависимом связывают деацилированной тРНК нв Р-сайте 70S рибосом принимают участие нуклеотида С74, С75 и A7S. Измерены их вклада в стандартную, свободную энергию связывания при двух концентрациях ионов Mg2f.

4) разработана модельная система для изучения слабого и бистро обменивающегося связывания тРНК с рибосомами методом мембранной фильтрации, которая мокет быть использована при изучении свойств А- и Е-сайтов.

Полученные результаты имеют теоретическое значение для понимания функционирования 70S рибосом.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 16-ой конференции ФЕБО (Москва), 10-ом Советско-французском симповиуме (Киев), 14-ом совещании по тРНК (Польша).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три статьи и тезисы в материалах трех конференций.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и содержит 4 таблицы и 19 рисунков. Диссертация состоит из "Введения", "Обзора литературы", "МаториалоЕ и методов", "Результатов и их обсуждения", "Выводов" и списка цитируемой литературы.

Содержание работы I. ВЗАШОДЕЙСТВИЕ тРНК С 50S СУКЧАСТМЦЕЙ С целью получения модельной системы, удобной для изучения взаимодействия деацшшрованной тРПК с 50S субчастицами методом мембранной фильтрации было изучено злияние метанола кн сродство (стандартную свободную энергию адсорбцию) деаиилированноП тРИГС к 60S субчаотицам рибосом Е. coll. Сродство тРНК к 50S субчаотицам повышается с ростом концентрации метанола. Показано, что при добавлении метанола не происходит скачкообразных изменений сродства, т.е. конформация суОчастиц и тРНК не меняются. Из изотермы связывания (адсорбции) на рис.1 (v-связшю тРИК, моль/на моль субчастиц, С-концентрация свободной тРНК) следует, 4TQ в присутствии 20% метанола на 50S субчастицах связывается более одной молекулы тРНК на субчастицу (1Л> принимает значения менее I). Вндэн сильный излом изотермы, который свидетельствует о наличии связывания на двух сайтах с сильно отличающимся сродством. Сродство деацилировашой тРНК к сайту с большим сродством ("сильному" сайту) определяется Но участку изотермы в области ' малых концентраций свободное тРНК. Соотвэтствущая константа ассоциации KQj= 2000 mkM~Ï Вставка ка рис.1 представляет собой изотерму связывания второй молекулы с мкМ. Таким образом, деацилировашгая тРИС способна взаимодействовать с двумя участками на 50S субчасткце. Сродство тРНК к одному из участков (участок I ) в 2000 раз (На1=--2000*2СЮ (лкГ.Г1 ) больше, чем к другому (Ka2=I,OíO,I MKir1, участок 2). Последний не был обнаружен в безметанольных системах (0raje75kaja et al., !972«; Вреслор с сотр., 1976).

Из рисунка 2 следует, что аналог ппит:1.дил--'<,г;-;к.

О,г 0.G 1,0 J/5,10-9 4 12 0 2

, I/C-IlT* , IT1

trl

Рис. I. Рис. 2.

Рис Л. Связывание деацшшров виной тРНК с 5GS субчасти цами в 20Й-НОМ метаноле. Пробы содержали в объеме 0,12 - 1,6 мл: 5-25 пмоль 50S субчастиц, 3 - 1000 пмоль [14С1тРНК. Метода измерения: мембранная фильтрация - светлые кружки, центрифугирование.- черные кружки. На вставке - изотерма связывания второй молекулы тРНК. Изотерма адсорбции на двух сайтах -v=voI«C«KaI/(r+C«KaI)+ro2»CxKaí¡/(I+C"Ka2), v0- доля сайтов, способных к адсорбции.

Рис.2. Связывание AcFhe-тРНК с 50S субчастицами. Пробы содержали в объеме 25 - 40 мкл: 2-40 пмоль Ac[I4CJPhe-TPHK, 15 - 20 пмоль DOS субчастиц. Метода измерения: мембранная фильтрация в присутствии 20Х-ного метанола - черные кружки, центрифугирование без метанола - светлые кружки, в присутствии 20Ж-ного метанела - квадраты.

АсРйе-тРНК гакне способна связываться с 5СБ субчэстицами в присутствии 20% метанола, но количество мест связывания не удается установить простой экстраполяцией изоторш при 1/С ~;0. Однако, различие изотерм, полученных методам! центрифугирования в равновесных условиях и мембранной фильтрации, позволяет предположить, что связывание к в данном случае происходит на двух сайтах с различным сродством. Центрифугирование позволяет наблюдать связывание на обоих сайтах при неполном их заполнении. При использовании метода мембранной фильтрации лиганд с одного участка диссоциирует при измерении связывания на фильтрах, а с другого не диссоциирует, и по данным фильтрации кокно определить константы ассоциации с последним участком (зачерненные кружки на рис.2; Ка=0,8±0,1 мкМ_1при 0 °0 и 0,07^0,01 мкМ_1 при 25 °0 Е 20% метаноле). Поскольку наклон графика по данным центрифугирования (квадраты на рис.2) меньше, чем по данным мембранной фильтрации (зачерненные кружки на рис.2), очевидно, что участок, с которого АсР1ге-тРНК диссоциирует на фильтрах, является более "сильным". Константы ассоциации, вычисленные из рис. 2, таковы: для участка с высоким сродством К = 4,4±0,8 мк.4-1 в 20% метаноле и 0,9^0,2 г-жМ-1 без метанола при 0 °0.

Ка рис. 3 представлена дашше по ингибирования связывания Ас[14С)РЬе-т1ЪТС посредством доацилироваиной тРШ. (Р0 - количество связанной Ас(14СШге-тРШ{ без ингибитора, Р - то же в присутствии деактированной тРНК). Видно, что "сильный" учясток для АоРЬе-тРНК очень сильно ингибкруется деацилировокной тРНК. Значешга К~1(МООО мкМТ1 рис. 3, кривая 2} соответствует значению Ка для деанилированной тРНК ка участия I (К»1=2000мк.Г!), т.е. участок I совпадает или перекрывается с тон

в

Рис.3. Рис.4.

• Рис. 3. Ингибирование связывания AcPhe-тРНК посредством дерцилироввнной тРНК. Методы измерения: мембранная фильтрация в присутствии 20%-ного метанола - черные кружки и квадраты, центрифугирование в условиях равновесия в присутствии 20%-ного метанола - светлые квадраты, без метанола - светлые

кружки. Черными квадратами представлен эксперимент, в котором в

Php

качестве ингибитора использовали деацшшрованную тРНК .

Рис. 4. Зависимость начальной скорости реакции îicPhe-TPHK с пуромицином от ■ концентрации AcPhe-тРНК. Пробы содержали 20%-тЛ метанол. Концентрация 60S субчастиц и пуро-мицина 1,5 ккМ и 0,5 мМ. Температура реакции 0 °0 (I) и 25°С (2).

участком, где АсРЛе-тРНК связывается более сильно (но все ке в 500 раз слаОее, чем деацилировапная тРНК).

К такому же выводу молено прийти, сравнивая KJ1 и KQ для тРНК в системе без алкоголя. В этом случае К^1>10 мкМ~1(рис.з, рривая I); для деацилированной тРНК в этих условиях К =62 икМ~1.

Кривые 3 и 4 показывают, что "слабый" участок связывания AcPíie-TPHK ингибируется тРНН, связывающейся относительно слабо, т.е. на участке 2.

На рис. 4 представлены зависимости начальной скорости реакции AcPhe-тРНК с антибиотиком пуромицином (пептиднл-трансферазнвя реакция ) от концентрации АсРЬе-тРНК в обратшх координатах при 0 и 25 °С. При этом, по определению, АсГЬе-тРНК находится на Р-сайте. Значения К"1, вычисленные из этих кривых (0,67-0,09 и 0,07^0,03 мкМ при О и 25 °С, соответственно), совпадают со значениями Ка для связывания AcFfie-тРШ на участке 2 при обеих температурах (0,8-0,1 и 0,07-0,01 мкМ "1для О и 25°С) |{а на участке I в присутствии ?,% метанола равна 4,4¿0,B мкМ-*, ■ т.е. почти на порядок величины больше. Следовательно, участок 2, а ке I, совпадает с Р-сайтом.

Методом мебрвнной фильтрации наблюдается только связывание АсРЬе-тРНК на Р-сайте 50S субчастиц (при содержать срирта 20%), но ие на А--сайте. Это подтверждается как литературными данными (Мао, 1973), так и приведенными ъ таблице I результатами. Проведено связывание AcPhe-тРНЛ и. Fhe-тРНК с 50S субчастицами в присутствии 20% метанола, с добавлением хлсрЕ'мф*-никола или линкомицина или оез такового. Известно, что x.iopsv.:?.'--никол и линксмицин являются ингибиторами Л-сайта при сьлзин«чг.«

на нем минимальных акцепторных' субстратов (Vazquez, 1972) а хлорпмфяникол, кроме того, способен стимулировать связывание на Р-сайте донорного субстрата (Celma et al., 1970). Видно, что наблюдается стимулирование связывания обоих лигапдов хлорамфени-колом и отсутствие ингибирования линкомицином. Таким образом, связывания AoPhe-TPHK на А-сайте в использованных нами условиях (20Ж-1ШЙ метанол) не наблюдалось. Это служит еще одним подтверждением того, что слабое связывание деацилировакной тРНК, которое ингибкрувт связывание AcPhe-TPHK при наблюдениях методом мембранной фильтрации, происходит на Р-са^те. Таблица I. Влияние антибиотиков хлорамфеникола и линкомицина на связывание Phe-тГНК и AcPhe-TPHK с 50S субчасткцаш в присутствии 20% метанола.

Лигавд. хлорамфёнйкол "'Линкомицин Связываете, %

20 мМ Mg^

Phe-TPHK - 100

Phe-TPHK + - 162

Phe-TPHK + 105

AcPhe-TPHK - 100

AcPhe-TPHK -:- - 133

AcPhe-TPHK + 91

50S субчастицы подвергали обработке растворами

хлористого аммония возрастающей концентрации. Известно, что в результате такой обработки происходит частичная отмывка белков (Brot et al., 1972 ). На обработанных таким образом 5US суб-чсстицах проводили количественные измерения связывания деацили-рсвшшеЛ тРНК и выхода реакции AcPhe-TPHK с пуромицином и сравнивали полученные результаты с теми же величинам для

необработанных 50S субчастиц. Из рис. 5 видно, что способность к "сильному" связыванию деацилирсванной tPIÜÍ начинает падать при более низких концентрациях соли, чем спосо0}юсть к синтезу пептидной связи, т.е. за зтя-два свойства &OS субчвстиц отвечают

Г 1,5 2

[Л/H^Cf], lv!

Рис. 5. Зависимость относительного выхода пуромицино-вой реакции (I) и относительного связывания деацилировакнсй тРНК на "сильном" сайте 5GS суочастиц (2) от концентрации хлористого аммония при "отмывке" суочастиц.

Представленные результаты покачивают , что в присутствии метанола в 6US суочастицэх обнаруживаются два участка для связывания деэтилированной тРНК и АсРЬе-тРНК, различающиеся но сродству. Участок 2 ( более слабый) не наблюдается без метанола: дазке в ZQ% метаноле сродство к ному Acíhe-тРНК и особенно деацилировенной тРНК нижа, чем к участку I, но оба даганда взаимодействуют с участком 2 почти с одинаковым сродством. Ки один из участков не является. A-сайтом. Более слабый участок является частью, р-сайта, расположенной на 505 еубчастицо. Водом

силышя участок является Е-сайтом. 12

2. ПОЛИ(U)-ЗАВИСИМОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДРОЖЖЕВОЙ тРНКРЙе И ЕЕ ФРАГМЕНТОВ О РИБОСОМАМИ ИЗ ESCHERICHIA СОЫ.

С цэлью локализации неизвестных центров взаимодействия деаиилированной тРНК с Р-сайтом, и, в частности,с его частью на 5OS субчастице, сравнивали поли(и)-зависимов сродство к 70S

Php

рибосоме Eeoherloh.ia ooli тРНК из дрожжей и различных ее производных: тРНК без одного £тРНК(-А)3, двух [тРНК(-СА)] и трех ЕтРКК(-ССА)) куклеотидов на 3'-конце, фрагментов, содержащих нуклеотиды с I по 45 (Ф1-451 и с 13-го по 76-ой №18-76), 15-нуклеотидного фрагмента AAGACmUGmAAYA4>^CUG, [Ф28-42], имитирующего антикодоновую шпильку дрожжевой тРНК®611 с одной заменой С на ft. в 5'-концевом нуклеотиде [N281. Эта замена на влияет на сродство фрагмента к рибосоме (Rose et al., 1983).

Известно, что участком, наиболее сильно связывающим тРНК в присутствии матрицы, является Р-сайт (Kirlllov, 1986; bill -et al.f 1986). Для Ф28-42 это также имеет место (Rose et al., 1983; Нехай, Саминский, 1989). Для лигандов с промежуточным сродством, очевидно, имеет место такая же ситуация. Из таблицы 2 и рис, 6 следует, чтс сродство к Р-сайту уменьшается в ряду Ф28-42< тРНК(-А) стРКК . Не исключено, что это уменьшение связано с тем, что антикодоновая шпилька в Ф28-42 имеет конформацию, менее благоприятную для связывания, чем в составе интактной тРНК. Другое объяснение состоит.' в том, что с рибосомой взаимодействуют, кроме центров, расположенных в антикодоновоЯ шпильке, еще и нуклеотид А76 и, сверх того, еще какие-то нуклеотиды в остальной части молекулы.

Свободная анергия связывания тРНК и Ф28-42 определяет-

ся как сумма соответствующей стандартной свободной энергии из таблицы 2 и свободной энергии смешения компонентов с водой (10,1 кДж/моль при 30 °С ). Если предположить, что вклады всех центров в общее взаимодействие аддитивны, то вклад знтикодоноеой шпильки при 10 мМ (-55,4 кДк/моль) составляет 87% свободной энергии связывания всей молекулы (-63,8 кДж/моль). А76 дает еще -2,4 кДж/моль, остальные центры дают -6,0 кДк/моль (см. таблицу 2).

Таблица 2. Термодинамические параметры взаимодействия тРНК и ее фрагментов с 70S рибосомами. Роль концевого аденозина А76. Влияние ионов Mg2+. Высокомолекулярная матрица.

Лиганд К*10~7 а -AG 0 -AAG 0

м-1 кДж/моль

10 мМ Mg2+

тРНК 180-30 53,7^0,2 2,4

ТРНК(-А) Ф28-42 63-13 6,4^0,4 51,3-0,2 45,3-0,1 6,0

20 ММ Mg2*

ТРНК 600±80 56,7-0,3 2,5

ТРНК(-А) Ф28-42 220-10 13^0,8 54,2-0,1 47,1*0,2 7,1

ДАО - разности между величинами стандартных свободных энергий связывания соответствуших лигандоЕ.

9+ 1 Ч-

При 20 мМ Mg~ сродство интактной тРНК возрастает на -3,0 кДж/моль, при этом вклад А76 не изменяется; большая часть прибавки приходится на шпильку (-1,8 кДк/моль ).

Полученный результат - зависимость сродства деацилиро-

ванной тРНК к Р-сайту от наличия А76 - противоречит утверждению

Лилла и соавторов (Ы11 et al., 1988) о том, что отрыв A7S нэ

влияет на сродство тРНК к Р-сайту. Однако в указанной работе

сравнивали ингибирувдеэ действие тРНК я тРНК(-А) по отношении к

последующему связыванию AcPhe-iPHK при очень высокой концентра-

-7

ции взаимодействующих компонентов, большей, чем 10 М. Очевидно, что при б том Р-сайт должен быть полностью занят гаггибитором.1 Кинетика обмена на Р-сайте, как видно из данных тех ¡кэ авторов (LUI et al-, 1986), весьма медленная. Естественно, что в выбранных авторами условиях различие в сродстве исследуемых ингибиторов но проявляется, tqm более,что и на самом деле оно не очень велико.

Из сказанного выше следует, что, помимо З'-концевого нуклеотида А76 и антикодоновой титьки, приходится допустить существование еще и других участков молекулы тРНК, взаимодействующих с Р-сайтом. Из табл. 3 следует, что к снижению свободной анергии связывания могут приводить различные модификации молекулы тРНК. В частности, отщепление . каждого из трех 3'-концевых нуклеотидов уменьшает стандартную свободную энергию связывания тРНК на 2,4-3,9 кДж/моль. В результате отщепления трех нуклеотидов сродство уменьшается в 40 раз, до величины, характерной для отдельной антикодоновой шпильки (эксперименты 1-6 и 9). Тот факт, что сродство лишенной ОСА-конца тРНК к Р-сайту последовательна возрастает при восстановлении скачала

нуклеотидов 074-С75, а'затем и А76, позволяет заключить, что падение сродства в экспериментах по удалению нуклеотидов 3*-конца происходит не по причине неспецифического повреждения молекул тРНК во время приготовления препаратов, хотя это и возможно (Tal et al., 1972). Маловероятно, что это отщепление влияет на сродство через неблагоприятные для связывания изменения конформации оставшейся части молекулы тРНК, т.к. нуклеотиды 3'-конца не участвуют в образовании вторичной и третичной структуры; кроме того,известно, что структуры шпилек тРНК не зависят от того, входят ли они в состав целой молекулы или в состав фрагмента (Llghtioot, 1973); тем Солее, удаление одних только концевых нуклеотидов не глокет повлиять на эти структуры. Наконец, совершенно очевидно, что удаление участка N1-N17 изменит ¡информацию сильнее, чем удаление CGA, и тот Факт, что сродство в последнем случае изменяется сильнее, чем в первом оксп. 8 и 6 в твбл.1), означает, что ССА-конец содержит центры связывания.

Вывод о непосредственном участии СОА-конца в связывании согласуется с многочисленными данными об участии нуклеотидов ССА-конца в связывании с пептидилтрансферезшм центрам в составе минимальных доноров (Chladek and. Sprlnzl, 1985). Существуют также данные, показывающие, что нуклеотиды 3'-конца АсРЬе-тРНК защищены от химических модификаций при связывании с Р-сойтом (Feattle and Herr, 1981), a 23S рРНК защищена от химических модификаций 3'-концевими нуклеотидами тРНК и донорными фрагментами, связанными на Р-сайте (Moazed and Noller, 1989b; Eoazed and Noller, 1991). Таким образом, З'-конневые нуклеотиды взаимодействуют с рибосомой непосредственно.

Таблица 3. Термодинамические параметры взаимодействия тРНК и ее производных с 70S рибосомами

N лиганд К«10-7 - AG - AAG***

М-1 кДк/моль

I тРНК 180*30 53,7 -

г тРНКвос! 170+15 53,6 -

3 тРНК(-А) 68±13 51,3 2,4

4 ТРНК(-А)В0С- 66±10 51,2 -

Б тРНК(-СА) 21±2 48,3 5,4

й тРНК(-ССА) 4,5+0,3 44,4 9,3

7 Ф1-45- 9,5±0,5 46,3 Т.4

8 Ф18-76 16±4 47,7 6,0

9 ' Ф28-42 6,4±0,4 45,3 8,4

10 АсРПе-тРНК I6+I 47,5 6,2

'Восстановлена из тРНК(-А). ^Восстановлена из тРНК(-ССА).

***Разность свободных энергий данного лиганда и интактной тРНК.

тРНК, лишенная 31 нуклеотида с З'-конца (Ф1-45), имеет сродство к Р-сайту не меньшее, а даже несколько большее, чем тРНК без ССА-конца; почти такое ке сродство имеет изолированная антикодоновая шпилька Ф28-42 (эксперименты 6,7 и 9, табл. 3). Очевидно, что, присоединившись дополнительно к антикодоновай шпильке, участок МКМЭТ , а также' N43-^3 совместно о Н1-Н27, не только не привносят сродство, но даже несколько уменьшают

его. 17

Удаление из молекулы тРНК участка N1 -N17, так же, как и удаление участка N46-1776, приводит к зьметночу падению свободной энергии взаимодействия (эксперименты 7 и 8, табл.З). Однако, в составе тРНК(-ССА) и в составе Ф1-46 участок N1-N17 при этом совершенно различны: в первом случае он включен, как и в интактной тРНК, во вторичную структуру, а во втором - он одноцепочечный и имеет совершенно измененную кснформацию. Таким образом, мокно полагать, что сам по сабе участок М1-К17 я рибосомой не взаимодействует, а его удаление сказывается на общем сродстве только за счет изменения конфсрмации оставшейся части акцепторного стебля и связанного с этим ослабления взаимодействия нуклеотидов И74-Ы76. Возможно, что при этом часть взаимодействия этих нуклеотидов все я:е остается, и именно за счет него Ф18-76 связывается в 2,5 раза сильнее шпильки.

АсРпе-тРНК, аналог естественного субстрата рибосомы, . связывается с ней не только не сильнее, но даже значительно слабее, чем деацилировапная тРШ (эксперимент 10, табл. 3). Такое ослабление кажется вполне естественным, если принять во внимание, что рибосома является ферментом синтеза пептидной связи и, следовательно, максимальным должно бить сродство нэ в фермент-субстратном претранспептидационном комплексе, в котором пептидил-тРНК находится на Р-сайте, а в последующем по ходу транспептидации переходном состоянии (Ферпт, 1980), которое в статических состояниях не наблюдается. Фактически, сродство к Р-сайту АсРЬе-тРНК даже меньше, чем сродство производных тРНК, лишенных двух нуклеотидов с ССА-конца (эксперименты 3,5 и 10, табл. 3), и это наводит нэ мысль о тем, что АсРПе- группа просто

мешает взаимодействию этого конца с рибосомой.

Ранее уже было показано, что антикодоновая шпилька и дэацилированная тРНК имеют примерно одинаковое сродство к Р-сайту 3GS субчастиц., и что сродство антикодоновой шпильки к Р-сайту 70S рибосом примерно равно таковому к Р-сайту 3QS субчастиц (Rose et al., 1983; Пехай, Саминский 1989). Это-означает, что взаимодействие тРНК с 30S субчастицей сосредоточено в антикодоновой шпильке, а дополнительные взаимодействия должны происходить с 5QS субчастицей. Поскольку на этой субчастице находится гоптидилтрансферазный центр, именно с ней к должна связываться 3*-концевая часть молекулы тРНК, что на семам деле и . обнаружилось. Приведенные еышэ количественные данные, показывают, что на взаимодействие антикодоновой шпильки с рибосомой приходится основная часть свободной энергии связывания тРНК на Р-сайте 70S рибосом. Более того, из приведенных данных, следует вывод о том, что на Р-сайте 70S рибосомы тРНК связана только антикодскозой шпилькой и ССА-концом, т.к. вкладов указанных участков достаточно, чтобы сообщить даацилированюЗ тРНК имеющееся у нее сродство к Р-сайту 70S рибосом. В остальной части молекулы никаких центров взаимодействия кет.

ВЫВОДЫ

1. 50S субчастицы имеют, по крайней мере, два участка для связывания деацилироЕанной тРНК и AcPhe-тРНК.

Сродство одного из этих участков к деацшшрованной тРНК значительно больше, чем другого. Для AcPhe-тРНК различие в сродстве Еыражено слабее.

Участок со слабым Сродством является частью Р-сайта, находящейся на 50S субчастице.

Участок с сильным сродством, ранее отождествлявшийся с частью Р-сайта на 50S субчастице, является большей часть» Е-сайта.

Модельные системы, содержащие метанол, являются адекватным инструментом для изучения взаимодействия доацилиро-ванной тРНК с 50S субчастицами.

2. Основной вклад в матрично-зависимое взаимодействие деацилироваиной тРНК с 70S рибосомами дает антикодоновая шпилька.

Деацилировяшая тРНК, помимо актикодоновой шпильки, взаимодействует с Р-сайтом 70S рибосом, еще и с помощью ССА-конца.

Вклады отдельных нуклеотидов составляют 2,4 кДя/моль, 3,0 кДлс/моль и 3,9 кДж/моль для А76, С75 и G74, соответственно,,при 10 Ш Mg2 и 30 °с.

Двацилированная тРНК взаимодействует с Р-сайтом 70S рибосом только с помощью ССА-конца и антикодоковой шпильки.

. Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Парфенов Д.В., Саминский Е.М. Дополнительный сайт на 50S субчвстицах рибосом Escherichia coli для связывания деацилированной тРНК //16-я конференция ФЕБО: Тез. докл.. M., 1984,

с.275.

2. Парфенов Д.В., Саминский Е.М. Дезашшфованная тРНК связывается с 50S субчастицей рибосом Escherichia coli на специальном участке, не. совпадающем с участком Р'. - Молокуляр. биология. 1985, т. 19, с. 1378 - 1385.

3. Nekhal S.A., Parfenov D.V., Samirmky Е.М.. Interaction

of yeast t,RNAPhe and ite fragments with poly(U)-programmed riboeomee from E.coli// XIV tRNA Workshop rAbstr., Rydzyne (Poland), I991, c. 195.

4. Парфенов Д.В., Саминский E.M. Поли(U)-зависимое

Php

взаимодействие дрокковой тРНК с рибосомами из EBoheriohia oo3i. - Молекуляр. бчология, 1991, т. 25, о. 642-647.

5. Парфенов Д.В., Саминский Е.Ы. Поли(U)-зависимое взаимодействие дроясевой тРНК№е и ее фрагментов с рибосомами из Escherichia ooli. II. Локализация центров' связывания тРНК с Р-сайтом. - Молекуляр. биология, 1993, т. 27, с. 827 - 832.

6. Nekhal S.A., Parienov I).V., SairilnsKу E.M. tRNA regions which contact with the rlbosomal poly(U)-programmed P-alte/VX Russian-German Slmpoalum:Abstr., Suzdal, 1993.

РГП ПИП$,зак.780,тирЛ00,уч.-изд.л.0,9; I7/XI-I993r. Бесплатно