Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пуромициновая реакция А-сайт связанной пептидил-тРНК и влияние транспептидации на стабильность рибосомного комплекса

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Пуромициновая реакция А-сайт связанной пептидил-тРНК и влияние транспептидации на стабильность рибосомного комплекса"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

.. На правах рукописи

. ГБ ОД

; . л: 8 1396 •.

Шапкина Татьяна Георгиевна

ПУРОМИЦИНОВАЯ РЕАКЦИЯ А-САЯТ СВЯЗАННОЙ ПЕПТЙДИЛ-тРНК И ВЛИЯНИЕ ГРАНСПЕПТИДАДИИ НА СТАБИЛЬНОСТЬ РИБОСОМНОГО КОМПЛЕКСА

03.00.03 - молекулярная биология

. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Лаборатории биосинтеза белка Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им.Б.П.Константинова РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Ю.П.Семенков .

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

профессор, академик РАН А.А.Краевский,

доктор химических наук, профессор . И.Н.Шатский .

Ведущая организация: Новосибирский институт

биоорганической химии СО РАН.

Защита состоится "29" 199^ г. в час

на заседании Диссертационного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984,Москва,.ул.Вавилова, аз. . '

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН. Автореферат разослан "¿1" ^¿¿уиц. 199в г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат кжлкчэеких наук А.К.Крицан . -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биосинтез белка на рибосомах - один га наиболее важных и интересных клеточных процессов. Изучение зго представляет собой фундаментальную задачу молекулярной био-иогии. Уже более 30 лет ведутся интенсивные исследования этого зроцесса с помощью разнообразных физических и биохклических методов. Но,несмотря на то, что основные этапы и многие детали зго мозхно считать установленжши, остается целый ряд неразре-аенных вопросов и проблем, связанных с процессом трансляции в целом и с работой рибосомы.

Удлинение растущего пептида на одну аминокислоту происходит в ходе одного элонгационного цикла. Валинм шагом в понимании механизмов работы рибосомы явилось изучение взаимодействия рибосом с различными компонентами, участниками элонгации, и в первую очередь с тРНК. На сегодн. день определено количество сайтов связывания тРНК на рибосомах, их структурная организация, функциональная роль, измерены основные кинетические и термодинамические парэ-'этры взаимодействия различных форм тРНК (аминоацил-, пептидил- и деацшмрованной) с каадым сайтом. В последнее время особый интерес исследователей вызывает изучение комплексов [рибосома-мРНК-тРНК], отражающих конкретное функциональное состояние рибосомы в определенный момент элонгационного цикла, например, пре- и посттранспептидационное, пре- и пост-транслокационное.

Общепринято, что в пре транслокационном комплексе вновь синтезированная в рибосоме пептидил-тРНК находится в А сайте. В результате последующей транслокации ( ЕР-С-фактор-зависимой.

или "неэнзж.'атической") пептидил-тРНК перемещается в Р сайт Это состояние является, соответственно, посттранслокационшм. ] модельных комплексах In vitro положение пептидил-тРНК на рибосоме и, следовательно, состояние комплекса определяется, кш правило, по способности этой пептндал-тРНК реагировать с антибиотиком пуромицшга.м. Считается, что Р-сайт связанная пептвдил-тРНК (т.е. в посттранслокационном комплекса) количественно образует петидкл-пуролицин, а А-сайт связанная (т.е. в претранс-локационном когшлаксе) - вообще на реагирует с пуромицином.

Кинетика реакции с пуромицином для Р-сайт связанной пепти-дил-тРНК изучалась достаточно детально. Тем не менее,существуй различные точки зрения на необходимые условия ее проведения. 3 результате они варьируют в очень широких пределах. А поскольк; данные пуромициновой реакции используются для идентификацш сайтов, определения доли активных рибосом и доли рибосом в пре-и посттранслокационном состояниях, то в некоторых случаях применение определенных условий может привести к ошибочному представлению об рнализируемых комплексах.

Кроме того,следует отметить, что в действительности реакция с пурошштном дает информацию дайь о положении З'-концево! области пепт15дил-тРНК в рибосоме. Вследствие же многоцентровохч взаимодействия тРНК и рибосомы в процессе элонгации возмозта нахождение тРНК в смешанных или гибридных состояниях, когда различные части молекулы находятся в разных сайтах рибосомы, что уже показано на основе структурных исследований различны: тРНК-рибосомальных комплексов. В связи с этим,естественно, возникает вопрос о том, как вздет себя пептидал-ТРНК в таком со-етпяи;;;1, ннпример, по отношению к пуромицину и возможно ли <

помощью пурокпцйновой реакции идентифицировать это гибридное состояние тРНК в рибосоме.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работа явилось:

1) исследование кинет: 'и реакции с пуромицяном пептидил-тРНК в пост- и претранслокационном комплексах, причо:,! как связанной с Р и А сайтам« рибосем непосредственно из раствора, так и образованной естественном путем в результате синтеза пептидной связи на рибосоме;

2) исследование стабильности синтезированной в рибосоме пептидил-тРНК в посттранслокационном комплексе в отсутствии следующего шага элонгации.

Научная новизна и теоретическая ценность результатов. Впервые показано, что пептидал-тРНК может количественно реагировать с пуромицином без транслокации в Р сайт, оставаясь связанной с А сайтами 7QS рибосом. Таким образом, функционально доказано существование гибридного состояния пептидил-тРНК на рибосоме, когда основная часть молекулы находится в А сайте, а ее З1-конец в Р сайте пептидилтрансферазного центра.

Из сопоставления полученных данных с имеющимися в литературе предложена новая схема событий, происходящих в рибосоме в процессе транспептидации.

Даны практические рекомендации по применению антибиотика пуромицина для определения положения пептидил-тРНК в рибосоме. Доказана необходимость кинетической дискриминации А и Р сайтов при идентификации их с помощью пуромициновой реакции.

При исследовании стабильности посттранслокационного комплекса обнаружено явление спонтанной терманации, происходящее пр:т длительной инкубации пептидил-тРНК, синтезированной в рибо-

- б -

соме и находящейся на Р-сайте при свободных А-сайтах.

Показано, что деацилированная тШК, естественным образок полученная в рибосоме, имеет иные параметры взаимодействия с I сайтом, чем непосредственно связанная из раствора.

Теоретическое значение результатов состоит в уточнении механизмов транспептидации и транслокации в прокариотических рибосомах.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на И-о»

международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1939), на конференции Американского микробиологического общества по рибосоме (Монтана, США, 1989), к международных конференциях "Регуляция трансляции" (Рига, 1989' и "Биосинтез бежа" (Пущино, 1991).

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, списка литературы. Диссертационная работа изложена » 139 страницах, содержит 30 рисунков и 2 таблицы. Библиографа включает 159 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. А-сайтовая пурсмициновая реакция.

Исследуя кинетику реакции с пуромицином пептидил-тРЖ синтезированной в риСосоме, Е претранслокацчонном комплексе, м показали, что она способна образовывать пептидил-пуромицин, н трэнслоцируясь в Р саГ.г, а находясь на А-сайте. Эксперименты доказывающие этот факт,были поставлены следующим образом.

На .первом этапе Р сайта поли(и)-ззпрограшировашшх 7С ркбосом бнли заполнены простейшим аналогом псятадал-тРИК

Вреия (шш)

Рис.1. Образование претранслокационного комплекса -кинетика поэтапного связывания пептидил- и аминоацил-тРНК с 70S рибосомами при О°С. На первом этапе смесь в 50 мкл буфера TAMggg (20 мМ трис-HCl, рН 7.7; 200 мМ Ш^С 1; 6 кМ HgClg, 0.4 мМ спермин и 0.6 мМ спермидин, •5 мМ p-меркаптоэтанол) содержала 10-пмоль 70S. 5 мкг поли(О) и 12 .моль Ac[14C]Phe-TPHKPhe. Через 1 час инкубации в смесь добавили тройной комплекс: 10 пмоль t%]Phe-TPHK^e, 15 таль ЕР-Ти и GTP (в конечной концентрации 10_3М). Фильтруя смесь через нитроцеллюлоа-вде фильтры, определяли количество связанных с рибосомой тРНК: -о- - AcPhe-TPHRPhe, -о- - Phe-TPHKPhe. Пунктиром обозначено суммарное связывание.

VcPhe-TPHKPhe. На втором этапе с А сайтами связали Phe-TPHKPhe

I

з составе тройного комплекса с фактором элонгации Tu и GTP (рис.1). После синтеза пептидной связи рибосомы находились в третранслокационном состоянии, т.е. имели молекулу AcPhe«-

t

100

-100

50

50

20 40 60

20 40 60

Враия (мин)

Рис.2. Кинетика реакции с пурошцином претранслока-ционного комплекса с AcPhe2-TPHKPhe( синтезированной в рибосоме. Претранслокационный комплекс с Ас[ С1-Phe [ ^ ]Phe-TPHK?iie получали, как показано на рис.1. На А сайте находилось 0.8 молекул AcPheo-TPHK^8, принятые за 100%, Сйлесь переводили в 256С и делили на 3 порции. К одной добавляли 10 пмоль EP-G и пуромицин (10~3 М), ко второй - только пуромицин и измеряли кинетику образования AcPhe2-FM (А; -о- и -д-,соответст-вешо). К третьей порции пуромицин добавляли через 1 час ьлкубации ее при 25°С :з также измеряли кинетику реакции с антибиотиком (В>.

тРНК?Ье на А сайте. Далее этот претранслокационный комплекс переволи в 25°С и разделили на две части. К одной добавили фактор алонгации в и пуромицин, к другой - только пуромицин, и измеряли кинетику выхода пептидал-РМ, экстрагируя продукт в зтилаце-тат. Быстрая кинетика роакции с пуромицином в присутствии в фактора свидетельствует о том, что в этом случае ь системе идет

Время (шт)

Рис.3. Кинетика реакции с пуромицином Р-сайт связанных AcPhe- и AcPhe2-TPHKPhe. 5 пмоль 70S рибосом и 5 мкг îtojui(U) инкубировали 1 час при 25°С с 5 пмоль AcruC]Phe-TPHKPhe или Б пмоль Ac[uC]Phe[3H]Phs-

Php

тРНК в 25 мкл буфера TAMggg. После проверки связывания (v =О.Э - для АсРЬе-тРШ?110 и v=Q.6 для AcPhe,-phf» р

тРНК ), в смеси добавляли пуроиицин и измеряли кинетику выхода AcPhe-PM (-о-) и ÀcPhe2-PM (-о-). Параллельно измеряли кинетику реакции с пуромицином 0.6 пмоль Ac[1*C]Phe[3H3Phe-TPHKPhe, синтезированных в рибосоме (см. рис.1) и транслоцированных в Р сайт в ходе 5 мин инкубации с EF-G фактором (-л-).

процесс транслокации, и перешедшая на Р сайт пептидил-тРНК сразу образует пептидил- РМ (рис.2А,-о-). Однако и в отсутствии EF-G пептидил-тРНК количественно реагирует с антибиотиком, что можно объяснить, например, спонтанной трвнслокацией AcPî^-tFHK из А в Р сайт (рис.2А,-д-). Тогда через час инкубации претрвнс-локационного комплекса вся AcPhe2~TPHK должна оказаться на Р сайте и быстро реагировать с пуромицином при его добавлении.

-10В следующем эксперименте, проинкубировав пре транслокационный комплекс в течение часа при 25°С, мы внесли в смесь пуроми-цин и измерили кинетику выхода AcPhe2-PM (рис.2В). Оказалось, что лишь половина AcPheg-TPHK быстро вступила в реакцию, осталь •ная же часть реагировала с пуромицином медленно. Значит, не вся пептидал-тРНК, как предполагалось, находилась на Р-сайте к моменту добавления антибиотика, а лишь часть ее. Тем не менее, реакция продолжалась до конца.

Измерение кинетики пуромициновой реакции Р-сайт связанных

Php

пептидил-тРНК (рис.3) показало, что АсРЬе2~тРНК полностью образует АсР1ге2~РЫ уже через 20 с инкубации рибосомного комплекса с антибиотиком. Причем,такая высокая скорость реакции характерна как для связанной с Р-сайтом из раствора, так и для синтезированной в рибосоме и транслоцированной в Р - сайт AcPlieg-TPHK^6 (рис.3,-д-,-о-). Поскольку это так, измеряя ко-

Php

личество связанной с рибосомой AcPhe2-TPHK , которое успевает прореагировать с пуромицином за 20 с, можно определить,сколь ко пептвдил-тРНК, находится в данный момент на Р-сайте, й таким образом, добавляя пуромицин к пре транслокационному комплексу через различные промежутки времени в процессе его инкубации, измерить кинетику спонтанной транслокации. Из рисунка 4 видно, что процесс спонтанной транслокации (кривая 3) протекает значительно медленнее, чем реакция пептидил-тРНК в претранслокацион-ном комплексе с пуромицином (кривая 1). Значит.последняя не может быть объяснена только явлением спонтанной транслокацш.

Отсюда было выдвинуто предположение, что остальная .часть пелтидал-тРНК реагирует с пуромицином, не транслоцируясь в I сайг, т.е. находясь на А сайте. Но эта реакция протекает гораз-

-100

50

20 40 60

Время (мин)

Рис.4. Кинетика А-сайтовой "пуромициновой реакции и спонтанной транслокации при 25°С. Смесь, содержащую 8 пмоль претргчслокационного комплекса (см. рис.1),разделили на три части. К одной добавили пуромицин и биомицин (Ю-4 М), к другой - только пуромицин и измеряли кинетику выхода Ас [ иС]РЬе(%]РЬе-РМ (-о- +УЮ. -о--710). Третью часть смеси инкубировали без добавок, отбирая через указанное Дt аликвоты для 20 с. пуромициновой рэакции (-а-).

до медленнее, чем реакция той же пептидил-тШК из Р-сайта. Для проверки этого предположения мы использовали антибиотики - ин-

I

гибиторн транслокации - виомищш и канамицин. Предварительно показав, что эти антибиотики полностью блокируют спонтанную транслокацию, мы измерили кинетику пуромициновой реакции

AcPíie?-TPHK в претранслокационном комплексе в присутствии VIO. Оказалось, что и в отсутствии спонтанной транслокации синтезированная в рибосоме пептидал-тРНК вступает в реакцию с пуромицином. Кривая 2 (рис.4) в чистом виде отражает кинетику реакции из А-сайта.

Чтоб.; доказать, что AcPhe2~TPHK лрк этом действительно не покидает А сайт, ми использовали А-сайт-тест. Он основан на том, что аминоацил-тРНК в составе тройного комплекса мокет быстро связываться со свободными А сайтами рибосом (рис.5). В контрольном эксперименте перед добавлением в смесь тройного комплекса AcI'heg-TPHK^1113 была транслоцирована в Р сайт с помощью G-фактора. После добавления в смесь ТС дополнительное связыва-

Php

нио I'he-тРНК приблизилось к v=1 , т.е. действительно все свободные А сайты были компетентны в связывании аминоацил-тРНК (рис.5,-о-). Добавив ке ТС к претранслок ационному комплексу, проинкубированному около 1 часа без ингибитора транслокации и в его присутствии, мы увидели, что в первом случае с каждой рибосомой дополнительно связалось около 0.3 молекул вминоацил-тРНК (рис.5,-0-)-, а во втором - никакого прироста связывания не наблюдалось (рис.5,-д-). Значит, 70% и Ю0% .соответственно, А сайтов остались занятыми пелтидал-тРНК, которая, как было показано выше, реагировала с пуромицином.

Описанные эксперименты однозначно демонстрируют, что, поскольку ЛсРЬер-тРНК1'116 в претранслокационном комплексе способна реагировать с пуромицином, то она занимает такое положение, что 3'-конец ее находится в р участке пептидилтрансферазного центра рибосома, в то время как остальная часть молекулы продолжает занимать А-сайт или сайт, сильно с ним перекрывающийся. То

Вреыя (шш)

Рис.Б. А-сайт-тест. Кинетика связывания "второго" тройного комплекса с А сайтами рибосом. Смесь с пре-транелокационным комплексом (см. рис.1) перевели в 25°С и разделили на 3 части. К одной добавили 10 пмоль ЕР-Й и через 5 мин инкубации охладили до 0°С. Две другие части смеси инкубировали в течение 1 часа. Одну - в при;утствии виомицина, другую - без добавок. Затем их также охладили до 0°С. Далее в каждую смесь добавили по 10 пмоль тройного копмлекса - [!4С]Р1ю-тРККРЬе-ТЦ'СТР и измеряли добавочное связывание [14С1.

есть налицо гибридное состояние пептиднл-тРЙК в рибосоме - А/р. Интересно, что при связывании гоптидил-тРНК с А сайтами 7Сй рибосом из раствора после заполнения Р-сайтов деацилированной тРНК она также оказывается в гибридном состоянии. Это следует из эксперимента, представленного на рисунке 6. Биомицин не влияет на скорость реакции с пуромицином АсР11е-тРШ£Р1ш и АсРПе2-тРНК1>*1е в таких претранслокационных комплексах, т.о.

- u -

%

Вреия (кин)

Рис.6. Кинетика реакции с пуромицином AcPhe- и AcPhe2- тРНК?йе, связанных с А-сайтами из раствора. 10 пмоль 70S и 5 мкг поли(Ч) инкубировали в 25 мкл TAM6¿S при 25°С 1 час с 20 пмоль немеченой тРНКРЬе. Затем в смесь добавляли 10 пмоль Ac[uC]Phe[3H]Phe-TÍÍIKPhe или Ac[14C]Phe-TF}¿KPhe в 2 мкл того же буфера и инкубацию продолжали ©use 1 час. Далее каждую смесь делили пополам. К одной части добавляли пуромвдин, к другой-виомицин и пуромицин и измеряли кинетику образования АсРЬе2-РМ (-Д-, +VI0, -o-, -VIO) и AcPhe-PM (-д- +VI0, -о- -VIO).

спонтанная транслокация В данном случае не происходит, и мы наблюдаем только реакцию из А сайта. Не исключено, что пептидил-тГНК не может занимать в претранслокационном комплексе на рибосоме чисто А-саПтовое полокэкие, а может находит!ея только в

гжзридаом А/р-состоянии.

Структурные данные, касаициеся тРНК-рибссомальных комплексов, говорят в пользу того, что обе молекулы занимают на рибосоме разные положения до и после синтеза пептидной связи. Так, исследование различных тРНК-белковых сшивок в работах Абдураши-довой с соавт. и Карповой с соавт. показало, что в результате транспептидации изменяется набор белков, соседствующих как с аминоацил- , так и с пептидил-тРНК. На основании результатов нашей работы и литературных данных мы выдвинули предположение, что сам процесс транспептидации вызывает такие конформационные изменения тРНК-рибосомального комплекса, что вновь образованная пептидил-тРНК оказывается в гибридном положении, то есть во время синтеза пептидной связи 3'-конец аминоацил-тРНК, по-видимому, отклоняется к пептиду, находящемуся в Р-сайте РТС. Это предположение согласуется со структурными данными группы Хардести, согласно которым положение пептида относительно рибосомы практически не изменяется, за исключением удлинения на одну аминокислоту. 3'-конец образовавшейся деацилированной тРНК должен в таком случав отклониться в область Е сайта, освобовдая место новой тРНК. Значит, деацилированная тРКК также оказывается в гибридном - Р/Е состоянии. Рассматривая транспептидацию как реакции, в результате которой 3'-концевая область пеятидил-тРНК оказывается в Р сайте, ее следует считать первым или одним из первых этапов транслокации. На следующем этапе происходит, перемещение остальной части молекул пептидил-тРНК из А в Р сайт с участием ЕР-С и передвижение матрицы на один триплет, то есть собственно транслокация (рис.7).

Предложенная нами на основ© функционального подхода к изу-

ЕРА

50 S

5

АМИНОАЦИЛ-TPHK

Рис.7.

ШРАНСЛОКА ЦИЯ

I

пептидил-тРНК

J лелцилиро-/ ВАННАЯ тРНК

чению рибосом схема практически совпадает со схемой Ыоазеда и Ноллера (Nature, 1989), базирующейся на структурных исследованиях. Авторы изучали тРНК-рибосомные комплексы методом химического футпринтинга. Согласно их данным,молекулы тРНК на рибосоме экранируют от химической модификации определенные наборы нукле-отидов рибосомальных PJIK. Исследовав эти группы нуклеотидов в различных типах комплексов, авторы пришли к выводу, что для претранслокационного состояния рибосомы характерно гибридное положение пеитидил- и деацилированной тРНК - А/Р и Р/Е,соответ~ ' ственно. Интересно, что авторы предположили возможность пепти-дил-тРНК в претранслокационном комплексе реагировать с пуроми-цином, однако экспериментально не подтвердили этот факт. Причина, на наш взгляд, заключается в том. что они проводили инкуба-

%

50 с

Вреия (иш)

Рис.8. Кинетика реакции с пуромицином АсРЬе2-тРНКр^е, синтезированной в рибосоме, яри 0°С. К 7 пмоль пре-транслокационного комшзекса (см.рис.1) с Ас[14СШш-[^]РЬе-тРНК^е, находящегося при 0°С в ТАЫ^,' добавляли пуромицин (—о—) или пуромяции и биомицин (-д-) и измеряли кинетику реакции при 0°С.

цшэ комплекса с антибиотиком, ео избекакии спонтанной транслокации, при 0°С. А мы показали, что щи этой температуре пуроми-циновая реакция А-сайт связанной пептвдил-тРНК очень медленная, и за 30 мин протекает лишь на незначительной части рибосом (рис.а). Отличие предложенной нами схемы от схемы Ыоазеда и Ноллера заключается в том, что, по мнению авторов, пептидил-тРНК попадает в гибридное положение после трэнспептидации вследствие более высокого сродства З'-конца деацилированной тРНК к Е сайту, а З'-конца пептидал-тРНК - к р сайту РТС. № же предполагаем, что перестройка комплекса происходит непосредственно

в ходе реакции транспептидации.

Следует отметить, что .обнаружение А-сайтовой пуромициновой реакции ни в коей мере не исключает возможности использования _ пуромицина для определения положения пептидил-тРНК в рибосомном комплексе. Однако вместо принципа "все или ничего" следует использовать кинетическую дискриминацию сайтов, основанную на большой разнице скоростей пуромициновой реакции пептидил-тРНК, находящейся на Р-саРте и оставшейся на А. Измеренная нами константа скорости реакции с пуромицином А-сайт связанной АсРЬе2-тРНКР11е при 25°С составляет « 5.8х10-4 с-1, что примерно на два порядка величины ниже, чем константа скорости пуромици-новой реакции Р-сайт связанной АсРЬ^-тРНК . Только короткая инкубация комплекса с пуромицином позволяет оценить истинное количество Р-сайт связанной пептидил-тРНК. Цри. длительной же инкубации значительным оказывается вклад в результат реакции из А' сайта. Например, за 50 час (а такое время инкубации с антибиотиком можно встретить в литературе) даже при 0°С и даже АсРЬе-тРНКГ11е, находящаяся на А сайте, успеет полностью образовать АсР1ге-РМ. Так, некорректное использование пуромицинового теста может привести к неправильному представлению об используемом комплексе, а следовательно, к неверной интерпретации результатов и построению ошибочных моделей. На то, что транспепти- • дация вызывает в рибосомальном комплексе глубокие конформацион-ные изменения, указывают и результаты, полученные в следующей части настоящей работы.

2. Спонтанная терминация.

Мы.показали, что, если в рибосоме синтезировать молекулу AcPhe2-TPHKFlie на А сайте, как делалось в предыдущей части, фактор-зависимо транслоцировать ее в Р сайт, и затем инкубировать такой посттранслокационный комплекс при 25°, не добавляя в смесь компонентов, необходимых для следующего шага элонгацион-ного цикла, то этот посттранслокационный комплекс оказывается нестабильным. Более детальное исследование его обнаружило, что пептидил-тРНК не диссоциирует из рибосомы в виде целой молекулы, а подвергается гидролизу. При инкубации дасттранслокацион-ного комплекса с Ac[14C]Phe2-TPHKPhe количество связанного с рибосомой [14С]-материала уменьшается параллельно с количеством ТХУ-осаждаемого [**С]-материала (рис.9, и -а-). То, что происходит разрыв связи между пептвдсм и молекулой тРНК, а не деградация последней, вызванная присутствием РНКаз, было показано в экспериментах с AcPhe2-TPHKPlie, у которой пептидильный остаток содержал [14С]-метку, а конечный аденозин самой молекулы ["^Ш-метку. Количество ТХУ-осаждаемого [%]-материала в этом случав .со временем не менялось.

Наблюдаемый нами процесс отличен от обычного щелочного гидролиза пептиднл- тРНК в растворе и от гидролиза, вызванного действием пептидил- тРНК-гвдролаз, поскольку рибосома защищает молекулы тРНК,связанные с ней, от такого рода гидролиза, а в данном случае,напротив,она сама катализирует процесс. Если диссоциировать пептидил-тРШ в раствор, понизив концентрацию ионов

Php

магния в смеси, то АсР1ге2-тРНК оказывается гораздо стабильнее (рис.9, —о—, -л-).Кроме того, рибосома осуществляет гидро-

Вреия (чао)

Рис.9. Стабильность молекулы пептидил-тРНК в пост-транслокационном комплексе. Ас[иС]РЬе-тРНКУ1ге синтезировали в рибосоме (см. рис.1) и транслоцировали в Рг сайт (+10 пмоль ЕР-С, 25°С, 5 мин). Инкубируя смесь при 25°С. через различные Д1; отбирали аликвоты, параллельно измеряя связывание (-•-)и количество ТХУ-осак-даемого СиС1-материала (-а-). Часть исходной смеси перед повышением температуры разбавили в 10 раз буфером без Мв24 и проводили в ней такие же измерения. (Открытые символы.)

лиз пептидил-тРНК только, если последняя транслоцирована в Р сайт. Задержанная на А сайте с помощью антибиотика - ингибитора транслокации, АсРЬе2-тРНКР^е сохраняет свою целостность при инкубации комплекса в аналогичных условиях.

Таким образом, наблпдвемнй процесс аналогичен тврминации

Рис.ю. Относительная стабильность различных пост-транслокационных комплексов. С 10 пмоль комплекса [7СЙ-поли(и)] в 50 мкл буфера ТАМ^ связали в течение 1 час при 0°С 9 пмоль Ас[1*С]Р11е-тРНКР1ге (-л-) или 7 пмоль Ас[14С]Рй.е[3Н]РЬе-тРНКРПе (-о-). 7 пмоль пост-транслокационного комплекса образовали естественным путем (см. рис.1) в буфере ТАЫ15 (-«-). Далее все смеси перевели в 25°С и измеряли кинетику связывания пептидал-тРНК. За 100% принято количество Р-сайт связанной пептидил-тЕНК в момент повышения температуры.

полипептидной цепи. Поскольку в системе отсутствуют нонсенс-кодоны и терминирующие факторы, то в данном случае происходит спонтанная транслокация.

Следует отметить, что это явление свойственно только

50

1 2 3.4 Время (чао)

Рис. 11. Кинаипса гидролиза пептидил-тИЖ и связывания образующейся деавдлированной тРНК в посттранслокацион-ном комплекса при 25°С. Посттранслокационный комплекс, (см. рис.9) с Ас[14стге2-[3Н]тРНКР11е в буфере ТАМ15 инкубировали при 25°С, параллельно измеряя связывание (-о-) и количество ТХУ-осаздаемого материала (-л-). Заштрихованные символы - [ С}—материала незаштрихо— ванные символы - ("^Н]-материал.

комплексу с синтезированной в рибосоме АсРЬе2-тРНК1'йе. Связанные с Р сайтом из раствора АсРЬе- и АсРЬе2-тРНКИ1е оказываются значительно стабильнее (рис.10). Транслокация АсРЬе-тРНКР1ш после связывания с А сайтом в Рсайт не влияет на стабильность молекулы. Значит,необходимым условием наблюдаемого явления является предшествующая транспептидация.

Из эксперимента с пептидил-тРИК с двойной меткой видно

также, что вслед за гидролизом пептидил-тРНК на рибосоме, происходит и диссоциация самой молекулы тРНК. Связывание { Н]-метки с некоторым отставанием тоже падает со временем (рис.11). Константа ассоциации вновь образованной деацилирован-ной тРНК с Р-сайтом оказывается на 2 порядка величины ниже, чем константа ассоциации деацилированной тРНК, измеренная при связывании из раствора. Причина вменения сродства тРНК к Р сайту лежит, на наш взгляд, в самой реакции гидролиза. Эта реакция представляет собой первый шаг транспептидации и осуществляется тем же пептидилтрансферазным центром. В ходе гидролиза также освобоздается макроэрг. Поэтому и транспептвдация, и спонтанная терминация могут приводить к одинакового рода изменениям в тРНК- рибосомальном комплексе. Превращение пептидил-тРНК в деацилированную во время синтеза пептидной связи может выражаться в снижении константы связывания ее с Р сайтом. Таким образом в рибосоме, по-видимому, создаются условия, благоприятные для ухода деацилированной тРНК из Р, сайта в ходе транслокации. Данное предположение согласуется с экспериментом на рисунке 6, где мы показали, что спонтанная транслокация пептидил-тРНК из А в Р сайт возможна, только если до этого в рибосоме произошла транспептидация.

ВЫВОДЫ

1. Доказано, что пептидил-тРНК в претранслокационном комплексе, как синтезированная в рибосоме, так и связанная из раствора, находящаяся на А сайте, способна реагировать с пуромици-ном. Отсюда:

а) сделан методологический вывод о необходимости кинетической дискриминации Р- и А-сайтовой пуромщиновой реакции при использовании ее для локализации пептидил-тРНК на рибосоме.

б) уточнен механизм транспептидации, а именно,сделан вывод о том, что в процессе образования пептидной связи происходит перенос 3'-конца аминоацил-тРНК, находящейся на А сайте, в р сайт РТС, в результате чего в претранслокационном комплексе вновь образованная пептидил-тРНК оказывается в гибридном А/р . состоянии. "

2. Установлено, что при длительной инкубации посттрансло-кационного комплекса с вакантным А сайтом пептидил-тРНК подвергается гидролизу с участием рибосомы. Доказано, что необходимым условием протекания процесса является предшествующее образование пептидной связи.

3. Установлено, что сродство деацилированной тРНК, образовавшейся в ходе спонтанной терминации к Р сайту 70S рибосом, значительно ниже, чем сродство деацилированной тРНК, связанной с Р сайтом 7GS рибосом в тех же условиях из раствора.

4. Показано, что спонтанная транслокация может идти только при инкубации претранслокационного комплекса с синтезированной в рибосоме пептидил-тРНК.

ОПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Semenkov Yu.P., Shapklna T.G., Kirillov S.V. Puromycln reaction at the rlbosomal A site, Preprint LNPI » 1495, May,1989, 17 С.

2. Shapklna T.G., Semenkov Yu.P., Makhno V.I., Kirillov S.V. Spontaneous termination in 70S ribosomes E.coll, Preprint LNPI Л 1621, July, 1990,14 C.

3. Semenkov Yu.P., Shapkina T.G., MaKhno V.I. Kirillov S.V. Puromycln reaction lor the A-slte bound peptldyl-tRMA.

PEBS Lett. - 1992. - V.296. - P.20T-210.

4. Semenkov Yu.P., Shapkina T.G., Kirillov S.V. Puromycln reaction of the A-site bound peptidyl-tRNA. BiochUnle - 1992. - V.74. - P.411-417.

Отпечатано в типографии П11ЯФ

4ai:. 560, тир. 100. yi.-ичд. л. 1; 21/XI-1995 г. Бесплатно