Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эволюция копийности белка L12 в рибосомах бактерий и органелл эукариот

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Эволюция копийности белка L12 в рибосомах бактерий и органелл эукариот"

На правах рукописи

Давыдов Яков Игоревич

ЭВОЛЮЦИЯ КОПИЙНОСТИ БЕЛКА Ы2 В РИБОСОМАХ БАКТЕРИЙ И ОРГАНЕЛЛ ЭУКАРИОТ

Специальность 03.01.03 — Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

11 2013

005538146

Москва — 2013

005538146

Работа выполнена в Научно-техническом центре «Биоклиникум»

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор, член-корреспондент РАН

Тоневицкий Александр Григорьевич

Федеральное государственное бюджетное учреждение

Научно-исследовательский институт

общей патологии и патофизиологии РАМН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Миронов Андрей Александрович Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М. В. Ломоносов

доктор биологических наук, профессор Гельфанд Михаил Сергеевич Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем передачи информации им. А. А. Харкевича РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биоорганической химии им. академик М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится 2013 года в часов на

заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Автореферат разослан

года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук, доцент

Т. Л. Воюшина

Общая характеристика работы

Введение. Актуальность проблемы

Рибосома — сложная молекулярная машина, осуществляющая синтез белков на основе матричной РНК. Наименее изученным участком рибосомы является так называемый Ь7/Ы2-стержень (или Р-стержень для эукариот).

Рибосомный стержень необходим для трансляции, он взаимодействует с факторами трансляции, являющимися ГТФазами (такими как EF-Tu, EF-G, IF2 и RF3 или их эукариотическими гомологами), и стимулирует гидролиз ГТФ. Экспериментально показано, что рибосомный стержень влияет на скорость и точность трансляции, хотя механизм этого влияния малоизучен.

Ь7/Ы2-стержень включает в себя рибосомный белок L10 (или его гомолог РО в случае эукариот и архей), а также несколько молекул белка L12 (или его гомологов Р1/Р2 у эукариот).

Значение копийности белка L12 в рибосоме различается в разных видах: так в рибосоме Escherichia coli содержится четыре молекулы белка LI2, а в рибосоме Thermotoga maritima — шесть. При этом для большинства изучаемых бактерий значение копийности белка LI2 остается неизвестным.

Изучение копийности белка L12 и эволюционных событий, приводящих к ее изменению, является актуальной научной задачей и позволяет пролить свет на возникновение и эволюцию рибосомы.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было изучение копийности белка L12 и его эволюции в бактериях, митохондриях и пластидах. В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать алгоритм предсказания копийности белка LI2 в бактериях, пластидах и митохондриях.

2. Предсказать с использованием разработанного алгоритма копийность белка LI2 бактерий.

3. Предсказать с использованием разработанного алгоритма копийность белка L12 для органелл эукариот.

4. Изучить основные события изменения копийности в ходе эволюции.

5. Экспериментально подтвердить полученные предсказания.

Научная новизна и практическая значимость

В данной работе было проведено систематическое изучение копийности рибосомного белка L12.

Был разработан алгоритм предсказания копийности белка L12, основанный на аминокислотной последовательности белков с использованием методов предсказания их вторичной структуры. Выдвинут ряд гипотез о предковых состояниях копийности.

Было выполнено предсказание значения копийности L12 более чем для тысячи различных видов. Впервые предсказана копийность L12 для рибосомы митохондрий и пластид.

Впервые были обнаружены бактерии, имеющие восемь копий белка L12. Данное предсказание получило экспериментальное подтверждение.

Полученные результаты могут быть использованы при изучения аппарата трансляции различных видов бактерий, а также при разработке новых противо-микробных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В ходе исследования разработан алгоритм предсказания копийности белка L12 в рибосоме. С использованием алгоритма предсказана копийность белка L12 более чем для тысячи видов бактерий;

2. Анализ эволюции копийности показывает, что у последнего общего предка современных бактерий в рибосоме содержалось шесть копий белка L12;

3. В рибосомах митохондрий и пластид, как правило, содержится шесть молекул белка L12;

4. В ходе исследования впервые предсказано, что у ряда цианобактерий в рибосоме содержится восемь молекул белка L12. Предсказание было экспериментально подтверждено.

Апробация работы и публикации

Основные результаты работы докладывались на: 33-й конференции молодых ученых и специалистов ИППИ РАН ИТиС'10 (Геленджик, сентябрь 2010), 5th International Moscow Conference on Computational Molecular Biology MCCMB'll (Москва, июль 2011), 34-й конференции молодых ученых и специалистов ИППИ РАН ИТиС'11 (Геленджик, октябрь 2011), 35-й конференции молодых ученых и специалистов ИППИ РАН ИТиС'12 (Петрозаводск, август

2012). По материалам диссертации опубликовано семь печатных работ, из них три — статьи в журналах, рекомендованных ВАК, четыре — тезисы в материалах конференций.

Диссертационная работы была апробирована на заседании Научно-технического совета НТЦ «Биоклиникум» 27 февраля 2013 года, а также на семинаре секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИ-генетика» 14 октября 2013 года.

Личный вклад

Все основные результаты, включенные в диссертацию, получены лично соискателем. Соискателем выполнена разработка алгоритма, предсказание ко-пийности белка L12 бактерий и органелл, а также исследование эволюции ко-пийности. Обсуждение и интерпретация результатов осуществлялись совместно с научным руководителем. Экспериментальные работы осуществлялись совместно с коллегами из Института биофизической химии объединения Макса Планка: Мариной Родниной и Ingo Wohlgemuth.

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, благодарностей, списка литературы и одного приложения. Полный объем диссертации составляет 99 страниц с 31 рисунком и 9 таблицами. Список литературы содержит 166 наименований.

Основное содержание работы

1. Копийность L12 в рибосомах бактерий

Предсказание копийности белка L12

Белок LI2 состоит из двух доменов соединенных гибкой перемычкой. Глобулярный С-концевой домен взаимодействует с факторами трансляции, тогда как а-спиральный N-концевой домен участвует в димеризации и связывании с белком LI0 (Wahl, Möller, 2002).

Белок L10 содержит восемь «-спиралей и четыре /3-листа; гомодиме-ры белка L12 связываются с последовательными элементами на С-концевой а-спирали белка L10. Отдельные L12-CBH3bmaioume сегменты белка L10 разделены изломами (Diaconu, 2005) на С-концевой а-спирали (рис. 1).

Димер L12 №2

Рис. 1: Трехмерная структура комплекса белка L10 и трёх участков димеризации белка L12 Т. maritima. С-концевые домены белков LI2 не показаны.

Копийность белка L12 зависит от длины С-концевой ск-спирали, т.к. длина этой а-спирали определяет число последовательно расположенных сегментов, связывающих димеры белка L12 (Diaconu, 2005). Таким образом, предсказание вторичной структуры белка L10 может быть использовано для обнаружения потенциальных 1Л2-связывающих сегментов.

Для предсказания копийности LI2 использовались более двух тысяч последовательностей рибосомного белка L10 из базы данных UniProt. После кластеризации на основе степени сходства последовательностей было выбрано 754 характеристических последовательности, каждая из которых представляла один из кластеров. В совокупности 754 последовательности представляли более 1200 различных видов бактерий.

Для каждой изучаемой последовательности белка L10 было выполнено предсказание вторичной структуры. На основе вероятностей нахождения аминокислот в a-спиральной конформации была обнаружена С-концевая а-спираль. При поиске использовался тот факт, что эта спираль является наиболее длинной а-спиралью в белке (рис. 2).

Распределение длины предсказанной a-спирали имеет бимодальную форму (рис. 3). Основные пики расположены на значениях в 32-33 и 40-42 аминокислотных остатка; также присутствует несколько более длинных а-спиралей (около 55 остатков).

Разница между двумя основными модами распределения соответствует длине одного L12-cвязывaющeгo сегмента. Рибосома организмов с более ко-

100 120 140 160 180 200

80 100 120 140 160 180 200

Л

20 40 60

100 120 140 16i

а)

—I—Г~ 20

100 120 140

I-1-1-1-1-1

160 180 200

б)

Рис. 2: Предсказание вторичной структуры белков LIO Е. coli (а) и Т. maritima (б). На верхней части графика изображена предсказанная вторичная структура. Снизу расположен график вероятности нахождения аминокислоты в а-спиральной конформации, серым прямоугольником выделена С-концевая а-спираль.

роткой (28-37) С-концевой а-спиралью, по-видимому, способна связывать два димера белка Ь12, тогда как рибосома организмов с более длинной (39-51) — три.

Вид Копийность L12 Метод

Escherichia coli 4 Вестерн-блоттинг, масс-спектрометрия

Thermotoga maritima 6 Вестерн-блоттинг, предсказание на основе структуры

Thermus thermophilus 6 Масс-спектрометрия

Agrobacterium tumefaciens 6 Иммунохимически

Bacillus subtüis 4 Масс-спектрометрия

Thermus aquaticus 6 Масс-спектрометрия

Bacillus stearothermophilus 4 Масс-спектрометрия

Таблица 1: Экспериментально подтвержденные значения копийности белка L12.

Таким образом была предсказана копийность белка L12 на основе 754 характеристических последовательностей белка L10. В общей сложности 754 последовательности представляют 1238 различных видов бактерий (рис. 4). Для бактерий с известным значением копийности L12 результаты предсказаний полностью соответствуют экспериментальным данным (таблица 1).

В то время как у большинства бактерий длина предсказанной С-концевой

a-спирали не превышает 47 аминокислот, у ряда организмов длина этой а-

5

х о

sSH

А

м

. Ibrurflm

10 20 30 40 50 60 70 Длина спирали, количество остатков

Рис. 3: Гистограмма распределения длины С-концевой а-спирали.

спирали составляет порядка 55 аминокислотных остатков. Более того, на предсказанной спирали можно обнаружить не один или два излома (участка падения вероятности нахождения аминокислоты в а-спиральной конформации), а три (рис. 5).

По-видимому, рибосомы этих организмов способны связывать восемь молекул белка ІЛ2. Большая часть организмов с восемью копиями белка Ы2 относятся к типу цианобактерии (15 организмов), ещё два организма относятся к типу СЬІогоАехі.

Филогенетический анализ

Филогенетический анализ показывает, что копийность L12 не является высоко консервативным свойством и может изменяться даже на небольших эволюционных расстояниях. Анализ филогенетического дерева, построенного по основной части белка L10 (за исключением С-концевой спирали), позволяет проследить события изменения копийности — потери и приобретения L12-связывающих сегментов.

Был обнаружен ряд событий изменения копийности белка L12 (рис. 6): уменьшение значения копийности произошло в семействе Opitutaceae, а также в таксономических родах Deinococcus, Veillonella, Dichelobacter и Methylotenera. Также было обнаружен ряд событий увеличения числа копий L12 за счет приобретения дополнительного Ы2-связывающего сегмента в С-концевой а-спирали белка L10: в роде Nitratiruptor и отряде Clostridiales.

Тип 4 6 8 Тип 4 6 8

Acidobacteria 0 3 0 • • 6 in 8 Gemmatimonadetes 1 0 0 ®

Actinobacteria 6 130 0 • Lentisphaerae 0 2 0 •

Aquificae 0 11 0 • Nitrospirae 0 3 0 •

Bacteroidetes 3 91 0 • Planctomycetes 0 6 0 •

Chlamydiae 0 8 0 • Proteobacteria 277 282 0 w

Chlorobi 0 10 0 • Alphaproteobacteria 7 172 0 •

Chloroflexi 0 12 2 e Betaproteobacteria 71 15 0

Chrysiogenetes 0 1 0 • Gammaproteobacteria 171 54 0 Щ

Cyanobacteria 0 30 15 Deltaproteobacteria 0 38 0 •

Deferribacteres 0 2 0 • Epsilonprateobacteria 28 1 0 •

Deinococcus-Thermus 3 3 0 0 Zetaproteobacteria 0 1 0 •

Dictyoglomi 0 2 0 • Spirochaetes 11 6 0

Elusimicrobia 0 2 0 • Synergistetes 0 7 0 •

Fibrobacteres 1 0 0 • Tenericutes 26 0 0 •

Firmicutes 191 52 0 Щ Thermotogae 0 11 0 •

Fusobacteria 13 0 0 • Verrucomicrobia 3 5 0 6

Рис. 4: Распределение значений копийности белка ІЛ2 по таксономическим типам и по

классам для протеобактерий.

Предсказание копийности L12 в рибосоме общего предка бактерий

Мы наблюдаем большее число событий уменьшения числа копий LI 2, чем увеличения. Анализ филогенетического дерева на основе 16S рРНК показывает склонность базальных групп1 к большему значению копийности LI 2. На основе данных наблюдений была выдвинута гипотеза о наличии шести копий белка L12 в рибосоме последнего общего бактериального предка.

Восстановление предкового состояния значения копийности белка LI2 бактерий осуществлялось на основе последовательностей 16S рРНК с использованием программного обеспечения MrBayes. Результаты показывают большую вероятность (0,67) наличия шести молекул белка L12 в рибосоме последнего общего бактериального предка, вероятность 0,33 соответствует четырем молекулам L12 в рибосоме последнего общего бактериального предка.

Связь с термофильиостью

Первоначально наличие шести копий белка L12 было показано для термофильных бактерий Т. maritima (оптимальная температура роста 80°С) и Т. thermophilus (75°С). Мы изучали гипотезу (Maki, 2007) о корреляции копийности белка LI2 с температурой жизни бактерии.

Для проверки связи копийности с оптимальной температурой роста было рассмотрено 249 бактерий с известной температурой роста. В геномах этих бак-

1 Начальными в филогенетике называются группы организмов, которые отделились от корня раньше других.

7

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

1-1—I—I—I—I—I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I

0 20 40 60

100 120 140 160 180 200

ГЛ

J /

I I I I I I—I—I—I—I—I 100 120 140 160 180 200

a)

ПП П

M

100 120 140 160 180 200

6)

Рис. 5: Предсказание вторичной структуры белка LIO a) Synechococcus sp. WH7803 б) Synechococcus sp. JA-3-3Ab. На верхней части графика изображена предсказанная вторичная структура. Снизу расположен график вероятности нахождения аминокислоты в a-спиральной конформации, серым прямоугольником выделена С-концевая а-спираль.

терий была идентифицирована последовательность белка L10. По белкам L10 была предсказана копийность белка L12 в соответствующих организмах.

Температура роста (рис. 7) не показывает существенной связи с копийно-стью белка L12. Однако следует отметить, что оптимальные температуры роста бактерий с шестью копиями белка L12 покрывают практически весь диапазон температур жизни бактерий. Это наблюдение согласуется с гипотезой о том, что в рибосоме последнего общего предка бактерий также присутствовало шесть копий L12.

Копийность белка L12 и температура роста бактерий, строго говоря, не являются независимыми. Для близких видов оба свойства, вероятнее всего, будут принимать схожие или идентичные значения. Обыкновенные статистические подходы в такой ситуации могут давать как ошибку первого, так и ошибку второго рода, в зависимости от выбора исследуемых признаков и организмов.

Для преодоления этой сложности был использован подход (Pagel, 1999), сочетающий метод максимального правдоподобия с моделированием эволюции. С использованием пакета BayesTraits было проведено моделирование эволюции по модели броуновского движения. Сравнивалась модель независимой и зависимой эволюции двух параметров. Использовался тест соотношения правдоподобий (likehood ratio test).

Полученные значения LR при уровне значимости 0,05 не противоречат нулевой гипотезе — отсутствию связи между копийностью белка L12 и температурой роста вида.

r Thermus aquaticus T51MC23 L Thermus thermophilus i-Meiothermus ruber ATCC 35948

H iDeinococcus desci ti VCD115

U-Demococcus geothermalis DSM 11300 '—Deinococcus radiodurans

iSlackia heliotrinireducens ATCC 29202 Slackia exigua ATCC 700122 -Cryptobacterium curtum ATCC 700683 Eggerthella

|—Atopobium vaginae DSM 15829 In 41

L- Atopobium rimae ATCC 49626 L g

'-Atopobium parvulum ATCC_33793 rCollinsella stercoris DSM 13279

_P-Collinsella aerofaciens ATCC 25986

L Collinsella intestinalis DSM 13280

-Brachyspira

-Anaerobaculum hydrogeniformans ATCC BAA-1850

I—Dethiosulfovibrio peptidovorans DSM 11002

"jj-Pyramidobacter piscolens W5455

-Jonquetella anthropi E3 33 El -Thermanaerovibrio acidaminovorans ATCC 49978

I,-Synergistetes bacterium SGP1

*—Aminobacterium colombiense DSM 12261

Ruminococcus albus 8 Ruminococcus sp. 18P13

Faecalibacterium prausnitziI ïubdoligranulum variabile DSM 15176 Eubacterium siraeum istridium leptum DSM 753 Ethanoligenens harbinense YUAN-3 Clostridium metliylpentosum D5M 5476 ■Anaerotruncus colihommis DSM 17241

a)

6)

Рис. 6: Потери в роде Deinococcus (а) и приобретения в отряде Clostridiales (б) Ь12-связывающего сегмента С-концевой а-спирали белка L10.

Эволюция связывающих мотивов

Отдельные Ы2-связываютцие мотивы обладают различной аминокислотной последовательностью (рис. 8), что затрудняет их обнаружение. Для последовательностей L10, близких к LIO Е. coli (уровень сходства не ниже 50%) и к L10 Т. marítima (уровень сходства не менее 40%), на основе известных структурных данных были выявлены отдельные L12-cвязывaющиe сегменты.

Был проведен поиск отдельных L12-CBH3biBaiouj,Hx мотивов. Поиск мотивов осуществлялся в области предсказанной С-концевой а-спирали при помощи программы jackhmmer. На основе выравнивания с С-концевой а-спиралью L10 Т. maritima были выделены отдельные L12-cвязывaющиe сегменты. Четвертый L12-CBfl3biBaionniñ сегмент был выделен на основе аминокислотного выравнивания белков L10 цианобактерий.

Кластеризация L12-cвязывaющиx мотивов осуществлялась при помощи программы CLANS. Результаты кластеризации (рис. 9) показывают, что первый сегмент имеет относительно высокую степень консервативности даже для далеких видов. Остальные сегменты имеют меньший уровень сходства у разных видов. В то же время эти сегменты показывают сходство с соседними. Это свидетельствует о том, что сегменты возникали в результате серии последовательных дупликаций.

Тот факт, что первый сегмент имеет высокую степень консервативности, может означать, что структура именно первого L12-cвязывaющeгo сегмента имеет высокую значимость для связывания факторов трансляции с рибосомой, су-

9

60

ra о. >, ira о. ф с

§40 I-

20

4 6 8

Копийность L12

Рис. 7: Связь копийности белка L12 с температурой роста бактерий.

щественным образом ограничивая мутации в этой области, тогда как изменения в остальных сегментах могут легче переноситься организмом.

2. Предсказание копийности белка L12 в рибосоме митохондрий и пластид

Пластиды и митохондрии произошли в результате эндосимбиотического поглощения древними эукариотами бактерий, близких к современным цианобак-териям и а-протеобактериям, соответственно. Рибосомы этих органелл своим строением во многом повторяют рибосомы бактерий.

Низкое качество аннотации рибосомных белков органелл препятствует извлечению большого числа последовательностей белка L10 из соответствующих баз данных на основе их аннотации. По этой причине поиск гомологов белков L10 осуществлялся на основе сходства аминокислотных последовательностей.

В общей сложности было найдено 108 последовательностей митохондри-альных рибосомных белков MRPL10 — гомологов бактериального белка L10, — а также 42 последовательности пластидных рибосомных белков L10.

Сегмент 1

шЬ&Шттк?

1 11 Сегмент 2

1ДЯ.УиуЫД

12 22 Сегмент 3

LBgyfyeLNA;

23 33

а) б)

Рис. 8: Диаграммы Лого Ы2-связывающих сегментов белков L10 а) имеющих степень сходства не менее 50% с белком LIO Е. coli б) имеющих степень сходства не менее 40% с белком L10 Т. maritima. Нумерация остатков начинается с пятой аминокислоты С-концевой

а-спирали.

Найденные последовательности курировались вручную на предмет их полноты. Для дальнейшего анализа мы выбрали 102 последовательности ми-тохондриального рибосомного белка MRPL10, представляющие 82 различных организма (76 различных видов). Стоит отметить, что число найденных ортоло-гов в несколько раз превышает количество корректно аннотированных белков в базах данных UniProt и белковой базе данных NCBI.

Для рассматриваемых митохондриальных последовательностей было проведено предсказание вторичной структуры и предсказано значение копий-ности митохондриального белка MRPL12 — ортолога бактериального белка L12. Вторичная структура митохондриального белка MRPL10 очень близка ко вторичной структуре бактериального белка L10 за исключением наличия неструктурированного пептида на N-конце, который, по-видимому, является сигнальным пептидом и необходим для транспорта белка в митохондрию.

Для всех рассматриваемых последовательностей митохондриального происхождения предсказанное значение копийности L12 составило шесть копий на рибосому. Стоит отметить, что шесть копий L12 также характерно для

о ©

Рис. 9: Кластеризация отдельных L12-связывающих сегментов С-концевой a-спирали белка L10. Раскраска вершин графа соответствует номеру сегмента начиная с N-конца. Ребра проведены между вершинами, имеющими схожую последовательность.

подавляющего большинства бактерий, относящихся к классу а-протеобактерий (рис. 4).

Также было рассмотрено 36 полных последовательностей пластидного рибосомного белка L10, представляющих 30 различных видов. Для всех последовательностей была предсказана вторичная структура и соответствующее значение копийности белка L12. Для большинства последовательностей было предсказано шесть копий белка L12 в рибосоме, что соответствует копийности L12 в большинстве цианобактерий.

У некоторых видов растений было обнаружено два неидентичных гена, кодирующих белок L10 пластидного происхождения. Для ряда обнаруженных в таких организмах последовательностей предсказанное значение копийности белка L12 составило четыре молекулы на одну рибосому. Стоит отметить, что несмотря на принадлежность к одному организму, уровень сходства различных

белков LIO в таких ситуациях невысок: так уровень сходства двух белков L10 Arabidopsis thaliana пластидного происхождения составляет лишь 43% (рис. 10).

Ранее было показано, что у ряда растений отсутствует рибосомный белок MRPL10 митохондриального происхождения, а его функцию выполняет белок L10 пластидного происхождения. Также показано, что этот белок пластидного происхождения может быть локализован как в митохондриях, так и в пластидах (Kubo, 2010).

Таким образом, у ряда растений в рибосоме митохондрий, вероятно, содержатся четыре молекулы белка L12, тогда как рибосомы пластид могут связывать как четыре, так и шесть молекул белка L12. Значение копийности в рибосоме пластид будет обусловлено типом белка L10, входящего в её состав, и, по-видимому, часть рибосом пластид связывают четыре белка L12, а часть — шесть. Возможно также, что под воздействием внешних факторов, таких как стресс, в пластидах может происходить изменение соотношения различных типов белка L10 и, таким образом, копийности белка L12.

№__187843.1 ----------------------------------------------------------------------О

да_196855.1 МЕУАЬЬЗЕЗЗЗЬЗРЬСН<2Р13ТЬТРКТЗЫЗРМУРВ. 35 Консервативность

ЫР_187843.1 МАЗШК0ЬЬУАСЦ------ТЕЛ ЬРОэКМЛЕ I Т КШИ 29

ЫР_196855.1 ЪРУ1га5ЯуЗКЫК1аЕЕТУЕАУга5НШд1?МЯЬЪААВ5Н 70

Консервативность ** * * ***** ***

ЫР_187843. 1 КШзЯ^ЬЯЕПгабХЯНЕЫТЫгагДьк^Ш^А^УШЬ 64

ыр_196855.1 к1вдтВ^ЕНр^ктЯрр--тШЯ1В^а{|>*1И1р|8Й11 юз

Консервативность ** *** * ** * *** ******* **

ЫР_187843.1 ^сШа^э^ПаД'НЖЧ^ОКГДТИЯ^ИЗ Е РЙВАВЬИТ Е'1 м 99

96855 . 1 УКЗ 138

Консервативность ****** *************** ** * *

ЫР_187843.1 №1Я!НК^¥РШЬ6МДЦа1э1Е[ЯЬ|Ж130РУКИ1>*а8МЯ 134

ЫР_Х96855.1 173

Консервативность **** ** * ***** * *** ** ****

ЫР_187 84З . 1 шр^смоттазя^^ьрЕтаыАНГол^РААйЕыгату 169

ЫР_196855.1 !^Е^ЛК|ЩЯАДОЗ15Д1ЫДЦТТН1»>Л;1----АЩ1У1 204

Консервативность **** **** ** ** **** *

Рис. 10: Выравнивание аминокислотных последовательностей пластидных рибосомных

ЫР_196855.1 МУЬМАУГККЬЕРЕЗМА 220

Консервативность

Рис. 10: Выравнивание аминокислотных последовательно

белков 1Л0 А ЛаИапа.

3. Копийность белка L12 у цианобактерий

Стоит отметить, что не у всех цианобактерий в рибосоме содержится восемь копий белка L12. Так из 47 рассматриваемых цианобактерий у 32, согласно предсказанию, в рибосоме шесть копий белка L12, и только у 15 — восемь (рис. 11).

Выравнивание аминокислотных последовательностей белка L10 цианобактерий (рис. 12) показывает, что у бактерий с длинной С-концевой а-спиралью присутствует вставка длиной 11 аминокислот. Эта длина является характерной длиной одного L12-связывающего сегмента С-концевой а-спирали белка L10.

Кластерный анализ (рис. 9) показывает высокое сходство между третьим и четвертым L12-CBH3biBaiouiHMH сегментами. По-видимому, появление дополнительного сегмента возникло в результате относительно недавней дупликации С-концевого сегмента.

Группа цианобактерий с восемью молекулами белка L12 в рибосоме не является монофилетичной2 (рис 11). В то же время базальные группы — Gloeobacter violaceus, Synechococcus sp. JA-3-3Ab и Synechococcus sp. JA-2-3B'a(2-13) — содержат восемь молекул белка L12 в рибосоме. На основе этих фактов можно выдвинуть предположение о том, что последний общий предок цианобактерий обладал восемью копиями белка L12 в рибосоме.

Для проверки этой гипотезы мы использовали программу MrBayes. Восстановление предкового состояния копийности осуществлялось на основе последовательностей 16S рРНК цианобактерий. В качестве внешней группы использовалась бактерия Т. thermophilus. Вероятность восьми копий L12 у последнего общего предка цианобактерий составила 0,86 против вероятности 0,14 для шести копий белка L12.

Стоит также отметить относительно высокую степень сходства последовательности вставки у различных цианобактерий. Гомологичность вставки дополнительно подтверждает наличие восьми копий L12 у последнего общего предка цианобактерий.

Таким образом, по-видимому, у общего цианобактериального предка значение копийности L12 составляло восемь молекул, причем появление дополнительного сегмента явилось результатом относительно поздней дупликации. Тогда как цианобактерии с шестью копиями белка L12 в рибосоме произошли в результате потери одного из L12-CBfl3biBaioLUHx сегментов в белке L10. Причем

2 Группа организмов называется монофилетичной в том случае, если она содержит всех известных потомков некоторого гипотетического предка.

■ Gloeobacter violaceus PCC 7421

p Nostoc azollae 0708

di-Nostoc punctiforme PCC 73102

- Nodularia spumigena CCY9414

6:1 I 8:1

4

4;

h:

Ц

i:

I-Mi

|_r c> I— (

Anabaena variabilis ATCC 29413 Nostoc sp. PCC 7120 Microcoleus chthonoplastes PCC 7420 Trichodesmium erythraeum IMS101 Lyngbya sp. PCC 8106 Arthrospira p/atens/s strain NIES 39 Arthrospira maxima CS-328 Cyanothece sp. PCC 8802 Cyanothece sp. PCC 8801 I— cyanobacterium UCYN-A ] Crocosphaera watsonii WH 8501 Cyanothece sp. ATCC 51142 Cyanothece sp. CCY0110 Synechococcus sp. PCC 7002 Synechocystis sp. PCC 6803 Microcystis aeruginosa NIES843 Cyanothece sp. PCC 7822 Cyanothece sp. PCC 7424 Acaryochloris marina MBIC11017 Cyanothece sp. PCC 7425

-Thermosynechococcus elongatus BP1

Synechococcus elongatus PCC 7942 Synechococcus elongatus PCC 6301 Prochlorococcus marinus str. MIT 9313 Prochlorococcus marinus str. MIT 9303 Synechococcus sp. WH 7803 ■ Synechococcus sp. WH 8102 I Synechococcus sp. CC9902 L Synechococcus sp. CC9605 — Synechococcus sp. RCC307 Synechococcus sp. CC9311 Prochlorococcus marinus str. MIT 9211

I Prochlorococcus marinus CCMP1375 I Prochlorococcus marinus str. NATL1A ' Prochlorococcus marinus str. NATL2A Prochlorococcus marinus str. MIT 9515 Prochlorococcus marinus CCMP1986 I Prochlorococcus marinus str. AS9601 Prochlorococcus marinus str. MIT 9301 Prochlorococcus marinus str. MIT 9215 Prochlorococcus marinus str. MIT 9312

- Synechococcus sp. JA-2-3B'a(2-13)

— Synechococcus sp. JA-3-3Ab

Рис.

11: Филогенетическое дерево по последовательностям 168 рРНК цианобактерий. Листья раскрашены в соответствии с предсказанным значением копийности белка Ы2.

16

A.platensis UCYN-A С.ATCC_51142 С.PCC_8801 G.violaceus L.PCC_8106 M.chthonoplastes M.producta S.JA-3-3Ab T.erythraeum

A.marina A.variabilis С.PCC_7424 С.PCC_742 5 C.PCC_7 822 С.raciborskii F.JSC-11 M.vaginatus M.aeruginosa N.spumigena N.azollae N.punctiforme P.marinus S.CB0101 S.CC9902 S.CC9311 S.elongatus S.PCC_7 002 S.PCC_7335 S.RCC307 S.WH5701 S.WH7803 S.PCC_6803 T.elongatus Консервативность

gVNAVPTKLAVG0K¡j[ HINQVPTSLGRGVNÜl gVNEVPTSIGRGgNDI SINEVPSsvargRnEE SlNQVPTKVAVGON: 3TKAVPTKLAVG0K: §vnevpaslgrcvn"

jINEVPASLGRSHN: ¡LNAVPTQVARG0Qj 3LDAVPTQLATG0N|

Рис. 12: Выравнивание аминокислотных последовательностей рибосомного белка L10 ряда цианобактерий. Отмечена вставка, отвечающая за связывание дополнительного димера белка

L12.

эта потеря происходила независимо несколько раз на различных ветвях эволюции.

4. Экспериментальное подтверждение существования организмов с восемью копиями белка L12 в рибосоме

Чтобы подтвердить возможность связывания восьми молекул белка L12 цианобактериями, несущими вставку в С-концевой a-спирали белка L10, мы использовали масс-спектрометрию для определения стехиометрии рибосомно-

го стержня цианобактерии Arthrospira platensis (также известную как Spirulina platensis).

Используемый подход (Lange, 2008) позволяет произвести абсолютную квантификацию комплекса L12:L10 на основании соотношения пептидов, полученных в результате ферментации протеазами. Концентрация пептидов в этом случае будет отражать концентрации белков-предшественников при условии, что протеолиз был проведен полностью (рис. 13).

L12 \ трипсин

4mi JK. Js^-» спреи 1 м у

i 2 ^ i

30S j Эндогенные пептиды

аххао ИЗОТОПНО меченые AQUA-пептиды

Рис. 13: Общая схема эксперимента.

Подходящие репортерные пептиды (два пептида для белка LI2 и три для белка L10) выбирались на основе первичного анализа с применением высокоэффективной жидкостной хромотографии с тандемной масс-спектрометрией на масс-спектрометре Orbitrap. Исследовались выделенные очищенные рибосомы, ферментированные протеазами трипсин и LysC.

В эксперименте квадруполь 1 (Q1) выделяет пептид-предшественник по его массе (как эндогенный, так и изотопно-меченый), q2 используется для газовой фрагментации выбранного пептида, a Q3 служит для выделения отдельных фрагментов пептида-предшественника, так называемых SRM переходов, которые детектируются, а также квантифицируются. Стехиометрия L12:L10 вычисляется на основе концентраций отдельных пептидов-предшественников. В качестве контроля использовались рибосомы Е. coli, поскольку значение копийности L12 этих рибосом известно.

При известной концентрации двух пептидов белка L12 и трех — белка L10 была вычислена стехиометрия комплекса L12:L10 на основании шести возможных комбинаций пептидов в каждой точке титрования. Так как ни одна комбинация не показала наличия систематической ошибки, мы усреднили значение по всем точкам титрования, а также всем биологическим и техническим репликам.

Таким образом, мы получили стехиометрию L12-.L10 4,1±0,6 для Е. coli (основываясь на 702 независимых величинах), что полностью соответствует ранее опубликованным данным. Для очищенных рибосом А. platensis соотношение

Q3 LI2 LIO

Время

L12:L10 составило 7,7±1,1 (рис. 14), близкое к четырем димерам белка L12, связывающимся с белком L10, в соответствии предсказанием.

i 4h

7.7±1.1

4.1±0.6

Б. со//

Л. platensis

Рис. 14: Соотношение Ы2:Ь10 для рибосомы £. со// и А. р1меп.?1.1, измеренное при помощи

масс-спектрометрии.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (Государственные контракты №16.522.12.2015, №16.522.11.2004 и №11.519.11.2047) и с использованием оборудования ЦКП «Постгеномные и метаболомные методы исследования в молекулярной биологии» (Государственный контракт №16.522.11.7057).

Выводы

1. Аминокислотная последовательность белка L10 позволяет предсказывать копийность белка L12 в рибосоме.

2. Разработанный алгоритм позволил предсказать копийность более чем для тысячи видов бактерий. Было показано, что копийность белка L12 может изменяться как внутри таксономических типов, так и на более высоких таксономических уровнях.

3. У последнего общего предка современных бактерий в рибосоме, вероятно, содержалось шесть копий белка L12.

4. Ранее предполагалось наличие связи между копийностью белка L12 и температурой роста бактерий. На большом объеме данных эта гипотеза не подтверждается.

5. Анализ отдельных L12-CBfl3bmaioiiiHX сегментов показал высокую консервативность первого из них. Новые сегменты, как правило, возникали в результате дупликации одного из соседних сегментов.

6. В рибосомах митохондрий и пластид, как правило, содержится шесть молекул белка L12.

7. У некоторых цианобактерий в составе рибосомы присутствуют восемь молекул белка L12. У последнего общего предка цианобактерий в рибосоме, по-видимому, содержалось восемь молекул белка L12. Дополнительный L12-CBfl3biBaioumñ сегмент белка L10 возник в результате дупликации, которая произошла до появления последнего общего предка цианобактерий. Масс-спектрометрические исследования подтверждают наличие восьми молекул белка L12 в составе рибосомы A. platensis.

Список публикаций по теме диссертации

1. Происхождение эубактерий с тремя димерами белка L7/L12 в рибосоме / Давыдов, Я. И., А. С. Розов, Е. А. Тоневицкий, М. К. Валь, А. Г. Тоневицкий // Доклады академии наук. 2008. Т. 1. С. 121-124.

2. Анализ копийности рибиосомального белка L7/L12 / Е. С. Гребенюк, А. А. Докрунова, Давыдов, Я. И., Е. А. Тоневицкий, А. Г. Тоневицкий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009. Т. 147, № 5. С. 516-520.

3. Давыдов, Я. И., Тоневицкий А. Г. Изучение копийности рибосомального белка L7 // Труды 33-й конференции молодых ученых и специалистов ИППИ РАН ИТиС'10. 2010. Т.427-428.

4. Davydov, I., Artamonova I., Tonevitsky A. Ribosomal multicopy protein study // Proceedings of International Moscow Conference on Computational Molecular Biology (MCCMB'11). 2011. T. 84.

5. Давыдов, Я. И., Артамонова И. И., Тоневицкий А. Г. Многокопийный рибо-сомный белок L12 // Труды 34-й конференции молодых ученых и специалистов ИППИ РАН ИТиС' 11. 2011. Т. 156-158.

6. Рибосомный белок L12: копийность и её регуляция / Давыдов, Я. И., О. В. Цой, И. И. Артамонова, А. Г. Тоневицкий // Труды 35-й конференции молодых ученых и специалистов ИППИ РАН ИТиС'12. 2012. Т. 288-291.

7. Evolution of the protein stoichiometry in the LI2 stalk of bacterial and organellar ribosomes / Davydov, I. I., I. Wohlgemuth, I. I. Artamonova, H. Urlaub, A. G. Tonevitsky, M. V. Rodnina // Nature Communications. 2013. c. 1387.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Давыдов, Яков Игоревич, Москва

На правах рукописи УДК 575.86

04201365508

ДАВЫДОВ ЯКОВ ИГОРЕВИЧ

ЭВОЛЮЦИЯ КОПИЙНОСТИ БЕЛКА 1Л2 В РИБОСОМАХ БАКТЕРИЙ И ОРГАНЕЛЛ ЭУКАРИОТ

Специальность 03.01.03 — «Молекулярная биология»

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д. б. н, профессор Тоневицкий А.Г.

Москва -

2013

Содержание

Введение 4

1 Обзор литературы 8

1.1 Функционирование рибосомы......................................................8

1.2 Эволюция рибосомы................................................................10

1.3 Рибосома бактерий..................................................................11

1.3.1 Ь7/1Л2-стержень............................................................13

1.3.2 Белок LI2....................................................................13

1.3.3 Белок LIO....................................................................14

1.3.4 L12 вызывает иммунный ответ............................................16

1.4 Эукариотическая и архейная рибосома..........................................16

1.5 Рибосома митохондрий и пластид................................................16

1.6 Предсказание вторичной структуры белков......................................17

1.7 Поиск скоррелированных признаков..............................................19

2 Методы 25

2.1 Сбор последовательностей ........................................................25

2.2 Предсказание вторичной структуры и копийности LI2............25

2.3 Поиск и кластеризация L12-cBfl3bmaiouwx мотивов............................26

2.4 Построение деревьев и восстановление предкового состояния................26

2.5 Подготовка рибосомы и масс-спектрометрия....................................27

2.6 Поиск признаков, коррелирующих с копийностью..............................28

3 Предсказание копийности 29

3.1 Поиск С-концевой а-спирали......................................................29

3.2 Предсказание копийности L12....................................................29

3.3 Филогенетический анализ..........................................................31

3.4 Связь с термофильностью..........................................................32

3.5 Эволюция связывающих мотивов..................................................34

3.6 Предсказание копийности L12 в органеллах....................................36

4 Белок LI2 у цианобактерий 45

4.1 Копийность белка LI2...............................45

4.2 Экспериментальное подтверждение существования организмов с восемью копиями белка LI2 в рибосоме..........................49

4.2.1 Выбор пептидов для масс-спектрометрии................................51

4.2.2 Измерение копийности....................................................56

Заключение 58

Выводы 60

Литература 62

А Предсказания копийности белка Ь12 для бактерий 73

Введение

Актуальность темы

Рибосома — сложная молекулярная машина, осуществляющая синтез белков на основе матричной РНК. Наименее изученным участком рибосомы является так называемый Ь7/1Л2-стержень (или Р-стержень для эукариот).

Рибосомный стержень необходим для трансляции, он взаимодействует с факторами трансляции, являющимися ГТФазами (такими как EF-Tu, EF-G, IF2 и RF3 или их эу-кариотическими гомологами) и стимулирует гидролиз ГТФ. Экспериментально показано, что рибосомный стержень влияет на скорость и точность трансляции, хотя механизм этого влияния малоизучен.

Ь7/Ь12-стержень включает в себя рибосомный белок L10 (или его гомолог РО в случае эукариот и архей), а также несколько молекул белка L12 (или его гомологов Р1/Р2 у эукариот).

Копийность белка L12 в рибосоме различается в разных видах: так в рибосоме Escherichia coli содержится четыре молекулы белка L12, а в рибосоме Thermotoga maritima — шесть. При этом для большинства изучаемых бактерий копийность белка L12 остается неизвестной.

Изучение копийности белка L12 и эволюционных событий, приводящих к ее изменению, является актуальной научной задачей и позволяет пролить свет на возникновение и эволюцию рибосомы.

Степень разработанности темы

В конце 70-х годов прошлого века было показано, что в рибосоме Escherichia coli содержится четыре молекулы белка L12 [1-3]. Лишь в 2005 году было открыто, что у ряда бактерий копийность может составлять не четыре, а шесть молекул [4,5].

Впоследствии для 28 видов бактерий на основе выравнивания аминокислотных последовательностей белка L10 была предсказана копийность L12 [6]; для трех видов бактерий копийность была определена экспериментально [7].

Было показано, что в рибосомах эукариот содержится четыре молекулы аналогов белка L12, а рибосомы архей могут связывать шесть молекул белка L12 [6,7]. В то же время для большинства видов бактерий копийность белка L12 оставалась неизвестной. Также оставался открытым вопрос копийности белка L12 в рибосомах органелл эукариот.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было изучение копийности белка L12 и его эволюции в бактериях, митохондриях и пластидах. В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:

2. Предсказать с использованием разработанного алгоритма копийность белка 1Л2 бактерий.

3. Предсказать с использованием разработанного алгоритма копийность белка Ы2 для органелл эукариот.

4. Изучить основные события изменения копийности в ходе эволюции.

5. Экспериментально подтвердить полученные предсказания.

Научная новизна и практическая значимость

В данной работе было проведено систематическое изучение копийности рибосомного белка Ь12.

Был разработан алгоритм предсказания копийности белка Ь12, основанный на аминокислотной последовательности белков с использованием методов предсказания вторичной структуры белков. Выдвинут ряд гипотез о предковых состояниях копийности.

Было выполнено предсказание копийности 1Л2 более чем для тысячи различных видов. Впервые предсказана копийность Ы2 для рибосомы митохондрий и пластид.

Впервые были обнаружены бактерии, имеющие восемь копий белка Ы2. Полученное предсказание получило экспериментальное подтверждение.

Полученные результаты могут быть использованы при изучения аппарата трансляции различных видов бактерий, а также при разработке новых противомикробных препаратов.

Методология и методы исследования

Для решения поставленных задач применялся методы анализа аминокислотных и нуклеотидных последовательностей. Использовались методы предсказания вторичной структуры белка, а также построения филогенетических деревьев. При изучении 1Л2-связывающих мотивов использовались методы кластеризации; при восстановлении предковых состояний и поиске корреляций между признаками использовались методы моделирования эволюции с применением байесовской статистки. При проведении экспериментов использовались методы масс-спектрометрии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В ходе исследования разработан алгоритм предсказания копийности белка 1Л2 в рибосоме. С использованием алгоритма предсказана копийность белка Ы2 более чем для тысячи видов бактерий;

2. Анализ эволюции копийности показывает, что у последнего общего предка современных бактерий в рибосоме содержалось шесть копий белка Ы2;

3. В рибосомах митохондрий и пластид, как правило, содержится шесть молекул белка 1Л2;

Степень достоверности и апробация результатов

Полученные предсказания согласуются как с известными литературными данными, так и с экспериментом, проведенным в ходе исследования. Достоверность результатов эксперимента обеспечена использованием контролей, а также биологических и технических реплик.

Основные результаты работы докладывались на: 33-й конференции молодых ученых и специалистов ИППИ РАН ИТиС'10 (Геленджик, сентябрь 2010), 5th International Moscow Conference on Computational Molecular Biology MCCMB'll (Москва, июль 2011), 34-й конференции молодых ученых и специалистов ИППИ РАН ИТиС'11 (Геленджик, октябрь 2011), 35-й конференции молодых ученых и специалистов ИППИ РАН ИТиС'12 (Петрозаводск, август 2012). По материалам диссертации опубликовано семь печатных работ, из них три — статьи в журналах, рекомендованных ВАК, четыре — тезисы в материалах конференций.

Диссертационная работы была апробирована на заседании Научно-технического совета НТЦ «Биоклиникум» 27 февраля 2013 года, а также на семинаре секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 14 октября 2013 года.

Личный вклад

Все основные результаты, включенные в диссертацию, получены лично соискателем. Соискателем выполнена разработка алгоритма, предсказание копийности белка L12 бактерий и органелл, а также исследование эволюции копийности. Обсуждение и интерпретация результатов осуществлялись совместно с научным руководителем. Экспериментальные работы осуществлялись совместно с коллегами из Института биофизической химии объединения Макса Планка: Мариной Родниной и Ingo Wohlgemuth.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, благодарностей, списка литературы и одного приложения. Полный объем диссертации составляет 99 страниц с 31 рисунком и 9 таблицами. Список литературы содержит 166 наименований.

Список используемых сокращений и обозначений

GLS Generalized least squares ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота РНК Рибонуклеиновая кислота рРНК Рибосомная РНК мРНК Матричная РНК

LUCA Last universal common ancestor

ГТФ Гуанозинтрифосфат

PDB Protein Data Bank

PSSM Position-specific scoring matrix

fMet N-Formylmethionine

HMM Hidden Markov model

MCMC Markov chain Monte Carlo

ДТТ Дитиотреитол

SRM Selected reaction monitoring

PTC Peptidyl transferase center

LR Likelihood ratio

Глава 1

Обзор литературы

1.1 Функционирование рибосомы

Трансляция белков является ключевой особенностью организмов, относящихся ко всем трем доменам жизни [8]. Трансляцию выполняет специализированная органелла, носящая название рибосомы. Рибосома производит полипептиды, последовательность которых определяется шаблоном — матричной РНК, — используя для этого аминоацил-тРНК.

Во всех организмах рибосома состоит из двух субъединиц, образованных рибосом-ной РНК и белками. Малая субъединица обеспечивает комплементарное взаимодействие между мРНК и тРНК, которое определяет последовательность получаемого продукта [10]. Большая субъединица включает сайт, катализирующий формирование пептидной связи [11]. Этот сайт носит название пептидилтрансферазного центра (РТС). РТС катализирует реакцию, в ходе которой происходит удлинение пептида на одну аминокислоту [9].

Участок рибосомы, в котором располагается пептидил-тРНК непосредственно перед переносом аминокислоты, носит название Р-сайта, а участок, занятый аминоацил-тРНК, носит название А-сайта [12]. Участок, через который аминоацил-тРНК проходит на пути к А-сайту, носит название Т-сайта [13], а деацетилированные тРНК покидают рибосому через так называемый Е-сайт [14]. Непосредственно после переноса аминокислоты Р-сайт рибосомы занят деацетилированной тРНК, а пептидил-тРНК находится в А-сайте. Затем происходит транслокация — процесс, в результате которого деацетилированная тРНК из Р-сайта покидает рибосому через Е-сайта, пептидил-тРНК из А-сайта перемещается в Р-сайт, рибосома сдвигается вдоль мРНК в сторону 3' конца на один кодон, а следующая аминоацил-тРНК может быть доставлена в свободный А-сайт в соответствии с её комплементарностью к мРНК (рис. 1.1 и 1.2) [9].

Все тРНК являются Ь-образными молекулами, имеют схожую трехмерную структуру. тРНК обладают достаточной длиной для того, чтобы взаимодействовать с обеими субъединицами рибосомы одновременно. Концевой участок, соответствующий верхней части буквы Ь, связывает аминокислоту и полипептид, и в основном взаимодействует с большой субъединицей рибосомы, тогда как антикодоновые петли тРНК расположены с другой стороны молекулы и комплементарно связываются с мРНК на малой субъединице [9].

Транслокация двух концов молекулы тРНК происходит не синхронно. Это означает, что молекулы могут находиться в гибридных состояниях, то есть их антикодоновые концы могут находиться в А- и Р-сайтах малой субъединицы, а акцепторные — в Р- и Е-сайтах, соответственно. В то же время Т-сайт присутствует лишь у большой субъединицы, и в начальный момент аминоацил-тРНК также находится в гибридном состоянии:

Рисунок 1.1: Цикл работы бактериальной рибосомы. Инициация синтеза начинается с привлечения рибосомных субъединиц. Затем происходит связывание мРНК, а также молекулы формилированной метионил-тРНК (ГМе^тРНК) с малой субъединицей, инициация завершается в тот момент, когда происходит доставка аминоацил-тРНК, связывающей вторую аминокислоту белка с рибосомным комплексом. Затем наступает фаза элонгации, в ходе которой сиитезируемый полипептид удлиняется. В тот момент, когда синтез полипептида завершен, последний высвобождается из рибосомы, рибосомный комплекс разбирается, а освободившиеся субъединицы отправляются в клеточный пул. На рисунке малая субъединица изображена золотым, большая — голубым [9]. Использована иллюстрация из работы [9].

акцепторная часть молекулы расположена в Т-сайте большой субъединицы, а антикодо-новая петля — в А-сайте малой субъединицы. Перемещение акцепторной части тРНК, необходимое для формирования пептида, происходит позже и носит название аккомодации [9,15].

Последовательность событий, приводящая к добавлению одной аминокислоты к растущему пептиду, носит название цикла элонгации и повторяется п — 2 раза (где п — длина белка). Инициацией называется сборка двух субъединиц рибосомы на стартовом кодоне мРНК, а также формирование первой пептидной связи. Когда рибосома встречается со стоп-кодоном, получившийся пептид высвобождается из рибосомы, а субъединицы отправляются в клеточный пул. Этот процесс носит название терминации [9].

Новая

Большая н7ы аминоаиил-rPHK

Рисунок 1.2: Цикл элонгации.

1.2 Эволюция рибосомы

В гипотетическом последнем общем предке всех известных организмов (LUCA) уже содержалось значительное число генов, вовлеченных в трансляцию белков. Более того, гены, связанные с трансляцией, составляют большую часть известного генома LUCA [16]. Таким образом, аппарат трансляции в таком виде, как он был представлен в LUCA, уже является в большой степени состоявшимся. Это указывает на то, что основные события эволюции рибосомы произошли до появления LUCA [17].

Происхождение рибосомы берет свое начало в древнем мире РНК [18,19]. На ранней стадии аминокислоты (или подобные им молекулы) связывались с небольшими олиго-мерами РНК. При взаимодействии таких структур друг с другом в присутствии РНК, являющейся предком современного РТС, формировалась амидная связь. Таким образом происходило создание более крупных пептидо-подобных молекул. Было показано, что такая реакция осуществима в мире РНК [20]. Эти ранние РНК стабилизировались за счет Mg2+. Полученные пептиды имели смешанную хиральность, однако с преобладанием L-аминокислот, возможно в результате избытка D-рибозы в молекулах РНК древнего мира [21,22]. Ранние пептиды могли стабилизировать разные виды РНК и, таким образом, давать эволюционное преимущество в древнем мире. С ростом сложности древнего организма появилась однодоменная тРНК, а также предок РТС. Этот ранний РТС уже включал начало выходного тоннеля, который впоследствии увеличился: сначала появился регион домена II, а затем часть домена IV. На некотором этапе был добавлен декодирующий домен тРНК, в результате чего возникла современная двухдоменная тРНК [17].

Существует гипотеза, согласно которой второй домен тРНК предоставил возможность удерживания тРНК на вспомогательной РНК, увеличивая время, в течение которого тРНК взаимодействует с РТС, и повышая, таким образом, вероятность протекания реакции [17,23]. Затем растущая малая субъединица стала выполнять задачу перемещения шаблона, позволяя извлекать использованные тРНК и привлекать новые. Эта вспомогательная РНК могла служить в качестве шаблона, а затем в качестве мРНК, обеспечивая возникновение системы кодонов [17].

Согласно другой теории, часть РНК малой субъединицы возникла не в результате усложнения древней проторибосомы, а независимо в РНК-мире, где она могла служить в качестве репликазы. В этом случае, вовлеченная в зарождающуюся систему синтеза белков, эта РНК возможно была способна перемещаться вдоль шаблона [17].

После того, как появились мРНК и основы движения малой субъединицы, рибосомы стали стремительно усложняться: сначала были добавлены ранние консервативные белки, такие как L2, L3 и L4. Дальнейшее расширение рРНК могло происходить путем последовательного добавления различных элементов, например, 5S рРНК и её белков [17].

Следующим важным шагом, по-видимому, было добавление ГТФазного центра к большой субъединице. Это событие, вероятно, существенно увеличило скорость трансляции. В результате могло произойти существенное увеличение числа различных типов клеток и, впоследствии, окончание эры РНК [24], а затем начало эры потомков LUCA [17].

В дальнейшем изменения касались системы инициации, добавления выходного Е-сайта, добавления белка L1, который обслуживает проникновение тРНК, появление посттранскрипционной модификации нуклеотидов и ферментов, выполняющих эту функцию. Затем рРНК, по-видимому, не претерпевали существенных изменений, но появлялись новые, уже не являющиеся универсальными для всех организмов, белки, а также происходила тесная интеграция между транскрипцией и трансляцией. Существенные ограничения на размер генома и его стабильность впоследствии привели к замене РНК-генома на ДНК-�