Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моделирование организации активных рибосомных генов в геноме человека и фенотипических проявлений их копийности

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Моделирование организации активных рибосомных генов в геноме человека и фенотипических проявлений их копийности"

На правах рукописи УДК 575.17:575.224:51-76

Пороховник Лев Николаевич

МОДЕЛИРОВАНИЕ ОРГАНИЗАЦИИ АКТИВНЫХ РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА И ФЕНОТИПИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ ИХ КОПИЙНОСТИ

03.02.07 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005532892

12 СЕН 2013

Москва-2013

005532892

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Медико-генетический научный центр" Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ляпунова Наталия Алексеевна

Официальные оппоненты:

Балановский Олег Павлович, доктор биологических наук

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова» Российской академии наук, руководитель группы геномной географии

Носиков Валерий Вячеславович, доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля» Российской академии наук, заведующий лабораторией постгеномных молекулярно-биологических исследований

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И.Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра медицинской генетики

Защита состоится «07» октября 2013 г. в_часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д.1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «06» сентября 2013 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Рибосомы - цитоплазматические органеллы, осуществляющие синтез белков на матричных РНК. Их основным компонентом служат рибосомные РНК (рРНК), кодируемые рибосомными генами (РГ). РГ представлены в геноме человека множественными копиями. За один митотический цикл эукариотическая клетка продуцирует около 10 миллионов рибосом, а на рРНК приходится до 80% общего количества РНК в клетке.

Последние три десятилетия интенсивно изучаются молекулярные механизмы регуляции транскрипции РГ (Jacob S.T., 1995; Xie W. et al., 2012). При этом неоправданно мало внимания уделяется биологической роли количества копий (копийности) РГ в геноме. Это в значительной мере объясняется техническими трудностями определения числа копий умеренно повторяющихся последовательностей. Кроме того, изучение копийности РГ затруднено наличием разных эпигенетических состояний активности этих генов (Santoro R., 2011; Ляпунова H.A., Вейко H.H., 2010).

Вместе с тем, в ФГБУ «МГНЦ» РАМН разработаны методы определения общего количества рибосомных повторов в индивидуальных геномах человека, и на больших выборках показано, что у разных индивидов этот признак варьирует в пределах от 250 до 670 копий на диплоидный геном (Вейко H.H., 2001; Вейко H.H. и др., 2003). Однако активна в отношении транскрипции и, следовательно, обеспечивает необходимое клетке количество рибосом только часть (около 30%) копий РГ (Вейко H.H., 2001; Ляпунова H.A., Вейко H.H., 2010).

У человека кластеры тандемных повторов РГ разного размера формируют ядрыш-кообразующие районы (ЯОР) в коротких плечах пяти пар акроцентрических хромосом (13, 14, 15, 21 и 22). Уникальным свойством РГ является сохранение в метафазных хромосомах белков транскрипционного комплекса (UBF и РНК-полимераза I), обладающих селективной аргентофильностыо (Roussel P. et al., 1996; Roussel P., Hernandez-Verdun D., 1994, Sirri V. et al., 2000). До настоящего времени единственным методом оценки общего количества активных копий РГ (АкРГ) в отдельных ЯОР и в индивидуальных геномах остается цитогенетический метод полуколичественной (ранговой) визуальной оценки в условных единицах размеров преципитатов серебра на 10 ЯОР метафазных хромосом (AgflOP) после селективной окраски кластеров АкРГ нитратом серебра (Howell W.M., Black D.A, 1980). Сумма оценок 10 размеров AgЯOP служит мерой общего количества АкРГ в диплоидном геноме индивида (Ляпунова H.A. и др., 1988, 2001). В специальном исследовании показано, что одной условной единице размера АёЯОР соответствуют 8±1 копия рибосомного повтора (Вейко H.H., 2001).

С помощью этого метода в Лаборатории цитогепетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН па-коплен большой массив данных о количестве АкРГ в геномах индивидов разного пола и возраста, как практически здоровых, так и страдающих разными формами наследственных и ненаследственных патологий. На основании наблюдаемых пределов варьирования признака высказано предположение о существовании стабилизирующего отбора на пре-натальной стадии. Выявлен внутрипопуляционпый полиморфизм размеров AgiIOP, однако механизмы формирования и поддержания подобного полиморфизма неясны. Установлено, что размер AgЯOP, отражающий количество транскрипционно активных копий РГ в кластере, является стабильной и наследуемой характеристикой соответствующей хромосомы. Однако известно, что в кластерах тандемных повторов повышена вероятность неравного кроссинговера в профазе мейоза, приводящих к изменению числа повторов в кластере. Вопросы существования и частоты спонтанных «мутационных» изменений размеров кластеров АкРГ остаются неизученными.

Ранее в ряде работ продемонстрированы фенотипические проявления количества активных копий РГ человека в норме и патологии (Ляпунова H.A. и др., 2000), в том числе в раннем развитии (Воронина В.Н., 2001), при атопическом дерматите (Неудахин

E.B. и др., 2008), ревматоидном артрите (Шубаева Н.О., 2004; Вейко H.H. и др., 2005), в ходе старения (Малиновская Е.В. и др., 2008) и др.

Одним из основополагающих факторов, определяющих способность клетки эффективно отвечать на стресс и выживать, является возможность быстрой активации белковых синтезов, что в свою очередь зависит от скорости синтеза рибосом de novo. Поскольку стадией, лимитирующей скорость биогенеза рибосом, является транскрипция генов рРНК (Larson D.E. et al., 1991; Sirri V. Et al., 2008), естественно ожидать, что количество активных копий РГ в геноме влияет как на стрессоустойчивость здорового индивида, так и на развитие заболеваний. Это предположение подтверждено в экспериментах по изучению преодоления окислительного стресса клетками в зависимости от количества АкРГ в их геномах (Вейко H.H. и др., 2005).

Патогенез мультифакториальных заболевашш (МФЗ) определяется аддитивным взаимодействием генетических и средовых факторов. Увеличение генетического груза и антропогенные изменения окружающей среды, многократно усилившие стрессорные сре-довые воздействия, приводят к наблюдаемому в последние десятилетия росту частоты МФЗ, в частности, аутоиммунных и нейродегенеративных. Так, частота раннего детского аутизма в США возросла десятикратно за два десятилетия (1988-2008 гг.), достигнув уровня одного случая на 150 детей. Выработка персональной стратегии обследования, вакцинации, лечения пациента из группы риска по ряду МФЗ будет малоэффективна без учета количества активных копий РГ в геноме пациента В целом, персонифицированный подход к диагностике и лечению требует полной генетической характеристики индивида, обязательной частью которой должно стать определение количества АкРГ в геноме.

В этой связи понятна практическая значимость метода цитогенетического анализа копийности АкРГ в индивидуальных геномах, в силу чего возникает необходимость в верификации его надежности и в определении связей между копийностью АкРГ и предрасположенностью к тому или иному МФЗ и прогнозом протекания заболевания. Все вышесказанное позволяет сформулировать цель и задачи диссертационного исследования.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в оценке надежности цитогенетического полуколичественного метода определения копийности активных рибосомных генов, в изучении стабильности и изменчивости количества рибосомных генов человека на уровне ЯОР, индивида и популяции, а также в анализе фенотипических проявлений копийности активных рибосомных генов в норме и патологии.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

1) Создание компьютерной базы данных «Копийность активных рибосомных генов в индивидуальных геномах человека» на основе экспериментальных материалов, полученных в Лаборатории цитогенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН за 1988-2013 гг.;

2) Анализ надежности (точности и воспроизводимости) метода визуальной полуколичественной оценки размеров кластеров АкРГ на материале компьютерной Базы данных;

3) Исследование условий стабильности популяционного полиморфизма размеров кластеров АкРГ в ряду поколений;

4) Оценка среднепопуляционной величины стабилизирующего зиготического (эмбрионального) отбора, направленного на поддержание копийности АкРГ в интервале, обеспечивающем жизнеспособность клетки и организма человека;

5) Определение величины зиготических потерь по признаку копийности АкРГ в выборках здоровых и страдающих репродуктивными нарушениями супружеских пар и оценка возможного вклада этих потерь в нарушения репродуктивной функции;

6) Изучение копийности активных рибосомных генов у детей с ранним детским аутизмом и анализ влияния данного признака на развитие окислительного «пресса как фактора патогенеза детского аутизма.

Научная новизна.

Впервые на обширном материале проведена верификация надежности нитошю-тического метода оценки числа копий активных рибосомных генов в кластере на основании ранговой оценки размера AgЯOP и показана удовлетворительная точность и воспроизводимость метода.

На большой выборке уточнены пределы признака копийности активных рибосомных генов, обеспечивающие жизнеспособность клетки и организма, и определена средне-популяционная доля зигот (около 9-10%), подлежащих элиминации по данному признаку.

Впервые показано, что для поддержания стабильного полиморфизма частот размеров AgЯOP, наблюдаемого в реальной панмиктической популяции большого размера, необходимо и достаточно двух факторов: гибель зигот, количество активных копий РГ в геноме которых выходит за пределы, обеспечивающие жизнеспособность клетки (<15 или >24 усл.ед.), и «мутирование» размеров кластеров АкРГ с определенной частотой (около 3,5х10~2 на кластер на поколение). Частота «мутирования» размеров кластеров АкРГ впервые определена экспериментально на выборке семей (родители и ребенок).

Впервые получены экспериментальные подтверждения того, что высокая вероятность появления зигот с недостаточным или избыточным количеством активных копий РГ может проявляться в снижении плодовитости супружеской пары.

Общее количество активных копий РГ впервые определено в геномах детей с ранним детским аутизмом и расстройствами аутистического спектра. Обнаружена достоверно более низкая копийность АкРГ по сравнению с контрольной выборкой здоровых индивидов.

На основе биоматематической модели Вольтерра «хищник-жертва» создана оригинальная математическая модель, впервые увязывающая окислительный стресс у пациентов, страдающих нейродегенеративными заболеваниями, со скоростью ответного синтеза антиоксидантных ферментов, зависящего от уровня синтеза рибосом, а следовательно, и от копийности АкРГ.

Научно-практическая значимость.

Создана компьютерная база данных «Копийность активных рибосомных геиои в индивидуальных геномах человека», объединившая и систематизировавшая экспериментальный материал, полученный в Лаборатории цитогенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН за 1988-2013 годы. База данных позволяет формировать выровненные по полу, возрасту и размеру контрольные выборки; анализировать и сравнивать количество АкРГ в выборках индивидов разных возрастных групп и с различными патологиями; формировать случайные выборки разного размера из протоколов с идентифицированными хромосомами для проведения имитационных скрещиваний.

Обоснована целесообразность нового критерия для обследования супружеских пар с нарушением репродуктивной функции: определение количества активных генов рРНК в каждом из 10 ЯОР обоих супругов с последующим расчетом ожидаемых потерь зигот по причине наследования ими избыточного или недостаточного для нормальной жизнедеятельности количества АкРГ.

Создана прогностическая таблица «Ожидаемая задержка наступления планируемой беременности в зависимости от зиготических потерь по количеству активных рибосомных генов» для возможного использования в медико-генетическом консультировании. Определена верхняя граница величины зиготических потерь для репродуктивно здоровых супружеских пар (15%).

Предложен новый критерий дифференциальной диагностики раннего детского аутизма и ранней шизофрении: низкая копийность АкРГ свидетельствует скорее о наличии раннего детского аутизма, а высокая копийность - о наличии шизофрении. Результаты диссертационной работы позволяют обосновать эффективность антиоксидантной терапии только у детей с низкой копийностью АкРГ.

В целом научно-практическая значимость работы заключается в обосновании нового критерия для индивидуального подхода к диагностике, профилактике и лечению широкого круга заболеваний как наследственной, так и ненаследственной природы, учитывающего количество активных копий РГ в геномной ДНК пациента.

Основные положения, выдвигаемые па защиту:

1. Воспроизводимость измерений размеров как отдельных AgflOP, так и общего размера 10 А^ЯОР на метафазных хромосомах дает основания использовать цитогепети-ческий метод ранговой оценки размеров AgHOP для сравнения индивидов и групп индивидов по признаку копийности АкРГ в их геномах.

2. Достаточным условием стационариости частот размеров А§ЯОР в панмиктиче-ской популяции человека является сочетание стабилизирующего отбора, поддерживающего копийность активных РГ в пределах от 120 до 190 копий, и определенного уровня спонтанного «мутирования» ЯОР. При этом предсказанная в модельном эксперименте частота «мутирования» размеров кластеров АкРГ в результате неравного кроссинговера находится в доверительном интервале эмпирической частоты «мутирования», а распределение зигот по числу возникших мутаций соответствует теоретически ожидаемому биномиальному закону.

3. В результате стабилизирующего отбора по количеству активных РГ элиминации подлежат 9-10% всех зигот (эмбрионов) в популяции, причем доля элиминируемых зигот является специфической характеристикой каждой супружеской пары и может варьировать в пределах от 0 до 45%. Одним из условий репродуктивного здоровья пары является небольшая (<15%) величина зиготических потерь по данному признаку.

4. Динамика окислительного стресса в клетках носит колебательный характер с наличием единственной точки устойчивого равновесия, причем равновесный уровень окислительного стресса обратно пропорционален копийности АкРГ в геноме клетки. Поскольку в геномах детей с ранним детским аутизмом количество транскрипционно активных копий генов рРНК достоверно ниже среднего значения как в контрольной выборке, так и в выборке больных шизофренией, можно предполагать более важную роль окислительного стресса в патогенезе детского аутизма, чем шизофрении, и обосновать эффективность антиоксидантной терапии в лечении детского аутизма, но не шизофрении.

Апробация работы.

Материалы исследования докладывались на V Съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005), П Съезде Общества клеточной биологии (С.Петербург, 2007), IV Съезде медицинских генетиков Украины (Львов, 2008), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), V Конгрессе Всемирной Ассоциации Репродуктивной Медицины (Москва, 2010) и на II Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины. Возможное и реальное» (С.-Петербург, 2012). 10 июня 2013 года состоялась апробация диссертационного исследования на семинаре в ФГБУ «МГНЦ» РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в т. ч. три статьи в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ, и глава в зарубежной монографии.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, трех основных глав: «Обшр литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», списка исшшлонашюи литературы м трех приложений. Список литературы содержит 227 источников, из них 55 отечественных и 172 зарубежных авторов. Работа изложена на 141 странице. Текст содержит 22 рисунка и 12 таблиц.

Личный вклад соискателя.

Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Большая часть исследований, включая формирование базы данных, планирование исследований и статистическая обработка результатов, написание компьютерных программ и проведение вычислительных экспериментов, создание математических моделей и их анализ, выполнена автором лично. Анализ и обобщение полученных результатов, формулировка выводов и написание рукописи выполнены автором самостоятельно.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для создания компьютерной базы данных «Копийность активных рибосомных генов в индивидуальных геномах человека» (далее - «База данных») использованы результаты исследований размеров AgÎIOP на метафазных хромосомах, проведенных в Лаборатории общей цитогенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН в 1988-2013 гг. Результаты исследований оформлены в виде таблиц из 10 (или 11 - для синдрома Дауна) колонок по числу ЯОР и 20 строк по числу проанализированных метафазных пластинок. В ячейки таблиц внесены визуальные целочисленные оценки размеров AgHOP в условных единицах.

В зависимости от того, была ли проведена идентификация хромосом, колонки с размерами AgHOP в протоколах без идентификации хромосом подразделяются на группы D (колонки 1-6) и G (колонки 7-10), а в протоколах с идентификацией хромосом — на пары хромосом 13, 14, 15, 21 и 22, по две колонки, соответствующие двум гомологам, в каждой паре.

Система управления базой данных (СУБД) создана в программной среде Borland Delphi 7 на языке программирования Object Pascal. База данных реализована средствами СУБД Microsoft Access 2003 при содействии Р.В.Вейко.

Выборка анонимных больных ранним детским аутизмом (л=51) сформирована из пациентов Федерального государственного бюджетного учреждения (ФГБУ) «Московский НИИ психиатрии» Минздрава Российской Федерации и ФГБУ «Научный центр психического здоровья» РАМН. В указанных учреждениях имеются информированные согласия законных представителей пациентов на использование биоматериала в научных целях. Для анализа нам предоставлялись шифрованные образцы (1-2 мл) венозной крови.

В исследование включены дети с расстройствами аутистического спектра, соответствующие критериям диагностики раннего детского аутизма Международной классификации болезней (МКБ-10) и Американского общества психиатров (DSM-IV-TR).

Отбор больных проводился врачами детских психиатрических отделений с использованием клинико-психопатологического метода, включавшего наблюдение за ребенком в различных ситуациях с психопатологической оценкой поведения, эмоциональных и когнитивных проявлений, особенностей социального функционирования, дополненных материалами медицинской документации (карты амбулаторных исследований). Проводили изучение семейных наследственных факторов, раннего анамнеза пациентов, учитывали особенности течения беременности и родов у матери, сведения о перенесенных ею заболеваниях. Первичную оценку состояния ребенка проводили с помощью шкалы рейтинга детского аутизма (Childhood Autism Raiting Scale - CARS).

Возраст пациентов на момент исследования колебался от 2 лет 8 месяцев до 13 лет при соотношении мальчиков и девочек 3,5:1. В исследование не включали детей, у которых аутистические проявления обусловлены другими заболеваниями, такими как органические поражения центральной нервной системы, эпилепсии, врожденные дефекты обмена веществ. Для исключения такого рода заболеваний также использовали метод сравнительного электроэнцефалографического картирования.

Культивирование ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови больных детским аутизмом, фиксация клеток, приготовление и окраска препаратов мета-фазных хромосом и оценка размеров AgflOP проводились сотрудниками Лаборатории ци-тогенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН (Н.А. Еголина, Н.В. Косякова). Культивирование и фиксацию клеток, приготовление препаратов метафазных хромосом осуществляли стандартными методами. Селективную окраску препаратов нитратом серебра проводили по методу W.M.Howell и D.A.Black (1980) в модификации Н.А. Еголиной (Ляпунова Н.А. и др., 1998, 2001). Количество активных копий РГ в индивидуальном геноме определяли путем суммирования усредненных по 20 метафазным пластинкам ранговых оценок размера преципитата металлического серебра над каждым из десяти ЯОР в условных единицах от 0 до 3. При необходимости хромосомы идентифицировали с помощью стандартной G-окраски.

Статистические параметры выборок определяли при помощи пакета программ "AtteStat" (http://attestatsoft.narod.ru/download.htm) или стандартных встроенных функцией Microsoft Excel 2007. Решение о наличии или отсутствии мутационного изменения размера (числа копий) кластера АкРГ при сравнении протоколов цитогенетических визуальных ранговых оценок размеров Ag®DP принимали с помощью вычисления критерия хи-квадрат. Сравнение групп проводили с применением методов непараметрической статистики для несвязанных выборок (Холлендер М., Вульф Д., 1983) или с помощью критерия Стьюдента (для нормально распределенных величин) при помощи пакета программ "AtteStat" или путем расчетов по введенным вручную формулам в Microsoft Excel 2007. Вычисление точной вероятности по Фишеру проводили с помощью веб-приложения http://www.langsrud.com/fisher.htm. Моделирование и вычисления вероятностей проводили па основе закона геометрического распределения (Гмурман В.Е., 2005; Холлендер М., Вульф Д., 1983). Программы имитационных скрещиваний и моделирования динамики популяционных частот размеров AgiIOP в ряду поколений написаны автором на языке программирования SmallBasic версии 0.9.5.2. Уровень значимости для отклонения нулевой гипотезы выбирали как р<0,01 или р<0,05 в зависимости от рода решаемой задачи.

Для математического моделирования внутриклеточной динамики активных форм кислорода и аптиоксидантных ферментов применяли аппарат обыкновенных дифференциальных уравнений. Использованные математические средства приведены в «Справочнике по математике» И.Н. Бронштейна и К.А. Семендяева (1981). Численное изучение модели проводили при помощи некоммерческого пакета программ "ODE" (Московский энергетический институт).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Содержание и функции базы данных «Количество активных рнбоеомных генов в индивидуальных геномах человека»

В базу данных «Количество активных рибосомных геиов в индивидуальных геномах человека» (далее — «База данных») внесены все протоколы исследований, проведенных в Лаборатории цитогенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН в 1988-2013 гг.

Для каждого внесенного в Базу данных индивида, как правило, нпосили сдсдую-щие данные: шифр донора, содержащий сведения о принадлежности к той или иной тематической выборке; пол; возраст (абсолютный в годах или условный и градациях от О пренатальный период до 5 — старческий возраст); диагноз; дата исследования; сотрудник, проводивший исследование; статус в семье (входит ли данный индивид в семью и п качестве кого, родителя или ребенка); статус идентификации хромосом.

Постоянно попол1иемая База данных содержит сведения о количестве активных 1с-нов рРНК в геномах 1191 индивида, часть из которых обследована повторно несколько раз (от двух до восьми). Сведения об индивидах, вошедших в Базу данных, приведены в табл. 1.

Таблица 1. Выборки индивидов, вошедшие в Базу данных «Количество активных рибо-сомных генов в индивидуальных геномах человека»

Без идентификации хромосом С идентификацией хромосом

Выборка п Выборка я

Новорожденные 159 Здоровые индивиды среднего возраста 60

Дети 3-9 лет 44 Семьи с ребенком (кордоцентез) 30

Здоровые индивиды среднего возраста 189 Семьи со здоровым ребенком 36

Старческий возраст (80-100 лет) 90 Семьи с ребенком с синдр. Дауна 57

Фибробласты кожи здоровых индивидов среднего возраста 45 Супружеские пары с нормальной плодовитостью 30

Ревматоидный артрит 46 Супружеские пары из отделения ЭКО 24

Шизофрения (взрослые) 42

Синдром Дауна 90 Пары с репродуктивными нарушениями 100

Системная красная волчанка 17

Ранние детский аутизм и шизофрения* 94

Атопический дерматит 38

ИТОГО 854 337

ВСЕГО 1191

Примечание: * отмечены данные, полученные после 2007 года.

Функции системы управления базой данных (СУБД) позволяют: вводить и выводить различные данные и результата исследований для каждого донора; производить выборку данных индивидов по интересующим исследователя параметрам в любой комбинации введенных в параметров; выводить результаты выборки в файл Microsoft Excel для последующего определения всех заданных пользователем статистических показателей.

Созданная СУБД дает возможность решать следующие задачи: для различных изучаемых групп пациентов формировать выровненные по полу, возрасту и размеру контрольные выборки; анализировать и сравнивать количество АкРГ в выборках индивидов разных возрастных групп и с различными патологиями; формировать случайные выборки разного размера из протоколов с идентифицированными хромосомами для проведения имитационных скрещиваний, и т.п.

Надежность метода определения числа активных копий генов рРНК в отдельных

ЯОР и в геноме индивида

Для определения степени доверия к полученным в эксперименте результатам необходимо оценить такие критерии надежности метода как точность и воспроизводимость. Под точностью подразумевается мера, обратная случайной ошибке измерения в заведомо стандартных условиях (разброс оценок размеров всех Ag50P в разных мета-фазных пластинках в пределах одного препарата, обусловленный субъективной погрешностью визуальной ранговой оценки размера AgHOP и/или случайными флуктуациями

Ag-oкpacки). Воспроизводимость показывает разброс результатов в условиях, не являющихся гарантированно стандартными. Мерой разброса служат дисперсия или стандартное отклонение.

Для анализа точности метода сначала измеряли дисперсию повторных оценок А§ЯОР, произведенных в одно и то же время одним исследователем на одном и том же препарате (строка 1 в табл. 2).

Таблица 2. Определение надежности метода оценки копийности АкРГ в отдельном ЯОР и в геноме индивида (полуколичественный метод визуальной оценки размера AgЯOP в условных единицах).

№п/п Исследуемая случайная величина Объекты сравнения N СУ, %

1 Размер А%ЯОР, усредненный по 20 измерениям (отражает число копий АкРГ в отдельном ЯОР) Сравнение двух независимых средних оценок каждой из 10 хромосом у трех индивидов 60 0,081 4,3% 01=0,007

2 Сравнение одной и той же хромосомы в семьях у ребенка и родителя 212 0,110 5,8% 02=0,012

3 Сумма размеров 10 AgЯOP (отражает общую копийность АкРГ индивида) Протоколы повторно обследованных индивидов 52 0,67 3,5% 03=0,451

У трех индивидов оценивали 10 AgЯOP (то есть, всего 30 ЯОР) в серии по 40 оценок на каждый ЯОР. Стандартным числом определений метода является 20 оценок, которые усредняются. Следовательно, серию из 40 оценок можно рассматривать как две серии по 20 оценок, после чего в каждой из двух серий вычисляли усредненное значение и получали в результате для каждого из 30 исследуемых ЯОР две оценки в рамках одного препарата, то есть, 30 пар измерений. Таким образом, размер выборки составил 60 усредненных значений размера AgЯOP. Вычисленный по этим данным коэффициент вариации СУ, показывающий относительную ошибку метода, составил всего 4,3%. Точность измерения считается приемлемой для медико-биологических исследований, если у результатов измерений СУ не превышает 10% (Лакин Г.Ф., 1980). Несколько большее значение оказалось у дисперсии (характеризующей воспроизводимость метода) в другой выборке 212 повторных измерений размеров А§ЯОР одной и той же хромосомы в семьях (два родителя и ребенок), в которых в качестве пары повторных измерений брали родительскую хромосому и соответствующую ей хромосому ребенка (строка 2 в табл. 2). В датой выборке по сравнению с предыдущей добавился еще один потенциальный фактор изменчивости: прохождение хромосомы с ЯОР через мейоз, в ходе которого размер кластера АкРГ может измениться («мутировать») в результате неравного кроссинговера. Анализ проведен на выборке 11 семей, в которых можно проследить происхождение 110 ЯОР у детей от того или иного родителя. Однако четыре хромосомы детей оказались «мутировавшими» по размеру кластера АкРГ, что сделало невозможным определение их происхождения от того или иного родителя. Остальные 106 хромосом, не маркированные как мутантные, сопоставили с родительскими, каждая с соответствующей хромосомой соответствующего родителя. Сравнение дисперсий этой выборки и предыдущей выборки (строка 1 в табл. 2) по Фшпе-ру-Снедекору показывает незначимость отличий на 1%-ном уровне значимости (Р=1,71; р>0,01), однако отличия значимы на 5%-ном уровне.

Для определения воспроизводимости измерения числа активных копий генов рРНК как суммарного размера всех десяти отдельных AgЯOP использовали выборку многократно исследованных в разные годы индивидов. Число повторных исследований

одного индивида варьировало от двух до восьми. Суммарное число протоколов по веем повторам всех индивидов равнялось 52 (строка 3 в табл. 2). Эта выборка также продемонстрировала низкие дисперсию и коэффициент вариации.

Принципиально важными выводами, которые можно сделать на основании прицеленных в таблице данных, являются: (1) воспроизводимость измерений размеров кик отдельных AgЯOP, так и суммы размеров 10 AgЯOP на хромосомах данного индивида (даже если анализы проведены в разные годы и/или разными исследователями), что, м свою очередь, свидетельствует о постоянстве количества копий АкРГ в каждом из ЯОР и п геноме данного индивида в целом, и (2) постоянство копийности АкРГ в данном ЯОР на протяжении онтогенеза и в ряду поколений (сравнение размеравАцЯОР у ребенка и родителей). Всё это дает основания использовать данный метод для сравнения разных индивидов и разных групп индивидов по признак копийности АкРГ в их геномах.

Эмпирические популяциопные частоты размеров AgЯOP

В выборке 475 индивидов из Базы данных, для каждого из которых размеры 10 А§ЯОР проанализированы в 20 метафазах (всего 95000 отдельных оценок размеров AgЯOP) определены популяционные частоты вариантов размера А§ЯОР в усл.ед. от 0 до 3 (табл. 3).

Таблица 3. Частоты целочисленных оценок размеров AgЯOP (усл.ед. 0-3) в выборке п=95 000 оценок размеров отдельных AgЯOP, полученных от 475 индивидов

Оценка размера AgЯOP, усл. ед. Число оценок в исследованной выборке Частота в исследованной выборке Теоретическая частота при равной вероятности каждой оценки

"0" 8930 0,094 0,250

"1" 19475 0,205 0,250

"2" 37430 0,394 0,250

"3" 29165 0,307 0,250

Всего 95000 1,000 1,000

Полученные частоты заметно отличаются от теоретических частот, которые имели бы место при допущении равновероятности каждого варианта (1/4 = 0,25 для каждого из четырех вариантов), отклонения высокозначимы (/>«0,00001).

Пределы варьирования копийности АкРГ в индивидуальных геномах

В выборке размером п=1191 индивидов минимальное и максимальное значение копийности АкРГ оказались: хт1П=14,9 и хт1Х=23,7 усл. ед. при среднем значении 19 усл.ед. и стандартном отклонении 1,54. Критерии согласия хи-квадрат (уД=19=20,4; р=0,51) и Колмогорова-Смирнова (0=0,Об; р=0,73) не дают оснований отвергнуть нулевую гипотезу о соответствии изученной выборки нормальному закону распределения с параметрами (1=18,9 и ст=1,54.

На основании эмпирических данных принято, что копийность АкРГ ниже 14,9 или выше 23,7 усл.ед. является летальной. Поскольку в специальных исследованиях показано, что одной усл.ед. размера AgЯOP соответствует 8±1 активная копия рДНК (Вейко, 2001), в реальных популяциях признак варьирует в пределах от 120 до 190 копий. Если копийность АкРГ в геноме зиготы выходит за указанные пределы, происходит пренатапъная гибель зиготы (эмбриона, плода), что собирательно именуется далее зи-готическим отбором.

Компьютерное моделирование условий стабильности полиморфизма размеров кластеров АкРГ у человека в ряду поколений

Проведен ряд вычислительных экспериментов, моделирующих естественные процессы, протекающие в популяциях, с целью выяснения условий поддержания стабильности популяционных частот отдельных вариантов А§ЯОР (табл. 3).

В основу алгоритма программы заложены следующие условия:

1. Большой и стабильный размер популяции N (предварительные эксперименты показали, что N=10000 является достаточным размером для реализации модели).

2. Полная панмиксия, т.е. случайное и равновероятное формирование пар скрещивания.

3. Равновероятное попадание каждого гомолога в гамету и случайное формирование зиготы.

4. Гибель (элиминация) зигот, суммарный размер 10 AgЯOP в которых оказывается меньше 14,9 или больше 23,7 условных единиц.

5. Стартовые частоты четырех вариантов размеров А§ЯОР (0, 1, 2, 3) задаются экспериментатором.

6. Возможность спонтанного «мутирования» (изменения числа копий АкРГ в кластере) с заданной частотой рм на один ЯОР на поколение.

Программа оперирует матрицей из N строк по 10 числовых переменных, что является моделью популяции из N индивидов, причем N задается экспериментатором. Первоначально значения переменных в строках задаются случайными числами от 0 до 3, которые генерируются с равной вероятностью. Таким образом, в нулевом поколении частоты всех вариантов размеров AgЯOP одинаковы и равны 0,25.

Далее в ходе программного цикла смены поколений выполняются следующие действия. Программой случайно выбираются две разные строки в качестве "родительских индивидов". Каждый индивид генерирует случайную "гамету", в которую случайным образом попадает какой-то один гомолог из каждой та пяти пар родительских ЯОР-несущих хромосом. Затем две такие "гаметы" от выбранных "родителей" объединяются в новую строку, образуя "зиготу".

По количеству копий АкРГ в зиготах программа определяет число жизнеспособных и нежизнеспособных зигот, генерированных в текущем поколении, и вычисляет коэффициент зиготических потерь Е как:

£

Е =-х 100%,

ГН-У

где О - число нежизнеспособных зигот, подвергнутых элиминации, V — число жизнеспособных зигот, из которых формируется следующее поколение.

По завершении заданного числа циклов (как правило, 200) смены поколений выводится график дипамики частот вариантов AgЯOP (от 0 до 3) во всех поколениях и производится проверка по критерию хи-квадрат на соответствие частот вариантов в последнем поколении частотам, которые наблюдались в реальной выборке из нашей Базы данных (см. табл. 3).

В первой серии экспериментов (рис. 1а) отбор по дозе АкРГ достаточно быстро приводил к потере всех вариантов, кроме одного. Быстрее всех элиминирует вариант "0". Растет частота лишь варианта "2", и можно прогнозировать, что рано или поздно вся популяция будет состоять только из этих вариантов и сумма размеров 10 AgЯOP у всех индивидов будет равна 20. Но этого не происходит в реальной популяции. Влиянием генетического дрейфа в популяциях столь большого размера и при относительно высоких зиготических потерях можно пренебречь.

Рисунок 1. Динамика частот размеров кластеров АкРГ баллов "О", "1", "2", "3" на протяжении 200 поколений, в популяции размером 10000 индивидов, в зависимости от частоты «мутаций» (спонтанное изменение размера кластера АкРГ), заложенной в модельный эксперимент: а - 0%; б-1%; в - 5%; г - 3,4%.

Примечание: По оси абсцисс - порядковый номер поколения (от 0 до 200); по оси ординат -частоты вариантов Л;^ЯС)Р: "0" (сплошная тонкая линия), "1" (пунктирная линия), "2" (сплошная жирная линия) и "3"(точечная линия). Горизонтальными линиями показаны эмпирические частоты соответствующих вариантов размера А|>ЯОР (см. табл. 3). Исходная частота всех вариантов А{»ЯОР одинакова и равна 0,25.

Далее в модель вводили спонтанное «мутирование» с заданной ненулевой вероятностью рм на один ЯОР, имитирующее случайные изменения размеров кластеров АкРГ в индивидуальных ЯОР в результате неравного кроссинговера в профазе мейоза. При заданной частоте «мутирования» ръ,= 0,01 (рис. 16) картина становится иной. Примерно к 150-160 поколению частоты всех вариантов размеров А£ЯОР почти стабилизируются на определенных уровнях, приближающихся к эмпирическим, но ещё далеких от них.

На следующем шаге пятикратно увеличили частоту «мутаций» до уровня р„= 0,05 (рис. 1в). В этих условиях равновесная частота варианта "2" стала ниже эмпирической, частоты вариантов "0" и "3" - выше эмпирических, а модельная частота варианта "1" стабилизировалась на уровне, близком к эмпирическому. Естественно ожидать, что частота «мутаций», при которой равновесные частоты всех вариантов совпадут с эмпирическими, должна лежать в интервале между ри= 0,01 и р„= 0,05. Путем перебора частот «мутирования» с шагом 0,01 искомые значения частоты «мутаций» найдены в интервале (3,4-3,5)х 10"2 на отдельный ЯОР на поколение (рис. 1г, табл. 4).

Модельные эксперименты показали, что сочетание стабилизирующего отбора по количеству копий АкРГ и частоты спонтанного изменения размера кластера а

данном ЯОР в результате неравного кроссинговера(«мутирования») в пределах 3-4% на ЯОР на поколение является достаточным условием для поддержания равновесных частот вариантов размеров AgЯOP в панмиктической популяции человека.

В отдельной серии экспериментов случайно задавали разные исходные частоты для вариантов размеров А^гЯОР. Это не повлияло на конечный результат эксперимента, что дополнительно свидетельствует о стабильности стационарного состояния частот полиморфных вариантов размеров А§ЯОР в определенном диапазоне вероятности их «мутирования» и определенного давления стабилизирующего отбора.

Таблица 4. Оценка методом хи-квадрат сходства модельных равновесных частот вариантов А§ЯОР в 200-ом поколении (строки 1-8) с эмпирическими (строка 9)

№ Частота мутаций, Рм Частоты вариантов АвЯОР, % х2 Средний суммарный размер 10 Доля зигот Е, %, подлежащих Согласие с гипотезой о

п/п 0 1 2 3 AgЯOP, М+зс1, усл.ед. отсеву в 200-м поколении сходстве (р>0,01)

1 0,010 5,1 16,8 60,2 17,9 18945 19,1±1,96 3,7 нет

2 0,032 9,7 22,0 38,6 29,7 16,1 18,8±2,13 9,7 нет

3 0,033 9,9 21,7 38,3 30,1 11,3 18,9±2,16 9,2 нет

4 0,034 10,3 20,9 38,5 30,3 10,4 18,9±2,15 9,9 есть

5 0,035 10,0 21,2 38,9 29,9 8,6 18,9±2,16 9,4 есть

6 0,036 10,0 21,7 38,0 30,3 15,8 18,9±2,16 10,3 нет

7 0,037 10,2 21,8 37,6 30,4 38,5 18,8±2,16 10,4 нет

8 0,050 11,4 22,1 34,6 31,9 1192 18,7±2,20 11,6 нет

9 Эмпирические данные 9,4 20,5 39,4 30,7 - 19,0±1,54 9Д

Сравнение модельных и эмпирических данных о частотах «мутирования» размеров AgЯOP и о распределении зигот (ипдпвидов) по числу «мутаций»

Эмпирическая частота «мутирования» кластеров АкРГ изучена на основе анализа наследования вариантов А£ЯОР в 57 реальных семьях (отец, мать, ребенок) с оценками 10 А£ЯОР на идентифицированных хромосомах. Среди 57 семей в 39 семьях дети были здоровые, а в 18 семьях — дети с синдромом Дауна (для них хромосому 21 из анализа исключали). Таким образом, всего изучено наследование 534 ЯОР. Отсутствие наследования родительских вариантов выявлено в 19 из 534 ЯОР. Это позволило сделать вывод: эмпирическая частота «мутирования» 19/534 = 3,56х1(Г2 при 95%-ной надежности находится в доверительном интервале (1,99-5,13) хШ2. При этом предсказанная в модельном эксперименте частота спонтанных «мутаций» размера кластера АкРГ на ЯОР также лежит в указанном доверительном интервале. Это позволяет заключить, что предложенная модель адекватно предсказывает реальную частоту «мутаций» вариантов размеров AgЯOP.

Из 57 детей в изученных семьях у 40 мутации не выявлены, у 15 обнаружено по одной мутации и у двух выявлено по две мутации. Индивидов с тремя и более мутациями не обнаружено (табл. 5).

Таблица 5. Сравнение ожидаемых и наблюдаемых абсолютных частот носителей разного количества мутантных ЯОР в IV

Число мутаций у ребенка Эмпирические данные Теоретически ожидаемые на основе биномиального распределения Хи-квадрат

0 40 39,68 0,003

1 15 14,64 0,009

2 2 2,43 0,076

3 и более 0 0,26 0,255

ВСЕГО-. 57 57 0,34

Распределение зигот по числу возникших мутаций (0, 1, 2,3 и более) соответствует теоретически ожидаемому биномиальному закону (Х2,-з=0,34; р=0,88), что свидетельствует о независимости возникновения мутаций в разных хромосомах

Таким образом, модель поддержания полиморфизма размеров кластеров АкРГ путем баланса между «мутационным» процессом и отбором по суммарной копийности АкРГ продемонстрировала предсказательную силу в отношении частоты «мутационных» событий. Тем самым верифицированы все допущения, методы и данные, лежащие в основе модели. В частности, получила подтверждение возможность использования методики оценки размеров кластеров АкРГ в условных единицах как объективной и воспроизводимой величины.

Стабилизирующий отбор и величина зиготических потерь по признаку копийности

АкРГ

С помощью специально написанной автором компьютерной программы на выборке 240 индивидов, для которых варианты AgЯOP определены на идентифицированных парах акроцентрических хромосом, проведены имитационные «скрещивания» по принципу «каждого с каждым» с учетом идентичности реципрокных «скрещиваний». Определяли показатель копийности АкРГ в условных единицах для всех 23=32 типов гамет каждого из «родителей» и суммарную копийность АкРГ для всех 32x32=1024 равновероятных типов зигот данной пары. Всего проведено 2,8 х 104 «скрещиваний» и получено 2,9><107 «зигот» («потомков»), у которых копийность АкРГ варьировала от х1ПШ=5,8 до Хцшх—29,8 усл.ед.

Графики распределений суммарных размеров 10 А§ЯОР в выборке «родителей» и «потомков» всех имитационных скрещиваний приведены па рис. 2. Обе нормально распределенные выборки имеют одинаковое среднее т=19. Однако стандартное отклонение распределения «потомков» (штрих-пунктирная линия, зс!=2,46) существенно выше, чем в «родительской» выборке (сплошная линия, 8с1=1,54).

Рисунок 2. Идеализированные распределения копийности активных рибосомных генов (суммарный размер 10 А^ЯОР, усл.ед., абсцисса) в выборке условных "родителей", использованных

в имитационных скрещиваниях (и = 240, сплошная линия), и у "потомков" этих скрещиваний (и = 2,9 х 107), проведенных без учета «мутаций» (штрих-пунктирная линия) и при случайном генерировании «мутационных изменений» размеров кластеров АкРГ с вероятностью 3,4 х 10~2 (точечная линия).

Примечание: По оси ординат - частота Отсекаемые вертикальными линиями "хвосты" показывают доли элиминируемых зигот

Зная пределы действия отбора (пределы жизнеспособности клетки) по признаку копийности АкРГ в условных единицах и параметры распределения «потомков» тотальных имитационных скрещиваний, которое можно считать модельным отражением всех потенциально возможных в реальной популяции вариантов формирующихся зигот (потомков), можно оценить среднепопуляционную величину зиготических потерь в рамках рассматриваемой модели. Доля подлежащих элиминации низкокопийных зигот составила: рх<14 9 = 0,048 (4,8%), и доля высококопийных зигот: рх>2з,7 = 0,028 (2,8%) всех зигот.

Общая величина зиготических потерь (доля элиминируемых зигот): Е=0,048+0,028=7,6x10 2 (7,6%). Однако эта величина отбора заметно меньше, чем величины, получешше в модели с учетом мутаций (табл. 4, строки 4 и 5).

После этого имитационные скрещивания тех же 240 реальных индивидов из Базы данных повторно проводили по тому же алгоритму, но со случайным генерированием «мутаций» с частотой 3,4x10"2.В результате пределы копийности АкРГ расширились (Хтп^б, хтах=29,9 усл.ед.), а величина зиготических потерь возросла до 9,1% (рис. 2, точечная линия), при этом доля низкокопийных летальных зигот составила 6,8%, а доля высококопийных 2,3%. Это значение хорошо согласуется с величинами 9,4-9,9%, полученными в имитационных скрещиваниях с учетом «мутаций» (табл. 4, строки 4 и 5). Таким образом, это еще одна величина, предсказанная в модельном эксперименте.

Получешгая величина зиготических потерь является среднепопуляционной оценкой давления отбора на общий пул всех возможных зигот данной популяции (напомним, что зиготическими потерями мы называем любую пренатальную гибель организма). При этом, однако, каждая супружеская пара характеризуется своим распределением зигот и своим значением зиготического отбора, который варьирует в широких пределах у разных пар. На основании этого выдвинуто предположение, что у некоторых пар значения зиготических потерь по признаку копийности АкРГ зигот настолько велики, что могут служить причиной репродуктивных проблем.

Сравнение зиготических (эмбриональных) потерь у супружеских пар с пормальной плодовитостью и пар с репродуктивными нарушениями неясной этиологии

Для определения величины зиготических потерь для заданной пары индивидов специально написана программа, которая путем перебора генерирует все возможные варианты гамет заданной пары, определяет копийность АкРГ каждого из 1024 потенциально возможных вариаптов зигот и проверяет, попадает ли копийность АкРГ в интервал жизнеспособности зигот. В результате рассчитывается доля нежизнеспособных зигот, то есть, коэффициент элиминации зигот Е.

Из созданной Базы данных извлекли информацию о размерах преципитата серебра (А{>ЯОР) на пяти парах метафазных хромосом, идентифицированных с помощью О-окраски, у 114 индивидов 57-ми супружеских пар, а также у 233 здоровых индивидов, не входящих в супружеские пары. Исследованные реальные пары разбиты на три группы: нормальные с точки зрения плодовитости, имеющие не менее двух (до пяти) здоровых детей (группа I, п=18 пар), и две группы с нарушением репродуктивной функции неясного генеза, обратившиеся в медико-генетическую консультацию с диагнозом либо «невынашивание» — как правило, имеющие в анамнезе не менее двух случаев замершей беременности или спонтанного аборта в первом триместре беременности (группа И, п=21 па-

ра), либо «бесплодие», как первичное, так и вторичное (группа III, п=18 пар). Кроме того, сгенерирована отдельная группа имитационных пар, в которую вошли все возможные парные сочетания, полученные из 233 здоровых индивидов.

Для каждой группы определили коэффициент зиготических потерь и вычислили средние и медианные значения зиготических потерь для каждой группы.

Полученные результаты показали, что коэффициенты элиминации Е у разных пар варьируют в широких пределах: от 0 до 45 процентов. При этом величина коэффициента определяется не суммарной копийностью АкРГ, а по-хромосомным распределением размеров AgHOP у каждого супруга. Три примера показаны на рис. 3.

Рисунок 3. Примеры реальных семейных пар с разными значениями зиготических потерь Примечание: По оси абсцисс - количество активных рибосомных генов (АкРГ), усл.ед., по оси ординат - частоты вариантов зигот. Черным цветом выделены элиминируемые варианты (копийность АкРГ <15 усл.ед. или >24 усл.ед.). Сумма частот элиминируемых вариантов соответствует коэффициенту Е.

а) пара в браке 14 лет, многодетная (5 детей), репродуктивные проблемы отсутствуют. Копийность АкРГ супругов: 20,05 и 17,90 усл.ед., Е~0%; б) пара в браке 9 лет, идиопатическое первичное бесплодие. Копийность АкРГ супругов: 19,55 и 17,05 усл.ед., £=13%; в) идиопатическое бесплодие. Копийность АкРГ супругов: 17,05 и 15,50 усл.ед., Е=Ъ\%.

В результате имитационных скрещиваний 233 здоровых индивидов получено 27028 псевдо-пар. Распределение коэффициента Е в имитационных скрещиваниях можно считать модельным отражением его распределения в популяции (рис. 4 и табл. 6).

В реальных парах групповые среднее, медиана и дисперсия коэффициента Е, его максимальное значение и размах (разность между максимальным и минимальным значением) возрастают с повышением степени репродуктивных проблем в ряду изученных групп 1<П<Ш.

S 10 1S ТО 25 ЭО 35 «1 «

Рисунок 4. Распределение коэффициента зиготических потерь Е в 27028 модельных парах, полученных в имитационных скрещиваниях 233 здоровых иидивидов. Примечание: По оси абсцисс - коэффициент Е (%), по оси ординат - частота

Группа I наиболее однородна по коэффициенту Е, значения которого в данной группе не превышают 15% (см. табл. 6). При этом в группах II и III значительная часть пар имеет коэффициент Е в тех же пределах. Очевидно, у этих пар следует искать другие причины нарушений репродуктивной функции, не связанные с зиготическими потерями по копийно-сти АкРГ. Вместе с тем, в группах II и III присутствует примерно 20% пар с высокими значениями зиготических потерь, которые отсутствуют в группе I (см. табл. 6).

Таблица 6. Распределение коэффициента зиготических потерь Е в модельных парах, полученных в имитационных скрещиваниях п=233 фенотипически нормальных индивидов, и в трех исследованных группах реальных супружеских пар (1-Ш).

Группы Параметры " I II III Имитационные пары

Е, % 0-5 0,67 (12) 0,43 (9) 0,39 (7) 0,42

5-10 0,22 (4) 0,33 (7) 0,22 (4) 0,28

10-15 0,11 (2) 0,05 (1) 0,17(3) 0,16

15-20 - 0,14(3) 0,11 (2) 0,08

20-25 - 0,05 (1) 0,05(1) 0,04

25-30 - - - 0,01

30-35 - - 0,05 (1) 0,005

35-40 - - - 0,001

40-45 - - - 0,0003

45-50 - - - 0,00007

Размер выборки, п 18 21 18 27028

Медиана 2,54' 6,45 7,28 6,15

Среднее 3,93* 7,25 8,84 7,67

Стандартное отклонение 4,26 6,50 8,65 6,55

Минимум 0,00 0,39 0,00 0,00

Максимум 13,77 23,05 30,96 47,07

Размах 13,77 22,66 30,96 47,07

Примечание: Указаны относительные и абсолютные (в скобках) частоты. - статистически достоверное отличие от всех остальных групп (р<0,05)

При попарном сравнении медиан и средних трех групп по Уилкоксону-Манну-Уитни достоверно различались данные параметры групп I и II (р<0,05) и групп I и III (р<0,05), тогда как отличия между группами II и Ш незначимы (р>0,10). Это позволило нам объединить группы II и III и рассматривать их как единую выборку из одной генеральной совокупности. После этого каждую пару мы могли характеризовать дихотомическим (альтернативным) признаком "здоровая" или "имеющая репродуктивные отклонения", связь которого с величиной Е данной пары можно оценить с помощью бисериального коэффициента корреляции (Лакин Г.Ф., 1980).

Бисериальный коэффициент корреляции /=0,28 оказалась небольшим, но достоверно отличным от нуля (р=0,04), что показывает значимую, хотя и слабую зависимость. Факт слабой корреляции может быть объяснен тем, что существует много причин идиопатического бесплодия, и зиготические потери по количеству АкРГ — это только одна из них, которая имеет место лишь у некоторых пар с нарушениями репродуктивной функции.

Далее провели сравнение группы I с объединешюй группой II+III при помощи медиашюго теста. Медианное значение (5,18) общей выборки (N=57) превышается в 5 из 18, или в 28% здоровых пар, и в 23 из 39, или в 59% пар с репродуктивными нарушениями.

Согласно одностороннему точному критерию Фишера по этому тесту выборки достоверно различаются на 5%-ном уровне (р=0,03).

Таким образом, полученные результаты говорят о том, что одним из условий репродуктивного здоровья пары является небольшая (<15%) величина зиготических потерь по признаку копийности АкРГу возможных потомков.

Математическое моделирование н оценка влияния зиготических потерь по признаку числа копий АкРГ на плодовитость супружеских пар

Для оценки связи вероятного срока наступления беременности с долей элиминируемых зигот у супружеских пар предложена простая математическая модель на основе формулы геометрического распределения вероятностей наступления события А при к-том испытании, если вероятность его наступления в каждом испытании равнар:

где д=1-р, здесь и далее обозначает вероятность ненаступления (отсутствия) события.

Соответственно, вероятность ненаступления события в серии из к испытаний:

& = «* (1)

Известно, что без применения противозачаточных средств планируемая беременность наступает в течение 12 месяцев примерно у 75% супружеских пар. По усредненным данным разных авторов, полученным на случайных выборках необследованных индивидов, у 25% супружеских пар беременность наступила в течение одного месяца, у 63% - в течение 6 месяцев, у 80% - в течение 1 года и у 90% - в течение 18 месяцев (сб. "Бесплодный брак" под ред. Пепперелл Р.Дж. и др., 1986). Эти значения хорошо ложатся на кривую геометрического распределения. Методом наименьших квадратов получаем наиболее удовлетворяющее эмпирическим данным уравнение регрессии:

б* = 0,78*

где Qk - вероятность ненаступления беременности у среднепопуляционной супружеской пары через к акушерских месяцев (28-дневных менструальпых циклов). Рассчитанные по этому уравнению значепия хорошо согласуются с эмпирическими.

Рассмотрим роль зиготических потерь. Для нормальной беременности необходимо совпадение двух независимых событий: зачатие и жизнеспособность зиготы по количеству активных РГ. Вероятность этой комбинации событий равна произведению вероятностей каждого из них:

откуда:

= 1-Р1 = 1~(Р2 хрз) (2)

где р1 - вероятность наступления беременности, с^ - вероятность не наступления беременности, р2 - вероятность зачатия и д - вероятность того, что зигота окажется жизнеспособной по числу копий активных генов рРНК. Эмпирическое значение может быть рассчитано по формуле (1): ¿/,=0,=0,78 и тогда ¿>,=1-0,78=0,22. Зная полученную выше эмпирическую среднепопуляционную величину зиготических потерь (9,5% =0,095), получим: <73=0,095, ир3=1-0,095=0,905. Тогда из формулы (2) выводим:

р2=р1/р}=0,22/0,905=0,243 (3)

Соответственно, при отсутствии зиготического отбора вероятность ненаступления беременности в каждом цикле снизилась бы до величины ^2=1-0,243=0,757 и для интервала в ¿циклов рассчитывалась бы по формуле: <2к = 0,757 .

Далее с помощью модели можно оценить, насколько может возрасти длительность ожидания наступления беременности в парах, у которых давление зиготического отбора

превышает ереднепопуляционный уровень, и у какой доли пар действительно можно ожидать длительного (в течение нескольких лет) не наступления беременности из-за постоянной гибели зигот.

Пусть х - количество условных 28-дневных менструальных циклов, в течение которых "обязательно" (с вероятностью 0,99) наступит беременность. Тогда дх= 1 - 0,99 = 0,01 кх = к^ч(0,01) = 1п(0,01)/1п(<7,) = -4,605Лп(д,). Учитывая, что по формулам (2) и (3):

<71 = 1-Рг*Р1= 1-0,243 р3 (4)

получаем формулу расчета числа акушерских месяцев, в течение которых с вероятностью 99% наступит успешная беременность:

х — -4,605/1п(1—0,243 -рг) (5)

Вычислив количество акушерских месяцев х при различных значениях />3, получаем таблицу, отражающую зависимость длительности прогнозируемого периода ожидания беременности от величины давления зиготического отбора по признаку количества АкРГ в геномах зигот (табл. 7). Учитывая, что астрономический год примерно равен 13 акушерским (28-дневным) месяцам, из таблицы можно видеть, что при интенсивности зиготического отбора 15% может произойти задержка наступления беременности до полутора лет, что уже дает основания для диагноза "бесплодие". Этот факт дает основание провести условную границу между парами без риска и с риском попасть в категорию репродуктивных нарушений на уровне 15% зиготических потерь. Зиготические потери в выборке здоровых пар не превышают 15%.

Таблица 7. Расчетная длительность периода "гарантированного" (с вероятностью 99%) наступления беременности в зависимости от давления зиготического отбора по признаку количества АкРГв геноме зиготы

Интенсивность зиготического отбора, S Вероятность образования жизнеспособной зиготы по признаку ко-пийности АкРГ,рз= 1-Е Число акушерских месяцев для гарантированного зачатия (с вероятностью 99%)

0% 1,00 16,5

5% 0,95 17,5

10% 0,90 18,7

15% 0,85 19,9

20% 0,80 21,3

25% 0,75 22,9

30% 0,70 24,7

35% 0,65 26,8

40% 0,60 29,2

45% 0,55 32,1

На основании вышеизложенных данных можно сформулировать предложение о включении в цитогенетическое обследование супружеских пар с нарушением репродуктивной функции неясной этиологии нового критерия; определение количества активных генов рРНК в 10 ЯОР обоих супругов с последующим проведением имитационного скрещивания для определения ожидаемых потерь зигот по причине наследования зиготами избыточного или недостаточного для нормальной жизнедеятельности количества активныхрибосомных генов.

Сравнение числа копий АкРГ в контрольной выборке, при шизофрении и при раннем детском аутизме (РДА)

В геномах детей с РДА и расстройствами аутистического спектра (п=51) количество транскрипционно активных копий генов рРНК варьировало от 15,5 до 20,1 усл.ед. при среднем 17,8±0,25 (вЕ), что достоверно отличается от среднего значения как в контрольной выборке (р<0,01), так и в выборке больных шизофренией (р<0,001) (рис. 5).

А

ц=293

М+/-5Е-15>.0+/-0.23

Б

11=42

Л1-/-М. .= 1 1+/-0.22

В

п=51

14 16 2« 20 22 24

Число копий нкгыбных рпбосомнмх генов (усл. ед.)

Рисунок 5. Нормированные распределения количества копий активных генов рРНК в выборках здоровых доноров (А) и пациентов с шизофренией (Б) и аутизмом (В).

Примечание: Ось абсцисс: количество копий активных рибосомных генов (условные единицы); ось ординат: относительная частота (%). Черным цветом показаны значения ниже среднего в контроле, серым цветом - значения выше среднего в контроле, п - размер выборки, М - среднее арифметическое, ЭЕ - стандартная ошибка

Математическое моделирование динамики окислительного стресса в зависимости от количества копий активных генов рРНК

За интенсивность окислительного стресса (ОС) в модели принята безразмерная приведенная общая концентрация активных форм кислорода (АФК) независимо от их природы. Для математического моделирования динамики АФК и ферментов антиоксидантной защиты использовались обыкновенные дифференциальные уравнения и подход, аналогичный тому, который В.Вольтерра (УоКегга V., 1931) применил в своей модели «хищник-жертва». В предлагаемой модели АФК рассматриваются в качестве аналога «жертв», тогда как ферменты-катализаторы реакций нейтрализации АФК выступают в качестве «хищников». Модель задается скоростями изменения АФК и ферментов антиоксидантной защиты (ФАЗ), катализирующих реакции нейтрализацию АФК в клетке.

При отсутствии ФАЗ (количественно ФАЗ описываем переменной у) рост АФК (переменная х) происходит в простейшем случае со скоростью, пропорциональной текущему наличию АФКх. Таким образом, первый компонент скорости роста АФК можно записать в виде к\х, где к\- некоторый положительный коэффициент (константа). Этот компонент со-

ответствует экспоненциальному росту жертв, при отсутствии хищников в экологической модели Вольтерра.

Второй компонент скорости АФК соответствует взаимодействиям АФК и ФАЗ и описывает убыль АФК, пропорциональную текущим значениям хну и записывается как -к2ху, где к2 положительная константа. Данный компонент является аналогом убывания жертв из-за их уничтожения хищником.

Что касается скорости изменения ФАЗ в клетке, то вне зависимости от присутствия или отсутствия АФК молекулы ФАЗ деградируют с постоянной скоростью, так что их убыль пропорциональна текущему наличию ФАЗ в клетке, т. е. соответствующий компонент скорости записываем как -К^у, К2> 0. Другой компонент скорости изменения ФАЗ отражает реакцию клетки на рост АФК, которая заключается в усилении выработки ФАЗ в ответ на окислительный стресс. Этот компонент пропорционален текущему присутствию АФК и не зависит от наличия ФАЗ в клетке. Поэтому запишем его как /(¡х, К{> 0. Коэффициент (АГ]) скорости синтеза ФАЗ зависит от копийности активных рибосомных генов, поскольку число копий рибосомного повтора определяет концентрацию рибосом в клетке и, как неоднократно показано, тем самым модулирует общую скорость трансляции.

В итоге получаем следующую модель динамики АФК и ФАЗ в клетке (штрих означает производную по времени):

х' = кхх-кгху, у' = Клх-Кту. (1)

Поскольку для АФК и ФАЗ компоненты скоростей численно не известны, мы ограничимся изучением качественных свойств модели: будем исследовать вопросы существования равновесий и их устойчивости, наличия колебаний и их характера при единственном допущении — положительных и постоянных коэффициентах к,, кг, Кг. Заметим, что к2 и К2 варьируют у разных индивидов в зависимости от аллельных форм генов, кодирующих ФАЗ.

Анализ модели (1) состоит из трех этапов: поиск точек равновесия, исследование локального поведения системы вблизи точек равновесия (устойчивость равновесий) и анализ глобального поведения системы. Если равновесие неустойчиво (при малых отклонениях происходит их рост), то не следует ожидать реализации такого равновесия ввиду случайных возмущений, обычных для живой природы. Иными словами, система уходит от точки неустойчивого равновесия и стремится к устойчивому. При любых значениях коэффициентов в модели имеются два положения равновесия. Первое - это нулевое равновесие с отсутствием как свободных радикалов, так и ФАЗ: х = 0, у = 0. Анализ этого равновесия показал его неустойчивость. Следовательно, в живой клетке такое состояние не может быть реализовано из-за того, что при дыхании неизбежно генерируются свободные радикалы (малые отклонения от нуля в терминах модели) и система удаляется от точки неустойчивого равновесия.

Кроме нулевого, всегда существует равновесие с положительными значениями переменных (х,у) вида:

V 'у > к2К\ Ь {1>

Из (2) видно, что чем больше скорость К\ синтеза ферментов антиоксидантной защиты на рибосомах, тем ниже равновесный уровень -щг для АФК.

При любых значениях коэффициентов модели данное равновесие устойчиво, т.е. любые малые отклонения от равновесия со временем затухают. Интересно, что когда К2< 4£], затухание отклонений происходит колебательным образом, т.е. с переменой знака. С учетом того, что антиоксидантные ферменты («хищники») представляют собой крупные белковые молекулы, период полувыведения которых из клетки велик, а свободные радикалы («жертвы») - это очень короткоживущие и реакционно способные частицы, становится

очевидно, что скорость цепного прироста свободных радикалов выше скорости выведения из клетки или распада белковых ферментов, то есть, к(>К2, и тем более К2< 4Поэтому имеет место колебательный характер приближения к равновесию.

Глобальный анализ показал единственность устойчивого равновесия х="Щ?"- Важно, что в знаменателе формулы стоит коэффициент Къ показывающий скорость генерации клеткой ферментов антиоксидантной защиты в условиях стресса и отражающий, как сказано выше, количество транскрипционно активных копий РГ индивида. Следовательно, чем больше копий активныхрибосомных генов в геноме индивида, тем ниже у данного индивида равновесная концентрация АФК, а следовательно, уровень окислительного стресса (рис. 6) при прочих равных условиях.

На основании результатов моделирования и данных о разных средних количествах активных генов рРНК у пациентов с аутизмом и шизофренией можно высказать предположение, что в патогенезе раннего детского аутизма вклад ОС более выражен, чем в патогенезе шизофрении (по крайней мере, в большинстве случаев). Можно поэтому предположить, что лечебный эффект антиоксидантной терапии должен быть выражен только у детей с низкой копийностью активных рибосомных генов (<17 усл.ед.), в клетках которых интенсивность ОС максимальна.

X

11—--I---1---1---1-И-Ч-1-(-»

Рисунок 6. Фазовые траектории для двух индивидов с разным количеством копий активных рибосомных генов Кг (пунктирная линия - Кгп сплошная линия - Кгг, причем Кы>К22). Примечание: Все остальные параметры модели у обоих индивидов одинаковы. Координаты фокуса спирали соответствуют формуле (2). Точка старта обозначена стрелкой. Ось абсцисс: концентрация активных форм кислорода (АФК), х; ось ординат: концентрация ферментов антиоксидантной защиты клетки, у. В точке А окислительный стресс слабее (уровень АФК ниже), но при этом уровень антиоксидантных ферментов выше, чем в точке В. Поскольку нельзя предугадать, в какой точке будет находиться система при взятии проб, однократный замер концентрации антиоксидантных ферментов не дает истинного представления о равновесной величине окислительного стресса у того или иного индивида

Как показало математическое моделирование, динамика ОС носит колебательный характер. Эти колебания в идеальной модели являются затухающими. Однако в реальности клетка постоянно подвергается стрессорным воздействиям, выводящим ее из точки равновесия, в которое система затем возвращается по колебательной траектории. Предсказать заранее, в какой фазе цикла (восходящей или нисходящей) окажется индивид на момент измерений, невозможно. Выявленная в ходе анализа модели циклическая динамика процесса может объяснить противоречивость данных литературы о наличии ОС при шизофрении и РДА. Как правило, в опубликованных работах ОС исследовали однократно в малой выборке пациентов, очевидно, находящихся на разных стадиях циклических колебаний - как на пике стресса, так и на спаде. Мы полагаем, что наблюдавшееся в ряде экспериментов повышенное содержание антиоксидантных ферментов на фоне отсутствия маркеров перекиснош окисления липидов характерно для нисходящей фазы цикла борьбы клетки с ОС (в модели^ отстает от х, см. рис. 6, точки А и В). Следовательно, для адекватной оценки уровня ОС необходимые многократные измерения в разное время с последующим усреднением.

24

ВЫВОДЫ

1. Цитогенетический метод ранговой оценки размеров AgflOP обеспечивает достаточную воспроизводимость результатов (с коэффициентом вариации CV<6%) и поэтому может использоваться для сравнения индивидов и групп индивидов по признаку копийности активных рибосомных генов (АкРГ) в их геномах.

2. Достаточным условием стабильности популяционного полиморфизма размеров кластеров АкРГ в вычислительном эксперименте оказалось сочетание стабилизирующего отбора по общей копийности АкРГ индивида, отсеивающего зиготы, несущие менее 120 или более 190 копий, и вероятности спонтанного «мутирования» (изменение размера кластера АкРГ) на уровне 3-4% на ЯОР на поколение.

3. Предсказанная в вычислительном эксперименте частота «мутирования» размеров кластеров активных рибосомных генов в результате неравного кроссинговера соответствует эмпирической частоте «мутирования», которая лежит в доверительном интервале Д.И.95%=(3,56±1,57)х10"2

4. Величина стабилизирующего отбора по количеству копий АкРГ, предсказанная в модельном эксперименте и подтвержденная на эмпирическом материале, составляет в среднем по популяции около 9-10% зигот. При этом величина зиштических потерь является специфической характеристикой каждой супружеской пары, которая у разных пар находится в интервале от 0 до 45%. У репродуктивно нормальных пар зиготические потери по данному признаку не превышают 15%, более высокие потери могут повлечь задержку планируемой беременности на полтора года и более.

5. У детей с ранним детским аутизмом (РДА) количество АкРГ (17,8±0,25 условных единиц) достоверно ниже среднего значения как в контрольной выборке (19,0±0,23 усл.ед., р<0,01), так и в выборке больных шизофренией (21,1±0,22 усл.ед., р<0,001).

6. Динамика окислительного стресса (ОС) в клетках носит колебательный характер с наличием единственной точки устойчивого равновесия, причем равновесный уровень ОС обратно пропорционален копийности АкРГ в геноме клетки. Это позволяет объяснить противоречивость опубликованных данных о показателях ОС и антиоксидантого статуса клетки, а также об эффективности антиоксидантой терапии у пациентов с РДА и шизофренией.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Пороховник Л.Н., Викторов В.В., Еголина H.A., Цветкова Т.Г., Ляпунова H.A. Полиморфизм размеров кластеров активных рибосомных генов у человека и моделирование условий его стабильности в ряду поколений // Генетика. 2011. Т. 47. №12. С. 1666-1675.

2. Пороховник Л.Н., Еголина H.A., Косякова Н.В., Цветкова Т.Г, Ляпунова H.A. Зиготический и эмбриональный отбор по геномной дозе активных рибосомных генов как один из возможных факторов сниженной плодовитости супружеских пар Н Медицинская генетика. 2012. Т. 11. №6. С. 31-34.

3. Пороховник Л.Н., Пасеков В.П, Еголина H.A., Цветкова Т.Г., Косякова Н.В., Горбачевская Н.Л., Сухотина Н.К, Козловская Г.В., Сорокин А.Б., Коровина Н.Ю., Ляпунова H.A. Окислительный стресс, гены рРНК и антиоксидаитные ферменты в патогенезе шизофрении и аутизма: моделирование и клинические рекомендации // Журнал общей биологии. 2013. Т. 74. №5. С. 362-375.

Публикации в других изданиях:

4. Воронина В.Н., Пороховник JI.II., Иванов В.П., Ляпунова H.A. Демонстрация фенотипического проявления геномной дозы рибосомных генов в физическом развитии детей в первый год жизни: формирования зубного аппарата и гармоничность развития // MaTepiajiH III ЗЧзда медичних генетик!В Украши. Львт, 2002. С. 37.

5. Еголина H.A., Мхитарова Е.В., Мхитаров В.А., Пороховник JI.H., Местергази Г.М., Ляпунова H.A. Изменяется ли геномная доза рибосомных генов у человека при старении? И «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (3-й съезд ВОГиС), т. 2, Москва, 2004. С. 87.

6. Агапова Р.К., Пороховник Л.Н., Дубынин П.Т., Ляпунова H.A. Компьютерная база данных «Количество активных рибосомных генов (АкРГ) в индивидуальных геномах человека». (Материалы V съезда РОМГ, часть I. Уфа, май 2005) // Медицинская генетика. 2005. №4. С. 145-146

7. Ляпунова H.A., Еголина H.A., Мхитарова Е.В., Мхитаров В.А., Косякова Н.В., Малиновская Е.М., Агапова Р.К., Пороховник Л.Н., Местергази Г.М., Вейко H.H. Количественные характеристистики комплекса рибосомных генов у индивидов старческого возраста. (Материалы V съезда РОМГ, часть 2. Уфа, май 2005) // Медицинская генетика. 2005. №5. С. 221

8. Ляпунова H.A., Вейко H.H., Костюк C.B., Калашникова Е.А., Пороховник Л.Н., Агапова Р.К. Накопление в составе внеклеточной ДНК фрагментов транскрибируемой области рибосомного гена может провоцировать аутоиммунные реакции и быть причиной гибели зародыша в раннем эмбриогенезе (Тезисы докладов 2-го Съезда Общества клеточной биологии, С-Петербург, октябрь 2007) // Цитология. 2007. Т.49. № 9. С. 772.

9. Пороховник Л.Н., Еголина H.A., Цветкова Т.Г., Агапова Р.К., Ляпунова H.A. Геномная доза рибосомных генов как одна из возможных причин «необъяснимого» (идиопатического) бесплодия супружеских пар // Marepiann IV З'пда медичних генетиыв Украши. Львт, 2008. С. 31.

10. Пороховник Л.П., Ляпунова H.A. Моделированиеусловий стабильности полиморфизма по признаку геномной дозы активных рибосомных генов у человека // V съезд Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров. Москва, июнь 2009. Изд-во РГАУ-МСХА им. К.Л.Тимирязева. Москва. 2009. Часть 1. С. 481.

11. Пороховник Л.Н., Викторов В.В., Ляпунова H.A. Экспериментальное подтверждение частоты мутаций кластеров рибосомных генов, предсказанной в модельных опытах // Медицинская генетика, 2010. Материалы VI Съезда РОМГ, Ростов-на-Дону, май 2010. С. 145-146.

12. Пороховник Л.Н., Еголина H.A., Цветкова Т.Г., Косякова Н.В., Ляпунова H.A.. Зиготический отбор по геномной дозе активных рибосомных генов как возможный фактор пониженной плодовитости супружеских пар // Материалы II Российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины. Возможное и реалыюе».С-Петербург, 18-20 июня 2012 г. С. 220-221

13. Nataliya A. Lyapunova, Nataliya N. Veiko, Lev N. Porokhovnik. Human rRNA Genes: Identification of Four Fractions, Their Functions and Nucleolar Location // «Proteins of the Nucleolus Regulation, Translocation and Biomedical Functions», Edited by D.H. O'Day and A.Catalano. Chapter 5. Springer, UK. 2012. P. 95-118

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А^ОР — ядрышкообразующие районы хромосом, окрашенные азотнокислым серебром

8Е — стандартная ошибка

ивг — фактор транскрипции, связывающийся с рибосомной ДНК перед промотором

АкРГ — активные рибосомные гены

АФК — активные формы кислорода

МФЗ — мультифакториальные заболевания

ОС — окислительный стресс

РГ — рибосомные гены

РДА — ранний детский аутизм

рДНК — рибосомная ДНК

рРНК — рибосомная РНК

СУБД — система управления базой данных

ФАЗ — ферменты антиоксидантной защиты

ФГА — фитогемагглютинин

ФГБУ «МГНЦ» — Федеральное государственное бюджетное учреждение "Медико-

РАМН генетический научный центр" Российской академии медицинских наук

ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение

ЯОР — ядрышкообразующие районы хромосом

Подписано в печать 05.09.2013 г.

Печать трафаретная Усл.п.л. -13 Заказ № 8711 Тираж: 100 экз. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пороховник, Лев Николаевич, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

04201361072

На правах рукописи УДК 575.17:575.224:51-76

Пороховник Лев Николаевич

МОДЕЛИРОВАНИЕ ОРГАНИЗАЦИИ АКТИВНЫХ РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА И ФЕНОТИПИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ

ИХ КОПИЙНОСТИ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03.02.07 - Генетика

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ляпунова Н.А.

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ............................................................................................................2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................15

1.1. Общее представление о рибосомном повторе в геноме человека.............................................15

1.2. Количество и функциональное состояние копий генов рРНК человека................................17

1.2.1 Число копий рДНК в индивидуальных геномах человека.........................................................17

1.2.2 Регуляция транскрипции рибосомных генов у эукариот...........................................................18

1.2.3 Функциональные состояния и факторы регуляции транскрипции рибосомных генов эукариот...................................................................................................................................................21

1.3. Цитогенетический анализ ядрышкообразующих районов метафазных хромосом..............30

1.3.1 Селективное окрашивание ядрышкообразующих районов метафазных хромосом и интерфазного ядрышка нитратом серебра...........................................................................................30

1.3.2 Цитогенетический метод определения числа активных рибосомных генов и его верификация методом микроспектрофотометрии...............................................................................33

1.3.3 Цитофотометрическое определение размеров А^ОР..............................................................36

1.4. Количество активных копий генов рРНК и генетическая индивидуальность человека ....38

1.4.1. Комбинаторика формирования и пределы варьирования индивидуальной копийности активных рибосомных генов человека.................................................................................................38

1.4.2. Репродуктивные потери у разных супружеских пар по признаку количества активных рибосомных генов в зиготах..................................................................................................................42

1.4.3. Фенотипические проявления количества активных генов рРНК.............................................44

1.5. Влияние копийности активных рибосомных генов человека на жизнеспособность клетки и организма................................................................................................................................................49

1.5.1. Гены рРНК при старении и при синдроме Дауна......................................................................49

1.5.2. Выживаемость и стрессоустойчивость в зависимости от.количества активных копий рибосомных генов в индивидуальном геноме.....................................................................................51

1.5.3 Эффект количества активных копий генов рРНК при мультифакториальных заболеваниях54

1.5.4 Модель взаимодействий «хищник-жертва» в биологии и медицине.......................................62

1.6. Заключение.........................................................................................................................................64

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................................................67

2.1. Оформление полученных данных..................................................................................................67

2.2. Техническое описание программы управления базой данных размеров кластеров активных рибосомных генов (AgЯOP).................................................................................................68

2.3. Отбор пациентов с ранним детским аутизмом............................................................................68

2.4. Цитогенетическое исследование размера AgЯOP и оценка общего количества активных рибосомных генов.....................................................................................................................................69

2.5. Математический аппарат для статистической проверки гипотез и создания математических и вычислительных моделей.....................................................................................70

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................71

3.1. Организация базы данных. Анализ точности метода визуальной оценки размеров AgЯOP ......................................................................................................................................................................71

3.1.1 Содержание и функции базы данных «Количество активных рибосомных генов в индивидуальных геномах человека»....................................................................................................71

3.1.2. Надежность метода определения числа активных копий генов рРНК в отдельных ЯОР и в геноме индивида.....................................................................................................................................73

3.1.3. Эмпирические популяционные частоты размеров А^ЯОР.......................................................76

3.2. Исследование стабильности полиморфизма размеров кластеров АкРГ у человека в ряду поколений..................................................................................................................................................78

3.2.1. Пределы варьирования копийности АкРГ в индивидуальных геномах..................................78

3.2.2. Компьютерное моделирование условий стабильности полиморфизма размеров кластеров

АкРГ у человека в ряду поколений.......................................................................................................79

3.2.3 Сравнение модельных и эмпирических данных о частотах «мутирования» размеров AgЯOP и о распределении зигот (индивидов) по числу «мутаций»...............................................................84

3.3. Зиготический стабилизирующий отбор по признаку копийности АкРГ на уровне семейной пары и популяции..................................................................................................................88

3.3.1. Оценка среднепопуляционной величины зиготических потерь по признаку копийности

АкРГ.........................................................................................................................................................88

3.3.2. Сравнение зиготических потерь у супружеских пар с нормальной плодовитостью и с репродуктивными нарушениями неясной этиологии.........................................................................91

3.3.3. Математическое моделирование и оценка влияния зиготических потерь по признаку числа копий АкРГ на плодовитость семейных пар........................................................................................96

3.4. Копийность активных рибосомных генов при раннем детском аутизме и шизофрении ..103 3.4.1. Сравнение числа копий АкРГ в контрольной выборке, при шизофрении и при раннем

детском аутизме....................................................................................................................................103

3.4.2 Математическое моделирование динамики окислительного стресса в зависимости от количества копий активных генов рРНК...........................................................................................104

ВЫВОДЫ..................................................................................................................114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................116

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 - протоколы первичных данных цитогенетннеского

исследования............................................................................................................132

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 - структура СУБД.................................................................136

ПРИЛОЖЕНИЕ 3 - анализ модели «хищник-жертва»...................................140

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

3'ETS - внешний транскрибируемый спейсер (основания 12970-13314) 5'ETS - внешний транскрибируемый спейсер (основания 13314-42999) AgHOP - ЯОР хромосом, окрашенные азотнокислым серебром CV - коэффициент вариации IGS - межгенный спейсер

ITS1 - внутренний транскрибируемый спейсер (основания 5527-6623) ITS2 - внутренний транскрибируемый спейсер (основания 6779-7935) NoRC - ядрышковый ремоделирующий комплекс NTS - нетранскрибируемый спейсер

NuRD - комплекс ремоделирования и деацетилирования нуклеосом SD — среднеквадратическое отклонение SE - стандартная ошибка

UBF - фактор (транскрипции), связывающийся с рДНК перед промотором

А - активные (фракция рибосомных генов)

АД - атопический дерматит

АкРГ - активные рибосомные гены

АФК - активные формы кислорода

БД - база данных

БШ - больные шизофренией

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

М - молчащие (фракция рибосомных генов)

МГНЦ - Медико-генетический научный центр

МГС - межгенный спейсер

мРНК - матричная РНК

МТР - масса тела при рождении

МФЗ - мультифакториальное заболевание

НА - неактивные {фракция рибосомных генов)

нтмРНК - нетранслируемая малая РНК

НТС - нетранскрибируемый спейсер

ОС - окислительный стресс

ПА — потенциально активные (фракция рибосомных генов)

ПСБ - прочно связанные белки

ПФК - плотный фибриллярный компонент

РА - ревматоидный артрит

РАМН - Российская академия медицинских наук РДА - ранний детский аутизм РГ - рибосомные гены рДНК - рибосомная ДНК РНК -рибонуклеиновая кислота

РП - рибосомный повтор рРНК - рибосомная РНК СД - синдром Дауна

СУБД - система управления базой данных ТО - транскрибируемая область ФГА - фитогемагглютинин

ФГБУ - Федеральное государственное бюджетное учреждение

ФЦ - фибриллярные центры

ЯОР - ядрышкообразующие районы хромосом

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Рибосомы - цитоплазматические органеллы, осуществляющие синтез белков на матричных РНК. Основным компонентом рибосом являются рибосомные РНК (рРНК). Рибосомные гены (РГ), кодирующие рРНК, представлены в геноме человека множественными копиями. За один митотический цикл эукариотическая клетка продуцирует около 10 миллионов рибосом, а на рРНК приходится до 80% общего количества РНК в клетке.

Последние три десятилетия интенсивно изучаются молекулярные механизмы регуляции транскрипции РГ (см. обзоры Jacob S.T., 1995; Xie W. et al., 2012). При этом неоправданно мало внимания уделяется изучению биологической роли количества копий (копийности) РГ в геноме. В проекте «Геном человека» гены рРНК и вопросы их копийности в индивидуальных геномах не рассматривались. Это в значительной мере объясняется техническими трудностями определения копийности умеренно повторяющихся последовательностей в конкретном геноме. Кроме того, изучение копийности РГ затруднено наличием разных эпигенетических состояний активности этих генов (Santoro R., 2011; Ляпунова H.A., Вейко H.H., 2010).

Вместе с тем, сотрудниками МГНЦ РАМН разработаны методы определения общего количества рибосомных повторов в индивидуальных геномах человека, и на больших выборках показано, что у разных индивидов этот признак варьирует в пределах от 250 до 670 копий на диплоидный геном (Вейко H.H., 2001; Вейко H.H. и др., 2003). Однако активна в отношении транскрипции и, следовательно, обеспечивает необходимое клетке количество рибосом только часть (около 30%) копий РГ (Вейко H.H., 2001; Ляпунова H.A., Вейко H.H., 2010).

У человека кластеры тандемных повторов РГ разного размера формируют ядрышкообразующие районы (ЯОР) в коротких плечах пяти

пар акроцентрических хромосом (13, 14, 15, 21 и 22). Уникальным свойством РГ является сохранение в метафазных хромосомах белков транскрипционного комплекса (UBF и РНК-полимераза I), обладающих в определенных условия селективной аргентофильностью (Roussel P. et al., 1996; Roussel P., Hernandez-Verdun D., 1994, Sirri V. et al., 2000). До настоящего времени единственным методом оценки общего количества активных копий РГ (АкРГ) в отдельных ЯОР и в индивидуальных геномах человека остается цитогенетический метод полуколичественной (ранговой) визуальной оценки (в условных единицах) размеров преципитатов серебра на 10 ЯОР метафазных хромосом (AgЯOP) после селективной окраски кластеров АкРГ нитратом серебра (Howell W.M., Black D.A., 1980). Сумма оценок 10 размеров AgЯOP служит мерой общего количества АкРГ в диплоидном геноме индивида (Ляпунова H.A. и др., 1988, 2001). В специальном исследовании было показано, что одной условной единице размера А§ЯОР соответствуют 8±1 копия рибосомного повтора (Вейко H.H., 2001).

С помощью этого метода в Лаборатории общей цитогенетики МГНЦ РАМН накоплен большой массив данных о количестве АкРГ в геномах индивидов разного пола и возраста, как практически здоровых индивидов, так и индивидов с разными формами наследственных и ненаследственных патологий. На основании наблюдаемых пределов варьирования признака высказано предположение о существовании стабилизирующего отбора. Выявлен внутрипопуляционный полиморфизм размеров AgЯOP, однако механизмы формирования и поддержания подобного полиморфизма неясны. Установлено, что размер AgЯOP, отражающий количество транскрипционно активных копий РГ в кластере, является стабильной и наследуемой характеристикой соответствующей хромосомы. Однако известно, что в кластерах тандемных повторов повышена вероятность неравного кроссинговера в профазе мейоза, приводящих к изменению числа повторов в кластере. Вопросы существования и частоты спонтанных «мутационных» изменений размеров кластеров АкРГ остаются

неизученными.

Ранее в ряде работ были продемонстрированы фенотипические проявления количества активных копий РГ человека в норме и патологии (Ляпунова H.A. и др., 2000), в том числе в раннем развитии (Воронина В.Н., 2001), при атопическом дерматите (Неудахин Е.В. и др., 2008), ревматоидном артрите (Шубаева Н.О., 2004; Вейко H.H. и др., 2005), при старении (Малиновская Е.М. и др., 2008) и др.

Одним из основополагающих факторов, определяющих способность клетки эффективно отвечать на стресс и выживать, является возможность быстрой активации белковых синтезов, что в свою очередь зависит от скорости синтеза рибосом de novo. Поскольку стадией, лимитирующей скорость биогенеза рибосом, является транскрипция генов рРНК (Larson D.E. et al., 1991; Sirri V. et al., 2008), естественно ожидать, что количество активных копий РГ в геноме влияет как на стрессоустойчивость здорового индивида, так и на развитие заболеваний. Это предположение было подтверждено в экспериментах по изучению преодоления окислительного стресса клетками в зависимости от количества АкРГ в их геномах (Вейко H.H. и др., 2005).

Патогенез мультифакториальных заболеваний (МФЗ) определяется аддитивным взаимодействием генетических и средовых факторов. Увеличение генетического груза и антропогенные изменения окружающей среды, многократно усилившие стрессорные средовые воздействия, приводят к наблюдаемому в последние десятилетия росту частоты МФЗ, в частности, аутоиммунных и нейродегенеративных. Так, частота раннего детского аутизма в США возросла десятикратно за два десятилетия (19882008 гг.), достигнув уровня одного случая на 150 детей (McCarthy М., Hendren R.L., 2009). Выработка персональной стратегии обследования, вакцинации, лечения пациента из группы риска по ряду МФЗ будет малоэффективна без учета количества активных копий РГ в геноме пациента.

Разработка персонифицированного подхода к здоровью, диагностике

заболеваний и лечению пациента в последнее время выходит на передний план основных направлений медицины. Первостепенная роль в успехе этого направления принадлежит генетической характеристике индивида, и обязательной составляющей этой характеристики должно стать определение количества АкРГ в геноме.

В этой связи возрастает практическая значимость метода цитогенетического анализа копийности АкРГ в индивидуальных геномах, появляется необходимость в верификации надежности метода и в определении связей между копийностью АкРГ и предрасположенностью к тому или иному МФЗ и прогнозом протекания заболевания. Все вышесказанное позволяет сформулировать цель и задачи диссертационного исследования.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в оценке надежности цитогенетического полуколичественного метода определения копийности активных рибосомных генов, в изучении стабильности и изменчивости количества рибосомных генов человека на уровне ЯОР, индивида и популяции, а также в анализе фенотипических проявлений копийности активных рибосомных генов в норме и патологии.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

1) Создание компьютерной базы данных «Копийность активных рибосомных генов в индивидуальных геномах человека» на основе экспериментальных материалов, полученных в Лаборатории общей цитогенетики МГНЦ РАМН за 1988-2013 гг.;

2) Анализ надежности (точности и воспроизводимости) метода визуальной полуколичественной оценки размеров кластеров активных рибосомных генов на материале компьютерной Базы данных;

3) Исследование условий стабильности популяционного полиморфизма размеров кластеров активных рибосомных генов в ряду

поколений;

4) Оценка среднепопуляционной величины стабилизирующего зиготического отбора, направленного на поддержание копийности активных рибосомных генов в интервале, обеспечивающем жизнеспособность клетки и организма человека;

5) Определение величины зиготических потерь по признаку копийности активных рибосомных генов в выборках здоровых и страдающих репродуктивными нарушениями супружеских пар и оценка возможного вклада этих потерь в нарушения репродуктивной функции;

6) Изучение копийности активных рибосомных генов у детей с ранним детским аутизмом и анализ влияния данного признака на развитие окислительного стресса как фактора патогенеза детского аутизма.

Научная новизна

В настоящей диссертационной работе первые на обширном материале проведена верификация надежности цитогенетического метода оценки числа копий активных рибосомных генов в кластере �