ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО И ТРАНСЛЯЦИОННОГО АППАРАТОВ ХЛОРОПЛАСТОВ

Одинцова, Маргарита Семеновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО И ТРАНСЛЯЦИОННОГО АППАРАТОВ ХЛОРОПЛАСТОВ
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО И ТРАНСЛЯЦИОННОГО АППАРАТОВ ХЛОРОПЛАСТОВ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР. ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н.БАХА

На правах рукописи

л-гхдчэ

ОДИНЦОВА Маргарита Семеновна

исследования генетического и трлжимф^шюго

1 аппаратов хлорошастов ;

(Биохимия - 03.00.04)

Автореферат*

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

■...'' I ■

Москва - 1977

■ Работа выполнена в лаборатории эволюционной биохимии и субклеточных структур ордена Ленина Института биохимии вмени А.И.Баха АН СССР

(заведующий лабораторией - академик А.И.ОПАРИН) * . ,

Официальные оппоненты; ! доктор биологических наук, профессор О.Н.КУЛАЕВА доктор биологических наук Б.Ф.П0ГЛА30В доктор биологических наук, профессор Ю.Б.ФИЛИППОВИЧ

Ведущее учреждение - МГУ, Ък^Лдакулътетскйя пройденная лабораторная-молекулярной"бяологии и йаоорташгческой химки им. А.Н.Белозерского Автореферат разослан " " ¿(М>и.с<.— 1973 г.

Защита состоится " /У " 1978 г. в " "час

на заседании специализированного Ученого совета (Д 002.96.01) по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при ордена Ленина Институте биохимии им. А.К.Баха АН СССР (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2).

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук

/Н.Н.Дъячков/

1 .1 • ; 111: -■ > ■[■.-.'

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

I < ■ I :

; Актуальность проблемы. Исследование роли структурных компонентов эукариотической клетки в общей системе ее функциощфования и воспроизведения« принципов координации их функций имеет общебиологическое значение й занймает центральное место в современной биохимии. Хлоропласты, специфические органеллы растительной клетки, являются централи фотосиятетической деятельности зеленых растений и обусловливают, наряду с митохондриями» различные формы внеядер-ной наследственности./Изучение макромолекулярной организации хлоропластов является весьма актуальной задачей, необходимым шагом на пути выяснения механизмов дифференциации и йвсшсцил эукариотичес- ' кой клетки. Исследования молекулярной структуры ДНК хлоропластов, ответственной за ее специфические матричные функции, весьма суще-, ственны для выяснения'функций внеядерной ДИК и той роли, которую играют эти генетические*детерминанты в наследственной.системе клетки. Наряду с этим,! принципиальное значение для выяснения того, насколько автономными компонентами эукариотической клетки является хлоропласта, имеют: исследования трансляционного аппарата этих ор-ганелл, в частности, структуры и свойств хлоропластных рибосом.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение генетического и трансляционного аппаратов хлоропластов. Нас интересовали: макромолекулярная организация хлоропластов, как материальных носителей вдтоплазматической наследственности структура и физико-химические свойства ДНК хлоропластов; структура и свойства рибосом хлоропластов, как основного компонента аппарата трансляции, а также эволюционная связь пластид с фотосинтезвругацп-ми прокариотами.

. Исходя из поставленной цели, в экспериментальные задачи работы входило: ' !

- 'обнаружение! ДНК в хлоропласта* ' 1

- сравнение некоторых физико-химических свойств ДИК хлоропластов и ДНК Адер ' 1 .•:'.■

' - 'изучение локализации ДНК в пластидах и связи ДНК с мембран- . . ;> ной системой пЛастид

| -исследование конфорыащш и размера мо^ку^.^ОЖ хлоропластов и 1 ■■; ^¿.штг-;'?

' ; ■ 1 . ' т г^д:;.

г * 1 \ '

:.....'

. - сравнение ультраструктурн пластид нормальных зеленых и му-тантных растений }

- обнаружение рибосом в хлоропласта* . ».

- установление типа рибосомных частиц, локализованных в хлоро-* □ластах; выявление особенностей их структуры и химического состава (

- сравнительный анализ рибосом хлоропластов и рибосом фотооин-„ тезирующее прокариотов, -

* Научная новизна и практическая ценность работы. Полученные ре-^ эультаты расширяет. представления об организации генома и аппарата * трансляции в эукариотической клетке. В хлоропласта* высших растений1 обнаружена ДИК, отличная по ряду свойств от ДИК ядер; что свидетельствует о существовании в эукариотической клетке скоординированного взаимодействия, по крайней мере, двух генетических систем. Таким образом,' подтверждено предположение о наличии ДНК в пластидах, впервые высказанное вами в 1952 г. (Сисакян и Черняк, 1952). Небольшая емкость хлоропластного генома позволяет предполагать его ограниченную роль в реализации генетической информации клетки.

' - Получены первые данные о наличии рибосом в хлоропластах. Впервые получены электронные микрофотографии рибосом на срезах хлоро- ^ пластов и изолированной фракции рибосом (Иикульсжа, Одинцова, Сисакян, 1962), рибосомы выделены из хлоропластов нескольких видов выс- ■ ших растений ( о«таоуа а1., 1964). Показано, что рибосомы хло- ' ропластов имеют коэффициент седиментации и обладает рядом свойств, сходных о рибосомами прокариотов..

Впервые■показано, что гомология между рибосомами хлоропластов и рибосомами прокариотического типа носит более ограниченный характер,' чем это предполагалось ранее. Рибосомы хлоропластов (по крайней мере вусших растений) отличаются от рибосом прокариотов по относительному ердержанию белка и числу белков в рибосомной частице.

Генетический . аппарат, и рибосомы хлоропластов обнаруживают значительное сходство' с генетическим аппаратом и рибосомами прокарио-тнческих клеток, что может свидетельствовать о филогенетической связи хлоропластов с клетками прокариотов и расширяет представления о возможных путях эволюции этих органелл растительной клетки. Обнаружение ДНК и рибосом в хлоропласта* подтвердило представление о частичной автономии этих клеточных органелл.

Подученные.б работе данные по изучению ДНК хлоропластов, как одного из наиболее просто организованных геномов,.могут способствовать развитию исследований в области генной инженерии,-репликации, и транскрипции ДНК, что имеет большое7 теоретическое значение и может быть ^ использовано при репеЕИЯ проблемы увеличения, пшдавшс ресурсов путем управления фотоспнтеткч есхой деятельностью зеленых растение. Эти исследования открывают возможности - для селекша путем направленного мутагенеза.

Апробация таботн. Результаты исследований были доложены на 2-ой.Научной конференции по нуклеиновым кислотам растений (Уфа, 1962), 2-ой Всесоюзной-конференции по электронной микроскопии (Киев, 1962), 2-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Ташкент,-1969), 7-ом Международном конгрессе во электршшой микроскопии (Гренобль,. 1970), 2-ом'Всесоюзной съезде генетиков и селекционеров.(Москва, 1971),, Международном симпозиуме "Нуклеиновые кислоты и белки у высших растений" (Тихань, 1971), Всесоюзном симпозиуме "Генетические функции органоидов цитоплазмы* (Ленинград, 1971, 1974), Всесоюзном сшдтози-уме."Генетические.аспекты фотосинтеза" (Душанбе,.1972),, Всесоюзном симпозиуме - "Структура и функции нуклеиновых кислот и нуклеопротендов",. посвященном памяти акад..Л.Н.Белозерского (Москва, 1374), Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции нуклеиновщ. кислот"; (Ташкент,- 1974),,Ш-ец Всесоюзном симпозиуме "Электронная микроскопия в. ботанических исследованиях"1(Петрозаводск,-1974), ХП Международном ботаническом конгрессе (Ленинград, 1975),. Международной конференции по применению электронной микроскопии в биологических исследованиях. (Берлин, 1375), Мездународаой конференции "Регуляция процессов развития у/растений" (Галле, 1977), на заседаниях Московского отделения Всесоюзного биохимического общества при'АН ОССР,.на научных конференциях Института биохимии им. А.Н.Баха..

Птбликпдии.. По материалам диссертации опубликовано 40 работ,: в том числе I монография.

Структура и объем работ». Диссетдацдя состоит из. введения,, об-'' зора литературы, экспериментальной части, включающей 6. глав, а также описание, объектов и методов исследования, заключения,:основншс ■ выводов и списка датированной литература. (639 наименований). Работа , излажена на. 290. страницах шиинопасного текста,, иллюстрирована 102 рисунками - и 30 таблицами.

" К литературном обзоре рассмотрены тлеющиеся данные о струкГуре -и физ ико-х кмич еских свойствах ДНК клеточных органелл; специальные разделы посвящены локализации.ДНК в клеточных:органоидах и связи: ДНК: с мембранной системой пластид и/митохондрий« Рассматриваются ( также современные- представления о структуре и физико-химических свойствах.рибосом хлоропластов, составе и свойствах рибосомальной РШи'белковрибосои пластид.. *

■ »

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБНАРУЖЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ ФШШЭ-ШШЕСКИЕ СВОШТВА ДНК ХЛ0Р01ШСТ0В

С целью обнаружения ДНК в хлоропдастах,. нага было изучено распределение в градиенте плотности CaCl ДНК двух видов высших растений:-фасоли и гороха (Берлдзе и Одинцова, 1967; Беридзе и др.,-

1967). г г

► '

Распределение ДНК листьев Фасоли в градиенте плотности

Сумупоная ДИК.. При ультрацентри^угпровании в градиенте плотности CaCl препарата ДНК из листьев фасоли ¿или обнаружены два компо-1 нента.в^соотноте1ши.7:3. Для.определения плавучих плотностей.этих . ДНК к; суммарному препарату. ДНК в качестве метчика была добавлена ДНК Micrococcus lysodeikticua ( js csCl г/мл). В результате

било. рассчитано, что плавучая плотность основного кокяонепта ДНК фасоли составляет 1,694 г/мл, минорного - 1,703 r/m. Так как извест-■ но, что некоторые вещества ненуклеиновой природы (в основном^ полисахариды), не поглощащие в.УФ-свете, однако близкие по плавучей плотности к ДНК,, могут давать полосы на фотопленках,, полученных' с пошцьо УФ-оптшси, вследствие рассеяния света, било проведено одновременное фотографирование результатов опыта по ультрацентрифугированию в градиенте длотностл CsCl B УФ-оптике ж оптике "шшрен"; В оптике-"шлирен" обнаруживались, три компонента. "Тяжелый1! компонент принадлежал ДНК М; lysodetkticua , а два других - ДНК фасоли. * Соотношению этих компонентов в оптике "шщрен"*ш> сравнению с УФ-оп-тшсой не : изменялось. .. .

ДНК ядер. ДНК фасоли, выделенная из ядерной фракции.(осадка 400 g ), содержала два компонента, соответствующие по плавучим плотностям ДНК суммарного препарата. При этом соотнокение компонентов. (7:3) не менялось, "южно было допустить, что наличие минорного компонента вызвано пркиэсью в ядерной фракции "тягелых" хкоропластов, но в препаратах ДНК, выделенных из ядер, осажденных при меньпем ;центробежном ускорении (150 g), обнаруживались те же компоненты в . прежнем соотношении. Для объяснения полученных результатов было определено содержание ДНК и хлорофилла во фракциях, получаемых при дифференциальном центрифугировании (табл. I).

Таблица I.

Отношение ДНК/хлорофилл во фракциях» получаемых при дифференциальном центрифугировании гомогената листьев фасоли

i—--

I____

I 400 е

¡ i ооо е

¡ з ооо Е , 40 000 g

1 40-000 g надосадочная I жидкость

I Исходный гомогенат

Хлорофилл, мг ДНК,мкг

0,82 108,8

0,75 41,4

1,36 41,2

5,28 88,0

0,54 20,1

— . —

Фракции

ДНК/хлоро-фшш

132,7

55.2

30.3 16,7

37,2''

34,2

I_______________

Из данных табл. I" следует, что отношение ДНК/хлорофилл во фракции 400'g в четыре раза вше, чем в исходном гоыогенате. Следовательно, если в ядрах клеток фасоли локализован только один кошо-нент с плавучей плотностью 1,634 г/см3, то в ДНК из осадка 400 g его доля должна увеличиться в четыре раза по сравнении с сушарннм препаратом, что'однако, не было обнаружено. Для окончательного выяснения вопроса о том, является лл ДНК ядер фасоли двухкомпонентной, tai использовали метод очистки ядер осаддением через слой 2,2 М раствора сахарозы. Получаемая при этом фракция почти полностью свободна от примеси хлоропластов. Отношение ДНК/хлорофилл в этой фракции в. 10 раз выше, чем в гомогенате (394,4 и 38,4 мкг ДНКДт хлорофилла, соответственно). Однако , и в этом случае обнаруживаются даа коглгонен-та ДНК в прежнем соотношении 7:3 (рис. 1а). Следовательно, ДНК ядер

листьев фасоли состоит из двух компонентов. Основной компонент с плавучей плотностьв 1,694 г/см3 составляет 7055, -в минорный компонент с плотностью 1,703 составляет 30% от'всей ДНК.

В настоящее время показано, что ядерная ДНК многих эукариотов двухкомпонентна. Фасоль - один из первых растительных организмов, в ядрах которого был обнаружен дискретный сателлитный компонент ДНК.

ДНК хлооопластов. При исследовании распределения в градиенте плотности СзСХ ДНК из фракции неочищенных хлоропластов фасоли -. (фракция-400-1000.В; рис. 16) ш не нашли какого-нибудь различия по сравнению о суммарным препаратом ДНК. Как следует из табл. I,

м» о<й .

/и

4.(911 17» I

' I I _

Рис. I. ЬЬнроденсю'ограммн УФ-сннмков распределения ДНК фасоли в гргизюкте плотности СеС1 а - ДНК очгдешюй ядерной Фракции; б - ДНК фракции 400-1000е.

отношение ДНК/хлорофилл во фракции, осаждающейся в интервале 400-1000е.» меньше, чем в ядерной фракцш, однако несколько вше, чем в исходном гомогенате. При двухкратной очистке хлоропластов в 1ра-диенте концентрации сахарозы отношение ДКК/хлорофцял уменьшается в 7 раз по сравнению с гомогенатом (4,8 и(32,5 соответственно). Следовательно,;во фракции ДНК, выделенной^из двухкратно очищенных хлоропластов, доля хлрропластной ДНК должна увеличиться в 7 раз.

При анализе этой ДНК в градаенте плотности СвС1 били обнаружены два компонента, которые соответствовали по плавучей плотности ДНК ядерной. и суммарной фракций» Однако, в случае очсщеныцс хлороплас-тов. наблюдалось некоторое уменьшение процентного содержания минорного компонента. Если в ядерной и суммарной фракциях соотношение компонентов равнялось 7:3, то во фракции очкценшас хлоропластов оно соответствовало приблизительно 8:2. Так;гл образом, во фракции очщеннис хлоропласт о в не удалось обнаружить коггпонентов, отличающихся по плавучей плотности от ДНК ядер. Данные о том, что ДНК хлоропласт ов гложет не отличаться по нуклеотидаому составу от Д1К ядер, были подучены в наших опытах впервые.

Последукцке исследования о применением более совершенных методов вццелешя а очистки клеточных органелл показали, что ДНК хлоро-пластов фасоли однокомпонентна и имеет одинаковую шсавучу» плотность с основным компонентой ядерной ДНК ( К1гк , 1970).

Денатурация ДНК. Для подтверждения данных о двухкомпоиентнос-тл ДНК фасоли и выявления возмоззшх различий между компонентами ДНК ядерной и хлоропласт ной фракций бия использован метод тепловой денатурации (Верядзе и др., 1967). Кривые плавления суммарной ВЕС ■■ и ДНК очинённых хлоропластов фасоли приведены на рис. 2, а и б. Форма кривых сввдетельствует об их двухкомпонентности, Б интервале температур 73-80° наблвдается резкий подъем оптической плотности (на 30£), а начиная с 86° л виде нарастание оптической плотности ' (еце на 10£) носит более плавный характер. Профили кривых тепловой денатурации суммарной ДНК и ДНК из фракции очищенных хлоропластов не обнаруживает каких-либо различий.

Ренатугания, ДЩ. При исследовании ренатурацги препаратов ДНК, выделенных из клеточных фракций фасоли (Берздэе к др., 1967), были обнаружены значительные различия в способности к ренатурашш суькар-ной ДНК и ДНК очищенных хлоропластов: последняя реассоциировала гораздо лучше,-чем сухарная ДНК. В случае ДНК хлоропластов наблвдал-ся резкий подъем оптической плотности в интервале температур 80-9СР (рис. 2,в), в то время как в препаратах суммарной ДНК имело место почти равномерное нарастание.оптической.плотности от 20 до 100° (рис. 2,г). Бйлыдая способность к ренатурацш хлоропдастной ДЕК, впервые установленная нами, свидетельствовала о том, что она. представлена болое однородными,(по нуклеотиднощ1 составу) молекулами, ■ чем ДКК'ядер.

-101

а б

Рис. 2. Кривые плавления ДНК фасоли

Б - поглощение при 260 нм и данной температуре; Е^ -'поглощение при 260 нм и 2СРС; ' \

а - суммарная ДНК; б - ДНК очшенных хлоропластов; в - ренатурироваяная ДНК очищенных хлоропластов; г - ренатурированная суммарная'ДНК.

ЭЖЕСГРОННОШКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ДНК МАСТИД

<■■ Локализация ДНК в пластидах * •

Исследования проводили на cpêfeax изолированных и tn situ пластид нескольких видов высших растений (Одинцова и др., 1970; Mikuleka et el.. ,1970; Mikuiska о. Odlntsova , 1970; Odintsova et al., : 1970; Îîikulska et al. , *I974). Были изучены хлоропласта одно- и двудольное растений, пластиды, находящееся в процессе дифференциации от лропластид в полностью организованные хлоропласты, а также разные типы пластид: лейко-, ампло-, хлоро-, хромопласты.

На ультратонких срезах в строма всех f типов пластид обнаруживаются прозрачные1 для электронов участки, содержащие нити ДНК {рис. За)., . , i

В хлоропластах листьев pieum, Raphanus, Aspidistra, Billber-gia, Faphiopeâilum, Stanho^ea и" Clivia , находящихся в процессе дифференциации, ламеллярная система -довольно хорошо развита. Строма зернистая,, плотная для электронов. На срезах этих пластид Д1Ж-со-держадае электронно-прозрачные участки видны отчетливо.. Они хорош отграничены от остальной части матрикса, располагаются вблизи ти-лакоидов и в большинстве случаев ограничены ими. На продольном срезе,- прошедшем приблизительно через*середину хлоропласта, можно обнаружить несколько (3-8) электронно-прозрачных участков разной формы и величины. Отсутствие каких-либо структур, соединяющих электронно-прозрачные участки, позволяет предполагать, что они изолированы друг от друга и что хлоропласта содержат не одну копию генома.

На основании исследования срезов хлоропластов нельзя судить о том, , вся ли ДНК хлоропластов локализована в электронно-прозрачных участках. Возможно, что это только часть ДНК,.видимая благодаря низкой электронной плотности этих участков стромы; остальная часть ДНК может быть локализована в других участках.стромы, при.этом она может быть "свободной" или связанной с ламеллярной системой хлоропластов. Возможно, что большая плотность матрикса хлоропластов не , позволяет обнаружить этого на срезах.

■ В электронно-прозрачных участках хлоропластов нити ДНК образуют разные по форме структуры. Шзио видеть, что многие из ДПК-со-дераатсих нитей направлены в сторону тилакоидов/На срезах, однако, трудно наблюдать прикрепление ДНК к мембранам тилакоидов из-за кно-

Рис. 3. Схематическое изображение хлоропласта гороха (а)

ОМ - окружающая мембрана; ЛГ - ламеллы гран;, . *. *

ЛС -ламеллы стромы; Р - рибосомы; ЭПУ - электронно-прозрачный участок^ содержащий ДНК.

Кольцевая молекула ДНК хлоропластов гороха (б). !

Кощурная длина молекулы 35,0 мк; х 40 ООО.

гочисленных плотных рибосомоподобных частиц, . расположенных вблизи мембран. Рибосомы (полисомы) обнаруживаются и в остальных частях ' электронно-про эрачных участков. В изолированных хлоропластах с I

поврежденной опухающей мембраной, у которых вытекла большая часть

стромыи сохранилась, в основном, - мембранная система, в электронно-прозрачных ареалах сохраняются нити ДНК. Это;может свидетельствовать о том, что по крайней мере часть ДНК в пластидах связана с мембранами.тилакоидов.-Более.прямые данные о связи ДНК с мембранной системой пластид были получены при исследовании срезов хлоро- ' пластов, переваренных протеазами ( Herrmann a. KowaUik, 1970а; Kowallik ,„1371), а также изолированных хлоропластов в условиях ос--мотического шока и лизиса детергентами (см,ниже)• f

Электронно-прозрачные ареалы могут быть расположены различно ' в строме властвд:; в середине, , на одном конце среза шш на обоих концах. При исследовании-ультратонких срезов трудно обнаружить какую-либо корреляцию между числом и размером ДЙК-содержащих электронно-прозрачных ареалов с одной стороны, .'величиной и возрастом пластид, с другой.. В пропластвдах они обычно небольше,, в хлоро--пластах с не вполне развитой ламеллярной системой они крупнее, а В- хлоропласт ах с сильно развитой ламеллярной системой эти участка, совсем небольшие или вообще не обнаруживаются на срезах.- Лаке в пластидах одного-и.того же вида растений, находящихся на одной и той же стадии развития, можно обнаружить ДНК-содержащио электронно-прозрачные ареалы разной величины.

Форма электронно-прозрачных участков на срезах, по-видайому, зависит от типа и/или степени дифференциации пластид. На продольных срезах:пропластвд, лейко- и хромопластов электронно-прозрачные ареалы-иыеюг обычно^округлую или овальную форму. У хлоропластов они ча^е всего удлиненные, сплщенныэ, треугольные, линзовидные. В этом случае форма.электронно-прозрачных ареалов зависит, по-ввди-■

юиу, от расположения гракных и межгранных тилакоидов.

1 "

, , Обнаружение зерен крахмала и липидннх капель в ДОК-{ содержащих электронно-прозрачных участках; матрнкса хлоропластов

При алектронномпкроскопическом исследовании ДНК на срезах хлоропластов нами было обнаружено, что в электронно-прозрачных участках матрикса, содержащих, нити ДНК, локализуются также зерна крахмала. Об этом свидетельствовали опыты по обработке: срезов «¿-ампла-зой и результаты окрашивания срезов J2 + KJ (Uikuaekaa. oaintaova, 1970). Следует отметить, что зерна крахмала не удавалось обнару-

хоть в других участках матрикса хлороплаотов. , Присутствие зерен крахмала в ДНК-содержащгос) ареалах матрикса' пластид представляет определенный интерес. Такие наблюдения ранее отсутствовали в литературе. В настоящее время определенная связь между, локализацией зерен крахмала и нитями ДНК описана для ряда высших растений. Показано, что имеется взаимосвязь между числом и размером образующихся зерен крахмала с одной стороны, и числом ДНК» содержащих участков, с другой t Ris a. Plaut . 1962; Salema а. Ве-■denhuizen ,1969;. Hermann а. Коwallit ,1970 b).

. He исключено, что процесс амилогенеза протекает в ДНК-сойержа-щих• электронно-прозрачных участках матрикса пластид»-Косвенным Доказательством этого может служить обнаружение в электронно-прозрачных ареалах зерен крахмала на разных' стадиях их образования ( Mi-kulBka a.Odintaova, 1970).

Дифференцированные хлоропласты листьев некоторых однодольных растений ( Olivia, Iris, Anaryllia, stanhopes )^содержат в качестве запасного вещества капельки жира ( Uifculaka , I960). Интересно, что лшшдные капли в хлоропластах листьев Glivia и stanhopea ', подобно зернам крахмала, локализуются в ДНК-содеркащкх электронно- .. прозрачных участках матрпкса хлороплаотов. Как и в случае крахмальных зерен, в электронно-прозрачных участках можно наблвдать различные стадии формирования лмпцдных капель.

Обнаружение различных запасных; веществ в ДНК-содержащих электронно-прозрачных ареалах может свидетельствовать о том,.что эти участки матрикса пластид биологически активны. Однако необходимы дальнейшие цитохимические и радиоавтографнческие исследования на уровне электронного микроскопа, чтобы доказать наличие в электронно-прозрачных ареалах ферментов, участвующих в синтезе этих,запасных веществ. Расшифровка функций ДНК пластид позволит выяснить, какой геном контролирует эти цроцессы.

Связь ДНК с мембранной системой хлороплаотов

При исследовании ДНК на срезах хлороплаотов можно вздеть, что многие нити ДНК направлены к периферии электронно-прозрачных участков, где они находятся в контакте о мембраной.. Асроцзация ДНК с

мембранными структурами пластид значительно лучше видна при электрон. л- - .

ноникроскоппческом исследовании лязированнщ: пластид в белковой шнослое по методу Клайлшмидга. При лизисе хлоропластов гороха осмотическим шоком около ЗСВ! фрагментов мембран хлоропяастов ассоциированы с тонкими фибриллами или агрегатами фибрилл, которые полностью исчезают при обработке препаратов ДНК-азой. Нити ДНК примерно одинакового диаметра отходят от фрагментов мембран во всех направлениях, образуя многочисленные петли.; Иногда можно наблвдать множество одиночных петель, прикрепленных вдоль края мембраны, встречаются также две петли, прикрепленные к одному и тому же или соседним участкам мембраны. .

'В то время как при разрушении'Митохондрий животного происхожу депия осмотическим шоком обнаруживаются преимущественно кольцевые ' молекула ДНК ( Van Bruggen et el.-, 1968; Maes 1969b),. в ХЛОрО-пластах (и митохондриях) растительного.происхождения, разрушенных осмотическим шоком, нам не удавалось обнаружить кольцевых молекул.

При инкубации изолированных хлоропластов гороха^ с, саркозилом (255-ный раствор, 30 мин. при комнатной температуре) мембранная система-пластид лизируется лишь частично.: На электронных фотографиях' видны скопления фибрилл ДНК, ассоциированные с фрагментами мембран, при этом иногда удается наблюдать упорядоченное расположение нитей ДШ, напоминавдее довольно симметричную и плотно упакованную спираль. Возможно, что характерные спиралевидные структуры отражают особенности пространственного расположения ДНК в пластидах и представляют собой элементы третичной структуры ДНК хлоропластов (Турищева И Одинцоваi 1974, 1975;■ OdinteoTa а*.Turiecheva,. 1976).,

О трехмерной структуре ДНК, "упакованной" в хромосомах эукари-отов и бактерий, а также в вирусных'л фаговых.частицах известно мало.. Морфологическое сходство нуклеопдов прокариотич е ских клеток с "нухлеощшми" клеточных.органелл, сходные влектронномикроскошпес-кие картины ДНК осмотически лизированных нуклеоидов бактерий, клеточных органелл и фагов, позволяют думать,.что в основе третичной структуры ДНК во всех-случаях лежат общие принципы взаимодействия. Возможно, что упаковка ДНК в хромосомах бактерий и нуклеоцдах клеточных органелл сходна о ее организацией в хроматине эукариотичес-ких клеток я что в ней принимают участие белки и молекулы. РЖ. - Однако ,.полной аналогии в организации ДНК in aitw .по-видимому, может

не быть, во всякой случае между клеточными органеллаш и клетками прокариотов с одной стороны, вирусаш и фагами о другой, так как очеыь плотная упаковка ДНК у вирусов и фагов - это система для транспорта ДНК, а в клеточных органоидах и клетках прокариотов - '.. это-метаболдзируюцая система. Таким образом, конкретные модели орга низации ДНК, видимо, могут быть различны. »*

Результаты исследования ДНК хлоропяастов, .визированных сарко-эидом, подтверждают данные, - полученные в опытах с хлоропласташ, ли зированными'осмотическим шоком, о том, что ДНК ассоциирована о мембраной во многих разобщенных точках, образуя петли разной длины, которые подобно радиусам отходят от фрагментов мембран во всех на- , правлениях. Анализ конфигураций нитей ДНК, прикрепленных к фрагментам мембран хлоропяастов гороха, показал, что наиболее часто встречающейся конфигурацией являются одиночные петли (70-80^ всех типов прикрепления).. Общая длина нитей ДНК, ассоциированных с фрагментом мембраны, в хлоропласта* гороха, лизировйнных саркозилом, варьирует от 20 до 500 мк. Чаще всего при этом встречаются .нити ДНК длиной 30-40 мк. Следует отметить, что при таких условиях лизиса свободные концы в молекулах ДНК видны довольно редко или вообще не встречаются. * - „ ■.

Химическая природа связи ДНК-мембрана неизвестна. Некоторую диссоциацию этой связи удается наблюдать при обработке препаратов проназой. По нашим предварительным данным, обработка комплексов ДНК-мембрана 8 М мочевиной или 5 М раствором НаС1 также ведет к освобождению.ДНК из этого комплекса, в то время как при действии РНК-азы и фосфолипаз А и Д разрыва связи ДНК-мембрана не происходит. По-видимому, связь ДНК с мембраной опосредована белком, который, возможно, ответственен за специфичность этой связи.

Морфологическими исследованиями ультратонклх срезов и генетическими опытами доказана связь ДНК. с клеточной мембраной у бактерий. Общепринято, что мембраны играют важную роль в'репликациями' сегрегации бактериальных хромосом. Можно думать, что подобно мембранам бактериальной клетки, мембраны хлоропластов участвуют в решшка вил ДНК и последующей се^егавда дочерней ДНК - процессах, которые имеют 'место при делении этих клеточных органелл.

КонФормация и размер молекул хлоропластов

В связи с многочисленными данныш о постоянстве размеров и кольцевой форме молекул ДНК митохондрий животного происхождения,, большой интерес представляло изучение форми и размеров молекул ДНК органоидов растительной клетки. К началу нашей работы такие данные бшш очень немногочисленными.

При исследовании формы и размера молекул ДНК в лизатах хлоро-пластов гороха, подученных с помощью додецклсульфата. На, а также в препаратах ДНК, выделенных из хлоропластов, лизированных додецад-сульфатом На (Одинцова и др., 1970;' оа±п*воуа е* а1. , 1970), нами были обнаружены только линейные молекулы, длина которкс варьировала от 5 до 25 ш. Длина отдельных молекул достигала 30 нк.

Так как додецалсульфат является сильным аНионнш детергентом,, казалось целесообразным провести изучение формы и размера молекул ДНК хлоропластов в более мягких условиях лизиса..Весьма удобным для этих целей детергентом является.саркозал, анионный детергент, близкий по химическому составу к додецалсульфату.

Как было сказано выше, в использовашшх нами условиях саркозил " не лиэирует мембранные структуры пластид полностью. При электронно-микроскопическом исследовании лкзатов окало половины молекул ДКК (43,5£) обнаруживаются в связанном с мембранами состоянии. Свобод-нолежащие молекулы ДНК представляют собой кольца с длиной контура около 40 мк (рис. 36) (Турищева.и Одшщова, 1974; 1975; 0<ШПвоуа а. Яш^асНеуа, , 1976),'иол. вес 90х10б Дальтон.

Ксследот^итое структуры шгас?ид_пластомннх мутантов как родкод к выяснению функций хлоропласт ной ДНК ( (ШШвоУа et а!.. 197В)

. Одним из возможных экспериментальных подходов к изучению функций ДНК хлоропластов является исследование структуры и функциональной активности пластид цутантных растений. Особый интерес при этом представляют мутанты с генетическими повревденшшз, локализованными в пластоме..

Нами была изучена ультраструктура пластид спонтанно возникшего пластомного мутанта томатов 1.

-18В опытах использовала зародышевые листья .4-5 дневных проростков мутанта и зеленых проростков томата того же возраста,.

.Клетки листьев 4-5 дневных : зеленых проростков томата содержат, хлоропласта, морфология и гонкая структура. которых типичны для хло- ' ропластов высших.растений. Дифференцированные хлоропласта томата, имеют овальную или линзовидную форму и диаметр по длинной оси, равный 4,1+0,18 мк.. Среднее число rpait на органеллу составляет I5+I,7 ( п» 23), при этом грана состоит в среднем из 8+0,4-тглакоидов > . ( п =» 75). Строма пластид мелкозернистая, довольно плотная для

'электронов. В мелкозернистом катриксе хлоропластов имеются участки, прозрачные для электронов,, в.которых ваднн многочкслешше плотныо рибосодаподобкые частицы и короткие фибриллы, исчезахцие после обработки срезов ДЩ-азой. На продольном срезе, прошедшем через середину хлоропласта, -можно обнаружить несколько'электронно-прозрачных участков различной формы, которая зависит, по-видимому, от располо- ■ гения гранных и межгранннх ламелл.. В некоторых ДНК-содержапих . электронно-прозрачных участках локализуются зерна крахмала.

Клеткц листьев пластомпого мутанта pi-alb 1 содержат бесцветные'-пластиды, которые в среднем имеют близкий размер с хлоро-пластами нормальных растений. Средний диаметр когтантных пластид по длинной оси.составляет 4,1+0,33 кк. Основное отличие от хлоропластов нормальнюс растений состоит в вариабельности их размеров. В то время как для хлоропластов коэфс^ягиент вариации составляет 18,75«, для пластид мутанта Р1-а1Ъ 1 он равен.41,4%,. При этом му-тантные пластиды не обнаруживают признаков дегенерации. Возможно, что вариабельность размеров пластид px-alb v является фенотипи-ческим следствием отсутствия в них ла\:сллярной системы.

Форма мутантных пластид крайне разнообразна:: от охсруглой пли овальной, как у хлоропластов нормальных проростков, до амебовидной или более сложной неправильной формы. В некоторых гдутадтных пластидах каблвдаются шгсаггаащш цитоплазмы, содержащие митохондрии, рибосомы и элементы шероховатого эндсплазматического ретккулуш. Структура пластид мутанта Pl-alb 1 значительно отличается от структуры хлоропластов.-Ламеллярлая система, типичная для хлоропластов нормальных проростков,, отсутствует у цутантных пластцд; Они окружены двойной мембраной и содержат мелкозернистый матрикс, менее плотный для электронов;: чем матрпкс хлоропластов зеленых проростков^-

В ыатрлксе мутантных пласткд довольно часто встречается небольшие пузырьки и осмиофильные глобулы, Другие структурные- элементы практически полностью отсутствуют. Изредка встречаются. единичные короткие тилакокды, беспорядочно расположенные в строке, небольшие группы параллельно расположенных мембран ; а такае пучки ламелл и концентрические ламеллы. Проламеллярное тело в мутантных пластидах не обнаруживается. ■

Структура пластид мутанта Р1-а1Ъ 1 свидетельствует о том, что в своем развитии они проходят стадию пропластид, однако, дифференциация ткхакоидов блокирована на ранней стадии., Процессы, лежащие в основе роста пластид, по-вютшоглу, при данной мутации не затрагиваются шш затрагиваются в незначительной степени;

В лишенном тдлакоидов штргосе мутантных-пластид отчетливо видны ДНК-содержалще электронно-прозрачные участки;. На долю электронно- ■ прозрачна участков у цуганта Pl-alb 1 приходится 16,%I,<3% объема.: пластид. В то же время в хлоропластах зеленых проросткрв тошта па их долю приходится лишь 6,1+0,8^ объема пластид. Возможно, что такие существенные различия связаны с отсутствием ламеллярной системы в матриксе мутантнцх пластид и менее компактной организацией ЛЕС. В ' то время как в хлоропластах зеленых проростков томата электрошго-прозрачные участки беспорядочно расположены в строме, для 1утант-ных пластид характерно периферическое расположение электронно-прозрачных участков. Возможно,, это объясняется тем, что нити ДНК прикреплены к внутренней окружающей мембране, в то время как-в хлоро- ■ пластах нормальных проростков ДНК, по-вкдпмоцу, преимущественно ассоциирована с мембранами тилакокдов. Морфология ДНК-содержацях структур в мутантных пластидах такая же, как в хлоропластах зеленых проростков томата..

Для ряда изученных к настоящему времени пдастомкых мутантов характерно отсутствие или пониженное содержание 70 S рибосом в пластидах. В строме пластид мутанта. pi-alb 1 отчетливо'видны многочисленные рибосомоподобные частицы. Kaie и следовало ожидать, sep--на крахмала в пластидах мутанта Pl-alb 1 не обнаруживаются,.так как у мутанта отсутствуют субстраты, а возможно также и .ферменты, г необходимые для этого скнтеза.

Митохондрии в клетках пластоыного мутанта Pl-aib 1 по морфологии и структуре не отличаются от митохондрий нормальных растений..

Эти данные указывают, на то, что мутация Pi-alb л специфически блокирует дифференциации пропласгид в клоропласты: )нарушет образование типичной для хлоропластов высших растений ламеллярпой системы. Неизмененная структура ДНК-содергаздх электронно-прозрачнцхучастков, многочисленные рибосомоподобные частицы и близкий к хлоропласта» нормальных растений размер мутантних пластид указывают на то, что у, мутанта существенно не нарушены процессы, лежащие воснове роста пластид. Наличие двуслойной окруаазщей мембраны у пластид Pl-aib 1 указывает на то, что данная мутация не влияем'на сборку внешней и внутренней окружающих мембран. Цдагственныгл морфологически наблюдаемым эффектом нутации является блокирование сборки мембран тдлакои-дов. Ранее было показано участие ядерной ДНК в сборке мембран тила-КОИДОВ ( Wettstein et al. , 1971; Sprey , 1972; Hielsea et al. , 197.4). Полученные нами данные, наряду с данными, опубликованными в. литературе (, Wildraan et al. , 1973; Knoth et al. , 1974), свидетельствуют об участии ДНК пластид в этом процессе.

ОБНАРУЖЕНИЕ И ВНЕШНИЕ- РИБОСОМ ХЛОРОПЛАСТОВ J

Обнаружение ртбосототто тобних частиц на срезах хлоропластов

висвзос растений

' При исследовании ультраструктуры хлоропластов двух видов высших растений Chenopodium album L. (сец. Chonopodiaceae ) И Clivia lelniata liql. ' (сем. Anaryllidaceae ) в матриксе пластид были обнаружены электронно-плотные частица диаметром 100-300 А (Микульска и др., 1962). В хлоропласта* chenopodlum albun эти частицы располагались в матриксе Наружной части хлоропласта. одиночно кллгрутшми, иногда они были: прикреплены к ламедляриым структурам. Размеры этих частсц на срезах хлоропластов chenopodium album составляли 100140 А. ■ В хлоропластах ciivia'ainleta они располагались преимущественно на концах дисков грая и иногда небольшими группами в матриксе. Размеры этих частиц были довольно разнообразны и колебались в пределах от 120 до 300 2..

л.

По внешнему виду и величине.электронно-плотные частицы хлоропластов напоминали щггоплаз ыатиче ские гранулы Паладе (впоследствие названные рибосомами).

Ш попыталась выделить эти: частицы из хлоропластов указанных видов растений. Предварительно фракции изолированных хлоропластов: подвергали микроскопическому исследованию. При этом было показано, что они состоят почти целиком из неповрежденных.хлоропластов. ■

■ Шделеяие рибосом и их характеристика .

•Выделение рибосом из хлоропластов проводили двумя методами: I) экстракцией трис-НСХ буфером, рН 7,5, 2) обработкой хлоропластов 0,5^-ным раствором дезоксихолата На в присутствии ионов Ие2+ (ХСГ^М). Экстракты последовательно центри$угировали при 40000е в течение 30 юга. в при 105000б в течение 90 мин. Фракцию частиц, осаж-дашщхся в интервале 40000-105000 е , суспендировали в трас-НС1 буфере ,рН 7,5, в присутствии Мб2+ (1(ГгМ); суспензию центрифугировали при 8000с в течение 10 мин. и использовали в дальнейшем дня элект-ронномикроскопического исследования, определения белка, РНК и изучения поведения выделенной фракции в ультрацентрофуте»

Фракции частиц, выделенных из хлоропластов СЬепорсхНит а1Ъит и С11т1а ю!л1а1а , давали характерный для РНК максимум поглощения ; в УФ-свете и имели типичное для рибосом соотношение между содержанием белка и РНК (55-60? белка и 40-45^ РНК).

При злектро нношзкроскошгче ском исследовании выделенных фракций, фиксированных по Паладе ( Ра1айв , 1953), было обнаружено, что они состоят из маленьких плотных частиц, размером 100-180 А (Шки1эка в* а1. , 1962).

В аналитической удьтрацентрийгге в присутствии ионов Ие2+ (Ю~?М) фракция.риОонуклеопротеидашх частиц из хлоропластов сьепоро-<11ша а1Ъиа давала два.пика о коэффициентами седиментация 18,3 и 67,08 . 5 этих же условиях фракция РНП-частиц из хлоропластов С11у1а ш1п1а1а давала один пик с коэффициентом седиментации 68,Оэ . ¡компонент 18,35 является, видимо, водорастворимым белком хлоропластов ( ъуь'ие-ьоп , 1962). В отсутствие ионов Ме2+ компонент 67,об из хлоропластов сьепороакдт а1Ьиш диссоциировал на два меньшее компонента с коэффициентами седиментации 30,4э и 48,78 . Образование субъединиц в отсутствие ионов Мг2+ в среде, как известно, типично для рибосом.

Полученные данные свидетельствовали о тон, что в хлоропласта! СЬваорой1иа л1ъив» и сиvi а п!п1а1а нами обнаружены рибосома (Ми-

кульска и др., 1962; Mikulska et al. , 1962). Величина коэффициентов седиментации мономеров рибосом и шс субъедающ указывала на то,, что они являются, частицами типа 70 s. Позднее ( Odinteova e-t al. , 1964) нами были выделены рибосомы из хлоропластов нескольких видов высших растений. Во всех случаях при.аналитическом ультрацентрифугировании в присутствии 1(УШ Mg2+ препараты рибосом хлоропластов давали один основной пик с коэффициентом седиментации около 70.3. В среде без магния рибосомы хлоропластов диссоциировали на субъедшш-;. ды, тшшчше для рибосом бактериального типа.1 Диссоциация носила .обратимый характер и при добавлении ионов Mg2+ к среде (10~2М) моя-йо было наблюдать реассошацшо рибосомню: частиц.

Впервые проведенные наш сравнительные исследования нухлеотид-ного состава рРНК хлоропластов и Цитоплазмы показали, что РНК рибосом хлоропластов относятся к так называемому ГЦ-типу (коэффициент специфичности 1,15-1,21). Нуклеотиднкй состав рРШС хлоропластов разных видов растений близок п незначительно отличается от нуклеотид-' ного состава цитоолазматической рРНК ( Odintsova et al. ,, 1964). Более поздние исследования { Hanson a. Stutz , 1969; lîoesi a. Gualer-ai , 1970), проведенные на препаратах рРНК, выделенных из тщательно очищенных клеточных органелл, уточнив наши данные и показали, что -. незначительные различия в нуклеотидпом составе рРНК хлоропластов и цитоплазмы достоверны. -

Уде первые работы по изучению свойств рибосом хлоропластов показали,, что они существенно отличаются от рибосом цитоплазмы и обладают радом свойствсближадщих их с рибосомами бактерий.

. V .

УСТАНОВЛЕНИЕ ТИПА РИБОСОМНЫХ ЧАСТИЦ, ЛОКАЛИЗОВАННЫХ

В ХЛ0Р01ЩСТАХ *

« ■> <

^ Нами было предпринято специальное исследование для установления типа рибосомных частиц, локализованных в хлоропластах (Одинцова и др., 1967). Работа била начата с изучения типа рибосомных частиц, обнаруживаемых в гомогенате листьев фасоли'и проростков гороха.

, «

" f Обнаружение двух типов отбосом в листьях внсшск растений

Гомогенат зеленых листьев Дасоли. При центрифугировании в ана-V литической ультрацентрифуге годагената листьев фасоли всегда обнару-

живаются два основных пика рибосом с коэффициентам седиментации около 50-60 s и -60-70 s¿. Центрифугирование гомогената в присутствии' "метки" - рибосом Е. coli - показало, что больший по величине пик: рибосом соответствует 80s в то время как ыенышй пик - 70s -час-типам. Приблизительное соотношение компонентов варьирует от 1:2 до: 1:3. - Содержание рибосом в гомогенате зависит от возраста листьев, v В гомогенате 3-5-дневннх зеленых первичных листьев фасоли оно в несколько раз выше, чем в гомогенате двухнедельных листьев.

Гомогекат этиолированная; листьев фасоли.. При центрифуидювании в аналитической -ультрацентрифуге гомогената- этиолированных листьев обнаруживаются те же два типа рибосом (компоненты 50,6s и 60,4s ). Однако соотнесение 70s и 80S частиц в гомогенате этиолированных листьев сдвинуто в сторону 80s -частиц и составляет примерно от 1:4 . до 1:5., Обцее содержание рибосом в гомогенате этиолированных листьев выше, чем в гомогенате зеленых листьев того же возраста. Это связано, видимо, с:тем, что размеры клеток в этиолированных листьях меньше, чем в зеленых,и при одинаковых исходных навесках в случае этиолировавши листьев в опыт берется большее число клеток.-

Гомогенат зеленгес проростков гороха. При центрифугировании в аналитической ультрацентрифуге гомогената зеленик проростков гороха, также обнаруживаются два основных пика рибосом с коэффициентами седиментации 59,03 и 69,IS , которые соответствуют 70s и 80s -частицам. Отношение компонентов в гомогенате составляет 1:2 - 1:3. Таким образом, в гомогенате зеленых проростков гороха,-так.же как в гомогенате зеленых и этиолированных листьев фасоли, содержатся два типа. рибосом. '

Цитоплазма?отческие рибосом» листьев (Насоли к проростков урроха., При аналитическом ультрацентрийггаровании.препарата цитоилазматичес-. ких рибосом из листьев фасоли обнаруживается один основной пик мономера рибосом (69,6s ) и меньший по величине пик димера. (102,8s ), При-экстраполяции полученных в опыте значений коэффициентов седимен-. тации шггоплазштиче ских рибосом фасоли к нулевой концентрации была получена величина S|o w " 82,9 ед. Сведберга и таким образом было показано, что цитоплазматические рибосомы листьев фасоли относятся. к типу 80s-частиц..

Цитоплазматические рибосомы проростков гороха дают в аналити--ческой ультрацентрифуга сходную картину., На седаментацаонной дааг- ■

раыые обнаруживается один основной пик мономера рибосом (67,9s), который принадлежит к типу 80 s-частиц, )

Эти данные свидетельствуют о том, что основной рибосомнкй компонент , видимый на седииентационнкх диаграммах гомогената листьев фасоли и проростков гороха, имеет цвходлазматвческое происхождение.

Аналитическое ультрацентркфутпрование экстрактов пластид

• Экстракт хлоропластом гороха. Для того чтобы прямыми опытами доказать внутриклеточную локализацию 70è -компонента рибосом,, из проростков гороха бшш выделены хлоропласты. Из хлоропластов, раз-руаенных осмотическим шоком, экстрагировали рибосомы, и экстракт исследовали в аналитической ультрацентрпфуге.

а) Ненрог-отгне^хлоРогшастЫд. Экстракт непромытых хлоропластов содержит два типа рибосом с коэф.седиментации 50-603 и 60-70S , т.е. оба типа частиц, видимые на седиментационных диаграммах гомогената. Однако соотношение компонентов в экстракте хлоропластов отличается от гомогената и зависит от чистоты полученной фракции хлоропластов.. При выделении хлоропластов с двумя объемами среды в экстракте хлоропластов преобладает компонент с коэффициентом седиментации 50-60S , ■ который соответствует 70S -частицам.

б) Прогщт^е.рслодопластц^, Экстракт хлоропластов,. однократно промытых исходной средой, содержит практически один 70s -компонент ри- ■ босом.

.Экстракт хлоропластов и про пласт та йасоли. а) Неггрог.лггке^хлодо-пластыд. В экстракте непромытых хлоропластов фасоли также содержатся два типа рибосом. В отличие от экстракта непромытых хлоропластов гороха, в экстракте хлоропластов фасоли всегда преобладает 80s -компонент, хотя содержание 70S -компонента рибосом в экстракте хлоропластов увеличивается по сравнению с гомогенатом. Если приблизительное отношение 70S : 803 частиц в гомогенате двухнедельник зеленых листьев фасоли равно от 1:2 до 1:3, то в экстракте хлоропластов, выделенных из этих листьев, оно равно от 1:1,5 до 1:2;

6 ) Недромет ые_п£огапст:щы1. В экстракте непромытых пропластяд обнаруживаются те же рибосо:.зше компоненты, что и в экстракте хлоропластов. И в этом случае в экстракте преобладает компонент 80 s.

. в) Прю^итыв_хл0Ё01Эластн1, При однократной промывке хлоропластов ■, фасоли исходной средой в экстракте сохраняются (оба типа рибосом.

Экстракт триада промытых хлороплаотов содержит только 703 -компонент.

Таким образом, как следует из полученных нами данных, при выделении в одинаковых условиях'фракция хлоропластов фасоли содержат больше цитоплазматических примесей,чей фракция хлоропластов гороха.-

ДтаТгвереншальное центрифугирование экстракта'хлоропластов гороха; выделение ппбосом.. При дифференциальном центрифугировании ; экстракта. однократно промытых хлороплаотов гороха первый осадок : 105000 е содержит основной 70s -компонент, небольшую примесь пето--плазматических рибосом, белковый компонент и очень незначительные по величине пики димера исубьединиц. Пере о спадение осадка 105000g приводит к значительному снижению концентрации.рибосом. При этом видно, что содержание 70S -компонента понижается в.гораздо большей, степени, чем содержанке, цитоплазматических рибосом. Если суспенди-' ровать этот осадок:рибосом (второй осадок 105000 g) в О,ОШ фосфатном буфере (рН 7,5) - 0,0Ш HgClg , содержащем.О,дезоксихолата На ,.и исследовать суспензию в аналитической ультрацентркфуге, то на седиментацпонных диаграммах можно заметить появление гетерогенного пика продуктов деградации рибосом..Видно, что вприсутствии: дезоксихолата Иа компонент-80 s не разрушается. .

Дифференциальное центрифугирование экстракта хлоропластов Насоли. Выделение рибосом. Из. хлоропластов двухнедельных листьев фасоли получить препараты рибосом не удается. В этом случае в экстракте содержится очень незначительное количество рибосом, причем: преобладает компонент 80 s. При переосаждении рибосом в присутствии 0,5^-ного раствора дезоксихолата На сохраняется только 80 s-компонент цитоплазматических рибосом. Рибосомы нам удалось выделить из хлоропластов.3-5-дневных листьев. Как было сказано выше,.в этом, случае - экстракт трижды прошлых хлоропластов содержит : только 70 s-.компонент.

Результаты наших опытов по дифференциальному центрифугированию. экстрактов хлоропластов гороха и фасоли показывают, что рибосомы хлоропластов-значительно лабильнее цитоплазматических-рибосом : и легко разрушаются как в:процессе дифференциального центрифугирования, так* и при переосаждении ' рибосом в буферных растворах, - а~ также при очистке ' рибосом в присутствии ~ 0, 5^-ного ' раствора, дезоксихолата натрия..

ai- «*'•■' '

- 26 -

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РИБОСОМ ХЛОРОПЛАСТОВ ИЦИТОПЛАЗШ '

Злектронномккроскопическое изучение структуры и разметов

рибосом

Убедительным доказательством различия типов рибосомных частиц, локализованных в хлоропластах и цитоплазме, является измерение размеров этих частиц с помощью электронного микроскопа. К началу напей работы такого рода данные практически отсутствовали в литературе.

Нами бито проведено сравнительное электронномикроскопическое исследование цитоплазматнческих рибосом и рпбосом хлоропластов, выделенных из гороха(и фасоли (Одинцова и др., 1967; Bruokov а. Odintsova, 1963).

Цитоплазмагические рибосомы гороха и фасоли в использованных экспериментальных условиях имели характерную форму. Они выглядели, преимущественно, как немного вытянутые куполообразные частицы, т.е.: в направлемщ длины частицы рибосомы были плоские, с одной стороны,, и столообразные, с другой. Длина рибосомных частиц составляла * 260+10 5 для цитоплазматнческих рибосом гороха и фасоли, а пигрина соответственно 190+10 А и 200+10 X.

Рибосомы хлоропластов гороха и фасоли имели меньшие размеры, чем цитоплазматические. Длина частиц составляла 220+10 S для гороха ' и для фасоли, а ширина - 170+10 X. По форме хлоропластиые рибосомы в основном были1 аналогичны цитоплазматическим. Однако, в отличие от рибосом цитоплазмы, заметная часть рибосом хлоропластов имела борозду, подразделяющую рибосому на две неравные субъединицы.

Химический состав рибосом ( гглавтчая плотность рпбосом в градиенте СаС1)

Данные о плавучей плотности рибосом хлоропластов к началу нашей работы отсутствовали в. литературе. Между тем такого рода сведения представляли интерес с точки зрения эволюции рибосомгшх частиц, развития их структуры и функции, а также с точки зрения эволюции и происхождения клеточных органелл. Нами была изучена плавучая плотность в CsCl рибосом хлоропластов 2 видов высших и I вида низших растений ( Yuxina at Odintsova 1974), цитоплазматнческих рибосом

I вида-зеленых водорослей и 7 бедов высших растений, а также рибосом 2 видов фотосинтезируюиих бактерий и б видов синезеленых водорослей (Юрина и др., 1972). .

Большинство исследованных препаратов рибосом расиределялось в градиенте сзс! в виде одного гомогенного пика. В табл; 2 приведена плавучая плотность в сес1 исследованных вами рибосом ш данным: *, 2-5 независимых опытов.

Как видно, плавучая плотность бактериальных рибосом и рибосом' ' синезеленых водорослей, делящихся частицами 70 э-типа,, составляет 1,61-1,64 г/сл^ (отношение РНК/белок 1,52-1,86).. Для цитоплаздати-ческих рибосом зеленых водорослей и высших растений (80 э-частицы) характерна плавучая плотность 1,55-1,57 т/сиР (РНК/белок 1,00-1,13).

Известно, , что в процессе эволюции происходит увеличение размера рибосомних частиц: возрастают коэффициенты седиментации компонентов рибосомальной РНК,, увеличивается число белков в рибосомной частице, Данные, представленный в табл. 2, свидетельствуют о том, что относительное содержание белка в рибосомах также не остается посто-. янным и увеличивается в процессе. эволюции, В то времякак у бакте--рий и синезеленых водорослей отношение РНК/белок составляет в среднем около 1,7, у грибов оно уменьшается до 1,2, а у зеленых водорос- . лей, высших*растений! и животных это отношение близко к.1,0. '

Профили изоплотностной.седиментации хлоропластных рибосом показывают, что. 70 5 рибосома хлоропластов гомогенны по плотности и имеет плавучую плотность 1,57-1,58 г/см3.

На величины СзС1 рибосом мы рассчитали, что рибосомы хлоро--пластов содержат 47,0-45белка, а цктоплазматические рибосомы тех же видов растений.содержат 50,2-49,0$ белка. Зги данные совпадают с результатами химического анализа рибосом*. Таким образом, по относи-.тельному содержанию белка 70 э рибосомы хлоропластов сравнительно мало отличаются от 80 г рибосом цитоплазмы (табл. 3). В то же время рибосомы хлоропластов-и рибосомы прокариотов, близкие по ряду физико-химических и функциональных свойств, значительно различаются по относительному содержанию белка.. В табл. 3 приведены средние значения, плавучей плотности рибосом хлоропластов исследованных.видов растений, а.также литературные данные о плавучей плотности рибосом клеточных органедл,. Для сравнения.в таблицу, включены значения плавучей плотности цитоплазматических рибосом тех же организмов...

^ j '' Tüdüuma 2,

Haasy^EH raotHOCTt b CeCl ÖauTepaajiifBcc s pawjrtanSEur paöocoii, $¡nccnpOK

. $opKasiieriUio«

l OöiiKT icwiesoroKM f CsCl EejiOK, % PHK/öMOK Jteejarjpa ¡

I ■aKTenra

I Escherichia coli 1,63^0,005 35,1 1,85 IfczHa x jp., 1972 |

1 Ehedopseuíoinonaa gelatinosa ^ 1,62^0,007 37,9 1,64 '

: Chromatiuni vinosun j.eie^.oot' t.39,0 1,56 | r . |

Cumswiemre nojKroocjra .

' Anacyetle nldulons 1,615+0,007 39,2 1,65

. Bynechoojatis aquatIiis 1,612+0,002 39,7 1,62 . i .!

) lyngbya ep. 1,622+0,006 . 38,0 , 1.63

1 An&beeixa varlabills 1,634^,004 36,0 • 1,78 ■ ; i

' Plectonema boryenum 1,618+0,015- 30,7 1,58

• Splrullna ep. ' 1,640 35,0 1,86 ^ i

¡Tprciu

' Diotyosteliua diseoideura 1,58 45.0 _ • 1,22 T Cecearlni a, Kagglo, '

1968 1

Í Dietyostellnm purpureum 1,66 45,0 * 1,22

3wiesfKe BO^OJIOOT; * |

i * ■ 1 Chlorella pyrenoidoaa (H2TÖ- 1,657 49,0 1.01 jípnna SE 1972 l

> njia3Ma)

Bitcnae pacTemiÄ

1 Equlsetun pratense 1,667+0,0)2 47,1 1,12 ■ a

: Triticma vulgare 1,55^0,003 49,5 1,02 » l

• Zea naya I,553+0,C03 49,5 1,02 l

t AntirrMnum cajua I,568+P,C02 47,0 i 1,13 jn^ ■

1 Hicotlana tatacwi ' . 1,553+0,002 49,5 ! 1,02 ■ 1

' Fhaseolus vulgaris .1,663 43,0 ; 1,08 —1

Таблица 3.

1Плавучие плотности в ceci фиксированных формальдегидом рибосом клеточных органелл (т/см3)

Объекты . исследования

'Хлоро- 1'Мато- I Цсто- I пласты I хондркя | хиазма I

Литература

Раст-ения

кл. Plage11ata EugjLena gracilia

КЛ. Chlorophyoeae Chlorella pyrenoldosa

КЛ. Aacomycetee Candida utilis

кл* Dlco tyledone ae Chenopodium album

Pleum èativum

PIsum sativum

КЛ. Cillata

1,570 1.557

1,53х

1,568 f 1,550

1,555— ±0,003 1,576 1,527± ¿0,002 1,549

Гуликова и др., 197.4

К|ина и др., .

Vignaia et al., 1972 :

Yurlna a. Odlnt-eova, 1974 Светайло и ФшшпА сович, 1957

ина л др.,

Нивотные

1 Те'ЬХ'а11угаепа руг1?оип1а 1,46 ' 1,56 Chl a. Suyama, 1970

1 кл. КаттаНа

1 Печень быка Î.40 1,54 O'Brien, 1972

{Печень крысы ■ 1,45 1,569 Sacchl et al., 1973 '

Фиксированы глутаровым альдегидом.

Зная относительное содержшше РНК в рибосомах, можно рассчитать массу белка в рибосомной частице. Таким путем несложно показать, что масса белка в рибосомах хлоропластов на 0,5 млн.дальтон больше, чем в рибосомах прокариоткческлх клеток. Сумма молекулярных весов компонентов рРНК и массы белка, дает представление о массе ри-босомных частиц. Используя значения 1,07-1,11x10^ я 0,56x10е в качестве молекулярных весов большого и малого компонентов рибосомальной.

РНК хлоропластов ( ЬоеШпе ,1968), ш подсчитали, что 70 з рибосома хлоропластов имеют массу 3,0-3,1x10® далвтон.к,^отя эти расчеты приблизительны, они указывают, на.то,-что масса рибосом хлоропластов существенно меньше, чем шсса цптоцлазкатическпх рибосом (4,0x106 дальтон, компоненты рРНК 1,3x10е и 0,7хЮ6) и несколько больше, чем масса рибосом прокариотов (2,5х106 дальтон, компоненты рРНК1{ 07x10е и 0,56x1^).. Эти выводы хорошо согласуются с электронномикроскопичес-кши данными о размерах этих рибосом (табл.. 4).

Таблица 4. г

Размеры рибосом некоторых видов бактерий.п растений ( Вгивкоу а. О<ИггЬеоуа , 1968; Корина И др., 1972;

Юрина и Одинцова, 1974)

Псточншс рибосом

Длина частиц^. Ширина частиц

200 170

214 + 6 185 + 6

218 +10 150 + 10

220 ¿10 158 + 10

220 + 10 170 + 10

220 ¿10 170 + 10

260 + 10 190 + 10

260 ¿10 200 ¿;10

й1

-1 1

)

* I I

Escherichia coll

I Chromatiun vinosuas -lAnacyetia nidulans IAnabaena variabilis

i Рибосомы хлоропластов

I Pieum sativum

I Phoseolus vulgaris I

I Рибосомы цитоплазмы.

t Pisum eativun J Phase«lua vulgaris

. Тот факт,, что рибосом! хлоропластов о массой 3,0-3,1хЮ6 дальтон седиментируют о той же скоростью, что и рибосомы прокариотов U.sxid6 дальтон) не является удивительным, так как зависимость.скорости седиментации частиц ( s|0 w ) от их кассы различна для рибосом разного происхождения ( Saccbi et al. ,1973), Это может указывать, на то, что рибосомы хлоропластов и прокариотов значительно различаются до своим гидродинамическим свойствам.. Рибосомы хлоропластов могут характеризоваться менее компактной структурой частзд (более рцх-

^Расчеты проводились для рибосом хлоропластов и цитоплазмы chlorella pyrenoidoaa И Plaua sativum , а также рибосом Escherichia coll* - '

лой упаковкой РНП-тяжа) и/или большей гидраткрованностью частиц по сравнению с рибосомами прокариотов.

■Различия в относительном содержании белка между рибосомами хло-ропластов и" рибосомами прокариотов могут быть связаны как с различиями в молекулярном весе рибосомалыщх белков хлоропластов и прокариотов, так и с различиями , в числе индивидуальных белков. Результаты-исследовшшя белков рибосом пластид о помощью двумерного электрофореза в полиакршшшдном геле (ПААГ; см.низе) свидетельствуют о том, что рибосомы хлоропластов высших растений Чпо KpaäiHefl мере пшеницы и гороха) содержат значительно больше белков, чем рибосомы клеток прокариотов. Средний молекулярный вео белков рибосом хлоропластов указанных видов растений не известен. Если принять, что он равен 23 400 (средневесовой молекулярный вео рибосомальных белков хлоропластов Euslena -gracilis ) ( Preyssinet а. Schiff , 1974), ТО разница в 0,5 млн*дальтон будет соответствовать примерно-22 белкам. Это довольно хорошо согласуется с экспериментально найденными различиями в числе белков между рибосомами хлоропластов и рибосомами исследованных видов прокариотов.

Рибосомальнке белки. Так как рибосомы хлоропластов по ряду свойств сходны с рибосомами прокариотического типа, большой интерес представлял вопрос о составе белков рибосом хлоропластов в сравнении о белками цитоплазматических рибосом и рибосом прокариотического типа. ^ -

Лиск-электтюДювез в ПААГ. Методом диск-электрофореза в подзак-рллакидаом геле нами были изучены белки рибосом хлоропластов гороха, клеток Б. coli , а также цитоплазматических рибосом зеленых и этиолированиям листьев фасоли и проростков гороха (Одинцова и Крина, 1969).

При сравнительном исследовании основных белков рибосом хлоро-.пластов и цитоплазмы гороха были обнаружены значительные различия.

Если все белковые фракции, обнаруживаемые при электрофорезе, условно разделить на три группы - медленно двигающиеся белки (I), -белки со средней электрофоретической _ подвижностью (П) и наиболее подвижные белки (Ш), то в препарате белка цитоплазматических рибосом гороха группа I состоит из 10 полос, Л - из 13 к Ш - из 2 полос. В препарате белка рибосом хлоропластов гороха фракция медленно двигающихся белков состоит из 13 полос, белков со средней электрофоретической подвижностью - ез 9 и фракция наиболее подвижных белков отсутствует.

Заметны различия в интенсивности окраски белковых полос в пределах -отдельных групп. - Интересно, - что типичные для цитоплазматических рибосом высших растений Х-полосы отсутствуют в белках рибосом хлоропластов. . Белки рибосом хлоропластов значительно отличается также от белков рибосом Б. coli по числу, распределению и интенсивности окраски полос.

Различия в белковом составе рибосом хлоропластов и цитоплазма и цитоплазматических рибосом растений разных видов подтверждают имеющиеся в литературе данные о специфичности белкового состава рибосом. !

ДвуттерниЛ электрофорез в ПААГ. Исследование методом двумерного электрофореза в ПААГ белков рибосом хлоропластов и цитоплазмы проростков гороха (Юрнна и Одинцова, 19746) подтвердило, что 70s рибо-■ м сомы хлоропластов (и 80 s рибосома цитоплазмы содержат разные белки., Рибосомные частицы различаются как по числу,. так и по электрофорсти-ческой подвишгастп входящих в их состав белков. В цитоплазматических рибосомах проростков гороха.было обнаружено в среднем 80 белков..Из них:в первом направлении 64 белка двигались к катоду и 16 к аноду.

В рибосомах, хлоропластов гороха при двумерном разделении, бил обнаружен. 71 белок. В первом направлении 49 белков двигались к катоду и 22 - к аноду,-Следует отметить,-что возмогло не все белки, обнаруженные на двумерной электрофореграмме, являются белками рибосом. Среди них могут присутствовать также агрегаты рибосомалъных: белков и. нерибосомалыще белки. На основании нескольких опытов о различными препаратами рибосом была составлена суммарная схема распределения белков рибосом'проростков гороха при двумерном электрофорезе в ПААГ, -представленная на рис. 4а,б. Хотя распределение белковых, пятен на электрофореграшах 70з и 80s рибосом проростков гороха обнаруживает мало сходства, не исключено, однако, что оба типа рибосом имеют наряду с этим несколько белков с близким молекулярным весом и - одинаковым ' зарядом. Так, пять белков, , три из которых при делении в первом направлении двигаются к аноду п два - к катоду, занимают на электрофоре-граммах белков рибосом хлоропластов и цитоплазмы одинаковое положение. .

Результаты исследования химического состава и белков рибосом хлоропластов высших растений:свидетельствуют о том, что рибосомы, пластид не имеют.всех черт, сходства с рибосомами прокариотического типа я отличаются от них, по крайней мере, .по относительному содер-

Рис. 4. Распределение белков рибосом цитоплазмы (а) и хлоропластов (б) проростков гороха, а тапзе . рибосом АпасувМа п1аиД.впа (в) и йичипа^ит у!поешп (г) прп двумерном электрофорезе в ПЛАТ.

жанию белка и числу белков в рибосомной частице. Таким образом, гомология меаду рибосомами пластид и рибосомата клеток прокариотов, по-видимому» носит' более ограниченный характер, чем это предполагалось ранее. г

Одной из характерных особенностей клеточных белков основного характера (основных белков) является их способность коштексироватъ-ся с. нуклеиновыми кислотами. В этой .связи большой интерес представляет сравнительное изучение основных белков рибосом.и гистонов..

Нами было проведено сравнение этих-белков, выделенных из зародышей пшеницы, по аминокислотному составу, методом даск-электрофоре--за в ПААГ (Аракелян и др.,. 1972), а ,также методом пептидных карт (Аракелян и др., 1974)., В последней случае анализу подвергали фракции Н1 гистонов и подобную ей. по методу получения фракцию основных белков рибосом..

При электрофорезе в ПААГ-суммарных препаратов основных белков рибосом и.гистонов было обнаружено, что эти белки характеризуются разной степенью гетерогенности.- При этом.зона распределения гистонов не выходит за'пределы-зоны распределения основных белков рибосом.:

Пептидные карты триптического гидролпзата белков Фракции.Н1 гистонов и;подобной ей фракции белков рибосом обнаруживают значительное сходство. Общее число обнаруживаемых пептидов очень близко (35 во фракции Н1 гистонов и 36 во фракции белков рибосом). Положение пептидов, соответствующее их подвизшости в исследованной системе, также очень, сходно в гидролизатах обоих изученных белков.. Осо--бенно большое сходство наблюдается среди нейтральных пептидов и полочных, пептидов, обладающих низкой хроматографдческой подвижностью. , Большое число пептидов в исследованных;препаратах занимает одинако-' вое положение на пелтщшшс картах.

Обнаруженное нами впервые сходство пептидных карт гистонов Ш и подобной им фракции основных белков рибосом представляет большой интерес. Оно свидетельствует о значительной гомологии в первичной структуре этих-белков.

Таким образом, полученные нгши данные указывают на наличие в составе цитошхазматических рибосом сходных о гистонами белков. Возможно,-что эти белки участдуют в образовании полисом (в присоединении мРНК к рибосомам) и/или обеспечивают структурную организацию рибосом, подобно тому как гистонн участвуют в;организации структуры хромосом..По-видимому; в-эукариотичоской клетке существует универсальный механизм белково-нуклеинового взаимодействия.

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РИБОСОМ ХЛОРОПЛАСТОВ И ФОТОСИНГЕЭИЕУИЩК ПРОКАРИОТОВ В СВЯЗИ С ЭВОЛЮЦИЕЙ ПЛАСТИД '

последние годы в литературе широко обсуждается вопрос о про-исхоздении клеточных органоидов."'

Известны цитологические данные, свидетельствукщпе о сходстве в строении клеток синезеленых водорослей и хлоропластов, на основании 'которых в начале XX века русскими учеными К.Мережковским ( Mere echkowslcy , 1905) И А.Фаминциным ( Faraiatzin , 1907) б1Ш ВВДВИ-нута гипотеза о симбиотическом происхождении пластид. Согласно этой гипотезе хлоропласты произошли от свободаоживущих фотоспнтезируыдшс прокариотов (древних форм Cyanophyta и бактерий), ливших в качестве эндосимбионтов в цитоплазме гетеротрофных протоэукариотлческих клеток, с которыми филогенетически они не были связаны.

• Одним из возможных путей установления эвояадкиргаго родства хлоропластов с фотосинтезирулцимк прокариотами может быть сравнительное исследование их рибосом, в.частности, рибосомальних белков, состав и свойства которых являются таксономическим признаком.

' В втой связи казалось интересным провести сравнительное исследование рибосом фотосинтезирующих бактерий, синезеленых водорослей и хлоропластов низших и высших растений, т.е. фотосинтезиругпш: организмов, находящихся на разных уровнях развития фотосинтезирухщего аппарата. , ■

Рибосомы Фотосинтезпрущих бактерий

*■ Г

Фотосинтезирующие бактерии являются наиболее примитивными из

ныне живущих фотоскнтезируших форм. Это древняя группа микроорганизмов с примитивным типом фотосинтеза, фотосинтетический аппарат которых представлен относительно простой ламеллярной системой.

Нами были изучены рибосомы двух видов пурпурных бактерий: гаю-dopaeudomonaa gelatinosa (сем. Athiorhodaceae ) и Chromatlum vlnoeum (ceu. Thiorhodaceae ) (Юрина и др., 1972). Рибосомы обоих видов фотосинтезирухщих бактерий шелл типичный для рибосом спектр - поглощения в УФ-свете» Egeo^SO 1«86 и I*93i ^^акс^шн 1>40 и

1,77 соответственно для Rps.gelatinosa и Ch.vinosum . По данным аналитического ультрацентрифугирования препараты содержали преимущественно мономеры рибосом. Экстраполяцией полученных в опыте значений коэффициентов седиментации мономеров рибосом к нулевой концентрации были получены величины s^ и : для Hps. Gelatinosa 69,0 и для Ch. vinosum 70,2 ед.Сведберга'. Таким образом, по величине константы седиментации рибосомы обоих видов фотосЕнтезирупщгс бактерий является типичными бактериальными рибосомами.

По данным химического анализа рибосомы Upa.gelatinosa и Ch.vinosum содержат соответственно 59 л 55# РНК, 41 и 45% бедка (РНК/белок 1,44 и 1,22).

При диск-электрофорезе в ШГ белки рибосом Ррз.еа latinos а и Cb.vinoaura делятся на 28-30 поло о, картина распределения которых воспроизводится от опыта к опыту и в разных препаратах рибосом. В белках рибосом Rps.gelatinosa к Ch.vinosum обнаружено 8-9 компонентов, которые при рН 8,3 ведут себя как полианионы. ■

Электрофоретическиэ профили белков очень сходны у обоих видов фотосинтезирущих ¿актерий. Особенно, хорошо это видно по распределению интенсивно окрашенных полос. Наблюдаемые различия касаются 6-7 минорных компонентов, расположенных в верхней части колонки. Сравнение при помощи диск-электрофореза основных белков рибосом фото синтезирующих бактерий и хлоропластов не позволяет обнаружить сходства между ними (рис. 5). Значительные различия наблщахгсся также в "кислых" белках.

Более детальное исследование белков рибосом фотосинтезирущих бактерий (Юрина и др., 1975) и хлоропластов (Юрина и Одинцова, 1974) при помощи двумерного электрофореза в ПАЛГ подтвердило отсутствие филогенетической связи между фотосидоезирувдими бактериями и хлоро-шастами.

V В рибосомах ch. vinosum нами обнаружено 56 белков (25 пятен интенсивно и 31 менее интенсивно или слабоокрашенное). Группа кислых при рН 8,6 белков содержала 16 белков. К катоду двигалось 40 белков (рис.. 4г).

Таким образом, по общему числу белков рибосомы этого вида фото1- ' синтезирующих бактерий сходны ¿ рибосомами других изученных, прокариотов.

Л/

' 'Л. ■ :

а Б £ г . Ъ е [

1 ■*■

Рио. 5. Распределение основных белков рибосом Anacystia ntdulana (a) , хлоропластов ?iaun sativum (ö) , Chenopodlum album (в), Chlorella pyrenoidoва (г), а также рибосом АпаЪаепа variabilis (д) и Chromatiuta vinosum (е) при электрофорезе в ПААГ (схема).

Рибосомы синезелетгнх водопослей

Синезеленые водоросли.по организации фотосинтезирудаего аппарата заншсшт промглуточлое положение мегду фото синт е зирукдшп бактериями л высшими растениями. Они не имеют морфологически1 оформдетшцх пластид. Элементарной фотоскнтезирувдей структурой свнезеленых водорослей и хлоропластов является тилакоид.

Как видно из табл. 2, по химдческогду составу (содержали» РНК и белка) рибосомы изученных видов сине зеленых водорослей обнаруживают сходство с рибосомами бактерий. По размеру частиц рибосомы синезеле-ных водорослей также близки к рибосомам бактериального типа (Одинцова и др., 1967;.Крика и др., 1972). Экстраполяцией полученных в опыте значений коэффициентов седиментации мономеров рибосом к. нулевой концентрации были получены следующие величины w для Anaoyetia

п1£и1апз - 68,5; ЙупесЬосузМа ациа*11±а - 70,8; ЬупеЪуа ар, — 73,3; АпаЪаепа уаг!аМ11з - 68,5 ед.Сведберга.

При диск-электрофорезе в ПАЛГ белкд рибосом исследованных видов синезеленых водорослей делились на 24-27 полос. Оказалось, что распределение белковых полос у двух представителей класса хроококковых (одноклеточных) водорослей - Апасуз*1в п±йи1апз и ЕупесЬосуа-Ыа а^иа*Шв- - сходно по числу белковых компонентов,,обнаруживаемых при электрофорезе - и характеризуется наличием нескольких полос с одинаковой злектрофоретической подвижностью. Распределение белковых' компонентов у представителей класса гормогониевых (многоклеточных)

ВОДОрОСЯеЙ- ЬупеЬуа йр.» АпаЪаепа уаг1аЪЛ,11э И МееМонета Ьогуа-пш - обнаруживает заметное сходство. Более блжзкие виды: АпаЪаепа. и Песгопеяа обнаруживают наибольшее сходство ркбосомалышх белков (12 общих белковш: компонентов; 46&-ное сходство ). Довольно значительные различия в злектрофоретической подвижности, белков рибосом одноклеточных синезеленых водорослей возможно отражают неясное, систематическое положение Апасуе^ п!йи1шгэ , в то же время,сходное распределение белков рибосом многоклеточных синезеленых.водорослей согласуется с их систематикой..

Как по общему профилю распределения белковых компонентов при электрофорезе, так и по распределен;!» преобладающих компонентов между белками рибосом одноклеточных и многоклеточных синезеленых водорослей практически не наблвдается сходства. -

Как бшо указано ранее, распределение основнезс белков рибосом хлоропластов при диск-электрофор е з о в ПЛАТ не обнаруживает сходства с распределением основных белков рибосом изученных.видов фогосинте- . зирувдих.бактерий по профилю и количественному соотношению преобладающих и минорных компонентов.

Профили распределения белков рибосом хлоропластов при даск-эДектрофорезс также значительно отличаются от профилей распределе1шя. белков рибосом синезеленых водорослей, несмотря'на то, что в та имеется, в среднем, окало 6 компонентов с одинаковой злектрофоретической подоижностыо.

"Эяектрофоретическое сходство" между двумя препаратами - процентное отношение между числом полос с одинаковой злектрофоретической подвижностью и общим.числом полос в этих препаратах, - обнаруживаемых при.электрофорезе. ,

Среди изученных бедов скнезеденых водорослей наибольшее сходство с белками рибосом хлоропластов (по распределению, интенсивности окраски белковых полоо ц:числу компонентов о:одинаковой электрофоре-тической подвижностью) было.обнаружено у одноклеточной водоросли Anaoyatie nidulana. (рис. 5). В атом случае около 1/3 белковых полос совпадают по электрофоретической подвижности..Поскольку большей разрешающей способностью обладает метод двумерного электрофореза в ПЛАТ, доя выявления сходства между белками рибосом Anaсуstie nidu- ' Ions и белками рибосом хлоропластов бил использован указанный метод (рис. 4в). При двумерном разделении в ПАЛГ.в рибосомах A. nidu-l*ano обнаружен 51 белок (20 пятен интенсивно и 31 менее интенсивно , или слабоскраиенное). Группа кислых при рн 8,6 белков содержала 10 белков. К катоду двигался 41 белок. Таким образом, по общему числу белков рибосомы синезеленой водоросли Anacystis nidulana сходны с рибосомами других изученных прокариотов. Как было отмечено выше,,в рибосомах хлоропластов (гороха) при электрофорезе в аналогичных условиях обнаружен 71 белок, из которых 49 белков двигались к катоду и 22 белка - к аноду. На злектрофореграммах белков этих типов рибосом, обнаруживается 4 высокомолекулярных совпадающих по положению белка (рис. 46,в, стрелки), которые, следовательно, близки по заряжу и молекулярному весу. В то же время распределение белков рибосом ¿ото-синтезирукких бактерий (рис. 46,г) и рибосом хлоропластов на двумерных злектрофореграммах не обнаруживает сходства.

Таким образом, подученные нами данные о составе белков рибосом' хлоропластов, фотосинтезирувдих бактерий и синезеленых водорослей. не свидетельствуют о прямой филогенетической связи хлоропластов с фотосинтезирушимз.бактериями.и не отрицают возможной эволюционной связи пластид с синезелеными водорослями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Геном эукаркотической клетки состоит из ядерной ДНК и небольшой в количественном:откошении, однако,.важной для функционирования клетки, фракции ВЕС, локализованной в пластидах и митохондриях. Геномы, хлоропластов и митохондрий невелики. Молекулярный вес ДНК клеточных органоидов варьирует от 10 кегадальтон в митохондриях многоклеточных животных .до. SO мегададьтон в хлоропластах высших растений..

■ 11з трлшетного характера кода и предположения, что только один тяж ДНК является генетически значимым, следует,. что митохондркаль-ный геном может кодировать полииентиды, суммарная длина которых не превышает 5300 аминокислотных остатков, а геном хлоропластов высших, растений может кодировать полипептиды, суммарная длина которых составляет около 4ВОО0 аминокислотных остатков. Фактически кодиругацие возможности геномов клеточных органелл меньше, так как часть продуктов их транскрипции является нетранслируемой. Наличие повторяющихся . последовательностей также несколько сникает информационную емкость .геномов клеточных органелл. В результате, ориентировочно, ДИК митохондрий может колдовать около 35 полипептидов по 100 аминокислот >в' каждом, а ДНК хлоропластов - около 300 полипептидов такого же размера. Это существенно.меньше, чем информационная емкость генома бактериальной клетки, который может кодировать несколько тысяч белков. Ограниченность кодирующего потенциала внеядерной ДНК указывает на то,,что вклад этой ЛНК в биогенез клеточных органелл не может быть велик. 1 . I

В настоящее время можно считать доказанным, что ДНК хлоропластов и митохондрий высших растений и митохондрий многоклеточных животных обладает кольцевым строением, при этом мптохондриальная ДНК (мтДНК) животных клеток характеризуется удивительным постоянством размеров 5 мкм). Контурная длина ДНК хлоропластов (хцДНК) изученных видов высших растений, составляя в среднем около 40 мкм» варьирует в небольших пределах (Одинцова, 1976; Гаузе, 1977).

ДНК клеточных органелл представляет собой двутяжевую структуру, спкрализованную в соответствии с моделью Уотсона-Крика. У подавляю-, пего большинства изученных организмов ДНК хлоропластов и митохондрий относится к ЛТ-тгату. Содержание пар Г+Ц в хцДНК высших растений довольно близко и составляет 37-38^.

^ Данные о первичной структуре ДНК хлоропластов и митохондрий носят весьма ограниченный характер и позволяют судить лишь об общих чертах организации нуклеотидных последовательностей во внеядерной ДНК. Одной из таких черт является наличие в ней повторяющихся нуклеотидных последовательностей ( ВеаЪгоок а. Вогогай , 1976;; НоЬот е-Ь а1..' 1977). Другой характерной чертой первичной структуры внеядер-нойДНК'является ее внутримолекулярная гетерогенность по нуклеотид-ному составу (Ко1ойпе?-а. -теяаг! , 1975). Обе черты характерны так-

же.и для ядерного генома эукариотических клеток.

Картирование генов внеядерных; ДНК, начатое в последнее время, свидетельствует *о том, что в их генной организации имеется сходство. Та», два гена, кодирующие РНК большой и малой субъединиц рибосом, находятся в непосредственной близости друг к другу, а гены, кодирующие синтез тРНК, "рассеяны" по всему геному. , "

* Примечательно, что информационная организация хлородластной . ДНК разного происхождения также, по-видимому, сходна. Все изученные хоДОС кодируют синтез двух компонентов.рРНК хлоропластных рибосом, более.20 тРНК, а также ряда мРНК, участвующих в синтезе большой субьедиюцщ рибужозодифосфаткарбоксилазн, нескольких полипептидов, входящих в состав мембран-хлоропластов, в также*единичных белков рибосом хлоропластов ( Kung , 1977). Сходная информационная организация обнаруживается и.в митохондриальной ДНК. Различные мтДНК кодируют синтез двух компонентов рРНК.митохондриальных рибосом, около' 20 тРНК и 8-10 мРНК, необходимых для синтеза митохондриальных полипептидов, входящих в состав» цитохромоксидазы, сшо'омицинчувотвитель-Hoi АТФазы и цитохрома в (Одинцова, 1976; Паузе, 1977).

' Внеядерная ДНК локализована, в матриксе клеточных органелл и • связана с их мембранной системой (Одинцова и др., 1970). Возможно, что прикрепление к мембране существенно дня регуляции репликации и/или сегрегации Геномов клеточных органелл. До недавнего времени считали, что внеядерная ДНК в отличие от ДНК хромосом эукариотических клеток, находится в органеллах^.в "свободном" виде и не связана с белками типа гистонов. Обнаружение в митохондриях Phyearum poly-cepbalua. аргинин-богатых гистонов ставит под сомнение такое утверждение ( Kurolwa-et al. ,/1976).

' Наряду с собственным геномом клеточные органеллы содержат также все необходимое для экспрессии локализованных_в них генов. В них обнаружены РНК-пошимераза, рибосомы (и полисомы), мРНК, тРНК, амино-nmyt-тРНК-синтстазы. *а также факторы инициации, элонгации и термина-ции ( Parthier et. al. , 1975). .

Наличие рибосом в хлоропласт ах было доказано в 1962 г., когда впервые рибосомы были обнаружены нами на срезах хлоропластов (Микуль-ска и др., 1962), а затем выделены из хлоропластов нескольких видов высших растений (МикУдьска и др., 1962; Сисакян и др., 1962; Lyttle-ton , 1962). Значительные различия в коэффициентах седиментации ри-

босом хлоропластов и цитоплазмы (70s и 80s соответственно), наряду о результатами.прямого измерения размеров частиц свидетельствовали, о том, что рибосомы хлоропластов не идентичны рибосомам цитоплазмы соответствующих клеток (Одинцова и др., 1967). В то время как рибосомы хлоропластов всех изученных, видов растений имеют коэффициент седиментации 70S , рибосомы митохондрий характеризуются большим разнообразием коэффициентов седиментации: от 55-60S в клетках многоклеточных животных до 80s в клетках: инфузорий. (Одинцова.и.Крина,. ,1977). *

Рибосомы клеточных органелл состоят из двух неравных субъединиц и морфологически сходны с рибосомами из других источников (Одинцова и др., 1967; Брусков и др,, 1969). По своим свойствам они существенно отличаются от"рибосом цитоплазмы (Одинцова и Крина,. 1976, 1977), '

В то же время ряд;структурных и функциональных свойств рибосом, клеточных органелл сходны с таковыми рибосом бактериального типа.. * Рибосомы хлороплаЬтов не отличаются от рибосом прокариотическо^о типа, по величине мономеров, субъединиц и компонентов рРНК.,Оба типа частиц не содержат 5,83 рРНК. Условия диссоциации рибосом хлоропластов на субъединицы такие жё,,как для рибосом бактерий..По первичной структуре малый компонент рРНК хлоропластов является РНК типично прокариотического типа ( Borten a.Doolittle ,. 1975; Zahlen et al.., 1975).Также как 16S рРНК прокариотов малый компонент рРНК хлоропластов подвергается пост-транскрипционной модификации ( Buetow et al. , 1977). Характер синтеза рРНК в х^оропластах напоминает, этот процесс у црокариотических организмов. Из субъедшшц рибосом Е,. coli и хлоропластов мохут:быть подучены гибридные рибосомы,, которые сохраняют биологическую активность в системе in vitro . Кроме того,.рибосомы хлоропластов требуют для синтеза белка факторов . трансляции бактериального.типа, белковый синтез на них подавляется ингибиторами синтеза.белка на бактериальных рибосомах, инициация полипептидов осуществляется с формилметионпл-тРНК,. как у прокариотов,, и т.д.

Митохондриалыше рибосомы, подобно рибосомам пластид, также обнаруживают ряд черт сходства'о рибосомами бактерий ( Boret , 1972), Однако, собственные экспериментальные.данные и анализ данных,. ' опубликованных. в литературе, свидетельствуют о том, что гомология

между рибосомами клеточных органелл и рибосомами прокариотических клеток носит более ограниченный характер, чем .это предполагалось ранее. ''

Так, 3*-к6нцевая последовательность нуклеотидов в I6S рРНК хлоропластов не имеет сходства с таковой прокариотов (Одинцова и Юрипа, 1977). По данным химического и плотностного анализов рибосомы "хлоропластов разных видов растений содержат 45-53^ белка (отношение РЩ/белок >1,13-1,20) (Юрина и др., 1972;^1уллкова и др., I 1974; Одинцова и Юрина, 1975). Это существенно выше, чем относитель- ; ыое содержание белка в рибосомах прокарыотического типа и незначи--тельно отличается от относительного содержания белка в цитоплазма- , тических (80 S) рибосомах. Рибосомы хлоропластов не дают реакции преципитации с антисыворотхой uporjpj рибо'сомальных белков или целых • рибосом бактерий ( Wi-ttmann , I972; cualerzi et al. , 1974)., Наконец',. рибосомы хлоропластов, по крайней мере высших растений, содержат существенно больше белков, чем.рибосомы прокариотических клеток ОЦрша и Одинцова, 1974). ,

Рибосомы митохондрий (преимущественно животных клеток) отличаются от рибосом бактерий по коэффициентам седиментации рибосоминх частицних субъединиц, молекулярному весу компонентов рРНК, по первичной структуре 3»-конца малого компонента рРНК, отсутствию'53-кбмпонента рРНК, низкому относительному'содержанию РНК, по числу и основности белков, входящих в рибооомную частицу, а также по иммунологическим свойствам рибосонфльных.белков. .

Таким образом, рибосомы клеточных органелл нельзя без оговорок отнести к рибосомам прокариотического типа. Более того, , они имеют некоторые черты сходства с эукариотпческиш рибосомами. Показано, например, что эметин, ингибитор трансляции на цпто плазматических (80 S) рибосомах, подавляет также биологическую активность изолированных штохондриальных рибосом. Рицин ингибирует на уровне рибосом цитоплазматический и митохондркальный синтез белка (по крайней мере у грибов) и не активен в прокариотической (Е. coll ) бесклеточпой системе. Обнаружено большое сходство в структуре 3*-конца малого компонента митохоцдриальной рРНК и рРНК цитоплазмы эукарпотических клеток. Выше говорилось о ток, что рибосомы хлоропластов близка к рибосошмэукариотического типа по относительному содержанию белка.

Имеются, данные, что рибосомы, клеточных органелл обладают также рядом уникальных свойств, • отличающих их как от рибосом прокариоти-

ческого, так и эукариотического типов. В случае рибосом митохондрий животных клеток.. к ним относятся минимальная по «^транскрипционная„ модификация рРНК, основность рибосомалышх белков,- чувствительность «некоторым ингибиторам белкового синтеза, а также, по-видимому ¿.относительное содернание РНК и белка в рибосомной частице,,.

Рибосомы митохондрий также,, по-вядимол<у, не совсем сходны с рибосомами.пластид. Так, субъединицы рибосом митохондрий не образуют1 гибридных рибосом с субъединицами рибосом хлоропластов. Рибосомы ми—' тохондрий не дают перекрестной реакции с антисыворотками против рибосом хлоропластов*.По величине плавучей плотности митохондриальные рибосомы изученных объектов отличаются от рибосом хлоропластов.. Структура 3'-конца малого компонента рРНК митохондрий не похожа на структуру малого кошонента рРНК пластпд. Наконец,- для рРНК митохондрий характерно низкое содержание пар Г+Ц и низкий уровень.метилирования, в то время как рРНК пластид характеризуется высоким содержанием пар Г+Ц и высоким уровнем метилирования. В ряде случаев рибосомы митохондрий отличаются от рибосом пластид также по величинет частиц, их субъединиц и компонентов рРНК.-

. . Таким образом,. структура и свойства рибосом клеточных; органелл: указывают на многообразие рибосом; встречающихся в природе..Обычно принятое деление рибосом на рибосомы прокариотического и зукариоти-: ческого тшюв не отражает в полной мере этого многообразия. Рибосомы хлоропластов,. в общем,-обнаруживают, больше сходства с рибосомами прокариотов, чем рибосомы митохондрий. Среди последних наименьшее сходство с рибосомами прокариотов имеют рибосомы митохондрий животных. клеток.

Для функционирования внеядерной генетической системы требуется информация,, содержащаяся в ядерном геноме. Число ядерных.генов; необходимых, для обеспечения функционирования оргаиелл, во много раз превышает.число генов,.присутствующих в их геномах. В этой связи большой интерес представляет вопрос о происхождении клеточных.орга-неял,_ в частности, хлоропластов с их структурно автономной.генетической системой.

Давно замечено сходство в строении хлоропластов и клеток прокариотов : - синезеленых водорослей.. Изучение структуры. и свойств генома ^ пластид* свойств их трансляционного аппарата в сравнении с таковыми прокариотических клеток также указывает на значительвое^сходство

хлоропластов с клеткайи прокариотов. Так, в структурировании ДНК в обоих случаях, по-видимому, не принимают участия* гистоны (во всяком случае типичные гистоны, которые участвуют в структурировании ДНК в хромосомах.эукариотических клеток). Молекулы ДНК хлоропластов и изученных прокариотов имеют форму ковалентно-замкнутых колец. С помощью гибридизации обнаружена значительная гомология нуклеотддных последовательностей ДНК хлоропластов и рРНК:синезеленых водорослей ( Р1ео1Л а. Сагг, 1972).

Выше говорилось о существенном структурном и функциональном сходстве между рибосомами и рИК хлоропластов и прокариотов»

Наконец, сравнительные исследования белков хлоропластов и сино-зеленых водорослей также указывают на сходство хлоропластов с клетками прокариотов. Фикобилипротеиды - светособиранщие компоненты пиг- -ментов фотосинтеза у синезеленых и красных водорослей - обнаруживают значительную гомологию у этих двух эволхционно далеких типов ( Кипе , 1977). Обе субъединицы фикоэргегрипа красных и синезеленых водорослей взаимозаменяемы без потери функций. Физические к химические* свойства белков хлорофилл-белкового комплекса фотосистемы X хлоропластов высших растений сходны с таковыми синезеленых водорослей { Рапыег , 1975). Обнаружено сходство в структуре рибулозодифос-фаткарбоксилазн синезеленых водорослей и хлоропластов высших растений. Проведенные нами исследования белков рибосом хлоропластов и. организмов, находящихся на разных уровнях развития фотосинтетического аппарата, также указывают на сходство хлоропластов о синеэелены-ми водорослями. . ~

* Все эти данные свидетельствуют о несомненной филогенетической связи хлоропластов о клетками прокариотлческого типа.' Предполагают» что хлоропласта могли образоваться из прокариотической клетки дву- ■ мя путями: путем "внедрения" прокариота в клетку эукариотического. типа или "эндогенным" путем, т.е. путем эволюции древней прокариотической клетки.

Согласно 1-му предположению,-получившему название гипотезы эн-досимбиоткческого происхождения, хлоропласты произошли отфотосив-г тезирующих прокариотических клеток, возможно, от клеток синезеленых водорослей, которые "обосновались* в примитивной эукариотической клетке в качестве эндосимбионтов.

' Согласно 2-цу предположению, получившему название гипотезы эндогенной кошартментализации, хлоропласты возникли в "процессе посте-

■ г

сенной эволюции прокариотической клетки, возможно клетки синезеленой водоросли. ' }

■Оба предположения о происхождении хлоропластов базируются на данных сравнительной биохимии и цитологии ныне существующих форм. .Соответствующие палеонтологические данные, которые позволили.бы восстановить отдельные этапы образования эукариотической клетки, отсут-* ствует. Поэтому доводы, приводимые в пользу каждого из предположе-- ний,- нельзя рассматривать как доказательства.. Обе гипотезы имеют .слабые стороны и не дают исчерпывающего представления о происхождение пластид.

Значительное,сходство хлоропластов с клетками прокариотов,, о чем говорилось выше, является аргументом в пользу обеих гипотез и -свидетельствует о том, что хлоропласты птюизоали от прокариотов и остались, в основном, на прокариотлческом уровне,- независимо от того,'имел о ли место "внедрение" прокариотов в эукариотическую клетку с пли постепенная эволюция црокариотической клетки.

Все имеющиеся данные указывают на то, что наиболее вероятными предками хлоропластов являются клетки сине зеленых водорослей и что * филогенетическая связь хлоропластов с клетками фотосинтезирувдпх бактерий отсутствует. Так, ДНК хлоропластов не гибридизуется с рРНК фотосинтезирующих бактерий ( а. Сагг , 1972). Нет сходства в

первичной структуре малого компонента рРНК хлоропластов и фотосинтезирующих бактерий. Рибосомы фотосинтезирующих бактерий по электрофо-ретическим свойствам белков не обнаруживают сходства с рибосомами хлоропластов (Крина и др., 1972). Существенные отличия по физическим и химическим свойствам обнаруживают белки фотосистемы I фотосинтез ирущих бактерий и хлоропластов. Наконец, современные фотосинте-зирующие бактерии не содержат хлорофилла а и пластохияона (РаггМег, 1975).

Несомненно, что о момента возникновения эукариотичеекая клетка прошла длительный дуть эволюционного развитая. Высокая степень клеточной дифференциации, усложнение функций, необходимость синтеза большого числа разнообразных белков привели, в частности, к образованию высокоэффективной системы трансляции, более совершенных механизмов регуляции белкового синтеза, к усложнению структурной организации рибосом. Рибосомы цитоплазмы эукариотов, по сравнению с рибосомами прокариотов, имеют более высокий молекулярный вес_,. причем уве- '

ф *

лпчение молекулярного веса обуслся&еко как увеличением кодеиулярно-го веса компонентов рРЕК (суммарно ®т 1,7x10^ до 2,0x10е), так п значительным увеличением относительного содернания белка в ри босомной частице: от >~<5Ъ% у большинства бактерий-до ~ 5С% у эукари-отов. Существенно больше и число белков вркбо&ках зукариотов.

Вместе с развитием эукарлотической ¡слетки определенные изменения претерпел ^аппарат трансляции.^лоропластов. Исследования относительного содержания РНК и белка в рибосомах хлоропластоб (Юрииа и др., 1972), покйзали, что хотя молекулярный веб' кошонентов рРНК в них остался неизменным по сравнению с компонентами рРНХ прокарпо-тичееккх клеток, существенно увеличилось относительное содержите белка в рибосомной частице, {.£э.сса балка в рпбосо:-.^х хлоропластов ^ на 0,5 ьин.дальтон больше, чем в»рибосо!йах прокариегоп, и близка к массе белка в ц^топлазкатичееккх рибосомах эукарпотичееккх меток В хлорооластах высекх растений значительно увеличилось также число белков, входщпх'в состав рибосокно^ частицы, В результате совреыен ный аппарат трансляции хлоропластов представлен рибосомами, структурная организация которых сложнее,^чем рибосом их прокарпотпческях предков. >

' Присутствие в эукариотической клетке оргаиелл, обладающих собственной ДНК, является]для клетки нэ только необходимостью, но к определенным "фактором риска". Активность ядерной и внеядерноЗ генетя ческих систем должна быть тштельно скоордикиров&га, чтобы обеспечить выполнение"не только свойственных органаллам специфических функций, но и достичь наиболее эффективного фуккциошгрованпя зука-. риотической клетки в целом. Изучение механизмов соподчинешл и координации функций ядерной и внеядеркой генетических систем, процессов регуляции активности генов является задачей будущих исследований,, которые возводят точнее представать пути эволюции эукариотической клетки.

• . '

- ОСНОВНЫЕ -ВЫВОДЫ-

I. Методами равновесного ультрацентркфугароЕапяя в градиенте плот-кости хлорида цезия и электронной микроскопии в' хлоропластах высших растений обнаружена ДНК. Генетический аппарат хлоропластов представлен двутязевыки кольцевыми молекулами ДНК с длиной

контура около.40 га и молекулярным весом около:90x106 дальтон.

а) ДНК хлоропластов относится к АТ-типу и . содержит .35-36? Г+Ц;

б) По нуклеотидному составу, ДНК хлоропластов изученных.видов растений не отличается-от ядерной ДНК;.

в) Впервые показано, что ДНК хлоропластов обладает бЛльией.способностью к ренатурацин, чем ядерная ДНК, г.е., представлена более однородными (по нуклеотидному составу) молекулами, чем ДНК ядер.

П.Изучена макромолекулярная организация хлоропластов, как материальных носителей пдтоплазматической наследственности,.

а) Показано; что ДНК'локализована в электронно-прозрачных участках матрикса хлоропластов. В этих ко участках катрыкса обнаруживаются многочисленные рибосомные частицы и . запасные вещества растительной клетки (крахмал и липида);:

б) ДНК ассоциирована с мембранной. системой хлоропластов. Наиболее часто встречающейся конфигурацией нитей ДНК, прикрепленных к

.фрагментам мембран,, являются одиночные петли (70-80& всех ти' пов прикрепления). Встречаются также двойные петли ДНК, прикрепленные к одному и тому же или соседним участкам мембраны;

в) Геном хлоропластов представлен:многими копиями» что следует из наличия нескольких ДНК-содержащих электронно-прозрачных участков на срезах хлоропластов к измере1шя длины нитей ДНК, ассоциированию: с фрагментами хлоропластных мембран;;

г) Обнаружены рибосомы в хлоропластах... Впервые показано, что рибосомы располагаются в матриксе хлоропластов одиночно или группами, иногда они. прикреплены к ламеллярнил структурам к располагаются на концах дисков гран..

Ш. Геном хлоропластов по кнформацио!шой емкости, конформгцди моле. кул и ряду физико-химических свойств ДНК существенно отличается от ядерного генама эукариотлческих-клеток.

ХУ. Из хлоропластов восьми видов двудольных и однодольных растений выделены рибосомы. Впервые;получены злектронномикроскопические снимки изолированных хлоропластных рибосом.. Основной компонент аппарата трансляции хлоропластов представлен рибосомами с коэф-.фицкентом.седаментации 70 5.

а) Рибосомы хлоропластов морфологически сходных рибосомами из других источников;,; *

- 49 -

(5) Рибосомы хлоропластов меньше соответствующих цитоплазматичес--кес рибосом. Размеры рибосом хлоропластов фасоли и гороха составляют 220x170 2; рибосом цитоплазмы 260x130 а и 260x200 А соответственно; ^

> в) Предложена модель рибосомы, отражаодая некоторые существенные' черты организации рибосоккоЗ частицы, ' ■ .У. Изучен состав рибосом хлоропластов.

а) Показано, что рибосомы хлоропластов содержат 47,0-45,7/» бел-Э. ка ( у СаС1 1,57-1,58 г/см3) и 53,0-54,РНК. рРНК хлоро-

пластов относится к Щ-типу (коэффициент спещфпчности 1,151.21);

и б) Белковый состав рибосом хлоропластов видоспецифичен. Рибосо-

мы хлоропластов и рибосомы вдтоплазмы одного п того же вида растений содержат разные белки; в) Обнаружено значительное сходство в первичной структуре белков рибосом.и гистонов —, клеточных белков основного характера, -что позволяет предполагать наличие в эукарпоткческоК клетке универсального механизма белково-нуклеикового взаимодействия; ■ г) По относительному содержанию белка рибосомы хлоропластов

сравнительно мало отличатся от соответствуодос иктоплазматк-ческих рибосом (50,2-4Э,0{5 белка;* у5 С*С1 1,55-1,56 ¿"/см3) и существенно отличаются от рибосом прокариотических клеток (35,0-40,белка; у> СзС1 1,61-1,64 г/см3); >д) Рибосомы хлоропластов высших растений содержат больше белков, ^ чем рибосомы прокариотов, и ■ меньше белков, чем ВО 3 рибосо-

мы эукарибтов,

. У1. Рибосомы хлоропластов предстазлякт собой особый тип рибосомных частиц, которые по своим свойствам существенно отличаются от рп-а босом эукариотического и прокариотичзского типов.

УЛ. Подученные'данные свидетельствуют о значительном■сходстве генетического и трансляционного аппаратов хлоропластов с генетическим и трансляциошцгл аппаратами прокарнотпческих клеток и согласуются с представлениями.о возможной эводюцгонной связи пластид с синеэелеными водорослями.

е-

Список работ , опубликованных по теш д^сс^ртягртт

1.,Микульска Е.И. , Одинцова М.С., Сисакян Н.М. 1962.. Выделение и

характеристика рибосом хлоропластов.. Биохимия, 27, I06I-I069.

2. Uikulska OdintsovalJ.S. , Slssakian В.Ы. 1962. On the isola-

tion of.ribosomes from chloroplaeta. Haturwiss., H.' 549551.

3. Odintsova U.S., Colubeva £.7., Sisaakian U.M. 1964. Chloroplaet

ribosomes. Nature, 20^. 1090. *4;:Беридзе Т.Г.,.Одинцова М,С.,-Сисакян Н.М. 1965, О свойствах дез-окскрибонуклеиновой кислоты хлоропластов. Докл. АН СССР, 162. II88-II90.

5. Беридзе Т.Г., Одинцова 1Л.С., Спсакян Н.М. 1967. Распределение

компонентов ДНК листьев фасоли во фракциях клеточных структур. Мол. биология, I, 142-153.

6.: Беридзе Т.Г., Одинцова М.С. 1967. О распределении ДНК пророст-- .

ков гороха в градиенте плотности хлористого цезия.. Докл. АН СССР, 173, I209-I2II. .

7.„Одинцова Ы.С.,. Брусков В.Й., Голубева Е.В. 1967. Сравнительное исследование рибосом хлоропластов п цитоплазмы некоторых видов растений. Биохимия, 32, 1047-1059.

8.-Bruskov V.I., Odintsova U.S. 1968. Comparative electron microscopic studies of chloroplas.t and cytoplasmic ribosomea. J. Uol. Biol., 22; 471-473.

9. Беридзе T.T., - Одинцова M.C. 1969, Дезоксирибонуклеииовая кисло-

та цнтоплазтатических структур: пластид и митохондрий. Ус' пехи биол.- химии, 10,.36-63.

10. Брусков В.II., 1Сиселев Н.А., Одинцова М.С.Л969. Злектронномик-

роскоппческое исследование структуры цитоплаэматических рибосом листьев фасоли.. Шл.-биология, 3, 571-578,"

11. Одинцова М.С., Юрина Н.П. -1969, Белки рибосом хлоропластов и ци-

топлазглы. Исследование методом электрофореза в полиакрил-шлидном геле. Биохимия, 34, 667-673.

12. Odintsova M.S., Yurina II.P. 1969. Proteins of chloroplast and

cytoplasmic ribosomes. J. Uol. Biol., ¿0, 503-506*

13. Одинцова M.C., Микульска E., Турищева M.C. 1970. Электронномик-

роскопическое исследование ДЕК хлоропластов и митохондрий гороха» Мол. биология, 4, 889-838. >

14. вдкнцова М.С., !Ликульска Е., Турищева М.С. 1970. Форма, размера

и локализация ДНК в цитоплазкатлческих. структурах. В кн. "функциональная биохимия клеточных структур"., М., "Наука", стр. 52-62. * '*

15. Uikulaka Е., Odintsova U.S. 1970. On the localisation of starch

grains in -ША-containing areas of pea chloroplaot matrix. Septierae congr&o international de nioroocopte ¿lectronique. Grenoble,/197-193. IG. Jiikuleka £., Odintsova-M.S., Turlecheva U.S. 1970.. Electron microscopy of Ш In mitochondria of pea eeedlinga. J. Ultra-atr. Вез., ¿2, 258-267* 17. Odintsova U.S., XiikulskaE., Turischeva M.S^ 1970. Electron nic-roscopy of MA in p«a chloroplaats. Exptl. Cell Rea.. 61, 423-432. ' '

18..Odintsova M*3., Turischeva M.S.И972. Electron microscopy of

ГСГА in subcellular organelles of pea seedlings. Synp., Biol. Hung., 2Д, 221-227. . < „ ' *

19. Турищева M.C., Одинцова Ы.С. 1972. Исследование - формы молекул

ДНК внутриклеточных органоидов гороха. Мол.. биология, 6, 353-358.. ►

20. Юрина Н.П., Чудила В,И,, Оснкцкая Д.К., Одинцова М.С. 1972. Вы-

деление ^характеристика рибосом Chromatium vinosum. Мол. биология, 6, 153-160. *

21. Юрина Н.П., Одинцова М.С., Опарин A.U..1972. Плотностная харак-

теристика рибосом фотосинтезирувдих бактерий п растений. Докл. АН СССР, 205, 997-1000..

22. Юрина Н.П.,-Чудила В.И.,:0снпцкр1 Л.К., Одинцова М.С., Опарин

А.И.. 1972, Рибосоим фотосинтеэирушах бактерий. Докл. АН . СССР, 206, 503-506. ■

23.' Аракелян Б.Р., Гофаггейп Л.В., Одинцова М.С. 1972. Сравнитель-

ное исследование.основгшх белков рибосом и гистонов зародышей пшеницы методом диск-электрофореза в полиа1филамкдном геле. Докл. АН СССР,.206, 219-221.,

24. Юрина Н.П., Одинцова М.С,-1974*.Сравнительное изучение рибосо-

мальных белков синезеленых . водорослей и хлоропластов. Биохимия, 39; 348-357.'

25*. Uikulaka E.,, Odintsova M.S., Darasz В. 1974. ША-contа!д ing regi--' ons in various plastid types.. I. Are mil-contain tog regions , the sites of the formation of staiyh granules and lipid ■droplets in plasties? Biochem. Fh.yciol. Pflsngen.. 165. 166-' 174. '

26. К^ина Н.П., Одинцова M.C. 1974.. Ддавучая.плотвость B: Ceci рибосом хлоропластов. Тезисы докл. Всесоюзного симпозиума "Структура и функции нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов",. поев., пагшти акад. А.Н.Белозерского.. М., Изд-во МГУ» стр.83. '27: ТУрпщева М.С., Одинцова М.С. 1974. ДНК-мембранный комплекс хлоропластов гороха.. Тезисы докл.. Всесоюзного епшозпут.. "Структура и функции нуклеиновых кислот а нуклеопротеидов"; ■ поев, памяти акад..Л.Н.Белозерского. М.,.Изд-во МГУ, стр.60. 28. Аракелян Б.Р.,- Гофшгейн Л.В.Юрина Н.П., ОдинцоваС.- 1974..

Пептидные карты фракции. гметонов и подобной ей фракции , основных белков рибосом зародышей пшеницы. Докл.. АН СССР, 217.. 217-220..

29; Юрина Н.П., Одинцова М.С..1974..Белки рибосом растений.. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле белков рибосом хлоропластов и цитоплазмы проростков гороха.: Докл. АН СССР, V;.2I8. 1478-1481.

30. Yurina It.P., Odintsova M.S..1974. Buoyant density of'chloro-

plast ribosomea in CaCl..Plant Sci..Letters, ¿,229-234.

31. Xfcuaa Н.П., Одинцова М.С. 1974. Зволквдн белков растительных ри-

босом. - Тезисы докл. Всесоюзного симпозиума "Структура и ■ ' функции нуклеиновых кислот"» Ташкент, стр..20.

32. Юрина Н.П., Чудпна В.И., -Осницкая Л.К.Одинцова М.С., Опарин

, ' . . А.И. 1975. Белки: рибосом фотосинтезируюцих бактерий. Chrona-

tiun vinosum.. Докл., АН СССР, 225, .1450-1452.. 33* Odintsova U.S., Yurina Я.P..1975. Ribosomal proteins and the

origin of plastids.In; "Genetic Aspects of Photosynthesis"; eds Hesyrov Yu.S., Sestak Z., The Hague, p. 37-41.

34.-Oparin A.I. ,. Odintsova M.S.Yurina Ы.Р.,1975. Chloroplast ribo-аошез ae ribosomes of the prokaryotic type. Biochem. Physiol. Pflanzen. 168.,175-183. . -

35. Odintaova U.S.,,Yurina H.P.. 1975. On the.origin of plantids. Ori-

- gina of life, 6, 441-446. , > *•

36. Одинцова М.С., Корина Н.П. 1975. Белки рибосом в эволюции фото' синтезирующего аппарата. Тезисы докл. ХП Международного бо-

• танического конгресса. Ленинград, т. 2* .стр. 432.

37. Odlntsova U.S., Turiecheva M.S. 1976. To the question of DHA

organization in chloroplas£s of higher plants. Aota histo-chem., Suppl.-Bd. XVII. 107-116.

38. Одинцова M,C., Ерша Н.П. 1976. Рибосомы хлоропластов. Биохимия

41, I9I5-I927. . *

39. Одинцова М.С. 1976. Книга: "ДНК хлоропластов и митохондрий

(структура, репликация, физико-химические свойства)". М., Изд-во ВИНЖИ, стр. I-I80.

40. Odintsova U.S., Sansonova I.A., Turischeva M.S., Böttcher P.

1978. Genetische Kontrolle der Plastidendifferensierung. 1. Die Wirkung der Pl&atoinmutation'Pl-alb 1 auf^die Ultra-B struktur der Piastiden in der Kotyledonen von Lycoperaicon esculent ум. Biol. 1Ы. 1973.

Tr?7Z9? ______________Tttp.goo

i Типография X030 Госплана СССР

Информация о работе

Одинцова, Маргарита Семеновна
доктора биологических наук
Москва, 1977
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО И ТРАНСЛЯЦИОННОГО АППАРАТОВ ХЛОРОПЛАСТОВ ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО И ТРАНСЛЯЦИОННОГО АППАРАТОВ ХЛОРОПЛАСТОВ"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО И ТРАНСЛЯЦИОННОГО АППАРАТОВ ХЛОРОПЛАСТОВ
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия