Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние митохондрий на энерготраснформирующие функции хлоропластов in vitro

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние митохондрий на энерготраснформирующие функции хлоропластов in vitro"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОТАНИКИ им. В.Ф.КУПРЕВИЧА

РГб од

УДК 531.17.1:576.311.347+577.23

ОБУХОВСКАЯ ЛЮДМИЛА ВЛАДИМИРОВНА

ВЛИЯНИЕ МИТОХОНДРИЙ НА ЭНЕРГОТРАНСФОРМИРУЮЩШ; ФУНКЦИИ ХЛ0Р017ЛАСТ0В 1Л У1ТЯО

03.00.12 - физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск — 2000

Работа выполнена п лаборатории фотосинтеза Института экспериментальной ботаники им. В.Ф.Купрсвича НАМ Беларуси

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

[Иванченко В.М. [

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Серова З.Я.

кандидат биологических наук Савченко Г.Е. (ИФБ НАН Б)-

Оппонирующая организация:

Центральный ботанический сад НАН Б

/

Защита состоится "6>" 2000 г. в ^^ часов на заседании сове-

та по защите диссертаций Д 01.38.01 в Институте экспериментальной ботаники им. В.Ф. Купревича НАН Беларуси по адресу 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27.

Телефон (факс) ученого секретаря: (072) - 284-18-53

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Я. Коласа НАН Беларуси

Автореферат разослан " $ " ^¿¿¿и^ 2000 г.

Ученый секретарь ^ Фсх^Л-^

совета по защите диссертаций ■ ^ И.В.Рогульченко

Егю.Ш-Що

/йЛ- МАЛ/Р,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Исследование механизмов интеграции внутриклеточных органелл необходимо не только для получения фундаментальных знаний по физиологии клетки, но и для изучения возможности управления продукционным процессом целого растения.

В функционировании клетки живого организма одним из важнейших элементов является се энергообеспечение. В этом плане клетки растений уникальны, так как в них совмещены две энерготрансформирующие системы — хлоропласты и митохондрии. Являясь полуавтономными органеллами, имеющими собственные ДНК ,и белоксинтезирующий аппарат, обладающими однотипными системами генерации энергии, они функционируют в едином пространстве, называемом цитозолем, и не могут существовать без взаимодействия с другими клеточными структурами и друг с другом. Наиболее полно изучено их взаимовлияние на генетическом и метаболитном уровнях, получены доказательства возможности существования прямых контактов между хлоропластами и митохондриями в определенных условиях.

Мало изученным остается взаимовлияние этих органелл на энерготрансформирующие функции друг друга. Т.к. исследование этого вопроса in vivo крайне затруднено, в лаборатории фотосинтеза Института экспериментальной ботаники НАНБ под руководством доктора биологических наук В.М.Иванченко был впервые предложен метод изучения взаимодействия хлоропластов и митохондрий in vitro. Уже первые эксперименты дали возможность предположить существование неописанного ранее механизма взаимовлияния этих органелл на электронный транспорт (ЭТ) и образование АТФ в них. Поэтому было правомерным продолжить исследования в этом направлении.

Связь с крупными научпымн программами, темами. Исследования выполнены в рамках госпрограммы фундаментальных исследований и входили в плановые темы Института экспериментальной ботаники им. В.Ф.Купревича НАНБ: «Эпигенетическая регуляция активности фотосинтетического аппарата в связи с условиями произрастания растений» (№ г.р. 01850010153, 1985-1988 гг.); «Взаимодействие хлоропластов и митохондрий посредством белков-регуляторов» (№ г.р. 01890023819, 1989-1992 гг.); "Физиология и биохимия регуляторного взаимодействия хлоропластов и митохондрий", (№ г.р. 1993387; 1993-1995 гг.); "Физиология и биохимия регуляции реакций переноса энергии в хлоропластах и митохондриях эндогенными водорастворимыми факторами", (Na г.р. 1997336; 1997-2000 гг.)

Цели и задачи исследовании. Цель работы: исследовать механизм и особенности действия митохондрий на фотохимическую активность хлоропла-

стов in vitro, определить природу этого влияния. Для этого необходимо было решить следующие задами:

— исследовать действие митохондрии на кинетику реакций Хилла и фо-тофосфорилирования (ФФ);

— установить специфичность действия митохондрий из корней и листьев на ЭТ и ФФ в хлоропластах, а также сравнить влияние митохондрий разных видов растений на их хлоропласта;

— изучить влияние присутствия хлоропластов в срсдс инкубации па скорость выхода эффектора из митохондрий;

— определить природу эффектора;

— исследовать его действие на хлоропласта различного структурного состояния;

— выделить из митохондрий разобщитель реакции ФФ и получить его биохимические и физические характеристики.

Объект н предмет исследования. Объектом исследования служили хло-ропласты и митохондрии проростков гороха сорта Вегетативный желтый, элита. Предметом исследования были изменения фотохимической активности хлоропластов гороха и их связь с водорастворимыми белковыми эффекторами из митохондрий корней проростков гороха.

Методология и методы проведенного исследования. Были осуществлены модельные эксперименты, в которых хлоропласта и митохондрии помещались в единую среду и исследовалось непосредственное влияние митохондрий на фотохимическую активность хлоропластов in vitro. Для определения фотохимической активности хлоропластов использовали стандартные и модифицированные автором методики. Для изучения природы действующего вещества использовали биохимические и спектрофотометрнчсскис методы. Для очистки эффектора, а также определения его молекулярного веса использовали гель-фильтрацию и электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).

Научная новизна и значимость полученных результатов. Впервые изучено влияние митохондрий на фотохимическую активность хлоропластов in vitro и выявлен механизм этого влияния. Идентифицированы эффекторы, изменяющие энерготрансформирующие функции хлоропластов. В результате проблема внутриклеточного энергообеспечения в растительной клетке приобретает статус более высокой структурно-функциональной организации взаимодействия органелл и этим способствует разработке путей управления фотосинтезом и дыханием как главными составляющими продукционного процесса. Кроме того, новые знания взаимосвязанности функций хлоропластов и митохондрий являются основой для переосмысления существующих представлений о данном предмете и могут использоваться в ВУЗах.

Практическая значимость полученных результатов. Полученные результаты указывают на существование неописанного механизма интеграции хлоропластов и митохондрий на уровне трансформации энергии. Они имеют не только фундаментальное значение, но представляют также практический интерес для физиологов растений и фотобиологов, так как обнаруженные эффекторы, действуя на фотохимическую активность хлоропластов, могут выполнять в клетке роль регуляторов скоростей ФФ и ЭТ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. На защиту выносятся следующие положения: 1) особенности фотохимической активности хлоропластов in vitro в присутствии митохоидриальных эффекторов; 2) идентификация природы митохоидриальных эффекторов, механизм их действия.

Личный вклад соискателя. Весь представленный экспериментальный материал получен и обработан лично автором или при его активном участии. Автором предложена модифицированная методика определения фотохимической активности хлоропластов в одном образце для получения кинетических кривых ЭТ и ФФ, а также разработаны методические подходы для выделения изучаемых эффекторов из митохондрий.

Апробация результатов диссертации. Результаты работы были представлены на IV конференции молодых ученых ИПФС АН СССР, г. Пущино-на-Оке, 1989 г.; IV Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки, г. Минск, 1990 г.; II съезде Всесоюзного общества физиологов растений, г. Минск, 1990 г.; III съезде Всероссийского общества физиологов растений, г. Санкт-Петербург, 1993 г.; I съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков, 1994 г.; II съезде Белорусского общества физиологов растений, г. Минск, 1995 г.

Опублнкованность результатов. Основные положения работы опубликованы в 6 статьях (из них 4 — в научных журналах, 2 — в сборниках работ) и 5 тезисах. Общее количество страниц опубликованных материалов — 33.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 103 стр. машинописного текста, включая 27 рисунков и 1 таблицу, и состоит из введения, общей характеристики, 3 глав, заключения, списка литературы (148 источников, из них 59 на иностранном языке).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Взаимодействие эпсрготрансформмруюших органелл в растительной клетке

Проанализировано состояние вопроса о взаимодействии энсрготрансфор-

мирующнх органелл растительной клетки и показано, что отсутствие данных о механизмах, осуществляющих интеграцию хлоропластов и митохондрий на уровне регулирования их энергетических функций. Высказана гипотеза о существовании митохондриальных эффекторов, контролирующих фотохимическую активность хлоропластов.

Объект н методы мсслсдопания

Объектом исследования служили митохондрии и хлоропласты, полученные из проростков гороха {Pisum sativum L.) сорта Вегетативный желтый, элита. Хлоропласты выделяли из листьев 7-10-дневных проростков гороха, выращенных на водопроводной воде в люминостате (интенсивность освещения 8000 люкс). Хлоропласты 1 класса выделяли по [Иванченко, 1974; Эдварде, Уокер, 1986]. Хлоропласты 2 класса получали из супернатанта после осаждения хлоропластов 1 класса повторным центрифугированием при 3500 g и по [Иванченко, 1974]. Концентрацию хлорофилла определяли по [Лгпоп, 1949]. Митохондрии выделяли из корней 3-5-диашых проростков гороха и ячменя или из листьев этиолированных проростков ячменя в такой же среде, что и хлоропласты, по [Гавриленко и др., 1975]. Концентрацию белка в суспензии определяли методами Брэдфорда с Кумасси G-250 [Скоупс, 1985] и Лоури в модификации Хартри [Hartree, 1972]. Тестом для определения фотохимической активности хлоропластов служили реакции Хилла с ферри-цианидом и ФФ с феназинметасульфатом (ФМС) по [Гавриленко, и др., 1975], а также модифицированный нами вариант указанных методик для определения фотохимической активности хлоропластов в одном образце. Скорость реакции ФФ определяли по убыли Р„ в соответствии с [Гавриленко и др., 1975] и по модифицированной автором методике. Количество Р„ в образце измеряли по Аллену в модификации Чеснокова [Никулина, 1965].

Водорастворимые белковые фракции из митохондрий получали из свеже-выделенных митохондрий, которые ресуспендировали в дистиллированной воде в соотношении 1:20 (вес митохондрий/объем воды) и замораживали на ночь. Утром экстракт оттаивали и центрифугировали 30 мин при 12000g. Полученный супернатант концентрировали в вакуумном роторном испарителе и называли его фракция 1. Количество вносимого эффектора дозировали, как и в экспериментах с целыми митохондриями, по концентрации белка во фракции 1.

Осадок после выделения фракции 1, ресуспендировали в дистиллированной воде (1:30) в течение 1 ч, затем центрифугировали 45 мин при 12000 g. Процедуру повторяли 3 раза (в последнем супсрнатанте концентрация белка была 0.003 мг/мл). Полученные супернатанты объединяли и концентрировали в вакуумном роторном испарителе — фракция 2.

Очистка ингибитора ФФ. Разделение водорастворимой белковой фракции проводили методом гель-фильтрации [Остерман, 1985] на геле TOYOPEARL HW-40 (Япония). Фракции элюировали дистиллированной водой. Параллельные подфракции после нескольких разгонок объединяли и концентрировали в вакуумном роторном испарителе. Нативный электрофорез фракции 1 выполняли в 10 и 15% полиакриламидном геле (ПААГ) по [Laemmli, 1970].

Основные результаты и их обсуждение

Влияние митохондрий на фотохимическую активность хлоропластов in vitro

1. Изменение фотохимической активности хлоропластов in vitro под действием митохондрий

Введение митохондрий, выделенных из корней проростков гороха, в реакционную систему в количестве, эквивалентном количеству хлоропластов по белку, снижало скорость реакции Хилла и выделение Ог в хлоропластах из листьев гороха [Иванченко и сотр., 1986а]. При этом степень ингибирова-ния зависело от количества вносимых в реакционную систему митохондрий и времени их совместной предынкубации с хлоропластами. Супернатант после осаждения промытых митохондрий также проявлял ингибиругащую способность по отношению к ЭТ. Максимальное ингибирование не превышало 50% и достигалось при концентрации митохондрий 0.7-0.9 мг белка/мл реакционной среды.

Это дало нам основания предположить, что митохондрии, ингибируя ЭТ, ингибируют и процесс этерификации Р„ в хлоропластах в ходе реакции ФФ. Действительно, внесение митохондрий в реакционную смесь для ФФ снижает скорость этерификации Р„ в хлоропластах пропорционально концентрации митохондрий в реакционной смеси и времени их совместной предынкубации в темноте без кофакторов ФФ. Так, при концентрации митохондрий в реакционной среде 0.125 мг белка/мл ингибирование ФФ через 10 мин инкубации составляло ~ 18%, а через 60-90 мин--40%, в то время как при

0.25 мг белка/мл степень ингибирования достигала 60 и 80%, соответственно.

Поскольку предынкубация органелл проводилась в темноте и без кофакторов ФФ, можно полагать, что эффектор мигрирует в хлоропласта из митохондрий независимо от самого процесса ФФ и взаимодействует, по-видимому, непосредственно с сопрягающими мембранами, а не с субстратами ФФ. При этом зависимость степени ингибирования ФФ от времени инку-

бации характеризует время, необходимое для его диффузии из митохондрий в хлоронласты.

Важно было убедиться, что наблюдаемое снижение функциональной активности хлоропластов не обусловлено протеканием параллельно идущих обратных процессов или конкуренцией за субстрат. Для этого надо было показать, что восстановленный феррицианид пс реокисляется митохондриями, а образовавшийся в ходе ФФ АТФ не гидролизуется АТФ-азой митохондрий. С этой целью проводили темповую предынкубацию хлоропластов с митохондриями в отсутствие кофакторов электронного транспорта и ФФ, а также темповую пробу (контрольная) фиксировали одновременно со световой (опытной) для того, чтобы вычесть влияние каких-либо независимых от света реакций, если они имеют место в данной реакционной среде. Отмеченное нами усиление отрицательного действия митохондрий па ЭТ в хлоро-пластах по мере увеличения времени предынкубации предполагает, что это влияние пс обусловлено конкуренцией за субстрат — АТФ.

Существенную информацию при изучении такого рода реакций можно получить, изучая кинетику фотохимических реакций в хлоропластах. Исследования показали, что под действием митохондрий скорости ЭТ (рис. 1, а) и ФФ (рис.1, б) снижаются и, как следствие, снижается фотостациоиарпын уровень.

Обычно выход кинетических кривых па фотостациопарпый уровень обусловлен достижением равновесия между прямыми и обратными реакциями (цит. по Рабинович, 1959). Но в экспериментах, в которых в качестве кофактора ЭТ используется феррицианид (рис. 1, а), который, будучи восстановленным в реакции Хилла, не способен рсокисляться пи кислородом воздуха, пи в дальнейших фотохимических реакциях [Эдварде, Уокер, 1986], выход кинетических кривых на плато свидетельствует о прекращении реакции. Т.о. выход реакции Хилла на плато в присутствии митохондрий указывает на ин-гибирование ЭТ п хлоропластах. При увеличении времени совместной предынкубации хлоропластов и митохондрий выход на плато ускоряется.

Кинетика этерификлиии Р„ хлоропластами в процессе ФФ (рис. 1, б) н присутствии митохондрий очень схожа с кинетикой восстановления ими красителей (особенно феррициапида) и имеет Б-образпую форму. Скорость выхода па плато, по-видимому, определяется временем, необходимым для активации митохондрнального ингибитора фотохимической активности из митохондрий под действием освещения. Ускорение выхода па плато при увеличении времени темповой совместной предынкубации хлоропластов и митохондрий, очевидно, свидетельствует об увеличении концентрации действующего вещества в инкубате. Выход на плато спустя 1-2 мин после начала освещения в тех случаях, когда митохондрии вводили в реакционную

смесь непосредственно перед освещением, характеризует время, необходимое для проникновения ингибитора ФФ из митохондрий в хлоропласты.

AD,420mn AD, 650 mil

Рис. 1. Кинетика реакций Хилла (а) и ФФ (б) в хлоропластах гороха в отсутствие (1) и в присутствии митохондрий с предынкубацией 30 (2), 60 (3) и

90 (4) мин.

Характер кинетических кривых, и особенно увеличение скорости фотохимических реакций в присутствии митохондрий после некоторого ее снижения в начале освещения, свидетельствует в пользу того, что кривые характеризуют ход прямых фотохимических реакций в хлоропластах, а не равновесное состояние между противоположно направленными процессами, протекающими с участием митохондрий. Последнее позволяет предполагать, что выход кинетических кривых на стационарный уровень задолго до исчерпания субстрата означает прекращение реакции. Все вышесказанное свидетельствует о том, что полученные кинетические кривые фотохимической активности хлоропластов отражают особенности протекания именно фотохимических процессов в хлоропластах, обусловленные присутствием в системе митохондрий.

Специфичность действия митохондрий из листьев и корней проростков на фотохимическую активность хлоропластов

Мембраны митохондрий из листьев гороха и нсфотосинтсзирующих тканей имеют фактически идентичный фосфолипидный и полипептидпый состав [Day ct al., 1985; Ericson et al., 1984]. Это позволило предположить, что скорость фотохимических реакций в хлоропластах может различаться при

добавлении в реакционную смесь митохондрий из листьев и корней одного и того же или разных растений. Поэтому нами исследовался вопрос о специфичности иигибиторного действия митохондрий, изолированных из корней и листьев этиолированных растений, на фотохимическую активность хлоро-пластов.

Эксперименты показали, что действие митохондрии, выделенных из разных органов этиолированных проростков, по характеру проявления аналогично и не является специфическим. Специфичность отсутствует и при внесении в реакционную смесь митохондрий из разных видов растений, а также из печени крыс [Маршакова с сотр. [1990].

Влияние водного экстракта из митохондрий на ФФ

Ингибирующее влияние митохондрий на скорость реакции ФФ сохранялось, если после иредыпкубацни их с хлоропластами затем удалить митохондрии из реакционной смеси [Иванченко и др., 1987]. Это предполагало, что подавление митохондриями фотохимической активности хлоропластов in vitro происходит благодаря наличию в первых какого-то ипгибирующего эффектора. Для выяснения его природы и возможности выхода из митохондрий последние инкубировали в среде выделения 30 и 180 мин, затем суспензию центрифугировали для удаления из нее митохондрий, а супернатант испытывали на ингибиторную способность по отношению к хлоропластам. Полученные результаты убедительно показали, что с увеличением времени иредыпкубацни митохондрии в среде выделения возрастала иигибирующая способность супернаганта, что могло быть обусловлено увеличением количества эффектора в ипкубатс. Ьыстрос появление его в среде выделения предполагало, что он является водорастворимым. Поэтому получили водный экстракт из митохондрий и исследовали его ингибиторную способность по отношению к реакциям ФФ и Хилла с феррициапндом.

Действие фракции 1 на фотохимическую активность хлоропластов in vitro

Действие термообработки на ингибиторную способность фракции 1 из митохондрий. Выделение эффектора из митохондрий корней проростков гороха и идентификация его биохимических характеристик требовали подбора необходимых процедур и определения их последовательности.

Одним из важнейших свойств эффекторов является их чувствительность к термообработке. Поэтому мы инкубировали фракцию 1 при температуре 100°С в течение 10 мни на водяной бане. Затем центрифугировали, чтобы

освободиться от денатурированных белков, 30 мин при 16000 g и испытывали ингибиторную способность супернатанта по отношению к реакции ФФ. Полученные кинетические кривые ФФ при внесении в реакционную смесь митохондриалыюй фракции 1 до и после термообработки свидетельствовали о том, что кипячение фракции 1 не только не уменьшает, но увеличивает ее активность (в 5-7 раз). После термообработки фракции 1 S-образная форма кинетической кривой сохраняется, снижение скорости реакции этерифика-ции Р„ проявляется даже без прсдынкубации хлоропластов с фракцией 1 из митохондрий. Это свидетельствует о том, что эффектор, ингибирующий ФФ, является термостабильным и это свойство можно использовать для его выделения из фракции 1 митохондрий. При кипячении будут денатурироваться белки с большой молекулярной массой, к которым относятся и ингибиторы многих биохимических реакций [Ленинджер, 1985], а также флавоноиды [Запрометов, 1993].

Влияние компонентов фракции 1 на реакцию ФФ в хлоропластах гороха. При разрушении митохондрий осмотическим шоком в раствор вымывается содержимое межмембранного пространства, матрикса, а также белки, находящиеся на поверхности мембран, а при замораживании и оттаивании — и часть водорастворимых мембранных белков [Кагава Ясуо, 1985; Скоупс, 1985]. Спектр поглощения фракции 1 указывает на присутствие в ней органических веществ с пептидной связью — 205-220 нм — белков или полипептидов, 250-270 нм — дисульфидных мостиков; 265, 334 нм — флавоноидов и 260 нм — нуклеотидов (Скоупс, 1985; Кантор, Шиммел, 1984, с. 33-38). Измеренная концентрация Р„ во фракции 1 была довольно высокой — 4-7 мкмоль/мл. Нашей задачей было определить, какой компонент исследуемой фракции обусловливает ее ингибирующее влияние на фотохимическую активность хлоропластов.

Известно, что высокие концентрации нуклеотидов, флавоноидов и Рп могут снижать скорость реакций ФФ и ЭТ в хлоропластах [Jagendorf, Avron, 1958: Gross, Huffman, 1972: Прохорчик, Волынец, 1975; Акулова, 1977; Мальян и сотр., 1977; Музафаров, Залецкая, 1977; Молотковский, 1977; Му-зафаров и сотр., 1980; Жесткова, Молотковский, 1984]. Поэтому мы диали-зовали фракцию 1 через целлофан против дистиллированной воды в течение 5 ч. За это время удавалось избавиться от флавоноидов и нуклеотидов. Оказалось, что диализованная фракция 1 в меньшей степени ингибирует скорость реакции ФФ, чем недиализованная, что может быть обусловлено либо удалением флавоноидов, нуклеотидов и Р„ из фракции 1, либо полипептидов в ходе диализа в результате их выхода из диализного мешка, либо способностью эффектора адсорбироваться на диализной мембране (концентрация белка в ходе диализа уменьшалась на 22%).

Для разделения белков и флавопоидов первые осаждали охлажденным ацетоном [Скоупс, 1985]. Результаты (рис. 2, а) показали, что наиболее сильной пнгибиторной способностью обладает белковая часть фракции 1 после термообработки. Флавоноиды во вносимой концентрации (1(Г7-1(Г8 М) заметного влияния на скорость этерификации Р„ не оказывают.

А 420 тп Ц 650 /пи

t,MHll

/, мии

Рис. 2. Кинетика ЭТ (а) и ФФ (б) в присутствии фракций (фр1), фракции 1 после осаждения ацетоном (фр1/ац), фракции 1 после осаждения ацетоном и кипячения 5 мин при 100"С (фр]/ацЛ) и флавопоидной фракции (фл). К -

контроль.

Влияние разных концентраций белка митохопдриальной фракций на кинетику реакции ФФ в хлоропластах. Исследование влияния разных концентраций белка фракции ! на кинетику реакции ФФ показало, что, как и в случае с целыми митохондриями, повышение концентрации белка вызывает увеличение степени ингибирования реакции. При концентрации белка меньше 0.2 мг/мл реакционной смеси в наблюдаемый интервал времени (6 мин) реакция не достигает фотостациоиарного уровня, а при концентрации же 0.2 мг белка/мл реакционной смссн она выходит на плато уже после 1 мин освещения.

Действие протеаз на ингибиторную активность фракции 1 из митохондрий. В целях изучения свойств эффектора исследовали чувствительность фракции 1 после термообработки к действию протеолитических ферментов (проназы Е (70000 PUK/g) фирмы Merk и трипсина фирмы СПОФА (Чехословакия)). Результаты свидетельствовали, что термообработаппая фракция 1 устойчива к действию указанных амипогидролаз.

Это позволяет предположить, что функция исследуемого эффектора в клетке может быть более универсальной: он может быть и ингибитором реакции ФФ, и ингибитором протеолитических ферментов. Эта гипотеза, однако, требует более глубокого исследования.

Влияние хлоропластов на динамику выхода из митохондрии ингибитора реакции ФФ. Как было показано выше, эффектор способен выделяться митохондриями в среду инкубации. Было важно выяснить, влияет ли присутствие хлоропластов на скорость его выхода из митохондрий. Для этого хлоропласта с митохондриями инкубировали в темноте в среде без кофакторов ФФ и ЭТ в течение 10, 30 и 60 мин. Так же предынкубировали отдельно хлоропласта и митохондрии.

Полученные кинетические кривые реакции этерификации Р„ свидетельствуют о том, что время предынкубации выше 30 мин не было принципиальным для увеличения активности как в варианте с митохондриями, так и в варианте (хлоропласта + митохондрии), так как в инкубат за это время поступает максимальное количество активного эффектора, о чем свидетельствует ускорение выхода реакции на плато (с 4 мин после 10 мин инкубации до 2 мин после 30 мин инкубации). Полученные результаты привели нас к заключению, что присутствие хлоропластов не оказывает влияния на скорость выхода ингнСирующего эффектора из митохондрий.

Влияние фракции 1 на скорость реакции Хилла. Ранее было показано [Иванченко с сотр., 1986а, 19866], что митохондрии ингибируют ЭТ в хло-ропластах, т.е. базальный транспорт и функционирование ФС 2. Поэтому мы исследовали действие фракции 1 на скорость реакции Хилла с феррициани-дом в хлоропластах гороха. Оказалось, что фракция 1 или не изменяет, или ускоряет эту реакцию, что свидетельствует о наличии в ней разобщителя ЭТ и ФФ. Предынкубация хлоропластов с фракцией 1 в темноте без кофакторов ЭТ не ¡«меняет кинетику реакции.

Результаты экспериментов по влиянию на ЭТ белковой и небелковой части фракции 1 представлены на рис. 2, б. Видно, что все исследуемые фракции оказывают на него стимулирующее действие, что свидетельствует об та разобщающем влиянии на хлоропласта гороха. Причем наиболее сильным разобщителем является — термообработанная (5 мин при 100°С) белковая фракция (почти 200% по отношению к контролю). Таким образом, фракция 1 содержит разобщитель ФФ, но не ингибитор ЭТ.

Действие фракции 1 на ЭТ в хлоропластах различного структурного состояния. Для оценки возможности регуляторного действия митохондрий на фотохимическую активность хлоропластов in vivo необходимо было определить способность митохондриалыюго эффектора проходить через внешнюю оболочку хлоропластов. Для решения этой задачи из листьев пророст-

ков гороха выделяли хлороилаеты 1 и 2 классов (с ненарушенной и нарушенной целостностью внешней мембраны, соответственно) и исследовали действие фракции 1 из митохондрий на ЭТ в них. Их интактность оценивали по способности хлоропластов восстанавливать феррицианид (он не проникает через внешнюю оболочку хлоропластов [Эдварде, Уокер, 1986]).

Оказалось, что внесение фракции 1 в реакционную смесь с хлоропластами 1 класса сразу же приводит к росту скорости реакции Хилла (рис. 3), что свидетельствует о потере ими интактности. При этом ЭТ не нарушается, но снижается скорость ФФ, что возможно либо при утечке протонов и нарушении таким образом протонного градиента, либо при другом способе нарушения активности хлоропластных АТФ-синтетаз. Эти выводы подтверждается снижением величины абсорбции в хлоропластах, предынкубированных с митохондриями, при длине волны 388 нм в присутствии ФМС [1вапчанка 1 др., 1991].

АН 420 пт 0,9 -1

Рис. 3. Кинетика реакции Хидда с феррицианидом в хлоропластах 1 (1) и 2 (2) классов в присутствии фракции 1 (1' и 2', соответственно).

Получение фракции 2 из митохондрий и ее влияние на скорость реакции Хилла. Так как было установлено, что митохондриальная фракция 1 не содержит ингибитора ЭТ в хлоропластах, что противоречило полученным ранее данным об ингибировапии митохондриями реакции Хилла [Иванченко с сотр., 1986], провели дополнительную промывку осадка после получения фракции 1 и получили фракцию 2.

Исследовали ЭТ в хлоропластах без предынкубации и с предыпкубацией в присутствии фракции 2 в течение 3 ч. Результаты подтвердили наше предположение: фракция 2 содержит ингибитор реакции Хилла, который спижа-

ет скорость Э'Г даже без предынкубации с хлоропластами (рис. 4). Исследование чувствительности фракции 2 к кипячению при 100°С в течение 5 мин показало, что она, как и митохондриальная фракция 1, является тсрмоста-бильной. Более сильное действие термообработанной фракции 2 на скорость реакции Хилла в хлоропластах проявляется после 3 ч предынкубации, причем активность возрастает приблизительно в 5 раз.

{, мин

Рис. 4. Кинетика реакции хилла с феррнцианидом в присутствии фракции 1 (2), фракции 2 (3) и осадка после получения фракции 2 (4). Контроль - 1.

Очистка ингибитора ФФ

Для очистки разобщителя ФФ из фракции 1 использовали следующие процедуры. Фракцию 1 кипятили при 100°С в течение 5 мин при Ю0°С, центрифугировали 30 мин при 16000 g для удаления коагулировавших белков. Полученный супернатант методом гель-фильтрации раз;ч\чяли на колонке с гелем ТОУОРЕАЯЬ Н\У-40 на 6-7 подфракций. Параллельные подфракции после нескольких разгонок объединяли, концентрировали в вакуумном роторном испарителе и исследовали их влияние на фотохимическую активность хлоропластов. Самой высокой ингибиторной способностью обладали подфракции 3 и 6. Степень их очистки определяли нативным электрофорезом в 15%-ном 11Л.ЛГ. Подфракция 3 давала 1-2 полосы с ОЭП 0.06 и 0.1, что соответствует М,„ ~ 64-67 кДа.

Биологическая целесообразность действия митохондрий на фотохимическую активность хлоропластов in vivo

Так как фракция 1 ингибирует циклическое ФФ, то ее влияние связано с работой базапьного транспорта электронов и ФС 1. Местом действия этого эффектора, скорее всего, является комплекс цитохром hjí, на который замыкается цепь электронного транспорта при циклическом ФФ с ФМС. С другой стороны, способность эффектора митохондриальной фракции 1 изменять структуру мембран указывает на то, что ингибирование этерификации Р„ может происходить из-за утечки протонов и неспособности, таким образом, создания протонного градиента на мембране тилакоида.

Место ингибирования ЭТ эффектороммитохондриальной фракции 2 не установлено, что составит предмет дальнейших исследований взаимодействия хлоропластов и митохондрий п клетке.

Особенно важно отметить, что оба этих эффектора не ингибируют ФФ и ЭТ полностью, что дает возможность хлороиластам поддерживать некоторый уровень АТФ и НАДФН. Это свидетельствует о том, что отмеченное влияние митохондрий на фотохимическую активность хлоропластов возможно in vivo.

Как известно, высокий уровень отношения АТФ/АДФ поддерживается, главным образом, митохондриями [Heidt, 1969; Fliege et al., 1978; Flügge, Heidt, 1991]. Поэтому представляется возможным, что присутствие в митохондриях разобщителя ФФ и ингибитора ЭТ предопределяет биологическую целесообразность наличия у них механизма, позволяющего успешно конкурировать с хлоропластами за аденилаты как субстрат для образования мак-роэргических соединений в тех случаях, когда фотохимическая активность хлоропластов ограничена. В этих случаях хлоропластам необходим дополнительный приток энергии, который обеспечивается митохондриями.

Нечто подобное описано для животных клеток [Скулачев, 1989]. В тканях, характеризующихся большим потреблением энергии, например, в мышечных, в печени, когда необходима быстрая передача энергии, митохондрии образуют крупные агрегаты шаровидной или нитчатой формы, а также сетчатые структуры, которые автор назвал «митохондриальпый ретикулум». Он также отмечал, митохондрии перемещаются именно в ту часть клетки, которой в данный момент времени необходима энергия макроэргических соединений.

Таким образом, по-видимому, существование указанного механизма интеграции эиерготрансформирующих органелл необходимо раститениям для поддержания клеточного гомсостаза в условиях постоянно меняющейся внешней среды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Показано, что под действием митохондрий ингибнруются реакции ФФ и Хилла в хлоропластах гороха. Степень подавления фотохимической активности хлоропластов зависит от концентрации митохондрий в реакционной среде и времени их совместной предынкубации в темноте без кофакторов ФФ. Эффект возрастает и сохраняется даже после удаления митохондрий из среды инкубации [1, 4].

2. Действие митохондрий, выделенных из листьев и корней этиолированных проростков ячменя на фотохимическую активность хлоропластов по характеру проявления не являлось специфическим, т.к. митохондрии разных органов ингибировали ЭТ и ФФ [2, 4].

3. Установлено, что митохондрии выделяют в среду инкубации два водорастворимых эффектора белковой природы: один разобщает ФФ, другой ингибируст ЭТ в хлоропластах. Присутствие хлоропластов в среде выделения не влияет на скорость выделения эффектора из митохондрий.

Разобщитель ФФ находится в первой митохондриальной фракции. Он устойчив к действию высоких температур (100°С) и протеолитических ферментов (трипсина и проназы), его активность прямо пропорциональна концентрации белка в реакционной среде. Первая фракция гетерогенна по составу. Из шести подфракций наибольшей ингибиторной способностью обладают 2 и 3 подфракции после гель-филмрации. 3 фракция даст при электрофорезе 1-2 полосы с ОЭП 0.06 и 0.1, что соответствовует Mm ~ 64-67 кДа.

Ингибитор ЭТ находится во второй митохондриальной фракции. Он труднее вымывается из митохондрий, устойчив к действию высоких температур и для проявления его ингибиторной способности необходима пре-дынкубация с хлоропластами [3-7, 9, 10].

4. Эффектор из фракции 1 модифицирует проницаемость внешней мембраны хлоропластов in vitro, что обусловливает изменение фотохимической активности хлоропластов. Он не влияет на базальный транспорт электронов, однако, снижает скорость ФФ, изменяя активность хлоропластпой АТФ-синтетаз7»1 [10, 11].

5. Описан новый механизм взаимодействия хлоропластов и митохондрий на уровне трансформации энергии, который реализуется при помощи эффекторов белковой природы [3, 6, 10,11].

список

опубликованных научных работ Обуховской Л.В.

1. Иванченко В.М., Маршакова М.И., Урбанович Т.А., Микульская С.А., Обуховская Л.В. Влияние хлоропластов и митохондрий на энерготрапсфор-мирующие функции друг друга // ДАН СССР, 1986. — Т. 291, N 2. — С. 505-508.

2. Иванченко В.М., Маршакова М.И., Микульская С.А., Обуховская Л.В. Исследование in vitro влияния митохондрий на функциональную активность хлоропластов // ДАН СССР, 1987. — Т. 296, N 3. — С. 766-768.

3. Иванченко В.М., Маршакова М.И., Микульская С.А., Обуховская Л.В. Исследование механизма взаимовлияния хлоропластов и митохондрий in vitro // Сб. кр. научн. сообщений биохимиков Белорусской, Латвийской и Эстонской ССР "Молекулярные механизмы регуляции метаболических процессов" .-Мн., 1987,— С. 274.

4. Иванченко В.М., Маршакова М.И., Микульская С.А., Обуховская Л.В. Влияние митохондрий на кинетику фотохимической активности хлоропластов // В кн.: Вопросы взаимосвязи фотосинтеза и дыхания. — Томск: изд-во Том. ун-та, 1988. — С. 37-47.

5. Обуховская Л.В. Выделение и очистка ингибитора реакции фотофос-форилирования из митохондрий корней гороха // Тез. докл. "IV Всес. конф. молодых ученых по физиол. раст. кл." ( 15-20 апреля 1990 г., г. Минск). ■— С. 37.

6. Иванченко В.М., Маршакова М.И., Микульская С.А., Обуховская Л.В., Урбанович Т.А., Карсонова H.A. О регуляторном взаимодействии хлоропластов и митохондрий в растительной клетке // Тез. докл. "Второй съезд Всес. общ-ва физиол. раст." (24-29 септ. 1990 г., г. Минск. — С. 37.

7. Иванченко В.М., Маршакова М.И., Шевкова С.Н., Обуховская Л.В. О свойствах митохондриального белка-ингибитора фотофосфорилирования // Тез. докл. "Ill Вссрос. общ-ва физиол. раст. (24-29 июня 1993 г., г. Санкт-Петербург).— С. 115.

8. Иванченко В.М., Обуховская Л.В., Мурашко C.B. Влияние водных экстрактов из митохондрий на ЭТ в хлоропластах // Тез. докл. I съезда Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (22-23 ноября 1994 г.) - Мн.: изд-во БГУ, 1994.-С. 66.

9. Обуховская Л.В., Иванченко В.М., Мурашко C.B. Влияние водного экстракта белков митохондриальных мембран на скорость электронного транспорта в хлоропластах гороха // Тез. докл. II съезда Бел. общ-ва физиол. раст. (18-20 окт. 1995 г., г. Минск). — С. 65.

10. Иванченко В.М., Маршакова М.И., Микульская С.А., Урбанович Т.А., Обуховская Л.В., Вишняков C.B., Карсонова H.A., Шевкова С.Н., Избавите-лев С.П., Мурашко C.B. Обнаружение и исследование водорастворимых регуляторов переноса энергии в митохондриях и хлоропластах // Проблемы экспериментальной ботаники: к 100-летию со дня рождения В.Ф.Купревича. Под ред. В.И.Парфенова. — Минск: Беларуская навука, 1997. — С. 339-347.

11. Обуховская Л.В. Действие водорастворимой белковой фракции из митохондрий на ЭТ в хлоропластах различного структурного состояния // Becui HAH Беларусь 1998. — 106-107.

18

РЭЗЮМЕ Абухоуская Людмша Уладз1м1рауна

Уплыу мггахондрый на эпергатрансфарлпруючыя функцьп хларапластау in vitro

Ключавыя словы: хларапласты, мггахондрьп, ¡нтэграцыя, бялю-эфектары, фотах!\пчныя рэакцьп (рэакцыя Xmai фотафасфарылявання).

Мэтан працы было: даследваць мехашзм i асабл1васц1- уплыву лн'тахондрый на фотах1\пчную акгыунасць хларапластау. Вызначыць природу гэткага уплыву.

Выяулена, што мггахондрьп inri6ipyroub рэакцьп фотафасфарылявання i электронны транспарт у хларапластах in vitro. Ступень шпб1'равання прапар-цыянапьна канцэнтрацьп \йтахондрый у рэакцыонным асяроддз( i часу су-меснай перадыпкубацьй арганэл у асяроддз1 выдзялення без кафактарау фотафасфарылявання i электроннага транспарту. KineTbiKi рэакцш характара-зуюцца прысутнасцю лаг-фазы, якая вызначае час, неабходны для пра-нжнавення эфектарау у хларапласты. Вызначана прысутнасць у м1тахондрыях 2 эфектарау — разабшчыцеля фотафасфарылявання i iiiri6iTapa электроннага транспарту. Абодва эфектары маюць бялковую пры-роду, з'яуляюцца тэрмаустошпвымг Разабшчыцель фотафасфарылявання усто!швы да дзеянная пратэаз. Паказана яго здольнасць праходзщь праз знешнюю мембрану хларапластау. Выкарыстаннем метада гель-фшьтрацьп дабшкя павел|'чэння яго актыунасш ~ у 100 разоу. На{больш актыуиая фракция пры нашуным электрафарэзе у ПААГ давала 1-2 паласы, саадносныя Mw = 64-67 кД.

Мяркуееца, што inri6ipyi04bi уплыу мггахондрый на фотафасфарыляваппе i электронны транспарт звязаны з канкурэнцыяй з апоипшп за адэш'латы ва умовах ix шзкай фотах1м1чпап актыунасцг

РЕЗЮМЕ Обуховская Людмила Владимировна

Действие митохондрии на энерготрансформнрующис функции хлоропластов in vitro

Ключевые слова: хлоропласта, митохондрии, интеграция, белки-эффекторы, фотохимические реакции (реакция Хилла, фотофосфорилирова-ние).

Целью работы было: исследовать механизм и особенности действия митохондрий на фотохимическую активность хлоропластов, определить природу этого влияния.

Установлено, что митохондрии ингибируют реакции фотофосфорилиро-вания и Хилла в хлоропластах in vitro. Степень ингибирования пропорциональна концентрации митохондрий в реакционной среде и времени совместной предынкубации органелл в среде выделения без кофакторов фотофосфо-рилирования и электронного транспорта. Кинетики реакций характеризуются наличием лаг-фазы, которая определяет время, необходимое для проникновения эффекторов в хлоропласты. Обнаружено наличие 2 эффекторов — разобщителя фотофосфорилирования и ингибитора электронного транспорта. Оба эффектора имеют белковую природу, являются термостабильными. Разобщитель фотофосфорилирования устойчив к действию протсаз. Показана его способность проникать через внешнюю мембрану хлоропластов. Методом гель-фильтрации на TOYOPEARL HW-40 добились увеличения его активности в ~ 100 раз. Наиболее активная фракция при иативном электрофорезе в ПААГ давала 1-2 полосы, соответствующие Mw = 64-67 кД.

Предполагается, что ингибирующес действие митохондрий на фото-фосфорилирование и Э'Г в хлоропластов связано с конкуренцией с последними за аденилаты в условиях их низкой фотохимической активности.

SUMMARY

Obukliovskaya Ludmila Vladimirovna

The effect of mitochondria for the energy transformation function in chloroplasts.

Key words: chloroplasts; mitochondria; integration; protein-effectors; photochemical reactions (Hill reaction and photophospliorylation).

The aim of this work was to investigate the mechanism and characteristic property of the effect of mitochondria for the chloroplast photochemical activity to define the nature of this effect.

Mitochondria were found to inhibite the Hill reaction and photophospliorylation. in vitro. The degree of inhibition was proportional to mitochondrial concentration in the reactional medium and to time of cooperative pre-incubation them in the medium of extraction without cofactors of photophospliorylation and electron transport. Kinetics of this reactions are specified of the presence of the lag-phase, wich estimate the time for penetrate of effector into chloroplast. It is detect the presence of two effectors in mitochondria - uncoupling of photophospliorylation and inhibitor of electron transport. Both effectors have protein nature and arc termoresistance. Uncoupling effector of photophospliorylation is resistence to action by proteinase. It is demonstrate its capability to penetrate through envelope chloroplast membrane. Using gel-filtration method with TOYOPEARL HW-40 its activity was increased in 100 time. The most activity fraction demonstrates 1-2 zone in PAAG electroforesis in the range of Mw = 64-67 kD.

Its suppose that inhibition action of mitochondria for photophospliorylation and electron transport is concerned with concurrence for adenilates in condition of low chloroplast activity.