Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СТРУКТУРНЫЕ И МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПЕРЕХОДЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ ХЛОРОПЛАСТОВ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "СТРУКТУРНЫЕ И МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПЕРЕХОДЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ ХЛОРОПЛАСТОВ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К. И. ТИМИРЯЗЕВА

(3 / На правах рукописи

МОЛОТКОВСКИЙ Юрий-Георгиевич

СТРУКТУРНЫЕ И МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПЕРЕХОДЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ ХЛОРОПЛАСТОВ

• (03.00.12 — физиология растений)

Автореферат , диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 1972

АКАДЕМИЯ НАУК СССР . ' ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им/ К.А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

МОЛОТКОВСКИЙ ЮРИЙ ГЕОРГИЕВИЧ

СТРУКТУРНЫЕ 1 МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПЕРЕХОДУ ИЗОЛИРОВАННЫХ ХЛОРОПЛАСТОВ

(03.00.12 - физкодогия рамеикй) . _

- - ■ ' ' ' /

Автореферат диссертации на; соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва —1972-;

Работа выполнена £ группе структуры ж функций мембран

1 ' ордена Трудового Красного Знамени Института фиэиологии растений им.К.А.Тимирязева АН СССР

Официальные оппоненты: • доктор биологических наук Н.П.ВОСКРЕСЕНСКАЯ доктор биологических наук Н.С.ГЕЛЬМАН доктор биологических наук В.Б.ЕВСИГНЕЕВ

На официальный отзыв диссертация направлена на кафедру биофизика Московского ордена Ленина и орденаТрудовогоКрасного Знамени Государственного Университета««. М.В.Ломоносова * " '

' Защита диссертации состоится (¡о января 1975г. на заседании Ученого Совета Института физиологии растений ■м. К.А.Тимирязева АН СССР

Автореферат разослан декабря 1972г.

Отзывы и замечания направлять по адресу:

127273/М0с»а^ М-273П Б0Таю1Чв0Кая; 35 , ЮР АН СССР,

ученому секретаре, доктору бкох. наук В.И.Кефели

.1 • ВВЕДЕНИЕ

, Специальный раздел в области изучения биоюгическигмембран составляв» исследования динамичных свойств ях структуры и взаимосвя-

. - • ... - т . ... • •• _ • - •• .4.. . V •• . --.-*■ .... •■• • ' Л>, * •

зи между структурным состоянием и функциональной активностью мембранных систем. Начало этому направлению было положено ^ начало 60-х годов зксперимонгами, проведенными.на изолированных митохондриях животных, в которых была установлена лабильность ■■.'их структуры и ее быстрые

■ • ' ......... ' ■■. •. • ■ - ■■.. .У '-.л ■■'■■■■ - '■ ' ' ■

исменения при.действии самых разнообразных.факторов, сопровождаемые в ряде случаев изменениями метаболической активности / Baaflaub, 1953»'Hunter', Ford, 1955» Lehnlnger, 1956; Chappell, Qrevllle, 1958 /. Развитие этих исследований в.последующем позволило предположить существование достаточно строгой зависимости между структурным состоянием" и активностью, мембран и возможность синхронного их изменения / Hnckenbroci, :1966j1967s Ute-uai, Packer, . 196?; Wrlggleewortii, Packer, 1968./« Выяснение механизмов изменения структурно-метаболических состояний изолированных митохондрий и игоропластов с.неизбежностью приводит в необходимости разрешения мирового круга вопросов, . касающихся молекулярной.организадаи мембран, механизмов трансформации оноргин, трансмембраяного переноса ионов и авторегулирования. Был предложен ряд гипотез, с разных позиций¿объясняющих,возможные механи- -зкы одновременного регулирования структурного состояния и метаболической акткгности мембранных систем.

4 Формально мехаяохимический характер изменения объема митохондрий к. хлоропластов позволил предположить существование в мембранах акто-. ниозкнподобного:болка (АШЕБ). Рядом авторов была С9здана стройная концепция , согласно которой АЫПБ рассматривался как ключевой белок-' -фермент в процессах регулирования структурного состояния мембран, Г ' ; Т

их проницаемости, активности окислительного и фотосиятетического фос форилирования /ife&olngor, .1959, Казакова, Нейфах, 1963; Василоц, 1967; Ленанджер, 1964/. •-.

Вместе с теи било предположено,, что многообразные структурные изменения мембран могут осуществляться под действием осмотических сил, возникавцих в результате активного транспорта ионов / Hunter •t el., 1969;Hunter, Brierly, 1971; Бакаева, Ясайтис, 1971 /. Изменения функционального состояния при атом могут происходить вследствие высокоамплитудных изменения объема и конкуренции процессов "синтеза АТФ и транспорта ионов за первичный энергопотенциал.

На протяжении последних лет рядом авторов развиваются представле ния об энерго8ависимых конформационных переходах в мембранах, которые в результате кооперативного их осуществления, могут приводить к изменении конфигурации мембран. В зависимости от ряда условий изменение степени энергизацни мембран может сопровождаться возникновением различных ультраструктурных состояний / pennlston et'al., ,1968s Harris et al., 1968; Jolly et al., 1969 /. , V

' В последнее время сделаны экспериментально обоснованные предпо-.-ложения о существовании ряда дискретных информационных состояний мембран, превращения которых друг в друга в форме фазоЕШ переходов могут индуцироваться действием экзогенных факторов (мембран-аятивных эффекторов,*температуры) и эндогенных процессов / Конев и др. ,1970; Raison et ai., 1971; Черницкий и др., 1972; Колиовер, Блюменфельд,-' 1972'/. - V -

Рассмотрение перечисленных гипотез дает возможность предполагать существование известного множества способов синхронного изменения структурного состояния и активности мембран, которые не могут быть сведены к единому механизму. Следует отметить, что экспериментальные

обоснования существующих гипотез получены в результате исследований, проведенных преимущественно на митохондриях животных, плазматических мембранах микроорганизмов, эритроцитах и липь в небольшой части -на изолированных хлоропластах.

Вместе с тем установлены существенные изменения улыраструктурц хлоропластов в клетках листьев растений при различных режимах освещения в зависимости от качества света и условий засоления / Апур, Осапова, 1965; Еахов', Балаур, 1969; Строгонов и др., 1970; Власова и др., I97I /, которые, как установлено в ряде случаев, сопровождаются изменением функциональной активности выделенных из опытных ; растений хлоропластов / Воскресенская и др., 1968 /. Предполагается, что изменения, ультраструктуры и активности хлоропластов при длительных, световых воздействлях связаны с изменением их состава / Воскре- .-. сенская, 1965; Воскресенская и др., 1968/.'

Наряду с этим в" изолированных хлоропластах обнаружены быстрые свето-зависимые изменения структурного состояния. В частности, в -развитие хемоосмотическоП:гипотезы /Mitchell, 1961 /, на хлоропла-. стах позазано, что трансмембранный градиент рН является не только первичным энергопотенцяалом, возникавшим приосвеценил, ной реиавцкм фактором в измоиёнви кок^ормадии и конфигурации мембран - закисле-пие виутритилакоидного пространства на свету сопровождается обратимой денатурацией <3елков, протониро£гшиеи мембран и изменением их конфор-МПЦИИ / D«oa«r al., 190?! Murni&ai, Packer, 1969, 1970; Packer ot ai. , 1970 /.Амплитуда структурных изменений при этом достаточно строго соответствует уровню Ьнергизацни хлоропластов / щпд, Jageadort, 1965П Jagendorf, Квтаавп, 1965 /. Эти данные дают возможность предполагать'существование механиамов регулирования структурно--метабогического состояния хлоропластов, основанных на изменения электрохимических свойств мембран, что в известной мере подтверждав--

тся отдельными исследованиями /shavit, Avron, 1967; Diiiey, Rhotetein,.1967; Gross, Packer, 1967; Иванченко, Кручинина, 1969 /. В период, когда мы начинали собственные исследования, было неизвестно существуют ли другие механизмы единого регулирования структурного и метаболического состояния хлоропластов, как, впрочем, было неясно, существует ли. реально строгач зависимость между структурными переходами и изменением функциональной активности хлоропластов. Поэтому, начав в,1962г. исследования на изолированных.хлоропластах ряда.растений .( бобов, табака, гороха ), мы поставили целью выяснение -следующих вопросов : \

1 - насколько лабильна структура хлоропластов, возможны ля кардхаа-. льные изменения структуры под влиянием внеяняг.факторов нандо-

.. •. генных процессов, каков механизм структурных переходов;

2 - существует ли взаимосвязь структурного и метаболического состоя-

ний хлоропластов, каковы механизмы установления соответствия мевду ними; •■":■:■■..;■■•..■■ .■■•■■■■.■-•

5 - следует ли рассматривать процессы, вызывающие синхронное изме--нение структурного и метаболического состояний, как способы регулирования.

В результате^проведенных экспериментов установлено, что отчетг ливые и стабильные структурные и метаболические переходы хлоропластов совершаются при действии экзогенных факторов ( поД влияаиемпрогрева,. при изменении концентрации солей.) ив результате.эндогенных процессов {, при свето-индуцируемом транспорте ионов; образовании знергозависн-мых конформаций отдельных комплексов в мембранах ). Исследования и анализ этих явлений позволили'рассмотреть некоторые принципы^организации мембран хлоропластов, способов их работы и механизмов регулирования. ..... . ...... i ■ ■.-■/■... .

СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ХЛОРОПЛАСТОВ ПРИ ПРОГРЕВЕ

Исключительная роль энерготрансформируюцих органелл - митохондрий и хлоропластов - в обцем обмене веществ клетки позволяет предполагать существование специфических механизмов изменения их активности при действии неблагоприятных температур.; В митохондриях теплокровных животных установлено адаптивного характера терморегулируемое сопряле- . пие дыхания' и фосфорилирования с участием эндогенно образуемых факто- \ ров липидной природы / Северин и др., 1960; Скулачов, 1962; Левачев и др., 1965'/.В изолированных митохондриях растений разобщение окислительного фос£орилирования наступает под действием супраоптималь-ных температур / Молотковский, 1961 /, ,

К 1962г., когда была начата наиа работа, отсутствовали сведения о влиянии прогрева на хлоропласты. Исследование этого влияния дало возможность установить существование в хлоропластах специфической системы регулирования их состояния^ которая наиболее отчетливо проявляется в экстремальных температурных режимах. 4

Прогрев .при 40° суспензии изолированных хлороплрстов в изотонп- -. ческой солевом^растворе вызывает их набухание', которое регистрируется . по изменены) оптической плотности суспензии при540 ни и прямыми измерениями веса осадка после скоростного центрифугирования. Набухание, индуцируемое прогревом, сопровождается прогрессирувким. падением фотохимической акгивлосгя хлоропластов - после 20 минутной экспозиция сохраняется лг.иь следовал активность нециклического транспорта электронов ( расЛ ). Внесение в среду АТФ и Ц5++ вызывает сокращение хлоропластов и частичное восстановление фотохимической активности.^ Болео полное восстановление.исходного структурно-функционального состояния происходит при одновременной с АТФ и Мд++ внесении сиворо-ючного альбумина ( СА )/ Ыо1обкотзку, zhвstko▼a, 1965; йолотковскай,

б

Активность,7о

76

Рис.1. Изменение объема хлоропластов н активности реакции Хияла < в % от активности в исходном состоянии ) , при прогрело.

■ олеат,20мкМ

♦ . ■

Активность,0/.

АТ<Р,М£,СА . . 85

Рис.2. Изменение объема хлоропластов и активности реакции Хилла ( в % от активности в исходной состоянии ) под влиянием олеата. . _

Жесткова, 1966/. Эти эксперименты свидетельствуют о наличия в хлоропласта! специфического для данных условий механизма, синхронно регулирующего их структурное я метаболическое состояние. Механохимнче-* ский характер наблюдаемых изменений объема хлоропластов позволил • предположить участие в механизме регулирования актомиозинового.

КОШТЖвКСЯ. И ТЯЧЯЯИЙ ипшга. --------

чительную роль в регулировании структурного" состояния и активности мембранных систем различного происхождения выполняет гипотетический актомиозинподобный белок /Lehninger, <1959; Ленинджер, 1964; Нейфах, 1964 /. Предпринятые нами попытки выделить АЫПБ .или каким-либо способом показать его функционирование в мембранах хлоропластов были безуспезными и привели к заключению, что регулирование объема хлоропластов осуществляется но моханохимическим способом. Впоследствии било показано, что мембраны митохондрий и хлоропластов но-содержат АМПБ /Conover, Barony, 1966» Toung, Packer, 1966? Гогориивилн,' Заалипвили, 1968 /.Вместе с тем изменения объема хлоропластов.при прогреве но связаны с возникновением осмотических градиентов, поскольку наблюдаются в темноте в присутствии диурона, т.о. в условиях, исключасдих активный транспорт ионов и образование трансмембранного градиента солей. Очевидно, что структурные изменения хлоропластов, сопровождаемые изменением их активности, определяются эндогенггнш -процессами в мембранах, которые индуцируются прогровоы.

Нофакторная роль СА в процессе восстановления исходного состоя-' ■ ния хлоропластов при внесении АТФ позволила предположить, что измене- , ния объема' и активности хлоропластов при прогреве могут быть связаны с эндогенным образованием свободных жирных кислот ( СЖК ), достаточно специфическим адсорбентом которых является СА / Lewie, Fowler, 1960; Dalgaroo, Birst, 1963 /. СЖК рассматриваются как высокоактивные

природные регуляторы, эффективность действия которых установлена для митохондрий / Hulanaan et al., 1958; Eeaaert, Lehninger, 1958 /. Жирные кислоты обладают поверхностноактивнымя свойствами и способны вызывать изменения конформации белков / Мосолов, 1964; spector, John, 1968 /. .*•."■;'

. Проведенные эксперименты показали, что экзогенные СИ являются миметвками прогрева и внесение их в среду в концентрации не превыиа-

ющеЯ вызывает набухание хлоропластов и подавление реакции

Хилла (рис.2 ). действие СХК ( на примере олеата ) может быть : обращено последующим внесением АТ>, СА. Предварительное, добавле-

ние к среде инкубации-СА предохраняет хлоропласт от действия прогрева и олеата в равной степени / иодотковский, Хесткова, 1965; Полотков-ский, Жесткова, Капуро, 1966; мо1о«сатвку, ¡гьвагкоуа, 1966/. -Прямыми определениями было установлено, что при прогреве в хлоропластох образуются СХК в количестве, достаточном для полного подавлены. .реакции Хилла. Газо-хроматографический анализ -фракции СХК из прогре- ' хых хлоропластов, выделенной'хроматографированием в тонком слое сила- / кагеля, показал, .что основная их часть представлена линоленовой-.г• .-"-•: кислотой /,Молотковский, Жесткова, 1966 /, которая относится к числу'наиболее активных эффекторов, модифицирующих структурное и -функциональное состояние мембран митохондрий / зоЬо1вГ1вЫ, 1963 /.

Образование СХК в хлоропластах'является, результатом гидролиза* • .. части фосфолипидов, входящих в состав мембран, эндогенной фосфолипа-зой А / Иодотковский, Хесткова, Каяуро, 1966; Ыолотковский,.1968 /« что подтверждается следующими данными. В модельных опытах обработка хлоропластов препаратом фосфолипазы А, выделенной из яда кобры, > вызывала изменения, аналогичные действию прогрева или экзогенного " . ■ олеата; Хелатирование с помощью:ЭДТА кофактора.фермента - ионов, кальция - заметно тормоэило действие на хлоропласт экзогенной . . фосфолипазы-А или прогрева; присутствие в среде СА также предохраняло хлоропласт от повреждений, наносимых действием фосфолипазы А * ♦ или прогрева/ Из. ацетоновых препаратов-хлоропластов с помочью метода,-: предложенного Росси и. др. " / Еооа1 ее а1., 1965 /, была выделена , • фракция белка, обладающего 'активностью фосфолипазы А; Количественная тонкослойная хроматографии позволила установить; что прогрев хлоропластов в течение 30 мин. приводит к гидролизу части фосфолипидов. - -

При этом не наблюдалось преимущественного гидролиза каких-либо , , определенных фосфолипидов - напротив, отмечено равномерное снижение ..',■■ содержания фосфатидной кислоты, фосфатидилглзцерина, дифосфатидил-: v глицерина, фосфатидилннозита. Известно, что скорость гидролиза фосфолипидов фосфолипазой А зависит от плотности их улаковкя в мицеллах и монослоях^ /Walte, Siosoa, I97I; zoerafi et.al., 1971 /. v^; Очевидной причиной начала гидролиза фосфолипидов в мембранах хлоропластов является^разрыхление их упаковка под влиянием прогрева. ■> ' Квази-плавление лнпядной части мембран при повыиснии'температуры установлено в последние годы с помочью гидрофобных ЗПР-зопдов ' / Еянеков и. др.,1971; . Eilsen et al.," 3971 /. Эндогенно.образуемые свободные жирные кислоты^могут быть акцептированы.в составе ^фосфоли-? пндов в процессе ресантеза последних при внесении АТФ, как это-установлено для изолированных митохондрий ' / WoJtczak. Lehnlnger,' ~ 1961; «Tojtcsak ot ol.; 1963 /. На основании проведенных опытов пред-.; полагается существование специального пула фосфолипидов, гидролиз" которых не вызывает какях-либо изменений состояния хлоропластов, если образуемые при гидролизе СХК связываются сывороточным альбумином. Возможно, что фосДолилиды, входягдае в этот пул, выполняют специфическую роль доноров СЕ; Изменение нх,упаковки под влиянием различных . - эффекторов, в тег; числе температуры, может служить первым'отапок включепиясистемы регулирования, основанной на ондогенном образовании СIE. ^ - v * . "

- .Основные результаты наиих исследований были подтверждены в работах ряда авторов /HiaMda et al., 1966; isnratomi,'Hobel.', 1967;' Con3tantopsulcB, 2enj-oii, IS$S; Priedlaader, Housaan, . ' 1968 / И использовались для объяснения процессов структурных в функциональных < изменений хлоропластов la-eltu ■ / теп den Drieeecho, 1966 / и в искусственных средах после изолирования / conetantepoulos, Kenyon,. 1963; Priuilacdor, So\aiann, 1968

В последующем били расзирены представления относительно меха- . низма действия CIK нафотохимические реакции в хлоропластах / Katob, Зал Metro, 1967; Taaaablta, Butler , 1968; Cohen et al., 1969; Brody, 1970; Brody et al., 1970/ и влияния прогрева на основные функции хлоропласгов / Тарчовский, Заботин, 1972 /.

В специально проведенных экспериментах была установлена ; тождественность действия" прогрева и раствора олеата на ультрасгруктуру и активность хлоропластов в клетках листьев.табака и бобов / Ыолотков-ский, Хесткова, Казуро, 1966 /, что предполагает возможность осуцесх- -вления 1л vivo тех же механизмов изменений при прогреве, которые описаны для изолированных хлоропластов. .-,■>■ ; ^ -

. • ■' ИЗМЕНЕНИЕ СТРУКТУРНОГО СОСТОЯНИЯ И АКТИВНОСТИ . • ХЛОРОПЛАСТОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ МОНОВАЛЕНТНЫХ КАТИОНОВ с: - .

Возможность предполагать существование механизма регулирования состояния хлоропластов, основанного на изменении электрохимических свойств мембран, обоснована :в разделе "Введенио" настоящего авторе- .■-., ферата. Это предположение дало начало серии экспериментов, в которых, испытывалось действие солей.на структурное и метаболическое состоя- ' ние хлоропластов. ? ■ .. : ;

Цягкие процедуры обессоливания хлоропластов промывкой изотоническим раствором деиоиизованной сахарозы при рН 5,5-6,0 или электродиализом на холоду вызывают значительное подавление нециклического транспорта электронов, поглощения протонов на свету и катализируемого фоназинметасульфатом „ ( <Я1С ) фотофосфорилнрозания. Подавление полностью обратимо последующим внесением в среду солой(;рис. 3) ■ / Молотковский, Дзюбенко,. 1970; Молотковский, Дзюбенко, Тимонина, 1970 /.Линейная зависимость скорости перечисленных процессов от

ю » 50 «> 50 , : \ концентрация ссл1и,пМ—' •

Ряс. 3. Влияние концентрация солей на скорость реакции Хялда

концентрации солей при построении графика двойных обратных величин показывает, что она подчиняется закону действующих масс (рис.4). Полунасыдение скорости при рН-7,8 достигается;для поглощения Н+ -при концентрации солей 2 мМ, нециклического транспорта электронов - < 14 ыМ, фото{осфорилирования - 10 м!1. '

-Исследование зависимости процесса поглоцения протонов от концентрации солей показало, что она может быть объяснена.с учетом роли моновалентных катионовв поддержании злектронейтральности протонного градиента. Удаление из хлоропластов катионов при обессоливании злектродиализом приводит к их протонированию. Добавление в темноте-к суспензии протонированных хлоропластов солей калия или натрия -' приводит к обменной диффузии катионов внутрь тилакоидов и к выделению в среду протонов. Последующее-освещение"приводит к подщелачива- ' нию среды до исходного уровня, что свидетельствует о поглощении'. протонов в количестве, эквивалентном выделенному пород этим в темноте. Добавление солсй к . аналогичной суспензии хлоропластов на свету не вызывает изменений рН среды - ионообменной диффузии катионов ■ внутрь хлоропластов препятствует возникающий при освещении электропотенциал на мембране, плюс которого 'расположен на внутренней"стороне иси'брани. Проведенные расчеты показывают,.что количество поглощаемых на свету протонов в объеме хлоропластов ( 600 нэкв Н* на мг хлорофилла ) составляет приблизительно 10 мэкв/л. Экспериментально'установлено; что солевое "насыщение" протонного насоса.в хлоропластах \ достигается при 10 мМ KCI или цаС1 в среде - при данной концентрации катионов'обеспечивается поддержание злектронейтральности протонного градиента. Это позволяет заключить, что поглощение протонов хлоропластом« на свету происходит как результат индусируеыого сваток-.. ; катксн-протонного ойиена с заполненной протон-акцепторных групп мембран и внутритилакоидиого пространства протонами в обмен на

выделяемые в среду катионы (рис. 5) / Uolotkovsky, Dzjubenko, 1968; Молотковский, Дзюбенко, 1970 /.

Рис. 5. Схема образования электронейтрального градиента протонов в хлоропластах' ( транспорт на свету обозначен светлыми стрелками, в темноте - темными ).

Вместе, с тем скорость фотофосфорилирования1 при 10 mU солей в среде, что достаточно для полной активации протонного насоса, составляет менее „половины от максимальной, достигаемой при 50 uii солей, в среде. Исследования этих расхождений в солевом обеспечении процессов образования первичного знергопотенциала (дрН ) и последуюцеЯ его трансформации в макроэргические связи АТФ.показадо, что скорость последнего процесса зависит от электрохимических свойств мембран, определяемых.концентрацией солей в среде. Установлено, что мембраны хлорояластов,, подобно мембранам митохондрий / Scarpa, Azzi , 1968; Gear, Lebalnger , 1968; Jacobus, Erierley , 1969 /, является слабыми катионобменниками и могут находится в двух формах - протони-рованной и.солевой. Полное насыщение катионакцепторных групп мембран при рН 7,8 происходит при концентрации солеЯ моноваленгных '«елочных

металлов равной 50 м]|. Переход хлоропластов в дротонировазяую форму сопровождается кажущимся уменьавнием кислотных свойств мембран, что объясняется влиянием фиксированных отрицательных зарядов на диссоциации рядом расположенных киолотных групп, значение рк£ которых =>6,0. Внесение в сроду солей приводит к образованна катион-аннонкых ' пар в устранении электростатических взаимодействий, что вызывает ионизации дополнительных.кислотных групп - происходит увеличение числа анионных групп и усиление кислотных свойств мембран / Нолот-ковский, Дзюбевко, Ткмонина, 1970, 1972 а,б /. Плотность фиксированных анионных групп в хлоропласта* достаточна, чтобы вх взаимодействие вызвало деформации мембран. В сахарозной среде с повыяениеи степени ионизация кислотных групп пря довыяеняи рН в усилении элехтростатн-чоских взаимодействий отрицательных зарядов происходит набухание хлоропластов (рис. 6, кривая I). В солевых растворах в присутствия катионов, нейтрализусзих отрицательны» заряды мембран, объем хлоропластов лиаь л слабой степени зависит от рН среди ( рис.€, кривые 2,3) Возможность^ влияния кулоновских сил отталкивания в мембраяах хлоропластов на вх информационное состояние подтверждается результатам* \ измерения параметров дисперсии оптического времени V области аффекта Коттояа для <х -спирала белка. Пря переходе хлоропластов из прогонированной формы в солевуи происходит характерный сдвиг экстремума гладыш от 235 нм х 238 нм ( рис. 7), что свидетельствует об ? усялеяия гидрофобных взаимодействий / Молотковский, Дзюбенко, ; Тимоняна, 19720 /. Аналогичное красное смещение эзстреяумов ЛОВ

набжх5даля Райглесворт я Пэкер /»г1Е81е8»01ЛЬ, йюкег , 1969,1970 /

ва субпитохондриалышх частицах, суспендированных в бессолевой среде, при уменьвении плотности отрицательных зарядов на меабраяах после снижения рН среда.

Обратимые переходы хлоропластов из солевой формы в протониро-

; ьо •

, •30 ад ьа то áo pu -

Изменение объема хлоропластов с изменением рН среда.

1 - в растворе деиокнзованной сахарозы ( )•

2 - в растворе N«CI (120 klf ),

7.'Кривые ДОВ фрагментов хлоропластов в протонированной (---} к солевой ( -— ) форие.; -. ,..■■■■■■■..'■' .

ванную сопровождаются радикальными изменениями ультраструктурц. В результате обессоливаяия в хлоропласта* исчезают границе тилакоиды, а сами хлоропласты представляют систему крайне плотных линейных ' мембран ( рис. .8, пароход Г в состоявиеБ). Добавление к суспензии" протонированных хлоропластов солей ( не менее 20 при рН > 7,5 ) : вызывает образование граякых тилакоидовсобранных в четко очерченные упаковки грая и происходит расслоение межграняых тилакоидов на две ; параллельные мембраны с заметным промежутком между внин ( рис.8, проход 2 в состояние А ). В зависимости от концентрации солей в ^ среде наблюдаются промежуточные ультраструктурныо состояния хлоропластов. Переход хлоропластов в.безгранную форму при обессоливашга ' является результатом плотного слипания параллельных мембран граиных ; и межгранных . тилакоидов • / Иолотковский, Дзюбенко, Тимонина, 1972а,б /.

Приведенные данные позволяют рассматривать хлоропласты как " гибкие полианионы, состоящие на связанных гидрофобными,взаимодействиями субъединиц,на поверхности которых фиксированы кислотные группы, способные к ионообменному связыванию катионов. В зависимости от степени ионизации кислотных групп и концентрации противоионов в сроде, возможны изменения взаимодействия отрицательных.зарядов -анионных групп, достаточные для обратимых изменений конформадионного ' состояния и ультраструктурц хлоропластов. При недостатке солей отталкивание одноименных зарядов в мембране вызывает ослабление гидрофобных связей , причем степень ослабления увеличивается с повызением плотности зарядов, зависацей от величины рН. Экранирование отрицательных зарядов в солевой среде катионами ослабляет злектростатхчас-кие взаимодействиям приводит к усилению гидрофобных связей. Торможение процесса фотофосфорилирования при недостатке солей в среде . > ; может быть объяснено усилением ионных взаимодействий в мембране

затрудняющих онерго-коыформавдонные этапы трансформации потенциала протонного/градиента в химические связи АТФ.

Эффективное регулирование структурно-метаболического состояния хлоропластов, основанное на изменении электрохимических свойств мембран, происходит в пределах физиологических значений pH ( 6,0-8,0) ■ концентрации солей (1-50 мМ ), что предполагает возможность его осуществления в клетке.

С ВЕТО-ИНДУ ЦИРУЕ110Е НАБУХАНИЕ II ИЗМЕНЕНИЕ . v ' АКТИВНОСТИ ХЛОРОПЛАСТОВ

ч Освещение вызывает изменения объема хлоропластов, характер и амплитуда которых полностью зависят от состава среда ( рис. 9 ). а. В растворе сахарозы хлоропласт обнаруживают1 быстрое низкоамплитудное сокращение, обратимое при последующем выключении света.

•"■ ■■ '.'■■. f . ' . V л '

КС1,-е~

К auemam

Рис.9. Свето-индуцируеаде

изменения объема хлоропластов в различных средах.

Эти обратимые переходи связаны с образованием протонного градиента и отражают изменения, которые наступают при'закислении внутритилакоидного пространства на свету - обратимой кислотной денатурации и протонирования мембран.

б. В растворе'солей слабых кислот ( ацетат калия ) освещение вызывает высокоамплитудное сокращение ( рис. 8, переход 3 в состояние В ), обратимое в темноте. Ыеханизм сокращения, предложенный Крофтсом и др.' / 0го14а вЬ а1., 1967 /, состоит в транспорте по градиенту рН недиссоциированных молекул слабых кислот. -

' Указанные структурные переходы но сопровождаются стабильными изменениями функциональной; активности хлоропластов.

в. В растворе солей сильных кислот ( КС1 ) освещение индуцирует высокоамплитудное набухание, необратимое при последующем выключении света. В "результате свето-индуцяруемого набухания хлоропласт превращаются,» конгломерат баллонообразных везикул •

■ (рис. 8, переход 4 в состояние Г).

Измерения, проведенные в среде набухания, показывают, что набухание хлоропластов сопровождается ускорением нециклического транспорта электронов при относительно неизменном, по сравнению с исходным," уровне фотофосфорилироваяия. Но отделение осадка набухяих хлоропластов от среды, в которой производилось набухание, приводит к резкому падению "фотофосфорилирования ( табл. I ). Добавление надосадочной. жидкости восстанавливает фотофосфорилирование даже после предварительного ее кипячения в течение X - 2 мив. Установлено,'что в состав фактора, вызывающего восстановление фотофосфорилирования, входит . фосфатидяая кислота. Таким образом, свето-индуцнруемоо набухание переводит хлоропласт в неустойчивое состояние рыхлого сопряжения электронтранслортных реакций с механизмом фосфорилирования, которое

* - ' • . Табл.I

Изменение активности хлороплпстов в результате-свето-ин^упи-

. руемого нпбухапия ( в % Л»

Варианты транспорт о" - синтез АТФ

Исходные хлоропласты • ' доо '' • ICO

Набухпие хлоропласты ■ - 160-180 0-25

------"— + суперватанх „'■* - . - 95

легко сненпотся состоянием полного.разобщения'при-отделении десорбп-руемого. с мембран фактора липидной- природа. - ■ : •

Высокоамплитудное набухание обнаружено на изолированных хлоро-плзстах в 1УбЬг./ Packer, Slogenthaler, 1965/, но механизм этого " явления не получил удовлетворительного объяснения.-Проведенные исследования показали, что свето-индуцируемое набухание хлоропластов в растворах:солей сильных кнслот( KCl ) происходит в результате -транспо рта по градиенту концентрации и полю электрического заряда на мембране хлор-иона, для которого мембраны хлоропластов в темноте'слабо проницаемы. Предполагаете!: при этом, что плюс"заряда на внутренней стороне мембраны расположен в липидной фазе и недоступен для нейтрализации хлор-ионами.. Эдектронейтралыюсть процесса поддерживается *, диффузией внутрь хлоропласгов К+, для которых мембраны хлоропластов легко проницаемы. Выравнивание осмотического давления по обе стороны мембраны вызывает;набухание. В обоснование предлагаемого механизма свето-индуцируемого набухания хлоропластов получены следующие данные.

I; Б-растворе, содержащем нопроникаюиие анионы аспарагиновой кисло-* ты, хлсропласты в темного сохраняют неизменным свой объем в течение длительного, времени ( рис. 10 ). В растворе KCl в темно-~.те хлоропласта обнаруживают крайне медленное 'спонтанное кабуха-■ . ние. Внесение хлоропластов в растворы,содержащие проникающие —

анионы I" или N0^, вызывает быстрое высокоамплитудноо набухание, которое относительно слабо стимулируется валиномицином. После окончания темнового набухания последующее освещение в присутствии CMC не вызывает дополнительного эффекта. Следовательно, мембраны хлоропластов относительно легко проницаема для К+ и слабо проницаемы для CI"; свет не индуцирует набухания, если предварительно в темноте, в результате пассивной диКузии, выравнена концентрация солей по обе стороны мембраны.

Рис. 10. Темновое спонтанное и свето-индуцируемое набухание

ч ' хлоропластов в различных средах.

Внесение хлоропластов (ХЛ) и валиномицина (ВАЛ* 90нЫ) указаны стрелками. ~

Свэто-нндуцзруеиое набухание в растворе KCl заметно подавляется пикриновой кислотой, электрофорез липид-растворимых анионов которой приводят к нейтрализация мембранного потенциала /, GriniKs et а!., 1970 /. Диссапирование злектропотеяциала при внесении в среду одновременно 2,4-ДНФ и валиномицнна полностью подавляет свето-индуцируемое набухание¿"Напротив, максимальная скорость свето-индуцируемого набухания наблюдается ■

в растворе - в атом случае С1~ поступает внутрь хлоропла

стов по градиенту электропотенциала па иеибраяе.и заряду поглощенного Внесение в КН^С1-среду валиномицина, открывающего канал свободного выхода через мембрану ионов аммония, резко тормозит набухание.

3. Ускорение свето-индуцируемого набухания происходит при внесении в КС1-среду валиномицина ж низких концентрациях или проникающего катиона тетрабутиламмония. В обоих случаях ускорение набухания связано с быстрой диффузией катионов через мембраны, обеспечивающей поддержание электронейтральности внутренней среды хлоро-. пластов.■

~ Искусственно индуцируемое повыявние ионной проницаемости мембран хлоропластов ( в результате предварительного двухсуточного старения, внесения 2,4-ДНЭ совместно с валиномицином,' обработки низкими концентрациями детергента тритон-Х-ЮО ), вызывающее их спонтанное набухание в темноте в солевых растворах, сопровождается массивным выделением в среду протонов в результате ионообменного связывания монова-лснтных катионов мембранами хлоропластов. Очевидно,', что растяжение мембран при набухании делает доступными для взаимодействия с катионами кислотные группы, расположенные внутри мембран. Предполагается, что свето-индуцируемое набухание сопровождается избыточным насыщением мембран катионами.

Как результат указанных процессов происходит ослаоление гидрофобных, связей в мембранах хлоропластов. В проведенных совместно .с сотрудниками Института химической физики АН СССР А.И.Папиным я 11 .Г.Гольдфельдом исследованиях для определения' состояния гидрофобных участков мембран;был использован гидрофобный иминоксильний ЭЛР-зонд ' 2,2,6,6-тетраметил-4-калрилоилоксипиперидин-1-оксил. Измерения

микровязкости гидрофобного окружения зонда в мембране, о которых судили по величине анизотропии спектра ЭПР сигнала ( <х ) показали существенное ее.уменьшение у набухиих хлоропластов по сравнения с исходными. Анизотропный спектр ЭПР-зонда в мембранах исходных хлоропластов ( с* = 0,23 ) сменяется почти изотропный в мембранах набух-вкх хлоропластов ( « = 0,01 ). Следует отметить, что изменение состояния гидрофобных участков мембран ори набухании является специфической особенностью этого процесса,-происходящего на свету в солевых растворах, и отнюдь не определяется действием лишь осмотических сил. Это подтверждается тем, что суспендирование хлоропластов в гипер- и гипотонических растворах сахарозы ( 0,8 11 и 0,04 11 ) но сопровождается изменениями состояния гидрофобного микроркружения . зонда. • . ' ■ ■. ... V . - - •.■■■■.'■-■'.■

Проведенные исследования показывают, что в растворах солей сильных кислот ориентированный по возникающему при освещении градиенту электропотенциала на мембране транспорт анионов внутрь тилпкегдез " способен вызвать изменение конфориации,'ультраструктуры и функциональной активности хлоропластов. В растворах солей слабых кислот^чергз— —мембраны хлоропаасгсг -осуществляется ориентированный в противоположном направлении транспорт молекул слабых кислот по возникающему на свету градиенту рН, который вызывает сокращение объема и увеличение микровязкости гидрофобных участков мембран (с*, = 0,5 ). В зависимости от соотношения концентрации в среде анионов сильных и слабых кислот возможны:различные соотношения полярно.ориентированных транспортов и, соответственно, возникновение широкого спектра структурных изменений хлоропластов ' - ' 1 ,

ФОСФАТ-ИНДУЦИРУЕНОЕ ИЗМЕНЕНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО И СТРУКТУРНОГО СОСТОЯНИЯ ХЛОРОПЛАСТОВ

Конформационная гипотеза сопряжения электронтранспортных реакций в мембранах с механизмом синтеза АТФ, предложенная в 1964г. Бойором, получила экспериментальное / Hodges, Нала on, 1965; Green, Harria, 1969 / и теоретическое" / Bennun, „ 1971;Блвыен$ельд, Колмовер, 1972/ обоснование. В исследованиях, выполненных на изолированных хлоропла-стах, показано, что образование протонного градиента и трансформация его в химические связи АТФ сопровождается знергозависимым конформа-ционным переходом сопрягающего фактора - обратимой АТФазы /Eyrie, Jagendorf', 1971, 1972 /. Предполагается, что энергизацня мембран может вызывать кооперативные изменения конформации, которые приводят к заметным изменениям ультраструктуры / Pcnniston et al., 1968/.

В проведенных нами исследованиях была установлена возможность осуществления, отчетливого структурного и метаболического перехода, хлоропластом в результате энергозависимого изыенения состояния сопрягающего фактора - обратимой АТФазы.

В средах, исключающих возможность расходованкя-хлоропластами энергии света на какив-либ<Гпроцессы, кроме вааикодействия с неорганическим фосфатом, освещение вызывает их переход в полиостью разобщенное состояние. Освещение хлоропластов в течение нескольких секунд в сахарозной среде при полном отсутствии солей н АДФ, но в присутствии • фосфата в* низких концентрациях, приводит к последующему усилению — нециклического транспорта электронов, полному подавлении фогофосфо-рилирования и обращению транспорта Н+ - Еа свету хлоропласт выделяют протоны в среду ( табл. 2 ). В присутствии íi£C и прн' кптвгсив-ности освещения 4-IÖ5 зрг*см ""^cck""1 полупериод . процесса изменения метаболического состояния хлоропластов составляет 0.5 секунды, а

полунасыщеяио достигается, при 50 мкМ фосфата в среде. Аналогичное состояние разобщения в хлоропластах наступает, если энергозависимое взаимодействие их с фосфатом обеспечивается-добавлением в темноте ATO и других нуклеозидфосфатов. - < . ■ ; . -

. ' ' " * \ "Табл^ 2 ' , "

... - - ■- ' * . ... ■■ . . .Г- • .......; \ ........... .....

Индуцируемые неорганическим фосфатом изменения метаболизма . . хлоропластов ( в % ).

Активность . . ' хлороп исходные ласти: ; : - вд-обработакны«-

транспорт о~ синтез АТФ Н+ \ ~ 100 . -100 " 100 *- 5 280 - 450 - о, ■".. V. * ' 1 , . "2 -

Индуцируемые фосфатом изменения функциональной активности .„■■■ хлоропластов сопровождаются возникновением;при освевеняи специфиче- -...■ = ской волнообразной конфигурации мембран (рис.8, переход 5 в состоя--иие Д ).' Установлено, что волнообразная-конфигурация является , нестабильной и, сохраняясь на сэету в течение длительного времени (несколько минут ),. исчезает при последующем выключении света. Волнообразная конфигурация мембран возникает также при инкубации хлоропластов в темноте-в растворе сахарозы в присутствий АТФ. В мито-ч хондриях животных возникновение .волнообразной конфигурации . ( твист-конфигурации ) мембран при их взаимодействии в'знергизовапном состоянии-с фосфатом было установлено в лаборатории Грина /РепяАаСоп - еЪ аХ . 1ЭС8 /. Для хлоропластов возможность'перехода в ; ■ твист-конфигураиию установлена впервые. ■ —

■ ...■•.:■ Высокая~эффективность процесса фссфат-индуцируеыого разобщения фосфорилнрования предполагает, что изменению подвергается один из

этапов механизма сопряжения. В результате проведенных исследований установлено, что изменение активности хлоропластов при фосфат-обработке является результатом десорбции из состава мембран сопрягающего фактора при-его энергозависимом взаимодействии с фосфатом, которое одновременно сопровождается окислением части сульфгядрилышх групп, входящих в состав сопрягающего фактора и неизвестного пункта в мембране. В обоснование.предлагаемого механизма получены.следующие данные.

1. Обработка хлоропластов низкими концентрациями п-хлормеркурн-

... бензоата ( пХМБ ), блокирующая сульфгидрилыше группы активного центра сопрягагщего фактора / С2*але, КаЬа , - 1966; Сагеи, КаЬа , 196? /, вызывает изменения активности хлоропластов, аналогичные изменениям при фосфат-индуцируеиом разобщении фотофосфорилирования. . "

2. Специфическая экстракция из хлоропластов-сопрягающего, фактора

. раствором ЭДТА в бессолевой среде при рН 8,0 / Дте-сп, 1963 / вызывает изменения активности хлоропластов, аналогичные изменениям при фосфат-индуцируеиом разобщения фосфорилиройанвя и обработке пХЫБ. ч > : 3. Дисковый гель-электрофорез в полиакрнлаыиднсм геле показал

идентичность белка , десорбируеного в среду при фосфат-обработке хлоропластов на свету или при АТФ-обработке в темном ъ сахарозной среде, и сопрягающего фактора, входящего в состав ЭДТА-экстра-кта исходных хлоропластов. / .1

4. Перекрестная "гибридизадия хлоропластов, из которых сопрягающий фактор ( СФ ) предварительно экстрагировал раствором ЭДТА (., ЭДТА-хлоропласты ), с СФ," десорбируемым в среду при фосфат-обработке "('ФН-СФ ), показывает, что реконструкция фосфорилирую-

- ' ■■;'■ г?

цей системы достигается в более полной объеме ъ присутствия дямеркадтопропанола С ДШ1 ) ( табл. 3 ). Гибридизация хлоропластов, .подвергнутых фосфат-обработке ( Фн-хлоропласты ), с ЗДТА-С5 приводит к восстааовленип фосфорилирующей активности лишь s присутствии ДМП. ' ■ . .

Табл.3.- ■ .

Реконструкция фосфорилирующей системы у ЭДТА-экстр агиро-- ванных и фосфат-инактивированных хлоропластов.

Варианты . ; синтез АТФ

мкмоз/мг хлорофилла в час

Контроль 64

ЭДГА-хлоропласты ' v О

4- ЭДТА-СФ 30

+ Ф_-СФ : \ \ II

—»— + Ф„-СФ + 2ыМ ДМЛ 23

<®а-хлоропдасты О

+ ЭДТА-СФ ■ -- ' .' ;____о

__--ч—-+ ЭДТА-СФ + 2м51 № 28

5. Присутствие в среде сульфгадрильних соединений в низкой концентрации ( 1-2 мМ ) предохраняет фозофосфорилхроваяие от инаяти-вадав/ври фосфат-обработке.

Вявргозависимая фосфат-инактивация фосфорилирования зависит от исходного электрохимического состояния"мембран хлоропластов. Индуцируемые освещением в присутствии фосфата изменения активности, хлоропластов уменьшаются по мере возрастания в среде концентрации KCl ( рас. II ). Аналогичные результаты получены с jCcCI. %С12 предохраняет фосфорилирование ох знергозавгеииой инактивации фосфатом в концентрации, приблизительно в 10 раз мевьжвй, чем концентра-

ция солей моновалентных металлов. В присутствии солей не возникает волнообразная конфигурация мембран. Подавление фотофосфорилирования в результате фосфат-обработки в сахарозной среде происходит лииь при pH выше 7,0.

too%

" 10 30 ксим50

Рис.II. Влияние фосфат-обработки хлоропластов на скорость нециклического транспорта электронов ' (е~), фотофосфорилирования ( АТФ) и количество поглощаемых протонов (¿Н+) в зависимости от концентрации KCl в среде. ; - :

Таким образом, эффективное разобщение фосфорилнровакЕЯ.а электронтранспортных реакций происходит при фосфат-обработке в условиях, которые обеспечивают максимальное взаимодействие отрицательных зарядов в мембране. Десорбция СФ из состава мембран рассматривается как результат ослабления его взаимодействия с мембраной при переходе в энергоконформаци» я образовании комплекса с неорганическим фосфатом. Десорбция СФ открывает канал свободной диффузии протонов через мембрану и приводит к возрастанию скорости электрон-

. транспортных реакций, но контролируемой потенциалом протонного" градиента.Возникновение волнообразной конфигурации мембран объясняется кок результат генерализации локальной межмолекулярной дислокации в пункте сброса СФ по всей напряженной мембрано в условиях, когда в ней"максимально усилены зарядовые взаимодействия.

Приведенные данные позволяет установить принципиальную возможность синхронного изменения ультраструктуры и активности хлоропластов, регулируемые знергозавясямым изменением состояния сопрягаюдого фактора. ■ ■ ■ -

' - СИСТЕМЫ РЕГУЛИРОВАНИЯ СТРУтРКО-МЕТАБОЛИЧНЗКОГО. СОСТОЯНИЯ •

ХЛОРОПЛАСТОВ

Представленные материалы позволяет предполагать для хлоропластов существование специфического способа регуляции,-основанного на. зависимости между структурным сосгоянимги Функциональной активностью мембран. Эффективность атого способа регуляции может меняться "в зависимости ог-ОССбЗНносгей механизмов ,:вызцваючих_структурпые -изменения.-В продолах полученных данных "существует возможность' 'Классифицировать'зти механизма по:степени их сложности!а последовательно рассмотреть изменения структурного состояния,' вызываемые а) непосредственным влиянием внекнях факторов, б)-индукцией ¡эндогенных процессов в мембранах, в) преимущественным идя исключительным" стимулированием одного из процессов.

а). В известном приближения мембраны хлоропластов могут рассматриваться как гибкие матрицы, скелет которых организован гидрофобными взаимодействиями компонентов, несущих|отрицательные заряди.4 Взаимодействие зарядов в мебране," непосредственно зависящее от '

концентрации солей, в протонов в среде, определяет упругие деформации и структурное состояние мембран в широком диапазоне свойств. При этом кардинальные изменения ультраструктуры хлоропластов при переходе ог протонированной форкын солевой и конфориацнонные переходы происходят как результат постепенных изменений, осуществляемых"по мере связывания меыбранг^ш моновалентных катионов. Проведенные исследования дают ос^вание рассматривать катионы моновалентных щелочных металлов как облнгатные компоненты мембран. Высокая эффективность моновалентных катионов как модификаторов структурного состояния хлоропластов, определяется свойствами ыеабран кок гибких полианионов. Цы склонны особо подчеркивать это свойство мембран, поскольку оно в значительной мере выпадало до сих лор из поля зрения ; < исследователей и, за редкими исключениями / Конев и др., 1970 /, не принималось во внимание при-рассмотрения способов функционированием регулировшш1 мембранных систем; Вместе с тем существует достаточно обширное количество фактов, полученных.в исследованиях, проведенных на модельных системах и природных мембранах, которыо подтвервдаит мембранотропную роль катионов. Изменение гидрофобных, связей при взаимодействии катионов с анионными группами обнаружено > мицеллах фосфолипядов,. искусственных фосфолипидных мембранах и нативных мембранах различного происхождения с помощью флюоресцентных - и.<ЭПР.'зондов \е£ 1969; ,¥апйегкоо1,- Маг^оаоаЗ. , 1969;* СвгЪсп, 1970; Ва^ег « а1., 1970 /. Б спитах на эрчтроцятах устпн >вягяо ослабление гидрофобных связей в результято глубокого ооессс-иьания, достаточное для самопроизвольной диссопяацяи мембрьн на от.: , гьныа коплексы г/ма51а, КиЬу , * 19§8 /• Состояние пигментных комплексов в изолированных хлоропластах и распределение скергаи меадудр/мя фотосистемами изменяется в зависимости огстопонк

насыщения мембран катионами / сьы. et «1., 1971« Hurata, 1971 /

Очевидно, что механизм регулирования, основанный на изменении электрохимических свойств меибрая под влиянием катионов и протонов среди, является высокоэффективным: изволения концентрации солей в протонов индуцируют взвенения в мембранах в точение секунд; влияние во опосредовано через какие-либо.промежуточные зтапы; -.активность хлоропластов может меняться в вироком диапазоне от крайнего ижнимува до полной активации; взмеяения затрагивает во отдельные участка ненбрая в частные реакции, а состояние мембран в целой в весь комплекс осуществляемых с вх участием.процессов. На основадвв полученных данных в вх анализа ее» возможность полагать, что усяея-вость'будущих исследований хлоропластов во всех возможных аспектах во многом может определяться твв, насколько полно будет учитываться способность вембрая осуществлять обратимые копформациоаные переходы в зависимости от состояния и взаимодействия фиксированных на вх гибкой матрице воногвнпа: групп.

б). Под влиянием вневввх факторов л мембранах хлоропластов может происходить индукция специфических процессов, приводящих"к изменению вх состояния. Tax, разрыхление упаковки фосфогнвдов о повызеяивя температуры автоматически вххючае* систему регулирования с участием окдогекной фосфолипази А. Процесс» ферментативного гидро-хяза фосфолвпадов актввируетоа лрв любых воздействиях, умвяыахдях плотность вх упаковка в мицеллах, либо отпадных слоях мембран ~ под влиянием рН к концентрации солей в среде / de Haas et al ., 1971 /, при действии детергентов вля осмотического вока /Waite

et al . ,1969;'Pejeant et al ., 1970; fioelofeea et «1., 1971 /. Следует ожидать, что процессы гидролиза фоофоявпкдов и образования свободных жирных кислот s мембранах должны регулироваться фактора»

среда и изменениями метаболического их состояния, оказывающими влияние на плотность упаковки фосфолипидов, что подтверждается в ряде работ /Wojtczak, Lehainger , 1961; Weinbacli, Garbus, 1968 /. Быстрое, в течение 10 секунд, образование GZK в изолированных митохондриях в количествах, достаточных для изменения их сгруктурно--метаболического состояния, обнаружено под влиянием ионов кальция / Alimona et al., ч1970 /.Возможно, что своеобразным датчиком изменения ряда параметров среды - температуры, концентрации солей, протонов - является специальный пул фосфолипидов, предположение о существовании которого сделано на основании данных, приведенных " в первом экспериментальном разделе. Детергентное действие СЖК, образующихся в результате гидролиза.фосфолипидов, входящих в этот пул, полностью обращается при возрастании в среде-концентрации АТФ, т.е. существует замкнутый цикл процессов, соотношения которых иогут .. обеспечить переход хлоропластов в различные состояния. Можно полагать что ускоренный гидролиз фосфолипидов в хлоропластах при прогреве и образование токсических количеств СЖК является результатом диско-ординации процесса регулирования. Возможно, что в хлоропласту в1 норыесуществует тонкая система регулирования уровня концентрации СЖК и токсические■их количества при прогреве образуются уже . как результат односторонне гипертрофированной деятельности этого механизма. Предлагаемый механизм изменения структурно-метаболического состояния мембран, основанный на эндогенном образовании СЖК, уступает по-быстродействию другим механизмам, рассматриваемым в настоящей ' работе, поскольку для его срабатывания необходимо относительно продолжительное время, в течение которого осуществляется следующая цепь процессов: повышение атакуеиости фосфолипидов -.образование СКК - детергентное действие СЖК. : ,

■■ t- 33

з). Нвруасняе метаболического равновесия в хлоропластахв результате односторонней стимуляции одного яз .процессов, сопровождается изменением жх структуры, что влечет, в рвов очоредь, изменение'V общей функциональной активности. Возможность осуществления подобной триады явлений была ранее продемонстрирована на изолированных митохондриях животных, высокоаплитудныв изменения объема которых в результате поглощения ионов сопровождались синхронными изменениями скорости дыхания и окислительного фосфорилировання / Utaual , Packer, 1967; Deamer et al 1967; Packer ,1970 /.

На примере явления свето-индуцируемого набухания показано, что неравномерноо распределение ионов я молекул по обе стороны мембраны в результате осуществления в цих векторного метаболизма может служить одним яз механизмов изменения структурно-мотаболичоского ' состояния хлоропластов. Возникновение двух различных состояний хлоропластов - набухшего и сокращенного - является результатом различно ориентированных транспортов ионов я моложул по одной из двух составляющих; электрохимического потенциала, возникающего при ч освещения. Сокращение объема хлоропластов в растворах солей слабых— кислот происходит в результате транспорта недиссоцинрованных молекул, кислот по концентрационНоЯу .градиенту" протонов (&рН ), тогда как набухание.хлоропластов происходят в результате распределения анионов сильных.кислот по градиенту нх^концентрации и поли"злоХГрэтеского' потенциала (ду ). Преимущественная роалязащю каждого из механиз--нов транспорта полностью определяется ионным.составом среды: с . \ . увеличением молярной доли coiett слабых кислот растворе хлоридов происходит вначале торможение свето-индуцируемого набухания, ас дальнейшим увеличением их относительной концентрации - сокращение хлоропластов на своту. В искусственных средах свего-индуцируемое набухание хлоропластов обладает высокой чувствительностью к

освещенности - ощутимая скорость набухания регистрируется при освещенности ниже 2000 лк, а полное насыщение процесса достигается при 10 000 лк, когда все основные свето-зависнмые реакции хлоропластов ( транспорт электронов, фотофосфорилжрование ) далеки от насыщения. В клетке листа благодаря наличия сложного содового раствора, включающего целый набор анионов слабых^кислот, освещениевызывает обратимое сокращение хлоропластов / КнаЫа* е* а1., 1964; Раекег вЪ ей., 1967 /, которое сопровождается изменением жх солевого состава / ЯоЪвХ , 1969 / и строго параллельным уменьшению объема увеличенном скорости фотофосфорилированвя / НоЪв1,1968; НоЪеХ еЪ «1 ., 1969/ в выделения кислорода / тал Дев Вг1евясЬв, 1966 /. Очевидно, что регулирование активности хлоропластов, определяемое изменением ях структурного состояния в результате свето-индуцируемого транспорта ионов, может осуществляться 1а т1гв столь же эффективно, как ив искусственных средах. Ориентация возникающего на свету в хлоропластах осмотического градиента должна определяться изменением концентрация в клетке слабых кислот - фосфата и субстратов дыхания. Необходимо помимо этого отметить, что хлоропласты занимают исключительное положение в регулирования солевого обмена клеток листа и рассматриваются как внутриклеточные аккумуляторы-ионов / 8<госЫпв, Оа«аа, 1962; Ьагкии, 196й-/.'Учитывая полярно различную ориентацяп ионных транспортов через мембраны митохондрий в хлоропластов, можно предполагать, что,индуцируемые светом массивные потокя ионов з хлоропластах следует рассматривать как одага из возможных механизмов интеграции клеточного обмена. '

Проведенные исследования процесса энергозависямого фосфат-тиндуцируемого разобщения позволяют предполагать исключительную роль сопрягающего фактора - обратимой АТФазы - в регулирования

, 4 ' " 35 структурно-метаболического состояния хлоропластов. Фосфат-индуцируо-iioo разобщенно может рассматриваться как результат влияния отрицательного, ректора (анкона фосфата ) на фермент,' чувствительность ' которого' к эффектору зависит от его эноргосостояния и: электрохимических свойств мембран. Переводе© в энергоконформацию повивает его -способность взаимодействовать с различными соединениями - известно, что специфичность СЭ хлоропластов по отнощению к фосфату относительна поскольку в энергизованной форме он способен взаимодействовать с сульфатом /Kjrle, Jagcadorf, 1971 / и полианионами гепариновой, полигалактуроновой и др. кислот / Poiya, Jageadorf, 1970 /, что сопровождается частичной ого инактивацией в соловых растворах. Сопрягающий'фактор рассматривается как ключевой фермент в процессах трансформации энергии /mtohell, I968 / и регулировании-скорости электронтранспортшсс реакций /wit«, .1967 /. Полученные данные позволяют расширить эти представления и установить принципиальную возможность осуществления структурно-метаболического перехода хлоропластов в результате энергозависимого изменения состояния С? в мембранах. • ■;■■■.:■ ..........■ .• '

• Рассмотренные материалы могут быть подытожены в виде следующих общих положений. , • '. ■ - - ■

Для уровня организации, который занимают мембраны хлоропластов, специфической особенностью является отсутствие абсолютно устойчивого структурного состояния .Напротив, абсолютным являются непрерывные изменения структурного состояния вокруг некоторой оптимальной > конфигурации. '. ',' • - ; ' .

' ■■■ ■...... :)••• ' ■■ '4- ■ . : . •■ • '■■■ ' ч •,■■•■'.. "

Мембраны хлоропластов следует рассматривать не как инертный носитель ансамблей активных молекул - ферментов и переносчиков -

зб

а как динамические структуры, состояние:которых определяет активность (Процессов, осуществляемых с их участием. Синхронизация структурных и метаболических переходов хлоропластов может определяться а) тем, что ферменты и переносчики, являяськомпонентами мембран, испытывают „изменения одновременно с матрицей, в состав которой вмонтированы, . б)изменением их микроокружения^ и условий-взаимодействия друг с другом . и с.мембраной. • * • .. - . ■ ■ .....' ., .

В принципе переходы можду структурно-метаболическими состояниями хлоропластов могут осуществляться, в.зависимости от'механизма регулирования, либо плавно, в результате постепенных модификаций структуры,' либо скачкообразно, в результате кооперативных изменений-конформации белковых и лцдидных компонентов мембран. В действитольностя регулирование состояния хлоропластов липь в некоторых случаях может .".., = происходить по принципу "все пли ничего", а з основном,осуществляется постепенно,-в пределах некоторого порядка величин. -

•.Силами, стабилизирующими структуру мембран хлоропластов, следует • признать гидрофобные взаимодействия. Любые структурные переходы . .■._■■,. ' с неизбежностью сопровождаются; деформацией гидрофобных с'цеплониЯ.- г , Возврат к исходному.состоянию может .осуществляться-с затратой энергии либо благодаря спонтанному восстановлению первоначального объема. ' ■■ гидрофобных связей поело исчезновения зарядовых и диполышх возмущений и детергентных.влит ний^ ■ ^ . ' - ■. ■:. "■>■■■ ■:. ■ < . ■ широкий спектр структурно-метаболических переходов хлоропластов ./■ осуществляется при .участии сяоци?ического для каждого случая ■•"•. механизма - регулирования. Установленные механизмы регулирования не .. составляют иерархической системы, предполагающей соподчинение, и являются вполне независимыми. В принципе вполне допустимо:существование множества структурно-метаболических состояний хлоропластов '■■.;'{ "смеаанного" типа в результате одновременного-срабатывания незавц-

симых систем регуляции в различной их соотноыонии. При сопряженном ' осуществлении ряда функций мембраны хлоропластов находятся в состоянии динамического равновесия между различными.структурными состояния -ли и выбор в пользу ядного из них определяется в равной.стопени изменением условий,.непосредственно влияющих на структуру, и (или) преимущественным стимулированием одной из функций. V ' .

- ' ~ ' ' ,„ шведа * _ ■ -

. I.-Установлено существование принципиально различных механизмов - -, регуляции, вызывающих одновременное изменение структурного состояния и метаболической активности мембран хлоропластов. 2. Мембраны хлоропластов по физико-химическим свойствам являются

. слабыми'катионобменниками:с гибкой матрицей и могут существовать ■ в двух обратимых формах.-.протонированной и солевой. Регулируемые - , изменением концентрации солей моновалентных.щелочных металлов и протонов в среде переходы хлоропластов из "'одной формы в другую 4 сопровождаются изменением их конформационного состояния, конфигу-. рации я активности. ~ •• • • :>■-. ■ ■ - . ■

а) Насыщение акцепторных групп мембран катионами вызывает уменьаение взаимодействия отрицательно заряженных групп, фиксированных -в мембранах. В результате переход хлоропластов

в соловую форму сопровождается усилением гидрофобных'взаимодей ствкй, регистрируемых по изменению параметров дисперсии оптиче . • \ ского вращения в УФ и видимой части спектра. . " -

б) Ультраструктура двух форм хлоропластов резко различается:

. . протонмрованная форма не содержит гранных тилакоидов,"-хлоропла -сты представляют систему плотных.линейных мембран; в' солевой" . . форме хлоропласт .обладают ортодоксальным строением.*В завися-

мости о; степени насыщения акцепторных групп мембран катионами наблюдаются промежуточные состояния ультраструктуры.

в) Зависимость скорости поглощения протонов хлоропластами на свету, транспорта электронов и фогофосфорилироваяия от концентрации солей в среде подчиняется закону действующих масс в пределах 1-50 uil. Активирующее влияние солей на процесс поглощения протонов хлоропластами на свету ( полупасыщенио . при 2 нЫ солей ) может быть объяснено в райках хемоосмотической гипотезы с учетом роли моновалентных катионов в поддержании электронейтральности протонного градиента. Активирующее влияние солей.на : процессы транспорта электронов и фото$осфоридиро-вания С полунасыщение при 10-14 мМ солей ) объясняется как результат зависимости энергоконформационных переходов, необходимых для трансформации энергии градиента рН в химические

. связи АТФ, от электрохимических свойств мембран, регулируемых -------СОЛЯМИ. " ' .' ■ ■' г" ■

г) Свойства хлоропластов как полианиона с гибкой матрицей обеспечивают эффективное регулирование их структурного состояния и активности при изменении концентрации солей и протонов

в среде в пределах их физиологических значений (1-50 кМ солей, рН 6,5-8,0 ). , '

Предполагается наличие в хлоропластах системы регулирования, компонентами, которой^являются механизмы быстрого ферментативного образования свободных жирных кислот, и их энергозависимого акцептирования в составе фосфолипидов.

а) Набухание и подавление фотохимической активности хлоропластов при прогреве связано с поверхностноактивным действием эндогенно образующихся СЖК. ■ \

б) Источником СЖК является специальный пул фосфолипидов,

гидролизуемых эндогенной фосфолипазой А. Инициация гидролитического образования СЖК определяется 'повышением атакуемости фосфолипидов для фосфолипазы А в результате нарушения их упаковки в мембране при прогреве. • • в) Влияние прогрева, экзогенных СЖК (олеат) и экзогенной ■ фосфолипазы А на структурное и метаболическое состояние хлоропластов обратимо последующим внесением смеси АТФ, Ывн" и " сывороточного альбумина. -Структурно-метаболические переходы хлоропластов могут вызываться трансмембранными градиентами ионов и молекул, образование которых индуцируется светом. _

а) Высокоамлитудное свето-индуцируемое набухание в растворах солей сильных кислот превращает хлоропласты в конгломерат баллонообразных везикул, в которых устанавливается рыхлое сопряжение "электронтранспортных реакций с механизмом фосфори-лирования. : '

б) Набухание хлоропластов является результатом транспорта анионов сильных кислот по электрическому полю мембранного : потенциала, возникающего при.освещении. Электронейтральность, внутренней среды тилакоидов поддерживается пассивной диффузией

. моновалентных катионов, для которых мембраны хлоропластов легко проницаемы. • ' " : ; '

в) Процесс свето-индуцируёмого набухания сопровождается избыточным связыванием хлоропластами катионов по месту кислотных групп, которые становятся доступными благодаря деформации

. мембран под действием осмотического градиента. . г) Набухание в солевых средах вызывает резкое уменьшение микро вязкости гидрофобных участков мембран, регистрируемое по

изменению сигнала гидрофобного иминоксильного ЭПР-зснда.

д) В растворах солей слабых кислот освещение^вызывает высокоамплитудное сокращение хлоропластов в результате индуцируемо, го протонным давлением транспорта через мембрану по градиенту

концентрации недиссоциированных молекул кислот, согласно, ранее предложенному механизму ( ОгоЛо а1., 1967). Сокращенные хлоропласты сохраняют высокую скорость фосфорилирования ■ и прочное сопряяение транспорта электронов с механизмом утилизации энергии.

е) Индуцируемые светом в солевых растворах высокоаплитудные _ изменения объема и метаболического состояния хлоропластов

зависят от направления транспорта через мембрану ионо£ и молекул, которое определяется соотношением анионов слабых и ' сильных кислот в среде. Знергозависимая конформация отдельных комплексов мембран в определенных условиях вызывает изменение структурно-метаболического состояния хлоропластов. 4 ■'■: "-

а)' Взаимодействие хлоропластов с неорганическим фосфатоы в бессолевых средах при энергнзации светом или АТФ в теиноте вызывает.полное подавление фотофосфорилирования .обращение-транспорта протонов С выброс на свету ), ускорение'злсктрон-транспортных реакций и переход в специфическую нестабильную конфигурацию . . ■ '

б) Фосфат-индуцируемое разобщение фотофосфорилирования определяется выделением в среду сопрягающего фактора ( обратимой АХСазы ) в результате ее энергозависимого взаимодействия о фосфатом, и окислением ЗН-група, входящих в состав С? и неизвестного пункта в мембране. ■

" 41

в) Энергозависимые изменения метаболизма и ультраструктуры . хлоропластов предотвращаются присутствием в среде солей^ одно- и двухвалентных щелочных металлов или сульфгидрилышх соединений. .. •- .•■ ■•,-: , • ••

г) Рассматривается.механизм регулирования структурно-метаболи^ ческого состояния хлоропластов, в котором ключевую роль " занимает способный к энерго-ко'нформационным переходам сопрягающий фактор ( обратимая,АТФаза.). . ■ " • •. .

Список работ,.опубликованных по материалам диссертации.

•I. Ыолотковский Ю.Г., Жесткова И.М,-1965.' Морфологические и функциональные изменения изолированных хлоропластов под влиянием олеата. Физиол. растений, 12, I017 • .

2. Molotkovsky Ju. G., Zheatkova I.II. 1965« Influence of heating

on the aorphology and photochemical activity of isolated chloroplasts. Biochem. end Biophys. Ees. Coanun., 20, 411

3. Ыолотковский, ¡0.Г., Кесткова И.M., 1966. Морфологические и

функциональные изменения изолированных хлоропластов при прогреве. ДАН СССР, 166, 488 -

• 4. Иолотковский Ю.Г., Жесткова И.Ы., Капуро В.Ф. 1966. Механизм регулирования структурного состояния и фотохимической - активности изолированных хлоропластов. I. эволюционной ' биохимии и физиологии, 2, 159 '

5. Uolotkovsiy Ju.G., Zhestk07aX.il. 1966. Morphological and

functional changes in isolated chloroplasts. Biochim. et 4 Biophys. Acta, 112. 170 •

6. Молотковский 10.Г., Жесткова И.М. 1967. Влияние сахарозы на

устойчивость изолированных хлоропластов. Физиол. растений, ■" lit./367 *.-.' • :

7. KolotkCYsky Ju.G.," Dsjubeako V.S.1967. Regulation of light-

induced swelling of isolated chloroplaota. Biochaa. and Biophys. Eeo. Coaaun., 22, 298

8. Ыолотковский В.Г. 1968. Гидролиз фосфолипкдов и образование . свободных жирных кислот в хлоропластах. Биохимия, 35. 961

9.^olotkoTSky Ju.G. ,°D*3ubeaJco Y,S. 1968. Light-induced рЯ gradient through chloropleat. neabrene and translocation of

' " . cations. Bature,' 212.- *96

10. Цолотковский Ю.Г., Жесткова K.H. 1969. Ичмунохимичоский

" ' анализ антигонов хлоропластов при зелбнении. ДАН СССР, ■ ; 187, 1432 ' - 4 ' _

11. Ыолотковский Ю.Г., Дзвбенко'B.C. 196^. Свето-активируемоо

набухание хлоропластов и механизм его регуляции. Физиол. растений, 16. 78

12. иолотковский Ю.Г. 1969. Влияние катионов на конформацию

мембран хлоропластов и фотофосфорилирование. Тезисы : докладов международного симпозиума "Продуктивность фотосинтезирующих систем", U., стр.21

13. Молотковский Ю.Г., Дзюбонко В.С.,Тимонина В.H. 1970.

Энергозависимые конформационные изменения изолированных хлоропластов. Сб. Методы выделения хлоропластов, Пуцино--на-Оке, стр.77

14. Иолотковский Ю.Г., Дзюбенко B.C. 1970. Стимулирующее влияние

К+ и Яа+ на светозавжсимые реакции изолированных с

хлоропластов. Физиол. растений, 17, 280 '

15. Иолотковский Ю.Г., Дзюбенко B.C. 1970. Индуцируемое светом

поглощение Н+ изолированными хлоропластами. Молекулярная биология, 4, 383

16. Иолотковский Ю.Г. 1970. Некоторые аспекты строения и актив-

ности мембран клетка. Сизиол. растений, 17, 1249

17.Tzopin A.I., HolottOTBby ïu.G., Goldfleld M.G., Drjubenko V.3. 1971« Ligbt-induoed structural transition» of chloroplaata studied by the spin-probe sathod. Europ. J.Bloch.ea.,20, 218

18. Молотковский Ю.Г., Дзюбенко B.C., Тимонина В.H. 1972 a.

Влияние моновалентных катионов на конформацию мембран хлоропластов к фотофосфорилирование.; Сб.Теоретические 7--"" основы фотосинтетической продуктивности, "Наука", П., стр.65

19. иолотковский Ю.Г., Дзюбенко B.C.,'Тимонина В.H. 1972.

Структурные и конформационные переходы в хлоропластах, индуцжруемые моновалентными катионами. Оизиол. растений, 19, 525 .....

20. иолотковский Ю.Г., Дзюбенко B.C. 1972. Ингибирование

валиномицином фотофосфорилированхя в хлоропластах. J ДАН СССР, 204, 1272 ' : ://

Т-1ЭЭ1Э от 6ДП-72 : Ges.1293 Tiip.-iOO ^ ШС BEIXX