Генетическая детерминация фотосистем и структурно-функциональная организация мембран хлоропластов

Ладыгин, Владимир Георгиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетическая детерминация фотосистем и структурно-функциональная организация мембран хлоропластов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Генетическая детерминация фотосистем и структурно-функциональная организация мембран хлоропластов"

Piö

0!\ -■■■■

' РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ И ФОТОСИНТЕЗА

На правах рукописи

УДК 581. (132 + 154 + 174Л)

ЛАДЫГИН Владимир Георгиевич

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ ФОТОСИСТЕМ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ МЕМБРАН ХЛОРОПЛАСТОВ

Специальность 03.00.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Пущино - 1993

Работа выполнена в 11руппе биофизики растительной клетки Института биофизики АН СССР, Лаборатории молекулярной организа-, ции фотосинтетического аппарата Института фотосинтеза АН СССР и Группе генетики фотосинтеза Института почвоведения и фотосинтеза РАН. " •

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук В.А.Шувалов доктор биологических наук, профессор В.Е.Семененко

доктор биологических наук, профессор В.А.Шевченко

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, биологический факультет.

Защита состоится " 1993 г. в часов

на заседании Специализированного совета Д.¡¿00.¡¿9.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте почвоведения и фотосинтеза РАН (142292, г.Пущино Московской области).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института почвоведения и фотосинтеза РАН г.Пущино.

Диссертация в форме научного доклада разослана "_"_ 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

МгУ-— Б.Н.Иванов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фотосинтез растений — важнейший процесс в биосфере, раскрытие механизма и общих закономерностей управления которого во многом определит успех решения вопроса пищевых и энергетических ресурсов на Земле. Для достижения этой цели необходимо детальное исследование функционирования и молекулярной структуры уникальных по своей организации мембран хлоропластов и их генетического контроля.

Известно, что в генетическом контроле структуры и функции хлоропластов взаимодействуют две генетические системы: ядра и хлоропластов. Причем, их взаимодействие осуществляется не только на уровне ДНК CRoohaix,19S5; Herrman,1989), но и на уровне мРНК и белков (Jensen et ai.,1986). Функционирование генов ядра и хлоропласта обеспечивает биосинтез пигментов, белков и липидов, необходимых для формирования тилакоидов. Уникальной особенностью фотосинтетических мембран является наличие в них двух фотохимических систем: фотосистемы I (ФС-1) и фотосистемы II СФС—IX),струк-турно-функциональную основу которых составляют пигмент-белковые комплексы хлоропластов.

В работах, предшествующих нашим, считалось, что в мембранах хлоропластов существует только два типа комплексов, различающихся по составу и соотношению хлорофиллов "а" и "в" (Govindjcc, 1975), но некоторые экспериментальные данные не укладывались в эти представления. Исследования пигмент-белковых комплексов ( Thornber, 1975; Anderson,1980 ), спектров флуоресценции хлорофилла Butler, Kitajama, 1975), спектров поглощения и их вторых производных (Ладыгин, 1977,1979), ультраструктуры хлоропластов ( Miller et al., 1976 ) указывали на наличие в мембранах хлоропластов других комплексов, не связанных непосредственно с реакционными центрами фотосистем. Отсутствие ясности в идентификации и составе пигмент-белковых комплексов фотосистем требовало систематического и всестороннего изучения этой проблемы.

Большинство исследований проводилось на выделенных хлоропла-стах и мембранах с использованием детергентов, ингибиторов синтеза и антибиотиков. При таких подходах не исключалась возможность получения неоднозначных результатов, артефактов и даже свойств, не характерных для нативных систем. Значимость и актуальность проблемы требовали поиска новых путей и объектов для анализа нативных или близких к нативному состоянию фотосинтетических мембран.

Таким целенаправленным подходом к изучению структуры и функции мембран хлоропластов могло служить создание генетических коллекций пигментных и нефотосинтезирующих мутантов с блоком форми-

рования отдельных пигмент-белковых комплексов, с их различным сочетанием или содержащих в хлоропластах целых клеток только по одному из комплексов.

Важным условием выполнения такой работы являлось удобство объекта, который позволял бы сочетать методы мутагенеза, генетического анализа, а также биохимических и структурных исследований Всем этим требованиям удовлетворял классический модельный объект — одноклеточная зеленая водоросль хламидомонада (Chlamydomonas reinhardii Dang. ),

Работа выполнялась в соответствии с планами научных работ и научно-технических программ по физико-химической биологии и биотехнологии.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследований было установление общих принципов генетической детерминации и универсальных закономерностей организации фотосистем и пигмент-белковых комплексов как ключевых структурно-функциональных компонентов фотосинтетических мембран хлоропластов зеленых водорослей и высших растений. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:

1. Изучить эффекты химических и физических мутагенов с целью получения широкого спектра пигментных и нефотосинтезирующих мутантов и выявить основные принципы генетической детерминации фотосистем.

2. Охарактеризовать пигменты и функциональную активность хлоропластов и реакционных центров фотосистем и идентифицировать хлорофилл-белковые комплексы с помощью различных типов мутантов в качестве модельных объектов.

3. Установить биохимический состав нативных пигмент-белковых комплексов и выяснить роль белков в закономерности распределения хлорофилла и его спектральных и фотохимических свойств.

4. Оценить величину фотосинтетических единиц и числа реакционных центров для нативных комплексов ФС-I и äC-II.

5. Исследовать биогенез и закономерности локализации комплексов ФС-I и ФС-Л в мембранах хлоропластов и их роли в пространственной архитектуре тилакоидов.

6. Изучить принципы наследования структурно-функциональных признаков, измененных в результате мутации, как в процессе вегетативного и полового размножения в жизненном цикле, так и в процессе рекомбинации в скрещиваниях.

Основные положения, выносимые на защиту;

— химические и физические мутагены индуцируют 4-е типа мута-

ций, блокирующих синтез отдельных белков и формирование пигмент-белковых комплексов. В нативных хлоропластах обрадуется 4-е типа комплексов, два из которых выполняют светособирающ\е функции и не связаны непосредственно с реакционными центрами, § то время как два других содержат антенны ближайшего окружения и сами реакционные центры ЗЮ-1 и ФС-11;

— специфичность генетически контролируемого состава белков в пигмент-белковых комплексах обуславливает закономерное распределение хлорофилла, его спектральные и фотохимические свойства, универсальную организацию фотосистем в хлоропластах зеленых водорослей и высших растений;

— пигмент-белковые комплексы фотосистем являются структурно-функциональными единицами мембран хлоропластов, каждый из которых сохраняет свои нативные свойства при отсутствии других комплексов. Нормально функционирующие фотосистемы в мембранах хлоропластов представляют собой агрегаты, образованные попарным взаимодействием комплексов реакционных центров ФС-1 или ЗС-П и соответствующих им светособирающих комплексов. На сколах мембран хлоропластов они выявляются в виде 140 и 160 I субчастиц. Особенности локализации и взаимодействия отдельных комплексов обуславливают пространственную архитектуру мембран хлоропластов;

— мутационные изменения структурно-функциональной организации мембран хлоропластов сохраняшся в ряду поколений хламидомонады благодаря непрерывности пластид как при вегетативном и половом размножении в жизненном цикле, так и в процессе гибридизации.

Научная новизна работы. В диссертации развивается новое научное направление: "Экспериментальный мутагенез э исследованиях фотосинтеза". Для решения поставленной задачи нами впервые получена обширная коллекция мутантов и создан музей, включающий около 200 пигментных и нефотосинтезирующих мутантов хламидомонады. Многие двойные и тройные мутанты являются уникальными.

На основании всесторонних исследований установлено, что химические и физические мутагены индуцируют только 4-е типа мутаций, блокирующих формирование комплексов. С помощью тройных мутантов получены доказательства существования в нативных мембранах 4-х пигмент-белковых комплексов, генетически независимо детерминированных и принципиально не отличающихся по своей организации в хлоропластах зеленых водорослей и высших растений. Показано, что два из них выполняют светособирающую функцию,а два других содержат антенны ближайшего окружения и непосредственно связаны с реакционными центрами ФС-1 или ФС-11.

Обнаружено, что в структурно-функциональной организации на-

тивных пигмент-белковых комплексов решающая роль принадлежит специфическим белковым носителям, структура молекул которых обуславливает установленную нами закономерность распределения форм хлорофилла, а также характерных полос излучения флуресценции и фотохимическую активность.

Предложена и экспериментально подтверждена универсальность организации пигмент-белковых комплексов фотосистем зеленых водорослей и высших растений. Обнаружено, что каждый из них способен к формированию мембран тилакоидов, однако, только взаимодействие комплексов реакционных центров ФС-I и 5C-II с соответствующими им светособирающими комплексами обеспечивает образование нормально функционирующих фотосистем, структурным выражением которых на гидрофобных поверхностях сколов мембран являются I40 и 160 X субчастицы. Специфика локализации комплексов в мембранах обуславливает характерную пространственную архитектуру тилакоидов.

С помощью набора пигментных мутантов впервые получены доказательства принципиальной идентичности биогенеза мембранной системы хлоропластов зеленых водорослей и высших растений. Установлена непрерывность хлоропласта хламидомонады в течение вегетативного и полового размножения в жизненном цикле, а также в процессе гибридизации, обеспечивающая сохранение в ряду поколений мутационных структурно-функциональных изменений мембран хлоропластов.

На основании обобщения результатов исследования предложена схема закономерного распределения хлорофиллов и пространственной локализации в мембранах структурно-функциональных комплексов фотосистем. Сформулированы основные положения о принципах и универсальных закономерностях организации мембран хлоропластов, свойственных для зеленых водорослей и высших растений.

Научно-практическая значимость работы. Совокупность фундаментальных представлений, выдвинутых на основе полученных результатов, способствовали развитию нового направления исследований структурно-функциональной организации фотосинтетических мембран, в котором важнейшее внимание уделено пигмент-белковым комплексам как основным компонентам функционирования фотосинтеза и формирования структуры хлоропластов.

Установленный нами на модельных объектах принцип непрерывного наследования хлоропластов у хламидомонады в процессе клеточных делений в течение всего жизненного цикла может служить научной основой для объяснения и более детального исследования механизма двуродительского наследования хлоропластных генов и, в частности, контролирующих синтез полипептидов хлорофилл-белковых комплексов реакционных центров ФС-1 и SC-1I.

Предложенная в работе схема закономерного распределения ос-ювных спектральных форм хлорофилла между 4-мя пигмент-тбелковыми сомплексами и идентификация индивидуальных полос флуоресценции 1ативных комплексов, обусловленные специфичностью белковых носи--елей каждого из них, позволили нам не только установить четкую ;орреляцию между спектральными свойствами и гель-электрофорети-юским составом комплексов, но и предложить спектральный метод в ¡ачестве экспресс-теста на наличие или отсутствие комплексов в ¡ативных клетках водорослей или целых листьях высших растений не->ависимо от их генетической или метаболической деструкции.

Выявленная и обоснованная в данной работе идентичность в ор-■анизации мембранной системы хлоропластов зеленой водоросли хла-мдомонады и высших растений может иметь важное значение в пони-мнии их эволюционной взаимосвязи и исследовании вопросов проис-:ождения и эволюции фотосинтетических мембран и самих хлороплас-

'ОВ.

Широкое применение нашел предложенный и научно обоснованный акт метод визуального отбора фотосинтетических мутантов /22,23/. тот метод не требует специального оборудования, поскольку осно-,ан на особенности нефотосинтезирующих мутантов давать в миксо-рофных условиях нормально окрашенные, но карликовые колонии, есмотря на его простоту, эффективность отбора мутантов почти на ва порядка выше, чем при использовании флуоресцентных или радио-втографических методов.

Не менее важное значение может иметь использование нашей об-ирной коллекции /90,110/, особенно двойных и тройных мутантов, меющих практически любые сочетания комплексов или чистые индиви-уальные комплексы. Эти исключительно удобные модельные объекты ашли широкое применение в теоретических исследованиях молекуляр-ой организации мембран и механизма фотосинтеза, а также в био-ехнологических целях для получения и Нд на основе процесса атосинтеза и как базис для широкого внедрения их в работы по ге-етической инженерии. Кроме того, часть мутантов-суперпрдуцентов ке сейчас может найти практическое применение /67,107/.

Вьщвинутые и обоснованные в данной работе представления, ус-ановленные общие принципы и закономерности наследования и струк-урно-функциональной организации мембран хлоропластов зеленых во-эрослей получили широкое научное признание, имеют высокий индекс ятирования в мировой научной литературе. Они включены в современ-ае обзоры и монографии по цитологии (Седова Т.В. Основы цитоло-т водорослей. Л.: Наука,1977; Ченцов Ю.С. Общая цитология. М.: У, 1978), генетике (Шевченко В.А. Радиационная генетика однокле-

точных водорослей. M.: Наука, 1979), а также в учебники для ВУЗов (Горленко М.В. Курс низших растений. М. : Высшая школа, 1981), многие обзоры иностранных ученых (Arnold et al. Planta, 1978; Gaffai K.P., Schneider G.J. Cytobios, 1980; Hollman F.-A. et al. J. Cell Biol. 1980; Garnier J. et al.1979,198б) часто используются в докладах и курсах лекций по биофизике, биохимии и физиологии растений.

Апробация работы. Результаты работы докладывались: на 4-м Межд. конгр. по фотобиологии (США,1968), на 4-й Европейской конф по электронной микроскопии (Италия,1968), Всес. симп. "Биохимия биофизика фотосинтеза" (Иркутск,1970), 8-й Всес. конф. по электронной микроскопии (Москва,1971), 6-м Межд. конгр. по фотобиологии (ФРГ,1972), 4-м Межд. биофизическом конгрессе (Москва,1972), Всес. симп. "Генетические аспекты фотосинтеза" (Душанбе,1972), 1-м Всес. сов. "УФ-излучение и его применение в биологии" (Горький, 1973), 3-м Всес. сов. "Управление биосинтезом микроорганизмо (Красноярск,1973), 2-м Всес. симп. "Молекулярные механизмы генетических процессов. Мутагенез и репарация" (Москва,1973), 9-й Всес. конф. по электронной микроскопии (Тбилиси,1973), Всес.конф по генетике промышленных организмов (Цахкадзор,1973), Всес. конф ьВлояогкя и научно-технический прогресс" (Пущино,19?4), 3-м Всес симп. "Применение электронной микроскопии в ботанических исследо ваниях" (Петрозаводск,1974), 12-м Межд. ботаническом конгрессе (Ленинград,1975), Всес симп. "Магнитный резонанс в биологии и ме дицине" (Москва,1977), Всес. конф. "Использование биофизических методов в генетико-селекционном эксперименте" (Кишинев,1977), 4-Всес. симп. "Электронная микроскопия в ботанических исследования (Рига,1978), 14-м Межд. генетическом конгрессе (Москва,1978), Всес. конф. "Адаптация и рекомбиогенез у культурных растений" (К шинев,1979), II-й Всес. конф. по электронной микроскопии (Таллин 1979), Всес. симп. "Радиочувствительность и процессы восстановле ния у животных и растений" (Ташкент,1979), 18-м и 19-м Межд. сим специалистов стран СЭВ по фотосинтезу (Варшава, 1980; Пущино,1981 Всес. сов, "Энергетика, метаболические пути и их регуляция в фот синтезе" (Пущино,1981), 4-м Всес. съезде Всесоюзного общества ге нетиков и селекционеров (Кишинев,1982), Респ. конф. "Адаптация и рекомбиногенеэ у культурных растений" (Кишинев,1982), 1-м Всесою биофизическом съезде (Москва,1982), 12-х Пущинских чтениях "Фото синтетическое выделение кислорода" (Пущино,1983), 5-м Всес. симп "Ульраструктурная организация растений" (Кишинев,1983), Всес.кон "Проблемы фотоэнергетики растений и повышения урожайности" (Льво 1984), Всес. семинаре, посвященном 85-летию чл.-корр. А.А.Ничипо

ровича (Москва,1984), 5-м Межд. симп. по фотосинтетическим прокариотам (Швейцария,1985), 13-й Всес. конф. "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе" Шущино,1985), 4-й Всес. конф. "Биология клетки" (Тбилиси,1985}, 1-й Всес. конф. "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии" (Звенигород, 1985), Всес. конф. "Экология и биологическая продуктивность Баренцева /оря" (Мурманск,1986), Всес. сов. "Вопросы взаимосвязи фотосинтеза и дыхания" (Томск,1986), Межд. симп. "Минеральное питание и фотосинтез" (Болгария,1987), 1-й Всес. конф. "Актуальные проблемы 'овременной альгологии" (Черкассы,1987), 3-й Всес. конф. "Экологическая генетика растений и животных" (Кишинев,1987), 6-м Всес. :имп. "Ультраструктура растений" (Киев, 1988), 3-й Всес. конферен. 'Биология моря" (Севастополь, 1988), Всес. конф. "Структурная ди-)амика биологических мембран и её роль в регуляции фотобиологи-!еских мембран и рецепторных процессах" (Минск,1988), Всес. конф. 'Преобразование световой энергии в фотосинтетических системах и IX моделях" (Пущино,1989), Всес. конф. "Микроорганизмы - стимуля-?оры и ингибиторы роста растений и животных" (Ташкент,1989), Всес. еонф. "Онтогенетика высших растений" (Кишинев,1989), 8-м Междунар. :имп. по фотосинтезу (Швеция,1989), Межд. симп. "Молекулярная ор-'аниэация биологических структур" С.<!осква,1989), 1-м Всес. Совещ, 'Использование изогенных линий в селекционно-генетических экспери-1ентах"(Новосибирск,1990), 2-м съезде Всес. общества физиологов >астений (Минск,1990), 1-м Всес. сов, "Хемотаксономическое изуче-!ие споровых растений и грибов" (Полтава,1990), Межд, конф. "Зернение растений" (Пущино,'1991), Межд. конф. "Фотосинтез и фото-;иотехнология" (Пущино,1991).

Основные результаты диссертации были доложены и обсушены на :пециаяизированньгх научных семинарах в Институте физиологии раете-гий и генетики УАН, Киев; Институте фотобиологии БАН, Минск; Инс-■итуте биохимии им.Баха РАН, Москва; Институте физиологии растений м. К.А.Тимирязева РАН, Москва; на совместном семинаре Томского отделения Всес. общества физиологов растений, Лаб. фотосинтеза НИИ ¡иологии и биофизики и кафедры ботаники Томского гос. университета.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 196 науч-;ых работ, в том числе 110 статей в ведущих отечественных и зару-ежных научных журналах и сборниках, получено I авторское свиде-'ельство на изобретение.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНИЕ

I. Экспериментальный мутагенез и получение мутантов.

а) Особенности методического подхода и выбор объекта.

Одноклеточная водоросль СЫ.атус1отопаа ге1пЬаг<111 Сапе. — классический модельный объект. Она содержит один хлоропласт, поэтому все его изменения легко контролируются как в генетических (наличие полового цикла), так и в биохимических, биофизических и физи ологических исследованиях, в том числе на синхронных культурах. Наличие модельного объекта позволяло использовать самые современ ные методы исследования. Особое предпочтение мы отдавали методам позволяющим работать с нативными или близкими к ним системами.

Широко применяемые ранее методы выделения и фрагментации хлоропластов не давали нативный и однородный при повторных экспе риментах материал и не исключали появления большого числа артефа ктов, трудно отличимых от истинных свойств объекта, также как и использование детергентов, ингибиторов биосинтеза и антибиотиков не имеющих строгой специфичности воздействия, не дающих однородный материал, что обуславливало множественность эффектов и затрудняло выявление причин и следствий эффектов. Важные результаты были получены методом меченых атомов, но ограничением такого подхода являлась сложность исследования быстро протекающих процессов и анализа промежуточных продуктов из-за того, что часто их трудно получить в достаточном количестве для идентификации и детального изучения.

Многие из перечисленных недостатков можно исключить, исполь зуя метод экспериментального мутагенеза. Он позволяет путем гене тической блокировки синтеза отдельных компонентов производить прижизненную, поэтапную "разборку" сложных систем до индивидуаль ных составляющих, при этом сохранять оставшиеся компоненты в на-тивной клетке, практически, в оптимальных условиях. В зависимости от задачи исследования в каждом конкретном случае можно получать серию строго определенных мутантов, с помощью которых ввде-лять любые промежуточные продукты биосинтетического' процесса и изучать их состав и свойства. В сложных системах можно блокировать образование отдельных компонентов и детально анализировать оставшиеся индивидуальные составляющие, не нарушая при этом другие метаболические процессы в клетке. Именно такой методический подход был использован нами в данной работе. Однако, из-за недостатка информации он не давал вначале полной уверенности в том, что выявляемые на мутантах зеленой водоросли закономерности можно будет переносить и на высшие растения. Чтобы снять эти ограни чения нам необходимо было решить две задачи: I) доказать принци-..пиальную идентичность организации мембранной системы хлоропласто хламидомонады и высших растений и 2) установить наследование мутационных изменений хлоропластов в ряду поколений в течение веге

тативных и половых клеточных циклов. Обе задачи были успешно нами решены в модельных экспериментах с использованием мутантов, что дало нам основание утверждать, что сформулированные представления, общие принципы и установленные закономернее™ являются универсальными для мембран хлоропластов зеленых водорослей к высших растений.

б) Действие мутагенных факторов. Мы использовали химические (нитрозоэтилмочевина - НЭ.Л> и физические (УФ-лучи и ^-излучение) мутагены. Специфика действия НЭ'4 состоит в индукции большого числа пигментных мутантов / 2 /. Ультрафиолетовый свет является единственным неионизирующим излучением, способным к повышению частоты различных типов, преимущественно, точковах ядерных мутаций /2,8,107/. Ионизирующее ^-излучение индуцирует все типы мутаций как ядерных, так и хлоропластных генов /20,22,23,62,107/. Использование этих мутагенов позволяло надеяться на получение любых мутантов, но прежде чем приступить к их получению необходимо было изучить действие каждого из мутагенов и выбрать оптимальные дозы.

Вегетативные клетки хламидомонады гаплоидны, поэтому мы скидали, что кривые поза-эоЬфект будут экспоненциальными. Оцнако, полученные нами данные показали сигмоидный характер кривых (рис.1, а), что можно объяснить двумя причинами: I — работой сепараторной системы, когда физиологические изменения при малых дозах элиминировались клеткой, и 2 — гетерогенностью популяции клеток, различающихся по устойчивости, в частности тех, которые к моменту воздействия мутагена прошли стадию репликации ДКК и содержат удвоенной, по крайней море, ту часть генома, которая, имеет прямое отношение к выживаемости.

. Анализ выхода мутаций от дозы показал {рис.1,6), что для НЭ.Л и УФ-лучей частота мутаций повышается с увеличением дозы, но до определенного предела, выше которого заметного отклонения в сторону увеличения не наблюдалось. Поэтому для этих мутагенов оптимальной дозой для получения мутантов ми выбрали лДад. что соответствовало дозам: для НЭ'4 I час (С=0,0С5 М) и УФ-лучей I мин в варианте без фотореактивации и 3 мин в варианте с бототэеактиваш'.ей. Для ^-радиации выход мутаций имел экспоненциальную зависимость, поэтому для получения мутантов оптимальной дозой мы считаем ДЦдд (200 Грей1, дающей высокий процент выхода мутаций (10-15 %) и статистически достаточное для анализа число выживших клеток.

в) Получение мутантов. Наиболее важным моментом при отборе мутантов является выбор критериев селекции: окраска, размеры, морфология колоний, ростовые признаки и т.д. Мы установили, что после воздействия мутагенов появлялось большое число мелких коло-

5 -

^ 0 12 3 4 - 2

-I-1-rI

Время действия НЭМ, час ** I5i

0 2

Время УФ- облучения,

мин

-.-1-г

О 100 200 300 О

Доза гамма - облучения, Грей

1-г

100 200 300

I. Зависимость выживаемости Са) и выхода мутаций (б) от дозы при действии химических и физических мутагенных факторов

ний / 2,29,23 /. Природа их очень разнообразна. Часть мелких колоний, восстанавливающих скорость размножения до контрольной, не являлась мутантами. По-видимому, задержка клеточных делений у них обусловлена нарушением метаболических процессов. Остальные мелкие (карликовые) колонии, не восстанавливающие скорость клеточных делений при любых условиях выращивания, очень часто были нефотосин-тезирующими ацетат-зависимыии (А-тип) мутантами / 23 /. Другие мутанты обнаруживали потребность в некоторых метаболитах, что давало основание считать их ауксотрофами. Крапчатые колонии давали высокий процент реверсий (нестабильные) и были очень немногочисленными, так же как и морфологические (с неровной поверхностью колоний). Наибольшую и легко выявляемую группу составляли пигментные мутанты. Они подразделялись на группы: I - не содержащие пигментов - белые (Б-тип), 2 - хлорофилл-дефицитные, накапливающие только каротиноиды - желтые (1-тип), 3-е уменьшенным синтезом пигментов - светло-зеленые (С-тип), 4 - с увеличенным синтезом пигментов - темно-зеленые (Т-тип).

Колебания в содержании и качественном составе пигментов у мутантов в пределах каждого типа чрезвычайно разнообразны, в особенности у С-типа, что связано с неодинаковой степенью потери различных пигментов. Часто встречались мутанты с уменьшенным содержанием хлорофилла "в" (до 6-кратного) при 1,5-2 кратном уменьшении хлорофилла "а". Эта группа С-мутантов, как и С-мутанты с соотношением хлорофиллов близким к контрольному, как правило, имели нарушение светособирающего комплекса $С-1 / 34,37,49,55 /. Хлорофилл"в"-дефицитные С-мутанты не формировали светособирающий хлорофилл"а"/"в"-белковый комплекс ФС-11 / 50,55,60,61,78,81 /. Среди нефотосинтезирующих А-мутантов часто встречались с неактивной ФС-1 или ФС-11 / 21,33,43,44 /, которые не содержат хлорофилл "а"-белковых комплексов ФС-1 или <ЕС-Н, соответственно / 55,92, 96,105,109 /.

Всесторонние исследования более чем 150 пигментных и нефото-синтезирующих мутантов позволили заключить, что с помощью мутагенов индуцируется только 4 типа мутантов с генетическим нарушением пигмент-белковых комплексов. Этот факт предполагает автономное существование в хлоропластах 4 типов пигмент-белковых комплексов, которые можно было получить в чистом виде в нативном состоянии путем ступенчатого мутагенеза, последовательной индукцией одинарных, двойных и тройных мутантов (рис.2).

II. Биохимический состав и спектральные свойства нативных хлорофилл-белковых комплексов фотосистем.

а) Содержание пигментов. Исходя из основополагающей гипоте-

Клетки дикого типа

1.Н-1* . ьн-ц*

Мутаген I

Мутаген 2

Мутаген 3

Одинарные /¡.м мутанты

Двойные /ьи-1 мутанты

Тройные мутанты

Рис. 2. Схема получения нативных пигмент-белковых комплексов в клетках мутантов методом ступенчатого мутагенеза.

Дикий Мутант Мутант тип К(+) СС-107 ВФ-5

Рис. 3. Гель-электрофорез хлорофилл-белковых комплексов мембран хлоропластов клеток дикого типа К(+) и двойных Мутантов, содержащих либо только комплексы ФС-1 и К-II (мутант СС-107), либо только светособираицие комплексы I и II (мутант ВФ-5).

зы биохимической генетики (Beadle,latum,1941 ): ген - фермент -функция, мы предположили, что специфичность белков-носителей в комплексах играет решающую роль в локализации хлорофилла, поэтому можно было ожидать потерю в каждом конкретном мутанте именно той части пигментов, которая была связана с утраченным в результате мутации комплексом. Дальнейшие исследования полностью подт-. вердили эту гипотезу и позволили установить, что потеря любого хлорофилл-белкового комплекса у мутантов сопровождалась уменьшением содержания пигментов, причем строго определенного количества и четкими характерными для каждого комплекса спектральными, биохимическими и фотохимическими свойствами.

• Так у всех хлорофилл"в" - дефицитных мутантов / 49,50,54,56, 59,60,61,68,78,81,88 / не формировался еветособирающий хлорофилл "а"/"в" - белковый комплекс II и терялся связанный с этим комплексом хлорофилл около 30-50 % от его общего содержания в клетке / 29,34,37,92 /.

Мутанты, утратившие светособираюший комплекс I, накапливали на 20-30 % меньше хлорофилла, чем клетки дикого типа / 3-7,9,10, 14,19,28,34 /. В сумме же у двойных мутантов, не содержащих обоих светособирающих комплексов, хлорофилла накапливалось на 60-70 % меньше, чем в контроле / 54,58,68,82-84,92 /. Этот факт давал основание утверждать, что именно такое количество хлорофиллов ( в том числе весь хлорофилл "в") входят в состав светособирающих комплексов.

Нефотосинтезирующие мутанты / 21,24,25,32,34,36,38,39,41,87/, утратившие хлорофилл"ая - белковые комплексы ФС-I или ФС—II, а также тройные мутанты / 85,92,95-101,103-106 /, не содержащие обоих светособиршощих комплексов и одного из комплексов фотосистем, позволили установить, что на долю комплекса ФС-I приходится 15 -20 % хлорофилла "а", а на долю комплекса ФС-II — 10-15 % хлорофилла "а" от общего его содержания в клетках дикого типа / 88,92/.

Изменения в содержании каротиноидов менее значительны и, по-видимому, не являются прямым следствием мутаций, а обусловлены либо плейотропным действием генов или взаимозависимым синтезом пигментов, либо деструктивными изменениями мембран хлоропластов в результате потери пигмент-белковых комплексов / 11,12,18,76,87, 92, 108,109 /.

б) Идентификация комплексов и их полипептидный состав. Для выяснения вопроса прямой связи изменений в содержании пигментов у мутантов с утратой специфических белков и для идентификации принадлежности отдельных хлорофилл-содержащих полос с определенными комплексами мы провели анализ мембран хлоропластов мутантов

методом гель-электрофореза. Исследуя различные мутанты в сравнении с-клетками дикого типа, мы установили, что в геле можно выявить три хдорофиллсодержащие полосы (L.Hj, LHg, LHg) светособи-рающего хлорофилл"ап/"в"-беляового комплекса II, две полосы (LHq и t>Hv) светособирающего хлорофилл"а"- (или "а"/"в")-белкового комплекса I, и по одной полосе хлорофилл"а"-белковых комплексов SC-II (CP-II) или ФС-I (CP-I), а также одну полосу свободных пигментов (FP), содержащую не связанные с белком хлорофилл "а" и каротиноиды / 39,54,55,57,73,84,87,92,105 /. Остальные полосы содержат специфические полипептиды различной молекулярной массы.

Пояипепти.цный состав индивидуальных комплексов мы исследовали без их предварительного выделения, используя мутанты, не способные к синтезу определенных пигмент-белковых комплексов / 39, 105 /. На основании всестороннего анализа различных мутантов было установлено, что у хламидомонады, как и у высших растений, свето-собирающий хлорофилл"а"/"в"-белковый комплекс II построен из 3-х основных полипептвдов 30, 28,5 и 26 кДа. Три полипептида с молекулярной массой 34, 25 и 22 кДа образуют светособирающий хлорофилл-белковый комплекс I.

Основными хлорофилл-содержащими белками пигмент-белкового комплекса ФС-I являются полипептиды 65 и 62,5 кДа, но необходимым условием для формирования и агрегации целого комплекса ФС-I является наличие полипептида 19,5 кДа (F е-5 -белка). У мутантов, утративших этот низкомолекулярный полипептид, весь комплекс ФС-1 отсутствует.

Аналогичным образом происходит формирование и агрегация пигмент-белкового комплекса ФС—II. В этом комплексе основными хлорофилл-содержащими белками являются высокомолекулярные полипептиды 50 и 47 кДа, образующие внутреннюю антенну ближайшего окружения реакционного центра ФС—II. Однако для нормального формирования комплекса, включающего помимо указанных выше полипептидов и герби-цид-связьтвающего белка (32 кДа), необходим еще Д2-белок (29,5кДа) Именно с синтезом полипептида 29,5 кДа этого белка связано образование и агрегация целого комплекса ФС—II. При отсутствии этого полипептида у мутантов не формировался комплекс ФС-П.

Таким образом, исследования на мутантах позволили установить не только специфичность полипептидного состава каждого из 4-х генетически независимо детерминированных нативных комплексов в клетках хламидомонады (рис.3), но и выявить ключевые полипептиды, синтез которых обуславливает формирование и агрегацию комплексов реакционных центров ФС-1 и ФС-П. Кроме того, наши данные подтвердили идентичность организации комплексов у хламидомонады и у высших

растений и показали хорошее согласие числа полипептидов и генетических данных, из которых следует, что 6 полипептидов светособи-рающих комплексов I и II контролируются шестью ядерными генами, а 7 полипептидов комплексов фотосистем — 7-ыо хлоропластными генами.

в) Закономерности распределения хлорофилла в комплексах фотосистем. Известно, что все высшие растения и зеленые водоросли имеют два типа хлорофилла "а" и "в". В экстракте каждый из этих пигментов имеет один максимум поглощения при 662 нм и 644 нм, соответственно. Не выявлялись в экстракте другие максимумы и при использовании производной спектрофотометрии. В то же время в хло-ропластах живых клеток известны две формы хлорофилла "в" и, по-видимому, семь форм хлорофилла "а". Одной из возможных причин, изменяющих спектральные свойства молекулы хлорофилла, является его взаимодействие со специфическими белками мембран хлоропластов, генетическое нарушение которых ведет к потере активности реакционных центров 5C-I или ФС-П в зависимости от того, какой из белков утрачен в результате мутации. Проведенное нами исследование трех групп мутантов: а) с неактивной $С-1, б) с неактивной 5Ю-П и в) с неактивными обеими фотосистемами позволило установить различные спектральные формы хлорофилла в пигмент-белковых комплексах мембран хлоропластов / 32,37,38,41 /, чего с использованием фрагментации хлоропластов ранее не удавалось сделать. Поскольку мы не знали в результате одной или двух мутаций утрачена активность обеих фотосистем у третьей группы мутантов, то представлялось важным целенаправленно объединить две мутации по ФС-I и ФС-П в одной клетке. Таким приемом мы надеялись исключить формы хлорофилла, выполняющие функции ближайших антенн фотосистем и выявить формы, связанные со светособирающими пигмент-белковыми комплексами мембран хлоропластов.

С этой целью было решено получить нефотосинтезирующий штамм с неактивными обеими фотосистемами и проанализировать спектральные формы хлорофилла с использованием методов производной спектрофотометрии / 42 /.

Для получения гибрида мы взяли в качестве родительских штаммов хорошо охарактеризованные нами мутанты А-66 с неактивной ФС-1 и А-90 с неактивной 5C-II / 21,32 /. Оба мутанта имели (-) тип спаривания. Чтобы выделить эти штаммы с (+) типом спаривания, мы провели два скрещивания: К(+) X А-66С-) и К(+) X А-90(-), выделили отдельные зиготы и проанализировали 19 полных тетрад прорастающих зигот первого и 38 полных тетрад второго скрещиваний, обнаружили четкое Менделевское расщепление 2:2 по каждой мутации, неза-

висимое от гена, определяющего тип спаривания, что способствовало выделению как (-), так и (+) штаммов обоих мутантов.Менделев-ский способ наследования мутаций указывал на то, что у каждого из штаммов нарушен только один ген. Поэтому в случае несцепленно-го наследования мутантных генов мы могли объединить их в одной клетке. С этой целью мы скрестили мутанты А-90(+) X А—66(—) и изолировали 44 зиготы. После их прорастания и образования колоний из каждой дочерней зооспоры все рекомбинантные клоны были коллекционированы. Спектральным и фотохимическим анализами все выделенные клоны были разделены на 4 группы: содержащие одну из родительских мутаций А-66 или А-90, гибридные, содержащие две мутации, и дикие, утратившие мутантный ген в результате мейотической рекомбинации. Внутри каждой группы все штаммы, практически, не различались между собой независимо от типа спаривания, поэтому квждая из групп была охарактеризована на примере одного из штаммов: дикого типа К(+), родительских штаммов А-9СК-), А-66(+) и гибрида А-66-90(+).

Исследование содержания пигментов показало, что как у исходных родительских форм, так и у гибрида в первую очередь уменьшалось содержание хлорофилла "а". Причем потеря активности 5С-1 у мутантов приводила к нарушению наиболее длинноволновых форм в спектре поглощения хлорофилла.

Для того, чтобы доказать, что изменения в формах хлорофилла имели место в живых нативных клетках, было решено детально проанализировать состояние хлорофилла как в живых клетках мутантов, так и в интактных клетках при температуре жидкого азота (-!96°С).

Анализ спектров поглощения хлорофилла суспензии клеток при 23°С показал, что расположение основного максимума у мутантов А-66 и А-90 с неактивной одной из фотосистем смещался в коротковолновую сторону на I нм, а у гибрида А-66-90 с неактивными обеими фотосистемами — на 2 нм. Первые производные спектров поглощения указывали на то, что коротковолновые формы до 678 нм, по-видимому, не изменялись при нарушении активности фотосистем. Смещение положения максимума при 689 нм на 1-3 нм в коротковолновую сторону предполагало изменения в более длинноволновых формах /32, 42/.

Вторые производные спектров поглощения подтверждали, что формы хлорофилла "в" и коротковолновые формы хлорофилла "а" не изменялись у мутантов и у гибридного штамма, о чем свидетельствовало .совпадение максимумов при 651 и 670 нм и минимумов при 659 и 675 нм. В то же время смещение длинноволнового максимума при 684 нм на I нм у родительских штаммов А-66 и А-90 и на 2 нм у ги-

Рис. 4. Спектры поглощения хлорофилла и их вторые производные при температуре -196°С клеток дикого типа К(+), мутантов без $С-1 (А-66), без ФС-П (А-90) и гибрида без обеих фотосистем (А-66-90), а также клеток (ЬНС-П)и ЬНС-1) и выделенных светособирающих комплексов (ЬН-1 и ЬН-О) тройных мутантов БФ—5-16 и А-66-90-1 соответственно.

брида А-66-90, а также изменение в расположении минимума при 694 нм предполагало наиболее существенные нарушения самых длинноволновых форм у мутанта А-66 с неактивной ФС-1. Мутант А-90 с неактивной 5С-П имел смещение только основного максимума до 683 нм, что предполагало изменение форм в области 680-690 нм. У гибридного штамма А-66-90 можно было ожидать изменений во всех длинноволновых формах хлорофилла более 680 нм.

Таким образом, не вызывало сомнений, что нарушение активности фотосистем у мутантов сопровождалось изменением в различных спектральных формах хлорофилла в нативных клетках. Однако, при комнатной температуре можно лишь установить участок спектра с измененными формами хлорофилла, а выявить нарушения индивидуальных полос поглощения представлялось возможным только с использованием низкотемпературной производной спектрофотометрии.

При температуре жидкого азота (-196°С) в спектре поглощения мы выявили максимум хлорофилла "в" при 649 нм и два максимума хлорофилла "а". Первая производная спектров поглощения позволяла предположить, что потеря активности ФС-1 у мутанта А-66 сопровождалась нарушением форм хлорофилла "а" с максимумами поглощения больше 686 нм, а активности ФС—XI у мутанта А-90 — форм е области 682-687 нм. У гибридного штамма А-66-90, по-видимому, нарушены все формы с максимумами поглощения свыше 683 нм. Анализ второй производной спектров поглощения показал, что у всех штаммов сохра> нялись две формы хлорофилла "в" с максимумами, поглощения при 644 и 649 нм, на что указывала ассиметрия максимума при 649 нм. Эти две формы легко обнаруживались у пигментных мутантов с низким содержанием хлорофилла "в" / 34,37 /. Не претерпевали существенных изменений и формы хлорофилла "а" с максимумами поглощения при 661 667 и 676-681 нм. У мутанта А-66 с неактивной ФС-1 сохранялись все формы до 685 нм. Остальные три длинноволновые формы хлорофилла с максимумами поглощения при 689, 698 и 703 нм у него не выявлялись. Отсутствие активности ФС-11 у мутанта А-90 в результате мутации сопровождалось потерей его основной формы хлорофилла "а" с максимумом поглощения при 685 нм. У гибридного штамма мы не наблюдали накопления всех четырех длинноволновых форм, нарушенных у родительских штаммов (рис.4,а).

Представленные здесь результаты позволили доказать, что формы хлорофилла "а" с максимумами поглощения при 689, 698 и 703 нм входят в состав пигмент-белкового комплекса 5С-1 и выполняют функции антенны ближайшего окружения реакционного центра Руцо- Формы хлорофилла "а" с основным максимумом поглощения при 685 нм входят "в состав пигмент-белкового комплекса ФС-11 и выполняют функции ан

тенны, фокусирующей энергию возбуждения на реакционный центр Р^дд-Сохранение- у гибридного штамма А-бб-90 с неактивными обеими фотосистемами форм хлорофилла "в" при 644 и 649 нм и форм хлорофилла "а" с максимумами поглощения при 661, 667 и 676-681 нм указывало на отсутствие прямой связи этих форм хлорофилла с белками комплексов фотосистем / 32,37,41,48,66 /. Можно полагать, что эти хло-рофиллы входят в состав нативных светособирающих пигмент-белксвых комплексов.

Дальнейшие исследования на полученных нами тройных мутантах впервые позволили установить конкретные формы хлорофиллов: 649 и 661, 667 и 676 нм для нативного светособирающего комплекса II, а 644 и 661, 663, 671, 681 нм для нативного светособирающего комплекса I (рис.4,б).

Таким образом, проведенные нами исследования одинарных, двойных и тройных нефотосинтезирующих мутантов, а также гибридного штамма в сравнении с клетками дикого типа привели нас к заключению о существовании 4-х типов различных пигмент-белковых комплексов: двух — принадлежащих антеннам ФС-1 и ФС-П, и двух- све-тособирающим комплексам I и II (рис.5).

С помощью уникальных мутантов нам удалось изучить и впервые связать отдельные спектральные формы хлорофилла с определенными нативными пигмент-белковыми номплекс&уи мембран хлоропластов. Представленный здесь анализ форм хлорофилла подтвердил, что спектральные различия имели место не только при низкой температуре,но ив живых клетках дикого типа и мутантов при комнатной температуре.

Установленная нами универсальная закономерность распределения форм хлорофилла была подтверждена в многочисленных исследованиях на морских многоклеточных зеленых, бурых и красных водорослях, на эвглене, хлорелле и на высших растениях: хвойных, водных и лиственных С4- и Сд-растениях, причем как при генетической блокировке, так и при метаболической редукции комплексов / 41,48,52, 53-55,57,60,74,75,94,108 /.

г) Флуоресценция хлорофилла нативных комплексов. Флуоресцентный анализ является одним из наиболее прямых методов исследования первичных фотофизических и фотохимических реакций фотосинтеза. Он позволяет выявлять при низкой температуре спектры излучения молекул хлорофилла отдельных пигмент-белковых комплексов непосредственно в целых клетках мутантов.

В пределах температур от 300 до 5 К различным исследователям удавалось наблюдать 4 полосы излучения с максимумами при 680, 686, 695 и 710-740 нм. Полосу флуоресценции при 680 нм можно обнаружить только при температурах ниже 35 К. При температуре жидкого

Мутация I \ -У': • ' ■

/ Мутация 2

Фл. 681 I:

Фл. 686

|*Л-У' "в" *.\б49; '• /. "хл. гаК'бб1;: 667'; ;

I ■' ■ Хл; бб!;-.' 663

Фл. 707

Мутация 3

Фл. 695

Ц'ШЯу -

Фл. 720

Комплекс (фотоокисл! 1ния воды

2 Н20 02+4Н+'

Углеродный\, цикл Кальвина,

го

Рис.5.Схема распределения хлорофилла между 4-мя пигмент-белковыми комплексами хлоропластов хламидомонады с указанием характерных полос излучения флуоресценции хлорофилла и генетической блокировки их 4-мя независимыми типами мутаций.

азота -196°С (77 К) хорошо выявляются три основные полосы флуоресценции хлорофилла при 666, 695 и 710-740 нм, характерные для пигмент-белковых комплексов хлоропластов высших растений и зеленых водорослей.

Обнаружение 4-х полос флуоресценции хлорофилла и существование в мембранах хлоропластов 4-х генетически независимо детерми -нированиых пигмент-белковых комплексов наводит на мысль о возможности установления корреляционных связей между ними. Такие попытки неоднократно делались ранее, но ясности и единого мнения по этому вопросу до сих пор не было.

На основании исследований зеленеющих листьев на прерывистом свету Батлер с соавторами выдвинули гипотезу о прямой связи полос флуоресценции при 686, 695 и 710-740 нм с пигмент-белковыми комплексами: светособирающим, ФС-11 и $С-1, соответственно. Однако не все исследователи поддерживали эту точку зрения. Одни считали, что светособирающему комплексу принадлежит только полоса флуоресценции при 680 нм, а полоса при 685 нм — антенне ФС-11. Другие, используя фрагменты хлоропластов или модельные системы полагали, что две полосы при 686 и 695 нм могли принадлежать свечению све-тособирающего комплекса, хотя все хлорофилл-белковые полосы этого комплекса, полученные с помощью гель-электрофореза, имели максимум флуоресценции хлорофилла при 681 нм.

Большинство исследователей связывали полосу флуоресценции при 695 нм с ЗС-П. Разница состояла лишь в том, что одни приписывали ее реакционному центру или энергетической ловушке, другие ее ближайшей антенне, первичному донору или первичному акцептору ЗС-11.

Анализ большой группы мутантов ячменя с самыми разнообразными изменениями в ультраструктуре, функциональной активности' фотосистем и накоплении светособирающих пигментов в хлоропластах учеными Карлсбергской лаборатории не выявил какой-либо корреляции определенных максимумов флуоресценции хлорофилла с этими параметрами. Возник вопрос, существуют ли вообще в нативном состоянии для каждого хлорофилл-белкового комплекса характерные полосы флуоресценции хлорофилла? Чтобы получить ответ на этот вопрос, мы провели детальный анализ спектров флуоресценции хлорофилла при -196°С на 3-х группах мутантов.' В первой использовали одинарные мутанты, утратившие только один из 4-х хлорофилл-белковых комплексов. Во второй - двойные и в третьей — тройные мутанты, способные формировать в нативном состоянии два или только один из 4-х хлорофилл-белковых комплексов.

Исходя из специфичности белкового состава комплексов, зако-

номерностей распределения хлорофилла, мы предположили, что каждому из хлорофилл-белковых комплексов принадлежат определенные полосы флуоресценции хлорофилла. Поэтому потеря одного из комплексов в результате мутации должна была сопровождаться выпадением определенных полос излучения.

Исследования показали, что клетки дикого типа имели характерные полосы в спектре излучения хлорофилла при -196°С с максимумами при 686, 697 и 715 нм и слабо выраженный максимум в области 679*1,5 нм (рис.6).

У хлорофилл"в"-дефицитных мутантов, не формирующих светосо-бирающего хлорофилл "а"/"в" — белкового комплекса II / 34,37,50, 54,60,68,78 /, значительно падала интенсивность флуоресценции коротковолновых полос при 686 и 695 нм и смещалось положение длинноволнового максимума до 708-710 нм. На второй производной спектров флуоресценции хлорофилла мутанта С-48 хорошо видно отсутствие полосы излучения при 677-680 нм и смешение длинноволнового максимума в коротковолновую сторону до 712 нм, указывая на изменение в соотношении компонентов, ответственных за формирование полосы при 715 нм у дикого типа. Положение же максимумов при 686 и 697 нм не изменялось, хотя интенсивность их свечения становилась слабее. У мутантов, не формирующих обоих светособирающих хлорофилл-белковых комплексов, характер спектра флуоресценции оставался близким к дикому типу. Однако, положение длинноволновой полосы изменялось и ее максимум становился равным 720 нм.

Изучение двух типов мутантов с генетическим нарушением светособирающих комплексов указывало на то, что в одном случае клетки утрачивали преимущественно коротковолновую полосу излучения при 681 нм, а в другом — один из компонентов длинноволновой полосы флуоресценции, в результате мы наблюдали смещение максимума до 720 нм. Зти данные предполагали наличие полос свечения светособирающих комплексов как в коротковолновой, так и в длинноволновой областях.

Мутанты, утратившие активность 5С-П и не образующие хлоро-филл"а"-белковый комплекс СР II, имели только два четко выраженных максимума флуоресценции хлорофилла при 681 нм и 715 нм. Сохранение максимума при 715 нм указывало на то, что $С-П не вносит вклада в эту полосу излучения. Потеря комплекса СР II хорошо коррелирует с отсутствием полос флуоресценции хлорофилла при 686 и 697 нм. Сохранением у него светособирающего комплекса II можно объяснить наличие интенсивной полосы флуоресценции с максимумом при 681 нм.

Спектр флуоресценции хлорофилла у мутантов, утративших хлор

f 707

В i

650 700 750 800 650

Дикий тип К(+)

700 750

Мутант CC-I07

800 650 700 750 800

Мутант ВФ-5

6. Спектры флуоресценции хлорофилла и их вторые производные при температуре -196°С клеток дикого типа К(+) и двойных мутантов CC-I07, содержащего комплексы ФС-11 и ФС-I, и ВФ-5, формирующего только светособщэающие комплексы II и I.

филл"а"-белковый комплекс ФС-1 (CP I) имеет полосы излучения при 677-680, 686, 697 и 707 нм. Отсутствие у него ФС-1, по-видимому, обусловило потерю полосы излучения при 720 нм и выявило максимум флуоресценции при 707 нм, принадлежащий светособирающему комплексу I.

Таким образом, из анализа мутантов, дефицитных по одному из пигмент-белковых комплексов, можно заключить, что светособираю-щим комплексам I и II принадлежат полосы излучения при 681 и 707 нм, а комплексам ФС-П и ФС-1 — полосы при 686 , 697 и 720 нм, соответственно.

Исследования двойных мутантов, содержащих только светособи-рающие хлорофилл-белковые комплексы, показали, что они имеют два хорошо выраженных максимума при 681 и 707 нм (рис.6). В противоположность описанным выше мутантам двойные мутанты, содержащие только хлорофилл-белковые комплексы ФС-1 и (ЕС—II» имели три четких максимума при 686, 697 и 720 нм (рис,6). Эти факты давали нагл основание утверждать, что каждому из нативных пигмент-белковых комплексов свойственны строго определенные полосы излучения флуоресценции хлорофилла.

Для получения прямого ответа на вопрос о том, какие полосы флуоресценции принадлежат каждому из комплексов, мы получили тройные мутанты, содержащие только по одному из хлорофилл-белковых комплексов. Изучение их спектров флуоресценции однозначно показало, что в нативном состоянии комплексу ФС-П принадлежат две полосы излучения при 686 и 697 нм, комплексу ФС-1 — полоса излучения при 720 нм, светособирающему комплексу II — полоса при 681 нм, а светособирающему комплексу I — полоса при 707 нм.

Таким образом, детальный анализ мутантов, у которых генетически блокировано формирование одного, двух или трех пигмент-белковых комплексов, позволило выявить конкретные полосы флуоресценции хлорофилла каждого из нативных комплексов и впервые установить наличие двух длинноволновых полос излучения при 707 и 720нм, обуславливающих суммарную длинноволновую полосу флуоресценции клеток дикого типа при 715 нм.

III. Функциональная организация фотосистем.

До 1975 года многие исследователи поддерживали гипотезу Го-винджи о 2-х компонентной организации фотосистем. Однако, изучение флуоресценции Ватлером и Китаямой (1975), распределения форм хлорофилла (Ладыгин,1977,1979) и анализа Торнбером (1975,1979) белковых компонентов мембран привели в конечном счете к 4-х компонентной организации фотосистем. Возникал вопрос, как будут функционировать нативные комплексы реакционных центров при утрате свето-

собирающих комплексов. Эффективно и четко выполнить такую работу можно было только на мутантах.

а) Фотосинтетическая активность. В работе были использованы клетки дикого типа и мутантов без хлорофилла "в", утративших светособирающий комплекс II (мутант С-48),и двойных мутантов, не содержащих обоих светособирающих комплексов I и II, а имеющих только комплексы реакционного центра ФС-1 (мутанты АСС-П, АСС--14, АСС-42) или ФС-П (мутанты ЛСС-66, АСС-98, АСС-ЮО).'

Анализ способности клеток к фотосинтетическому вдделению 0£ показал, что при импульсном освещении у всех мутантов, содержащих ФС-П, наблюдались осцилляции с периодичностью максимального выделения 0-, на 3-4 вспышки /82 , 92/. Наличие осцилляций указывало на нормальное функционирование ферментной системы формирования 0^, а высокий уровень стационарного вьщеления 0«, при импульсном освещении подтверждал нормальную активность системы окисления ^0 и реакционного центра ФС-П / 14,19,21,82,92 /.

При непрерывном освещении первичный выброс С>2 в клетках мутантов был либо равный с клетками дикого типа, либо превышал его, что указывало на сохранение нормального функционирования пула пластохинонов ФС-П. Однако, высокий стационарный уровень выделения О2 мы отмечали только в клетках дикого типа, а у мутантов С-48 и СС-107 для достижения максимального уровня требовалась более высокая интенсивность освещения из-за потери одного или обоих светособирающих комплексов. Способность стационарного выделения 0£ характеризовала нормальную работу электронтранспортной цепи хяоропластов, включат активность ФС-1 и системы темновой фиксации СО^. Отсутствие комплекса ФС-1 у тройных мутантов не позволяло им длительно поддерживать высокий уровень выделения 0поскольку после восстановления пула пластохинонов ФС-11 скорость вьщеления ©2 у них резко падала, но, как правило, не до нуля. Нами впервые было установлено, что такой эффект обусловлен тем, что в отсутствие ФС-1, хотя и с низкой скоростью, возможен перенос электрона с ФС-П на НАДФ или гидрогеназу с выделением /69,79,82,92/.

Таким образом, используя мутанты, нам удалось доказать, что в отсутствие светособирающих комплексов сохраняется нормальная активность комплексов реакционных центров. Однако, уменьшение содержания хлорофилла требовало более высокой освещенности. Чтобы оценить как изменялась величина фотосинтетаческой единицы и число реакционных центров, мы провели специальные исследования.

б) Величина фотосинтетической единицы при нарушении светособирающих комплексов. Ранее мы отмечали, что в результате мутаций, приводящих к потере светособирающих комплексов или комплексов фо-

Величина фотосинтетической единицы в клетках дикого типа и мутантов аашпуйопюпаа ге1пЬагй11, рассчитанная по светоиндуцированным изменениям поглощения %од> феофитина, П^ и сигналам ЭПР 1 и ЭПР 2,-

Штаммы

| Размер антенны $С-1 и 5С-11, ! определенный методом ЭПР

Размер антенны 5С-1 и 5С-П, установленный абсорбционным методом

хлорофилл/Пцдд ! хлорофилл/Фео'.хлорофилл/П^од!хлорофилл/ Пхт !хлорофилл/Й^од

Отношение: РЦ $С-И РЦ ФС-1

К(+) 875 + 46 809 + 73 624 + 37 860 + 97 881 + 44 0,7-1,1

С-48 340 + 32 300 + 34 404 + 41 300 + 31 432 ± 68 1,2-1,4

СС-107 264 + 86 158 + 49 152 + 34 233 + 45 223 ± 43 0,6-1,1

АСС-11 0 0 143 + 56 0 118 ± 29 -

АСС-14 0 0 128 + 32 0 III + 31 -

АСС-42 0 0 118 + 37 0 117 + 24 -

АСС-бб 48 + 15 38 + 16 0 67 + 21 0 -

АСС-98 60 + 14 46 17 0 84 + 26 0 -

АСС-ЮО 57 4 II 48 + 12 0 95 + 18 0 -

АСС-238 51 + со 42 + 12 0 129 ± 34 0 -

8 I

Примечание : ноль указывает на отсутствие реакционных центров ФС-1 или 5С-П.

тосиотем, содержание хлорофилла уменьшалось примерно до 70, 40 и 15, 10 %, соответственно. Столь существенные изменения в накоплении хлорофиллов снижали величину фотосинтетической единицы, рассчитанной по соотношению молекул хлорофилла на число реакционных центров (табл.1).

Количественная оценка содержания реакционных центров ФС-Н к ФС-1 была проведена прямым их измерением. Реакционные центры ФС-П анализировали по светоиндуцированному изменению поглощения %80* Фе°Фи™на и ФС-1 — по I^qq, а также по сигналам ЭПР-II и ЭПР-1. В этих исследованиях нами было установлено, что в клетках дикого типа величина фотосинтетической единицы составляла 620 -880 молекул хлорофилла на один реакционный центр ФС-1 или ФС-П. Потеря светособирающего комплекса II уменьшает размер фотосинтетической единицы до 300-430 молекул хлорофилла, а потеря обоих светособирающих комплексов - до 150-260 молекул хлорофилла. У тройных мутантов, содержащих только комплекс ФС-1, величина фотосинтетической единицы уменьшалась до 100-120 молекул хлорофилла, а чистый комплекс ФС-П в нативном состоянии содержал 40-60 молекул хлорофилла / 82,88,92,95,96,101 /.

в) Число реакционных центров Фотосистем. Обычно у штаммов, содержащих обе фотосистемы, соотношение реакционных центров ФС-П /ФС-1 колеблется от 0,6 до 1,4 в зависимости от функционального состояния хлоропластов и стадии онтогенеза растений. У функционально активных хлоропластов оно близко к 1,0 или выше. В наших исследованиях было впервые установлено, что в молодых клетках дикого типа и мутантов с потерей части или всего светособирающего комплекса число реакционных центров существенно не изменялось как в расчете на грамм сырой массы, так и на один хлоропласт. Даже при потере комплекса ФС-1 у тройных мутантов число реакционных центров ФС-П на клетку и на один хлоропласт оставалось близким к контрольному (табл. 2).

'Важно отметить, что наши исследования также показали, что в расчете на мг хлорофилла число реакционных центров по мере редукции светособирающих комплексов существенно возрастает. Этот факт указывает, во-первых, на неспецифичность участия всех комплексов в организации фотосинтетических мембран хлоропластов, а во-вторых, на обогащение мембран тройных мутантов реакционными центрами /82, 92,96,101/, поскольку между формированием мембран и содержанием хлорофилла существует прямая коррелятивная связь;

Аналогичных данных для нативных комплексов нам не известно. Поэтому мы можем сравнить их с последними данными, полученными на

выделенных комплексах. Если принять, что из основных полипептидов

Число реакционных центров ФС-I и K-II в клетках дикого типа и мутантов Chlamydomonas reinhardii, рассчитанное по величине светоиндуцированных изменений поглощения феофитина и II^qq.

Штаммы 7 ■■■■'■ ...........— - ■< Число РЦ ФС-I и ФС-И X 10б на клетку и на хлоропласт Число РЦ ФС-I и ФС-И X Ю14 на г сырой массы Число РЦ ФС-1 и ФС-П X Ю14 на мг хлорофилла

пб80 I Фе0 ! ^700 %80 ! фео ! ^700 П680 ! фео ! "700

KU) 2,47 2,67 3,46 71,3 77,1 100,0 7,7 8,3 10,7

С-48 3,02 3,42 2,54 105,3 119,3 88,6 19,8 22,5 16,7

CC-I07 2,35 3,93 4,09 55,2 92,2 95,8 26,3 42,7 44,5

АСС-И 0 0 1,78 0 0 31,6 0 0 47,1

АСС-14 0 0 1,84 0 0 42,1 0 0 52,7

АСС-42 0 0 2,06 0 0 51,4 0 0 57,1

АСС-66 2,75 3,48 0 49,2 62,1 0 140,5 177,4 0

АСС-98 2,58 3,37 0 45,0 58,7 0 112,5 146,8 0

АСС-100 3,31 , 3,93 0 53,2 63,1 0 118,1 140,3 0

АСС-238 3,09 3,75 0 55,5 67,4 0 132,1 160,4 0

Примечание : в таблице представлены средние числа РЦ 2-4 независимых опытов.

ФС-П только два высокомолекулярных 43-47 и 47-51 кДа содержат хлорофилл по 23-25 молекул, то каждый реакционный центр должен включать около 50 молекул хлорофилла. Эти данные хорошо согласуются с организацией нативных комплексов ФС-11 у хламидомонады, которые имеют 50-10 молекул хлорофилла на один реакционный центр ФС-Л и обладают функциональными свойствами, характерными для клеток дикого типа. Содержание молекул хлорофилла нативного комплекса $С-1 мутантов хорошо согласуется с общепринятым в настоящее время представлением о величине ее фотосинтетической единицы, равной 110-160 молекул хлорофилла. Однако, известно, что лишь 30-60 молекул этого комплекса связаны с полипептицами 60-70 кДа реакционного центра П^дд ФС-1. Исходя из этих представлений можно полагать, что у мутантов, содержащих комплекс ФС-1, помимо пигментов, связанных с П^дд, накапливается еще 60-90 молекул хлорофилла ближайшей антенны 5X3-1, вероятно, не содержащих П^дд или непосредственно не передающих свою энергию на реакционные центры / 95,96 /.

1У. Развитие мембранной системы и структурная локализация фотосистем в тилакоидах хлоропластов.

С помощью мутантов высших растений, а также в процессе зеленения проростков,к началу наших работ уже были установлены основные этапы развития структуры хлоропластов от начала формирования мембранных пузырьков через проламеллярное тело до образования тилакоидов и упаковки их в граны.

В отличие от высших растений зеленые водоросли хлорелла, хламидомонада и другие способны синтезировать хлорофилл и на свету, и в темноте, поэтому в течение всего жизненного цикла имеют хорошо развитую структуру хлоропластов. Чтобы проследить ранние этапы ее образования, мы получили серию пигментных мутантов: белые, желтые, светло-зеленые и темно-зеленые, с помощью которых надеялись установить все основные этапы развития мембран.

а) Образование и развитие мембран хлоропластов хламидомонады. Поскольку хлорофилл является одним из основных компонентов мембран, то мы ожидали, что потеря пигментов у белых мутантов должна была сопровождаться редукцией тилакоидов. Электронномик-роскопические исследования впервые показали, что несмотря на хорошее развитие тела пластиды белых мутантов, мембранные структуры их пластид представлены 'лишь единичными пузырьками, разбросанными по всему матриксу (рис. 7). Пластиды белых мутантов заполнены практически только матриксом и, как правило, не образуют стигмы и пиреноида. Редукция глазного пятна обусловлена потерей каро-тиноидов. По этой же причине они не могут расти на свету.

Рис.7. Схема:образования и развития мембранной системы хлоропластов хламидомонада,установленная с помощью пигментных мутантов: 1-оболочка, 2-матрикс, 3-проламеллярное тело, 5-тилакоид.

Накопление харотиноидов у желтых (бесхлорофилъных) мутантов сопровождалось формированием большого числа мембранных пузырьков. Образование пузырьков в хлоропластах осуществлялось без участия хлорофилла как в темноте, так и на свету. Хлорофилл, по-видимому, необходим для бормирования проламеллярных тел и тилакоидов. Поэтому мутанты, способные накапливать хлорофилл на свету в первые часы зеленения, быстро формировали кристаллические структуры проламеллярных тел, из которых начинали развиваться единичные тилакоиды. С помощью желтых мутантов нами было установлено два принципиальных момента: I — образование большого числа пузырьков в отсутствие хлорофилла и 2 — формирование в первые часы синтеза хлорофилла типичной гексагональной структуры проламеллярных тел.

У светло-зеленых мутантов в зависимости от накопления хлорофилла формировалась сеть тилакоидов и зачаточное образование небольших гран из 2-3 тилакоидов. У штаммов с низким содержанием хлорофилла в темноте можно было наблюдать поздние этапы развития проламеллярных тел.

Нормальная же дифференцировка тилакоидов и упаковка их в граны происходила лишь в хорошо пигментированных хлоропластах клеток дикого типа, особенно при выращивании этой водоросли на свету. Хлоропласт исходного зеленого штамма имел типичную чашеобразную форму. Он занимал 2/3 объема клетки. Значительная часть тела хлоропласта заполнена тилакоидами с большим числом гран, включающих до 8-15 тилакоидов.

Темно-зеленые мутанты имели еще более внсокоструктурирован-ную мембранную систему хлоропластов, чем контрольные клетки с большим числом тилакоидов, заполняющих 'почти все тело хлоропласта, во многих местах образующих стопки тилакоидов от 10 до 30 штук на I грану во многом сходную с гранами высших растений.

Таким образом, с помощью мутантов была показана прямая корреляция степени структурирования хлоропласта с накоплением пигментов. Но более важно, что с помощью мутантов нами впервые были установлены все основные этапы формирования ламеллярной системы хлоропластов, характерные для пластид еысших растений и, следовательно, были получены доказательства принципиальной идентичности организации мембран хлоропластов зеленой водорослй хла-мидомонас и высших растений.

б) Пространственная локализация фотосистем в тилакоидах хлоропластов. Многие исследователи пытались локализовать фотосистемы в мембранах хлоропластов с помощью фракционирования, действия ингибиторов синтеза белков, детергентов, выделения гра-нальных и межгранных участков. Ни один из этих методов не давал

Рис. 8. Локализация пигмент-белковых комплексов на гидрофобных

поверхностях сколов замороженных мембран хлоропластов клеток дикого типа К(+) /а/ и гибрида А-66-90, не содержащего комплексов ФС-1 (140 К частицы РР - поверхности) и ЙС-11 (160 $ частицы ЕР - поверхности). Увел.: X 100 ООО

хороших результатов, йы решили получить мутанты без ФС-1 яги без ЗС-11 и изучить, как в нативньгх клетках этих мутантов изменяется архитектура тилакоидов и локализация субчастиц, обусловленных белками фотосистем на сколах замороженных мембран хлоропластов.

В электронно-микроскопических исследованиях тонких срезов клеток мутантов с неактивной 5С-1 мы установили, что в отличие от клеток дикого типа у них сильно редуцированы межгранные участки тилакоидов. Напротив, у мутантов с неактивной ЗС-П оставались только единичные тилакоиды, не имеющие плотных контактов, характерных для участков гран. Эти результаты предполагали локализацию ФС-1 преимущественно р межгранных участках тилакоидов, а ФС-П — только в участках плотных контактов тилакоидов гран.

Однако, чтобы подтвердить это предположение, основанное на изменении морфологии ламеллярной системы хлоропластов, необходимо было визуально пронаблюдать за локализацией хлорофилл-белковых частиц в мембране. Выявить локализацию белковых частиц в мембране с помощью электронного микроснопа позволяет метод замораживания-скалывания. Анализ субчастиц, выявляемых на гидрофобных поверхностях^сколов замороженных мембран хлоропластов, позволил установить четкую корреляцию между отсутствием хлорофилл-белковых комплексов 5С-1 у мутантов и 140 А частиц на поверхности скола внешней половины мембраны тилакоидов (РР) межгранных участков. В то же время отсутствие хлорофилл-белковых комплексов ЗС-П четко коррелировало с потерей 160 1 частиц на поверхности скола внутренней половины мембраны (ЕР) в участках контактов гра-нальных тилакоидов Срис. 8-9).

Важно отметить, что у мутантов без хлорофилла "в" число 160 X частиц не изменялось, но размеры их уменьшались до 80-110 1 / 49,65 /. Этот фа*Т указывал на то, что 160 А субчастицн представляют собой агрегаты, включающие хлорофиллпа"-белковый комплекс ФС-П и хлорофилл"а',/"в',-белковый светособирающий комплекс II. Кроме того, этот факт предполагал преимущественную локализацию хлорофилла "в" в гранальных участках мембран хлоропластов. Отсутствие хлорофилла "в" ведет к ослаблению контактов между ти-лакоидами гран, что служит указанием на важную роль этой части светособирающего комплекса в образовании контактов между тилако-идами в гранах. Светособирающий хлорофилл-белковый комплекс I показал преимущественную локализацию его в межгранных участках и, возможно, в составе агрегатов в 140 А субчастицах с комплексом ФС-1. Правомочность такого предположения подтверждена тем, что потеря комплекса СР I не ведет к полной утрате 140 а частиц, а лишь уменьшает их размеры при почти том же их числе.

Рис. 9. Схема пространственной локализации фотосистем с указанием молекулярной массы основных полипептидов, составляющих их комплексов, и групп генов, контролирующих синтез отдельных белков.

Следует особо отметить, что у двойных и тройных мутантов, также как и в клетках дикого типа и одинарных мутантов, сохранялась прямая корреляция между накоплением хлорофилла и числом тилакои-дов. Этот факт однозначно свидетельствует о том, что в структурном формировании мембран участвуют равноценно все комплексы, что позволило нам установить важную закономерность. В тех случаях, когда в результате мутации теряется один, два или три комплекса, число оставшихся комплексов на единицу поверхности мембраны увеличивается пропорционально. Так у двойных мутантов, утративших два светособирающих комплекса, число частиц ФС-II на мм^ поверхности мембраны увеличивается в 2 раза, а у тройных мутантов, у которых сохранился только один комплекс из четырех - число этих частиц возрастает в 4 раза. Обнаруженная закономерность позволила заключить, что плотность комплексов в мембране стехиометриче-ски постоянна, также как и размеры самих индивидуальных комплексов.

Следовательно, всесторонний анализ мутантов с различным со-

четанием комплексов позволил доказать, что 140 А субчастицы в межгранных участках тилакоидов представляли собой агрегаты, включающие комплекс 4С-1 и 1-2 субъединицы светособираюшего комплекса I, а 160 X субчастицы гран, помимо комплекса ФС-П, включали 2-4 частицы светособирающего комплекса II.

Локализация хлорофилл-белковых комплексов как в грапальных, так и в межгранных участках тилакоидов подчеркивала важность всей мембранной системы хлоропластов в высокоэффективном поглощении и запасании солнечной энергии в процессе фотосинтеза.

У. Наследование структурно-функциональных изменений хлоропластов в жизненном цикле и в процессе гибридизации.

Мутационные изменения хлоропластов сохранялись многие поко- . ления независимо от того, являлись ли это мутации ядерных или хлоропластных генов. И если для ядерных генов механизм их наследования хорошо известен, то для хлоропластных генов он практически оставался мало изученным. В данной работе нас интересовали вопросы структурно-функциональной организации мембран хлоропластов, поэтому исключительную важность приобрел вопрос наследования хлоропласта в жизненном цикле в процессе клеточных делений и при гибридизации. Работ по этому вопросу очень мало. Для подобного рода исследований мы использовали модельную систему, а именно клетки дикого типа с хорошо структурированным хлоропластом и клетки желтого мутанта Ж-4, хлоропласт которого формировал только пузырьки. На электронных фотографиях мы легко могли различать их и следить за их поведением с момента слияния гамет до со.". резания зиготы, а также за распределением мутантных признаков :седи рексмбинантных дочерних клеток хламидомонады.

а) Наследование хлоропласта при вегетативном размножении. Как уже отмечалось ранее, клетки хламидомонады содержат один хлоропласт. 3 процессе развития вегетативной клетки он также разрас-Г2дся и занимал 2/3 ее объема. иерез 6-8 часов роста в жидкой гг-'.-е -егетативная клетка способна к делению. Деление начиналось с удвоения числа хромосом и митотического деления ядра, которое заканчивалось формированием двух дочерних ядер (рис.10). Клетка г хлоропласт не делились до тех пор, пока не завершалось деление я.дра. Формирование двух дочерних геномов в клетке, возможно, являлось сигналом к началу деления хлоропласта. Вначале делился его пиреноид, глазок и, возможно, ДНК хлоропласта (пластом). И только когда начиналось деление клетки — цитокинез, можно было легко наблюдать образование перетяжки в базальной части посередине хлоропласта. Деление хлоропласта завершалось формированием

Рис. 10. Непрерывность хлоропласта в жизненном цикле хламидомонады как в процессе вегетативного (митотического) /а/, так и полового (мейотического) /б/ типов размножения.

двух полухлоропластов, каждый из которых уже имел пиреноид, глазок и ДНК-содержащую область (пластом).

Таким образом, нами было установлено, что вегетативное (ми-тотическое) деление клетки сопровождалось не только удвоением генома и пластома, но и делением хлоропласта пополам, обеспечивая его непрерывность в ряду клеточных поколений при бесполом размножении.

б) Наследование хлоропласта при половом размножен:;',; жизненного цикла. Хламидомонада имеет гетероталличный изогамный половой процесс. Её гаметы с половым знаком (+) и (-) морфологически неотличимы. Они подвижны за счет пары жгутиков. Гаметы отличались от вегетативных клеток биохимическим составом и отсутствием клеточной стенки.

Для того, чтобы легко было наблюдать за поведением хлоропла-стов материнской и отцовской клеток, мы использовали в скрещиваниях гаметы с морфологически легко отличимыми хлоропласта®. Гаметы дикого типа имели хорошо развитую структуру хлоропласта, а желтого мутанта Ж-4 — сильно редуцированную, содержащую лишь многочисленные пузырьки (рис.10,б).

После слияния таких гамет формировались зиготы, которые в первые 1-2 ч содержали два хорошо различимых морфологически хлоропласта и два ядра. Ядра уже через 1,5-2 ч начинали сливаться, образуя мембранные мостики вначале внешних, а потом и внутренних мембран ядерной оболочки. Слияние ядер могло происходить с образованием от I до 3 таких мембранных мостиков. Через 4-4,5 ч в зиготах почти заканчивается образование диплоидных адер с двумя ядрышками, которые затем тоже сливались. С этого момента можно было наблюдать начало слияния двух хлоропластов родительских гамет. Оно начиналось, как и в случае ядер, с образования мембранного мостика. Зона контакта оболочек хлоропластов постепенно расширялась, пока не охватывала всю ширину пластид. Сразу же в области слияния хлоропластов начинали Формироваться тилакоицы в желтой его половине. Восстановление структуры связано с наличием в гете--эзпготе гена дикого типа. Через б ч после начала слияния гамет оиготы имели один хорошо структурированный "диплоидный" хлоропласт зиготы.

Через 5 суток созревания зигот они способны к мейотическому делению с образованием четырех, дочерних зооспор, которые давали начало вегетативно размножающимся клонам. Таким образом, при половом размножении пластиды сохраняли свою непрерывность вместе с их автономной .от ядра генетической информацией. Механизм поведения пластсма пока мало изучен. На основании полученных нам дан-

ных по поведению хлоропластов.можно ожидать, что в хлоропластах существует механизм дубликации генетического материала и его распределения в дочерние клетки аналогичный ядерному, который обеспечивает сохранение плес тома как при бесполом, так и при половом размножении.

в) Наследование признаков хлоропластов в процессе гибридизации. Электронно-микроскопические исследования и генетический анализ наследования мембранной системы в случаях одногенной рецессивной ядерной мутации показали, что развитие мембранной системы хорошо коррелировало с менделевским типом наследования ядерных генов (рис.II).

В реципрокных скрещиваниях гаплоидных клеток дикого типа и мутанта Ж-4 получались диплоидные гетерозиготы, содержащие одну аллель дикого типа (отмеченную в ядрах знаком +) и одну мутант-ную аллель (отмеченную в ядрах знаком -) анализируемого гена Ж-4. После созревания и мейотического деления таких зигот в них формировалось четыре дочерних клетки: зеленые и желтые в соотношении 2:2. Каждая из них давала начало клону, способному неограниченное время размножаться вегетативно, как описано ранее. В контрольных скрещиваниях клеток дикого типа К(+) X К(-) или мутантов Ж-4(+) X Ж-4(-) образовывались диплоидные гомозиготы (+ +) или (—). От таких зигот получалось потомство только дикого (4:0) или только мутантного (0:4) типа, способное размножаться вегетативно неограниченное число поколений.

Представленные результаты позволили заключить, что с помощью генетических методов можно не только изменять структурно-функциональную организацию хлоропластов растений, ее генетический контроль, но и предсказывать наследование измененных признаков в ряду поколений.

б.' 3 и г о т ы: 3 зел. : I жел.

Рис. II.Схема наследования структурно-функциональных изменений мембранной системы хлоролластов хламидомонады в рецпп-рокных скрещиваниях клеток дикого типа и желтого мутанта Ж-4 при ядерной детерминации признака.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Благодаря использованию метода мутагенеза нам удалось показать, что все нативные хлорофилл-белковые комплексы, участвующие в организации фотосистем, во-первых, являются дискретными, генетически автономно детерминированными единицами, формирование каждого из которых может быть блокировано мутациями отдельных генов. Во-вторых, генетический блок образования любого из комплексов обусловлен нарушением биосинтеза специфических белков-носителей и, как следствие, сопровождается потерей части хлорофилла, которая с ним ассоциирована. Специфичность локализации белков в мембранах хлоропластов и их взаимодействие с хлорофиллом определяют характерные для каждого из комплексов спектральные свойства и фотохимическую активность и могут быть использованы как диагностический экспресс-тест. В-третьих, установленное нами сохранение нативной организации и свойств автономных пигмент-белковых комплексов фотосистем позволяет экспериментально моделировать и получать в нативном состоянии реакционные центры с различной величиной свегособирающей антенны, что открывает большие перспективы не только в выяснении ряда теоретических проблем, но и в решении практических задач рационального использования солнечной энергии. Так, например, для устранения эффекта полуденной депрессии фотосинтеза при высокой инсоляции в южных районах можно уменьшить светособирающий комплекс у растений или, наоборот, искусственно увеличить светособирающие антенны фотосистем для оптимизации процесса фотосинтеза при низкой интенсивности света. Оба направления искусственной модернизации фотосистем хлоропластов могут быть использованы для получения максимальной продуктивности растений при высоких и при низких освещенностях как в естественных, так и в искусственных условиях выращивания. Получение высокохлорофильных (темно-зеленых) мутантов, как правило, ведет к повышению белковой биомассы, что также может найти широкое биотехнологическое применение в особенности в тех случаях, когда будут установлены механизмы наследования структурно-функциональных изменений фотосинтетических мембран хлоропластов. Закономерное распределение и взаимодействие комплексов фотосистем в тилакоидах играет решающую роль в биогенезе мембран и их пространственной упаковке в хлоропластах. Установленная нами непрерывность хлоропластов в митотических и мейотических клеточных циклах открывает цути изучения механизмов наследования в ряду поколений не только ядерных, но и хлоропластных генов.

- 41 -ВЫВОДЫ

1. Получена уникальная коллекция одинарных, двойных и тройных мутантов хламидомонады, включающая около 200 разнообразных штаммов, в том числе содержащих отдельные комплексы или различные сочетания пигмент-белковых комплексов и представляющая исключительно удобные модельные объекты для изучения генетического контроля, молекулярной организации и функционирования фотосинтетических мембран.

2. Благодаря использованию мутантов впервые установлено, что химические и физические мутагены индуцируют 4 типа мутаций, блокирующих формирование четырех генетически независимо детерминированных нативных пигмент-белковых комплексов, два из которых выполняют светособирающие функции, а два других содержат комплексы реакционных центров ФС-1 и ФС-П и осуществляют светофокусирующие функции и первичное разделение зарядов соответственно.

3. На целых клетках мутантов выявлены основные закономерности распределения хлорофиллов в нативных пигмент-белковых комплексах. Основная часть хлорофилла "а" до 60-70 % и весь хлорофилл"в" входят в состав светособирающих комплексов I и II с содержанием пигментов в комплексах близком к 1:3 соответственно. В то время как комплексы реакционных центров I и II содержат только хлорофилл "а" в количестве 15-20 и 10-15 % соответственно от общего его содержания в хлоропласта*.

4. Показано, что в структурно-функциональной организации пигмент-белковых комплексов решающая роль принадлежит специфическим белковым носителям, структура молекул которых обуславливает спектральные и фотохимические свойства фотосистем и закономерность распределения форм хлорофилла между нативными комплексами, впервые установленную нами благодаря использованию различных типов мутантов.

5. Впервые проведена количественная оценка величины фотосинтетической единицы и числа реакционных центров фотосистем I и II для целых клеток мутантов и обнаружено, что при потере светособирающих комплексов число реакционных центров на хлоропласт не изменяется, а в расчете на хлорофилл существенно возрастает, предполагая значительное обогащение фотосинтетических мембран двойных и тройных мутантов реакционными" центрами.

6. С помощью набора пигментных мутантов получены доказательства принципиальной идентичности биогенеза мембранной системы хлоропластов зеленых водорослей и высших растений, начиная от формирования единичных пузырьков и проламеллярного тела до хорошо развитых гранальных структур.

7. На основании биохимических, спектральных и фотохимических исследований диких форм и мутантов водорослей и высших растений детально охарактеризована и экспериментально доказана универсальность организации пигмент-белковых комплексов фотосистем различных видов водорослей и высших Сд~ и (¡^-растений. Выявлена прямая коррелятивная связь между накоплением пигментов и развитием мембран хлоропластов и показана способность любого из комплексов к формированию мембран тилакоидов. Причем, если мембрана образуется с участием только двух или одного из комплексов, то стехиоме-трическая их плотность в фотосинтетической мембране увеличивается соответственно в 2 или 4 раза.

8. Найденная нами специфика локализации комплексов в мембранах хлоропластов обуславливает характерную пространственную архитектуру тилакоидов, благодаря расположению ЗС-П преимущественно в гранальных, а ФС-1 в межгранных участках тилакоидов. Взаимодействие комплексов реакционных центров ФС-11 или ФС-1 с соответствующими им светособирающими комплексами обеспечивает образование нормально функционирующих фотосистем, структурным выражением которых на гидрофобных поверхностях сколов мембран являются 160 X

и 140 8 частицы соответственно.

9. Установлены принципы наследования комплексов фотосистем благодаря непрерывности хлоропласта хламидомонады в течение вегетативного и полового размножения в жизненном цикле, а также в процессе гибридизации, обеспечивающие в ряду поколений сохранение структурно-функциональных изменений мембран хлоропластов у мутантов неограниченное время.

10. Совокупность полученных нами результатов и литературных данных позволили предложить концепцию организации фотосистем, включающую 4 типа нативных пигмент-белковых комплексов с закономерным распределением в них хлорофиллов, обладающих специфическими спектральными и фотохимическими свойствами, сформулировать основные положения и универсальные закономерности структурно-функциональной организации мембран хлоропластов, характерных для зеленых водорослей и высших растений.

cxicok работ по те.ш дйссертащз;

1. Ладыгин Б.Г. Замыкающие клетки устыы, пластиды л пальцевые зерна диплоидных и тетраплоидных гречих// Генетика. IS65. T.I. JS о. С. I27-I3I.

2. Ладыгин ¿.Г. Пигментные мутанта Chlamydcmcnas reinhardü шшу-цированные нитрозоэтилмочевиной и ульттайголетовыми лучами//Ге-нетика. I97U. Т.6. Si 3. С. 42-5Ü.

3. Ладыгин В.Г., Семенова Г.А., Тагеева С.¡i. Пигменты и фотосинтез мутантов Chism-domonas reinhardii i/ Биофизика ::т:вой клетки. Ред. Г.М.<гранк. Пушило. 1970. X.I. С. »4-69.

4. Семенова Г.А., Ладыгин З.Г., Тагеева C.B. Ультраструктурная организация хлоропластов пигментных мутантов Chlamydomonas rein-hardii // Биофизика кивой клетки. Ред. Г.М.йранк. Лущино. 1970. T.I. С. 90-94.

5. Тагеева C.B., Ладыгин В.Г., Семенова Г.А. Использование пигментНЫХ' мутантов Chlamydomonas для изучения структуры и функциональной активности хлоропластов// Биохимия и биосеизика фотосинтеза. Иркутск. 1971. С. 87-93.

6. Тагеева C.B., Генерозова К.П., Деревякка В.Г., Ладыгин В.Г., Семенова Г.А. Разнообразие ультраструктурной организации хлоропластов в зависимости от функционального состояния тканей растения, генетических фактороз и световых условий // Фотосинтез

и использование солнечной энергии. Л.: Наука. 19VI. С. 126-144.

7. Кикнадзе Г.С., Ладыгин В.Г. Кинетика флуоресценции хлорофилла пигментных мутантов Chlamydomonas reinhardü //Биофизика. 1972. Т.17. Вып.З. С. 453-459.

8. Ладыгин В.Г., Буриков Э.А. Действие ультрафиолетового излучения на асинхронную культуру и на разные стадии вегетативного клеточного цикла синхронной культуры Chlamydomonas reinhardü //Радиобиология. 1972. Т.12. Вып.о. С.723-729.

9. Ладыгин З.Г. 0 генетической регуляции ламеллярной системы хлоропластов пигментных мутантов Chlamydomonas reinhardii //BnoUl-зика кивой клетки. Ред. Г.М.^ранк. Дущино.JI972. Т.З. С.93-95.

10. Ладыгин В.Г., Семенова Г.А., Тагеева C.B. .жгментные мутанты как биологические модели с различным уровнем мембранной организации хлоропластов //Биофизика айвой клетки. Ред. Г.И.Франк. Пущино. IÔ72. Т.З. С. 142-149.

П. Ладыгин В.Г., Семенова Г.А., Тагеева С.З. Ульт растру ктуш пластид .белого И желтого мутантов Chlamydomonas reinhardü 7/ ЦИТОЛОГИЯ. 1972. т.14. и г2. с. i455-I4SC.

12. Ладыгин З.Г., Семенова Г.А., Тагеева C.B. Развитие ламеллярной структуры пластид у пигментных мутантов Chlamydomonas reinhardü //Цитология • 1973. Т.15. & 7. С. 310-817.

13. Ладыгин В.Г., Садовникова Л.Г. Генетический анализ светло-зеленых мутантов Chlamydomonas reinhardii //Генетика. 1573. Т.9.

If 6. С. 45-5С.

14. Ладыгин В.Г. Интенсивность фотосинтеза и накопление пигментов у исходного штамма и мутантов chiamydomaaas в течение вегетативного клеточного цикла //Физиол.растений. 1973. Т.20. Bun.5.

С. 993-926.

15. Ладыгин В.Г., Семенова Г.А., Тагеева С.З. Непрерывность хлоропластов chlamydomonas reinhardii а течение жизненного цикла Л. Деление хлоропласта при вегетативном размножении //Цитология. 1974. Т.16. » 10. С. 1203-1209.

16. Ладыгин В.Г., Семенова Г.А., Тагеева C.B. Непрерывность хлоропластов Chlamydomonas reinhardii В течение жизненного цикла. П. Формирование хлоропласта зиготы и пластид зооспод в процессе полового размножения.//Цитология. 1975. T.I7. Л 2. C.II5-I20.

17. Ladygin V.G., Semenova (i.A., Tageeva S.V. Electron - microscopio study of chloroplasts in zygotes of Chlamydomonas reinhar-

dii// Genetic aspects of photoBenthesis. Dr. Ъ-v. pub-

lishers. ihe Hague. 1975- P. 45-4-8.

18. Семенова Г.А., Ладыгин В.Г. Ультраструктура пластид трех типов мутантов chiamNdomoiias reinhardii (Ьеиотишнески желтых на свету или в темноте //Цитология, 1975. Т. 17. й S. С. J003-I008.

IS. Ладыгин В.Г. Об оценке'продуктивности пигментных мутантов одноклеточных водорослей// Физиол. растений. 1975. Т.22. Вып.2. С. 336-342.

20. Ладыгин В.Г., -Попов ¿.II., Тагеева C.B. Летальное и мутагенное действие гамма-лучей на одноклеточную зеленую водоросль Chiamy-domonas reinhardii '// Радиобиология. 1976. T.16. Зып.1.

21. Ладыгин^В.Г., Семенова Г.А., Тагеева C.B., Попов В.И. Экспериментальный мутагенез в получении.модельных объектов для изучения мембранной организации хлоропластов// В сб. Молекулярные механизмы генетических процессов. Д.: Наука, 1976. С. 52-07.

22. Ладыгин В.Г. Получение и отбор мутантов одноклеточных водорослей с нарушением цепи переноса электрона фотосинтеза //йизиол. растений. 1976. Т.23. Вып.5. С. 877-884.

23. Ладыгин- В.Г. Метод выделения нефотосшиезипующих мутантов водорослей по признаку карликовости колоний //Генетика. IS77. Т.13. -Ü 5. С. 905-910.

24. Попов В.И., Тагеева C.B., Ладыгин В.Г. Надмолекулярная организация мембран хлоропластов у мутантов Chlamydomonas reinhardii с неактивными фотосистемами //Известия Ай СССР, сер. биол. 1977.-В 6. С. 856-868.

25. Семенова Г.А., Ладыгин В.Г., Тагеева C.B. Ультраструктурная организация мембранной системы хлоропластов мутантов chiamjdo-monas reinhardii с неактивными фотосистемами// Физиология растений. 1977. Т.24. Вып.1. С. 18-22.

2S. Ладыгин В.Г., Семенова Г.А., Тагеева C.B. Пигментация и структура хлоропластов ЗИГОТ Chlamjdomonas reinhardii при рецип-рокных скрещиваниях хлорофилльных мутантов и клеток дикого типа// Цитология. I977-. Т. 19. S 6, С. 585-591.

27. Семенова Г.А., Ладыгин В.Г., Тагеева С.З. Электронно-микроскопическое изучение хлоропластов В зиготах Chlamydomonas reinhardii // Генетика фотосинтеза. Душанбе: Дониш. IS77. С.150--154.

28. Ладыгин В.Г.г Садовникова Л.Г. Наследование светло-зеленой окраски КОЛОНИЙ У одноклеточной зеленой водоросли Chlanodomonas reinhardii// Генетика фотосинтеза. Душанбе: Дониш, 1977.

С. 128-132.

29. Ладыгин В.Г., Костиков А.П. Спектральные свойства хлорофилла и активность фотосистем пигментных MVTaHTOBChlanrydomonas // Физиол. растений. 1978. Т.25. Вып.З. С. 500-509.

30. Семенова Г.А., Ладыгин В.Г., Тагеева C.B. Конденсация ДНК хлоропластов в зиготах хламидомонады// Цитология. IS78. Т.20.

й II. С. I320-I32I.

31. Ладыгин З.Г., Семенова Г.А., Тагеева C.B. Вариабельность в накоплении пигментов и структурной организации хлоропластов у рекомбинатов фенотигшчески желтого мутанта Е-4 chlamjdomonas reinhardii // Цитология. 1978. Т.20. № 9. С. 998-1004.

32. Ладыгин В.Г. Спектральные формы хлорофилла мутантов Chlamjdomonas с неактивнш,m фотосистемами // Биофизика. 1979. Т.24. Ban.2. С. 254-259.

33. Костиков А.П., Ладыгин В.Г., Мезенцев В.В., Ильин D.H. Установление места нарушения электронтранспортной цепи хлоропластов у мутантов Chiamydomonas с неактивной фотосистемой П // Биофизика. I97S. Т.24. Вып.5. С. 925-927.

34. Ладигаи 2.Г., Семенова Г.А., Тагеева C.B. Снектралыые *ормы хлорофилла п структура хлоропластов мутантов Chiamjdomonas с шруыешиии в светособвращкх пигментах // Ейо&изика. 15 79. Т. 24. Вии.4. G. 681-673.

Зо. Семенова Г.А., Ладыгин В.Г., Тагеева С.З. Исследование JJHÍ—со— дерваадах облаете;', хлоропластов в зиготах хлаппдошнадо .методом электронной ^здиоавтограпяш // Доклада All СССР. 1979. Т. 245.

3G. Дадыгин З.Г., Христин U.C. Изучение белковых переносчиков электронтранспортной цепи хлоропластов у не^отоскнтсзпруз^пс мутантов OhXaajdoaoaae reinhardii // BlîOXECTI. IS7S. T.44. ЗИП.7. С. I3IC-I3I6.

37. Тагеева J.ií. , Ладыгин З.Г., Семенова Г.А. Взаимосвязь между спектральными формами хлорофилла и структурной организацией мембран хлоропластов Chiamj-domonas reinhardii //Доклада АН СССР. 1979. T.24G. й 6. С. I5I3-I5IG.

38. Ладыгин В.Г. Флуоресценция и формы хлорофилла фотосистемы I и Фотосистемы И chiamjdomonas reinhardii// Доклады АН СССР. I27S. Т.248. № 4. С. 984-987.

39. Москаленко A.A., Ладыгин В.Г. Белковый состав мембран хлоропластов мутантов chiamydomonas reinhardii с неактивными фотосистемами I и II // Доклады АН СССР. 1979. Т. 249. № 4. C.ÎQI7--1019.

40. Рощина В.В., Ладыгин З.Г. Определение пятохромов в хлоропласта- мутантов chiamydomonas reinhardii //Прикладная микробиология. 1979. Т.15. 5 6. С. 8Ö3-888.

41. Ладыгин З.Г., Биль К.Я. Распределение хлорофилла ;,:е;.зд чС-1, QC-П'И светособцраищшл комплексом з хлоролластах зеленых водорослей у. Ся-растенпи // Препринт института фотосинтеза АН СССР. Пущин о: ОНТЛ НЦЕ:. 1979. 34 с.

42. Ладыгин 3.Г. Получение гибридного штата Chiam^domonas с неактивными íC-í и íX-II и установление трех типов антенного хлорофилла в метках in vivo // Генетика, i960. Т. 16. Ii G.

С. 994-IG9I.

43. Ладыгин З.Г., Семенова Г.А., Тагеева С.Б. фотохимические свойства к структура :.:с;.;бран хлоропластов гибридного птамма chia-sQrdomonae с неактивными 4-C-I и ЙС-П // Физиол. растений.

Т.27. ÜJ1I.I. С. 91-97.

44. Гольдфельд М.Г., Дадыгин В.Г., Халилов Р.И. Спектры ЭПР и термолюминесцентная яефотосинтезируюпцтх мутантов Chiam;,domonaö reinhardii// ¿изиол. растений. IS80. Т.27. Зип.2. С. 308-3X4.

4и. Гольд З.М., Гаевскип H.A., Григорьев lu.С., Белоног Н.П., Дадыгин З.Г. Индукционные переходы (Тдуоресценции и послесвечения хлорофилла у нефотосинтезирующих мутантов Chlamjdomonas reinhardii//Физиол.растений. IS80. Т.27. Вып.6. С. I2II-I2I7.

46. Рощина В.В., Дадыгин З.Г., Мутускин A.A., Мажорова Л.Е., Пше-нова К.З. 0 повреждении цитохрома С-553 в клетках нефотосинте-зиоующих мутантов Chi aurvdomona s reinhardii // Биохимия. 1980. T.45. Sun.10. С. I755-I7GC.

47. Семенова Г.А., Дадыгин З.Г., Тагеева С.З. Непрерывность хлоропласта Chlamjdomona s reinhardii в течение жизненного цикла. Ш. Структура хлоропласта и его компонентов в процессе созревания и прорастания зиготы // Цитология. 1980. Т.22. II.

С. 1290-1295.

40. Ladjgin V.G., Bil' К.ха. Chlorophyll form of 684 nm as antenne of photosystem II in ohloroplasts of C^-plant leaves //Photo-synthetica. 1981. V. 15. P. 49-54. 4

49. Семенова Г.А., Дадыгин В.Г., Тагеева C.B. Распределение внут-римембранных частиц в тилакоидах пигментных мутантов Chlamy-domonas с нарушением антенных форм хлорофилла// Доклады АН СССР. 198I. Т. 256. № 6. С. 1494-1498.

50. Чунаев A.C., Ладыгин В.Г., Гавриленко Т.А., Крэла Л.П., Корнь-шенко Г.А. Наследование признака "отсутствие хлорофилла в" и изменчивость светособиравщего комплекса в мейотическом потомстве мутанта С-48 chiamjdomonas reinhardii // Генетика. IS3I. Т.17. » II. С. 2013-2024.

51. Ладыгин В.Г., Семенова Г.А., Чемерилова В.П., Квитко К.В., Столбова A.B., Тагеева С.З., Ирошникова Г.А. Вариабельность структурной организации хлоропластов у аллельных светочувствительных мутантов Chiamjdomonas reinhardii // Цитология. 1982. Т.24. & 4. С. 391-399.

52. Ладыгин В.Г., Биль К.Я. Антенная Форма хлорофилла Фотосистемы П в хлоропластах // Биофизика. 1982. Т.27. Вып.1. С.37-41.

53. Ладыгин В.Г., Биль К.Я., Бонок Г.В. Форш хлорофилла и структура хлоропластов мутантов гороха с неактивной шотосистемои I или фотосистемой П //Физиол. растений. 1982. T.2S. Вып.З.

С. 479-487.

54. Ладыгин В.Г., Фомина И.Р., Биль К.Я.', Москаленко A.A., Елрши-кова Г.Н. Хлорофилл-белковые комплексы зеленых водорослей и высших растений. I. Идентификация хлорофилл-содер;:аидах полос В геле С использованием мутантов Chiamjdomonas reinhardii// Биохимия. 1983. Т.48. Вып.9. С. I42I-I428.

55. Фомина И.Р., Биль К.Я., Ладыгин З.Г., Москаленко A.A., Ыагоые-дов И.М. Хлорофилл-белковые комплексы зеленых водорослей и высших растении. П. Гетерогенность комплексов хлоропластов диморфных тканей листьев Сд-растешь// Биохимия. 1983. Т.48. Вып.10. С. I604-I6I0. 4

56. Ладыгин В.Г., Агрикова U.U. Структурная организация хлороплао-тов у аллельных хлорофилл "в" - дефицитных мутантов chlamjdomonas reinhardii //Цитология. I£83. Т.25. & II. C.I23I-I235.

57. Ладыгин В.Г., Семенова Г.А., Ширшикова Г.Н., Голота О.Н. Структура, фор™ хлорофилла и пигмент-белковые комплекса хлоропластов Euglena gracilis //чизиол. растений. 1983. Т.30. Вып.6. С. II80-IIS7.

58. Ладыгин В.Г. Активность фотосистем и спектральные свойства хлорофилла двойных хлорофилл "в" - дефицитных мутантов chlamjdomonas с неактивной уС-I или ФС-Д /7 Физиол. растений. 1984. T.3I. Вып.1. С. I04-II3.

59. Semenova G.A. , Ladjgin V.G. '.Copographj of thjlakoiü membranes of chloroplasts based on the analysis of Chlamjdomonas mutants deficient in chlorophyll-protein complexes // Fhotosjnthetica. 1984. V. 18. N I. P. 50-56.

60. Ладыгин В.Г. Доказательство сохранения части светособирашцего комплекса у хлорофилл "в" - дефицитного мутанта ячменя // Физиол. растении. 1984. Т.31. im Л. С. 733-739.-

Gl. Чунаев A.C., Ладыгин В.Г., :,1прная О.Н., Семенов 2.Я., Гаев-ский H.A., Болдина 0.II. ¡.¡нокественнып: аллелизм в гене cbn I, Контролирующем накопление Хлорофилла "в" У Chlamjdomonas reinhardii // Генетика. 1984. Т.20. Ii 5. С. 775-781.

62. Ладыгин В.Г., Ладыгина О.Н. Летальное и мутагенное действие /-излучения на клетки двойных пигментных и нейотосинтезирую-щих мутантов chlamjdomonas reinhardii //Радиобиология. 1985. 1.25. Вып.2. С.267-270.

63. Герц С.М., Биль К.Я., Крупенко А.Н., Ладыгин В.Г. Некоторые особенности фотосинтетического метаболизма углерода у мутантов хламидомонады с неактивными ФС-1 или ФС-П //Физиология и биохимия культурных растений. 1985. Т.17. № 3. С. 249-253.

64. Гаевский H.A., Сорокина Г.А., Гольд В.М., Ладыгин В.Г., Гех-ман A.B. Изучение природы термоиндуцированных изменении флуоресценции хлорофилла С использованием мутантов Chlamjdomonas reinhardii //Физиол. растений. 1986. Т.32. Вып.4. С. 674-680.

65. Семенова Г.Л., Ладыгин В.Г. Структурная организация мембран тилакоидов мутанта хламидомонады, лишенного светособирающего комплекса и цртосистеш I // Фиаиол. растений. 1985. Т.32. Вып.2. С. 223-230.

66. Ладыгин В.Г. Спектральные свойства хлорофилл "а" - белкового комплекса фотосистемы II в нативном состоянии // ¿изиол. растений. 1985. Т.32. Зып.Ь. С. 851-659.

67. Ладыгин В.Г. Штамм C-4I Chlamydomonas reinhardii - продуцент дзета-каротина //Авторское свидетельство й 1289064 от 13.0b .8э

G8. Ладыгин В.Г., Лебедев II.Н. Спектры флуоресценции хлорофилла фотосистемы I, фотосистемы ц и светособирающего комплекса Ghlam^domonas reinhardii // Молекулярная биология. 1986. Т.20. № 2. С.4(37-414.

69. Войченко В.А., Аллахвердиев С.И., Ладыгин В.Г., Климов В.В. Функциональное сопряжение гидрогеназы с фотосистемой II в целых клетках мутантов Ohiamjdomonas reinhardii //Доклады АН СССР. 1986. Т.290. & 4. С. 995-998.

70. Семенова Г.А., Северина Е.П., Ладыгин В.Г. Липлдный состав хлоропластов мутантов Chiamydomonas дефицитных по хлорофилл-белковым комплексам // Физиол. растений Г 1987. Т.34. Bun.I. С.74-79.

71. Klimov V.V., Allakhverdiev S.I., Ladj-^in V.G. Fnotoreduction of pheophytin in photosybtcm II of the cells of ^reen a:gae and cjanobacteria //Photosynthesis гееьах-eh. 1986. V.IO. Я J.

P. 355-J61.

72. йануильская С.В., Яедигип В.Г., Ыихно А.П., Циршкова Г.Н.,

Липщшьй состав глембран хлоропластов у мутантов chiamydomonas reinhardii , лишенных фотосистем или светособирающего комплекса// Биохимия. 1987. Т.52. Вып.5. С. 731-736.

73. Трусош J.I4., Ладыгин В.Г., аезешцев 2.3., Молчанов U.II. voc-Оолишаш иеглоуш ХЗОДОШЮТОВ цутщйа СЫав; dontonas reinhardii

не образующего иотсспстегл II //Ъоглосм All ССОР. 1987. Т. 293. а 3. С. 751-754.

74. Яадигш ¿.Г., Семенова Г.А., Зотнкова А.П., Сшаиова D.il. Пзхспюше уль'х'рас-'рук'адцси органкзацш: хлоропластов гсипекго: проростков сосны и кедра после киаткозремешюго освещения // цитология. 1987. Т. 29". 7. С. 754-760.

75. Закриевсккй Д.А., Ладыгина О.Н., Ладыгин В.Г. Влглпгс

т мелеза на спектралышс cBo;icvm число рошсцпощисс центров Сотоското!.; хлосслластоь гороха // растешь, 1UJ7. 1.34. Впл.5. С. 92G-932. 73. Ладыгин В.Г., итпшкова Г.Н. Участие фотосистемы I в светоин-дуцированном превращении виолакоантина в зеаксантин // Физиол. растений. 1987. Т.34. Вып.6. С. 1068-1072. 77. Klimov V.V. , Allakhv.erdiev S.I., Ladyfcin V.G. Photoreduction of pheophjtin in photos«st°s II of the г.-hjle cells of trten Rlf-at/'/ixitation ana electron transfer in pho tosyntht-sis. idf.Govindjee , iorcer 0 .Ketnarlands. 1Q87. P. 209-215. Ohuna^LV A.a., Ladj^m V.G. , iiemjushenko U.A. , Gaevsky Ы.А., Mirnaya О.И. Studies on chlorophyll "Ъ''-less mutants in Chia-Ejdomonas reinhardii// PhotcSjnthetica. 1987. V.2I. H i. P. JOi-iO/.

79. iioichenko v.A. , Alla^hverdiev S.I., Ladjtia V.G., Klimov V.'v. Junctional analysis of the native structural arrangement of photos;) stem II core complexes// Mineral nutrition and photosynthesis. Bulgaria. Varija. 1987. P.. 152-153.

80. Klimov V.V., Allakhverdiev S.I. Ladyfein V.G. Photoreduction

■ of phepphytin in photosystem II reaction centers under anaerobic conditions// Егос. Indian Natl. Sci. Academy. 1987. B.53. N 5-6. P. 385-389.

81. Ладыгин В.Г., Чунаев A.C., Семенова Г.А., Мирная О.Н., Корню-шенко Г.А., Ыаслов В.Г. Особенности ультраструктурной организации хлоролластов при взаимодействии генов, обуславливающих дефицит каротиноидов .и отсутствие хлорофилла "в у Chiana do-mona s reinhardii // цитология. IS88. T.30. Is I. С. 19-25.

82. Ладыгин В.Г., Аллахвердиев С.И., Ананьев Г.М., Климов В.В., Мальцев C.B. Функциональная характеристика фотосистемы П мутантов Chiamydomonas reinhardii , не содершщих светособираю-щего комплекса и фотосистемы I // Физися. растений. 1988. Т.35. Бып.1. С. 14-23.

83. Котова Е.А., Ладыгин В.Г., Чикишев А.Ю., Ильина Ы.Д., Иуразян А.Л., Борисов A.B. Наносекундная флуоресценция хлорофилла в клетках мутантов Chlamydomonas reinhardii// Доклады АН СССР. 1988. Т.299. № 4. С. 1000-1003.

84. Москаленко A.A., Ладыгин В.Г., Кузнецова Н.Ю., Ширшикова Г.Н., Ерохин ii.Е. Выявление двух хлорофилл "а"-белковых комплексов фотосистемы П у мутантов Chlamjdomonas reinhardii // Биофизика. 1988. Т.33. Вып.1. С. 13-17.

85. Аллахвердиев С.И., Климов В.В., Ладыгин В.Г. Фотовосстановление феофитина в реакционных центрах фотосистемы II целых клеток зеленых водорослей и цианобактерий в анаэробных условиях // Биофизика. 1988. Т.33. Зип.З. С. 442-447.

86. Ладыгин В.Г., Тагеева C.B., Семенова Г.А. Экспериментальный мутагенез в изучении генетической регуляции фотосинтетического алпата растении// щотосинтез и продукционный процесс. М.: Наука. 1988. С. 252-257.

87. Ладыгин В.Г., Ширшикова Г.Н., Семенова Г.А. Состав, организация и структурная локализация хлорофилл-белковых комплексов фотосистемы I и фотосистемы П// Вопросы взаимосвязи фотосинтеза и дыхания. Томск: Изд-во Т1У. 1988. С. 180-187.

88. Ладыгин В.Г., Аллахвердиев С.И., -Четвериков А.Г., Исследование величины фотосинтетической единицы и числа реакционных центров фотосистем у мутантов chiamydomonas с редукцией светособираю-щего комплекса // Вопросы взаимосвязи фотосинтеза и дыхания. Томск: Изд-во Т1У. 1988. С. 174-179.

89. Lehedev N.M., Khatypov Е.А., Ladygin V.G. Fluorescence excitation spectra and decay kinetics oí light-harvesting complex in Chlamjdomonas reinhardii mutants// Photosynthetica. 1988. V.22.

90. Ладыгин коллекция штаммов мутантов Chiamydomonas Института почвоведения и фотосинтеза АН СССР 1 [ Сб. Коллекция микроводорослей в СССР. Пущино: ОНТИ НЦБИ. 1988. С. 104-122.

91. Лебедев H.H., Ладыгин В.Г., Даелепова И.Д., Хатыпов P.A. Спектральные характеристики и время жизни флуоресценции компонентов светособирающего комплекса в клетках мутантов chlamjdomonas

' reinhardii // Биофизика. 1988. Т.33. Вып.6. С. 978-983.

92. Ладыгин В.Г., Ширшикова Г.Н., Аллахвердиев С. И., Четвериков А. Г. Экспериментальной мутагенез в исследованиях фотосистем как ключевых звеньев фотосинтеза и продуктивности растений // Биопро-

. дуктивность агроценозов как комплексная проблема. Пущино: ОНТИ НЦБИ. 1989. С. 123-140.

93. Гаевский H.A., Ладыгин В.Г., Гольд В.М. Новые данные о природе высокотемпературного подъема Флуооесценции хлорофилла //Физися. растений. IS89. Т.36. Вып.2. С. 274-277.

94. Ладыгин В.Г., Биль К.Я., Семенова Г.А., Колмаков П.В., Ластив-ка А.Н., Титлянов Э.А. Структурно-функциональная организация хлоропластов uiva fenestrate в течение жизненного цикла // Физиология растений. 1989. Т.36. Вып.З. С. 460-471.

95. Бойченко В.А., Игнатов Н.В., Ладыгин В.Г., Климов В.В. Перенос энергии возбуждения в нативных комплексах фотосистемы П с участием феофитина // Биофизика. 1989. Т.34. Вып.2. С. 246-250.

56. Бопченко-В.А., Ладыгин З.Г.', Литвин "i.Структурно-:Т;ункцио-нальная организация фотосинтетических единиц в клетках мутантов Chlamydomonas reinhardii // ;.10ЛеКУЛЯрнаЯ бИОЛОГИЯ. IS8S. Т.23. Вып.1. С. IG7-II8.

37. Krasnovsky A.A., Lebedev N.N., Barskaja I.V., Pakshina E.V. , Ladjtin V.ü. Pheophytin participation in fluorescence excitation of the internal antenna of PS-II// Physiol, plantarum. 1989- V.76. 'A 3.. part 2. P. A 110.

!8. Kotova E.A., Ladygin V.G., Chikishev A.iu., Borisov A.lu.,

limeresolved fluorescence analysis of photosystem II core and lightharvesting chlorophyll "a"/"tn - protein complexes in Chliaydomcr.3c reinhardii mutant cells //Physiol, piantax-um. 1989- V.76. H 3. part 2. P. A 110.

:9. Lebedev N.N., 'fang Chong-gin, Djelepova I.D., Khatypov E.A., Ladygin V.G. LHCP composition in green alga Chlamydomonas reinhardii// Abstraer book "Molecular organization of biological structures". Moscow. 1989. V. I. P. 4-Ч-.

00. Kotova b.A., Ladygin V.G., Chikishev A.lu. , Borisov A. iu., on the native of the nanosecond chlorophyll fluorescence in Chlamydomonas reinhardii mutant cells // Photosynthetica.

1989. V. 23. N 3. P. 288-293.

01. Ладнгин В.Г., Аллахвердиев С.И., Четвериков А.Г. Влияние редукции светособирающего комплекса на величину фотосинтетической единицы и число реакционных центров фотосистеи у мутантов Chlamydomonas reinhardii // Биофизика? i990. Т.35. Выи.2. С. 280-284.

02. Гончарова П.В., Четвериков А.Г., Ладыгин В.Г. уотовосстапов-Jiemie феррицианида хлоропласта!,¡и з условиях недостатка эндогенного неорганического фосфата //Известия АН СССР, сер. биол. I99C. ü I. С. 84-9U.

03. Пакыина 3.3., Лебедев Н.Н., Ладыгин В.Г., Климов В.З., Крас-НОВСКИЙ А.А. щеофИТИН В мутантах Chlamydomonas reinhardii

и в препаратах мембран, содержащих &С-П // йизиол. растений. I99G. Т.З*?. Вып.1. С. 47-53.

04. Фомин А., Ладыгин В.Г., Семенова Г.А. Накопление пигментов и формирование ультраструктуры хлоропластов в процессе зеленения этиолиоованных растении ряски // Физиол. растений. 1991. Т.38. Вып.4. С. 667-673.

35. Лебедев Н.Н., Тан Цзунчин, Ладыгин В.Г. Полшептшщий состав н формирование пигмент-белковых комплексов в мутантах chlamydomonas reinhardii // Биохимия. 1990. Т.55. Js II. С. 2072-2077.

36. Лебедев II.ÍÍ., Тан Дзинчин, Дделепова И.Д. , Ладыгин В.Г. Спектры флуоресценции изолированных пигмент-белковых комплексов мутантов зеленой водоросли chlamydomonas reinhardii // Молекулярная биология. 1991. Т.25. Вып.1. С. 43-53.

'J7. Ладыгин В.Г., Ьшршикова Г.Н. Повышение устойчивости клеток водорослей к действию ультрафиолетового излучения при изменении состава каротинов 7/ Альгология. 1991. T.I. J5 3. С.35-41.

)8. Пакшина Е.В., Лебедев Н.Н., Ладыгин В.Г., Красновский А.А. Состав хлорофилл-белковых комплексов и содержание капотинои-дов б мутантах хламидомонады // Физи«ш. растений. 1991. Т.38. Вып.4. С. 655-661.

)9. Ладыгин Б.Г. Коллекция штаммов мутантов хламидомонады Института почвоведения и фотосинтеза РАН // В сб. Каталог культур микроводорослей в коллекциях СССР. Москва. 1991. С. 152-175.

Информация о работе

Ладыгин, Владимир Георгиевич
доктора биологических наук
Пущино, 1993
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы