Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия хлоропластных генов в условиях in vitro: характеристика ДНК-белкового комплекса из хлоропластов Azolla pinnata

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия хлоропластных генов в условиях in vitro: характеристика ДНК-белкового комплекса из хлоропластов Azolla pinnata"

Академия наук СССР Ордена Ленина Институт биохимии им. А. Н. Баха

На правах рукописи УДК 576.315.42

ГАГАНИДЗЕ ДАЛИ ЛЕВАНОВНА

ЭКСПРЕССИЯ ШРОПШТНЫХ ГЕНОВ В УСЛОВИЯХ 1п тШ-о: ХАРАКТЕРИСТИКА ДНК-БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ХЛОРОПЛАСТОВ Аго11а ршпа1а

03.00.04 — Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

А*

Москва — 1991

Работа выполнена в лаборатории биохимии хло-ропластов ордена Ленина Института биохимии им. А. Н. Баха АН СССР.

Научный руководитель: доктор биологических наук М. С. Одинцова; доктор биологических наук Г. С. Каличава.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук И. И. Филиппович; доктор биологических наук Н. Л. Клячко.

Ведущая организация—Межфакультетская проблемная научно-исследовательская лаборатория молекулярной биологии и биоорганической химии им. А. Н. Белозерского, МГУ.

ванного совета (К 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А. Н. Баха АН СССР (117071, Москва, Ленинский пр., 33, корпус 2) .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (Москва, Ленинский пр., 33, корпус 1).

1991 г. в £2 часов на заседании специализиро-

Защита диссертации состой'

I а о

Автореферат

1991 г,

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

М. И. МОЛЧАНОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хлоропласта - специфические органел-лы растительной клетки, являются центрами фотосинтетической деятельности растений. В геноме хлоропластов идентифицированы около 100 генов. Показано, что они кодируют белки аппаратов транскрипции и трансляции, а также белки, принимающие участие в фотосин -тезе. С геномом хлоропластов связаны хозяйственно ценные признаки растений, такие как устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды, некотедым антибиотикам, гербицидам, грибным патогенам. ,

В последние годы достигнуты большие успехи в изучении структуры генома хлоропластов. Установлена полная нуклеотидная последовательность геномов хлоропластов трех видов высших растений: табака, риса и печеночного мха иагсЬат1а . Цросеквенирована значительная часть геномоз хлоропластов еще нескольких видов высших растений и водорослей.

В настоящее время все большее внимание удаляется исследованию вопросов функционирования этого клеточного генома, координации экспрессии хлоропластных генов и ядерных генов, кодирующих белки хлоропластов, а также регуляторных механизмов, контролирующих эти процессы.

В этой связи большое значение приобретает разработка модельных систём для изучения транскрипции хлоропластных генов и её регуляции. Одна из таких систем предполагает выделение из хлоропластов транскрипциоино-активных ДОС-белковых комплексов. Такая система не требует солюбилизации и очистки РНК-полимераэV регуляторных молекул и ДНК-матриц для опытов по реконструкции. Преимущество использования изолированных ЛПС-белкових комплексов хлоропластов при исследовании транскрипции состоит в том, что эта система максимально приближается к интактной клетке.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования явилась характеристика изолированного ЛПК-белкового комплекса (нук-лаоидов) хлоропластов дгоНо рхпг^а .изучение возможности использования этой модельной системы для исследования экспрессии хлоропластных генов.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:

-усовершенствовать метод выделения очищенных ингактных хлоропласте® из клеток папоротника АгоНа р!ппага;

- выделить транскрипционно-активный ДНК-белковый комплекс из очищенных хлоропластов;

- изучить химический состав, физико-химические свойства и структуру изолированного комплекса;

- определить функциональную (транскрипционную) активность изолированного ДЖ-белкового комплекса;

- провести анализ полнпоптидного состава ДНК-белколого комплекса хлоропластов а. ршг^а и сравнить ого с полшюттид-ннм составом других компартглентов пластид;

- попытаться обнаружить и идентифицировать бел1Ш основного характера в состава, ЯНК-белкового кошлекса хлоропластов А.р1пгтЛа ;

- определить оптимальные условия функционирования указанной модельной системы и идентифицировать рж-транскрипты.

АгоНа р1ппаю , как объект исследования, биохимически мало изучена и представляет интерес с эволюционной точки зрения. Кроме того,этот папоротник кмоет. народно-хозяйственное значение, что определяется его способностью связывать атмосферный азот и химическим составом его биомассы.

Даучная новизна исследования. Впервые выделен ДЖ-белко-вн2 комплекс из хлоропластов папоротника а.р1ппа1а при помощи гель-фильтрации на сефарозе ОД. Изучены хш.тнческий состав, некоторые физико-химические свойства и тонкая структура изолированного комплекса. Электрофоретипескшл сравнением полипептидного состава ДЕЖ-белкового комплекса, растворимой и мембранной' фракций хлоропластов показано, что компонентный состав полипептидов ДНК-белкового коглплокса специфичен. Обнаружены 9 полипвп-тидов, которые входят в состав комплекса и не встречаются в других компартментах пластид. В составе изолированного ДНК-белкового кошлекса из хлоропластов папоротника д. р!ппага . имеются два белка основного характера, по размеру и электрофорэтической подвижности гомологичные гистонам и ИЗ зародышей пшени-

цы. Изучена функциональная (транскрипционная) активность ДНК-белкового комплекса. Впервые шявлани оптишльннв условия функционирования этой системы. Идентифицированы некоторые ИК-транс-крипты, синтезируемые. изолированным ДНК-белковым комплексом из

хлорсюяастоа. папоротника д. pinnate . Показано, что прочно связанная с ДНК РНК-полимера за комплекса считывает гены pFffií.

Практическая значимость иослэдошнря. Работа имеет теорети-часкоа значение и вносит вклад в изучение модельных систем для исследования экспрессии хлороплаотных гепсв. Относительная простота модели и её приближенность к интактноЗ клетке позволяют изучать экспрессию генов, определяющая фотоскйтетнческую активность растений, в условиях максимально близких к условиях in vivo, что в перспективе позволит создать лучшие формы растений с желаемым сочетанием признаков.

Апробация работу. Материала по теш диссертации были представлены на:8-м Международном конгрессе по фотосинтезу в Швеции (Стокгольм, 6-II авг.1989); Международных симпозиумах (Варшава, 1989; Москва,1989); Советско-индийском симпозиуме (Пущиио-на-Оке, 1990); Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтезируших системах и моделях" (Пущино-на-0ке,1989).

Публикации, lio теме диссертации опубликованы б печатках работ.

Структура и объем писсепташщ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на страницах шшинописного текста, содержит 6 таблиц и 25 рисунков'. Список цитируемой литературы включает наименований, из которых на иностранных язы-

ках.

МАТЕРИАЛУ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .

Объектом исследования в данной работе служили хлоропласта водного папоротника Azoiia pinnate R.Gr.( отдел Polypodicphyta, класс Polypodiopaida ; CGM. Azollaceae ).

Методы выделения и очистки таопогшстов.Для выделения хлоро-пдастов растения, предварительно выдержанные в тачешв 48 ч в темноте, разрушали в нонёвога гомогенизаторе при 10 ООО об/шн в течение' 20 с в среде (М): 0,G5 трис-HCI,. рП 7,6; 0,35 шннит; 0,003 эдтл;0,005 2-меркап'гоптанол; О.Б^ншЧ БСА; 0,002 аскорбат

натрия и 2%-тй полавишшшрроллдон (соотношение веоа ткани и объема среды (l:f ,5). Гомогенат последовательно фильтровали через два слоя марли и нейлоновое сито 58 меш, а затем центрифугировали 5 мин при 100 g. Из надосадочноЯ зшдкости хлоропласта осаждали центрифугированием при 1000 g в течение 10 мен и двандн проглнвали средой для гомогенизации. Очистку хлоропластов проводили градиентным центрифугированием в растворах сахарозн или фиколла.

Чистоту хлоропластов контролировали спектрофотометричоски и с помощьи электрофореза в геле 0,8$-ной агарозы.

Внделение и характеристика ДКК-бэлкового комплекса щоуо-пластов^

Очищенные хлоропласта лизировали 1%-ти раствором тритона Х-100 в течение 45 мин при 0° (вес/объем, 1:3). К прозрачному лязату добавляли 4M (пн^)2зо4 до конечной концентрации 0,1 М, после чего наносили на колонку (2,5x60 см) с сеТярозоЯ 4В. Фракции (7 мл), обладавшие РНК-полиморазной активностью, объединяли и транскршщионно активный ДЦК-белковнй комплекс осаядалл центрифугированием при 229 ООО s в течение 6 часов (ультрацентрифуга "СКВ-65", угловой ротор Н1У-60Т).

Для определния коэффициента седиментации осадок ЛНК-бел-кового комплекса суспендировали в 100 мкл буфера (M):0,05 трис-HCI, рН 7,6; 0,01 0«-V2soA и суспензию наслаивали на линейный градиент концентрации сахарозы (10-ЗС$). Пробирки с градиентом центрифугировали 36 мин при 47 ООО об/мин (ультрацентрифуга "0105-65", бакегннЯ ротор РКС-50Т). Маркером служили 80 s рибосомы, выделенные из клеток Ai pirmatà.

Плавучую плотность комплекса определяли методом равновесного ультрацентрифугировакия в градиенте CsCI (вгипк, Lsick, 1969). Комплекс фиксировали 0,35$-ннм формальдегидом при комнатной температуре в течете I часа ( Liriat ot al.,1902). Обработку комплекса протеипазой К проводили no(Yoshïaa et ai., 1978).

Определение РТЖ-полимвразноЯ активности Ш?К-белкового коглп-лзкоа хлоропластов.

РНК-полимераэную активность определяли по (iiailick et al., 1976). Реакционная смесь содержала /гйЛ 50 трнс-HGI /рН 7,9/; ю MgCi-2 ; 40 (ш4)2304 ; по 0,3 АТФ, ГТФ, ЦТФ и 0,1 (5,6=3Н)=

УТФ (Ленинградская завод изотопов; уд,активность 0,5-1,5 мКи/мимоль). К смэси добавляли 40 шел буфера (!.!): 0,05 трис-HCI (pH 7,ü); ib%~wü глицерин; 0,04 2-Мбркаптсзтанол; 0,004 ЭДГА; 1&-ный трп-гон Х-100 к 20 1лкл опытного образца. Радиоактивность проб подсчитывали на счетчике sl-30 (n mtertocbnique ".франция).

Идслалоттга ульттаотттуктточ jpK-бвлкового котдвкса методам электронной микпооцопии.

Элактронномикроскопическоа исследование структуры хлороплас-:ов проводили по (Турищева и др.,1987), Тонкую структуру транс-ершщионно-активного "комплекса изучали методом белковой пленки , Klainechaiidt , Zahn , 1959) с последующим оттенекием образцов ¡планом pt - Pd (4:1) под углом 8° при вращении образцов.

Цзтчяниа полипептилпого составу ДНК-белкового комплекса лоропластов.

Суммарные белка экстрагировали из комплекса смесью: 0,0625 !Г' рис-HGI, pH 6,0; 0,5%-тй 2-маркаптоэтанол; 2^-кыЙ ДЦС-на.; оя сахароза. Раствор прогревала 4 мин при 90° и осветляли центрс-угированием при 20 000 g , 10 мин ( Laenrali ,1970).

Белки основного характера экстрагировали из комплекса 0,4 н. аствором Hg.S'O^ в течение I ч при постоянном перемешивании Penyia, chnlkloy ,1971). Экстракт центрифугировали 10 мин при 3 ООО g, к надосадочной вядкости добавляли 10 объемов охлаядав-эго ацетона, подстеленного концентрированной HCl до 0,01 п., а лаоь оставляли на 48 ч при -20°. Вышеший осадок отдаляли атрибутированием (23 000 g , 10 шя).

Электрофоретическое разделение суммарных белков ДГК-белково-з комплекса вели в градиентном (10-20$) ПААГ в присутствии ШО-Ш Laeramli ,1970). Белки основного характера, изолированные из НС-белкового комплекса, фракционировали с помощью электрофореза Щ-номПМГ в присутствии ДДС- Na ' ( Laemnü ,1970),а также > методу, используемому для разделения гистонов ( panytm , chai-iey ,1971).

Идентификация РНК-тоанскриптов. Идентификацию НТК-транс-иштов проводили с помощью электронной микроскопии ( Klein-hnidt, Zahn, 1959) и методом молекулярной гибридизации (Марзлаф, ан,1987). ,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЩНИЕ'

Выделение и очистка хлоропластов.

В результате приспособления к плавающему образу жизни, а также симбиоза с цианобактериями Anabaena azoiiae в строении листьев папоротника A2oila pinnata имеются уникальные черты, поэтому выделение хлоропластов из клеток a. pinnata сопряжено с определенными методическими трудностями. Для уменьшения количества крахмала растения перед выделением хлоропластов помещали на двое суток в темноту. Для связывания таннинов, фенольных соединений и других веществ вторичного происхоядения гомогенизацию листьев вели в присутствии аскорбата натрия и лоливинилпирроли-дона. Активность нуклеаз подавляли добавлением ЭДТА в среду для гомогенизации. ЭДТЛ также препятствует связыванию с хлоропласта-ми ядерного хроматина.

Очистку выделенных хлоропластов проводили центрифугированием в градиентах концентрашш сахарозы или фиколлз (рисЛ).Элект-ронномикроскопический анализ получетшх зеленых зон и осадков показал, что интактные хлоропласта a. pinnata располагаются на. границе 80% и 60^-ногорастворов сахарозы, а также на эданице 2Ъ% и I Одного растворов фиколлэ. разрушенные хлоропласты находятся в менее плотных > юях градиентов. В осадке обнаруживаются слипшиеся и очень крупные хлоропласты, а также гетесоцисты циано-бактерий.

Наличие ядерных примесей во фракции изолированных хлоропластов контролировали с помощью электрофореза в геле 0,8^-нои агарозы (рис.2). Фракция хлоропластов после трех промывок средой для гомогенизации содержала еще примеси ядерной ДНК. После очистки градиентным центрифугированием изолированная фракция хлоропластов не содержала ядерных примесей (рис.2, дорожки 2 и 3).

Наличие примесей симбпотических цианобактсрий в изолированной фракции хлоропластов контролировали спектральными методами, учитывая особенности пигментной системы ассоциации a. pinnata -A. azoilee : хлоропласта водного папоротника содержат хлорофилл а и хлорофилл ъ, а у цианобактерий, кроме хлорофилла а, присутствуют фикобилиновне пигменты и отсутствует хлорофилл ъ. Спектр флуоресценции хлоропластов зависит от длины возбуждающего света и температуры. При избирательном возбуждении в максимуме noiлощения ЛЮбОГО ИЗ ПРИСУТСТВУЮЩИХ В ассоциации A. pinnata - A.azollae фикобилиновых пигментов (530, 580, 610 к 650 нм) главные максимумы в спектре флуоресценции суспензии хлоропласто- при пониженном

Суспензия

хлоропластов . ^

Сахароза, % _40__[ -

■' -I' 60 |

80

1 И"'

Суспензия хлоропдастов

Фиколл, %

.*»>■ »

10

25

Сахароза,

80

Ркс.1 Распределение хлороллао-тов при очистке в градиенте концентрации сахарозы- (а) и фиколла (б).

Рас.2 Хлоропласта после трех промывок средоЯ для гомогенизации (I), гхослэ очистки в градиентах концентрации сахарозн (2) и фиколла (3).

температуре 77 К проявляются при 725 и 685 гад, что связано с флуоресценцией хлорофиялов ФС1 и ФСП. Кроме того, наблюдаются максимума при 538 и 654 км, которые могут быть обусловлены как пигментами хлорофиллового типа, так.и фикобилиновыми пигментам (рис. За). •

Чтобы выяснить природу флуоресценции, пигментов при указанных длинах волн, пигменты экстрагировали из хлоропластов 80$-' ным ацетоном. Фикобилшгавие пигменты при этом .остаются в осадам. Спектры флуоресценции ацетонового экстракта хлоропластов аналогичны спектрам флуоресценции суспензии хлоропластов (рис.36). Из этого следует, что флуоресценция при 654 нм обусловлена флуоресценцией хлорофилла ь, который1 у высших растений излучает прл 653 нм. Полоса при бЗС.нм обусловлена флуоресценцией яротояко-рофиллида. Тайм образом, спектралышо характеристики-хлоро-

пластов a. pinnata указывают на отсутствие фикобилипротеинов и, следовательно, примесей цианобактерий Anabasna azollae во фракции хлоропластов.

Дфл.отн.вд

650

700

750800, нм

1фл,отн.ед

650 700 750 » 11,4 Рис.3 Спектры флуоресценции при различных длинах волн воз- -бувдающего света: I - 445; 2 - 530; 3 - 680; 4 - 610; 5 - 650 нм суспензии хлоропластов (а) и ацетонового экстракта хлоропластов (б).'

Выделение и химический состдв ДНК-белкового комплекса из

хлоропластов. A. pinnata . .....

Выделение ДНК-белкового комплекса из хлоропластов a. pinnata проводили в условиях низкой ионной силы,'используя для очистки гель-фильтрацию на сефарозе 4В. Типичный профиль элщии пред-ставлан на рис.4. В таждоР фракции элюата определяли РНК-поли-мэразнутэ активность, белок, ДНК, HUÍ и хлорофилл. Как видно из рис.4, эндогенная РНК-поллморазная активность, обнаруживалась во фракциях, не содержащих, хлорофилла, элгоирующихся в свободном ■ объеме колонки. Максимум активности соответствовал минорному пику белка.

Б табл.1 праведен химический состав ДНК-белкового комплекса (нукдэоидоз) хкороплзса'ов л. pinnata . Как видно из табл.1, кроме-ДНК а белка, я ДНК-болковом комплексе обнаруживалось некоторое количество Щ$.

(Л 1

о t—4 ¡3-

X ■ъ.

и Si

|Э , ц . и Я >! 0} о 1

! 2 ¡20

10

0,6.

г.

Я

К* . '-1 ■и. о

0,4

0,2

Рис.4 Профиль элицня даК-белкового ксшдокса хлоропластов

a. pinnata при гель-фильтрации на колонке с сефа-розой 4В.

Таблица I

Содержание хлорофилла, ДНК, РПК и белка на различных стадиях очистки нузелеоидов хлерошнетоэ A.pinnata 1

Стадия очистки !Хлорофилл, ! мг !ДНК, ! МГ ! мг 'Белок, ! мг , !Евлок4РПК/ ¡да '! да

Хлоропласта 31,3 0,240 18,1 52,8 293,3 75,4

Супарнатант, на носимый на колонку с сефаро-зой 4В 25,7 0,165 14,5 33,6

Буклеоиды - 0,130 0,05 0,24» 1,9. 0,4

Результаты, приведенные в датой и других таблицах-, является средктги из 3-5 определений.

Следует отметить, что'при .аналогичных условиях выделения и очистки хишче лай состав ДНК-белкового комплекса из хлоро-пластов разных видов растений, а такае из хлоропластов и митохондрий сходен. Так, нуклеоиды из митохондрий physarum poiy-cepholum характеризуются отношением балок/ДНК, равным 1,4, и отношением РНК/ДНК, равным .'0,4 ( Kuroiwa ,1982).

На химический состав нуклеоидов сильно влияют ионные условия среды. При выдзлашги этих структур в условиях высокой ионной сила наблюдается длсссщиация многих ДНК- связанных белков, включая, как предполагают,"растворимую" форму ШК-полямеразы, регулзггорнне факторы транскрипции ( Lebrun et al. ,1986) я ряд гастоноподобчых белков ( Pottijohn, sinden ,1935). Такие комплексы сильно отличаются от 'гранскршщионно-актпвнах комплексов, выделенных в условиях низкой ионной силы, по физическим свойствам и белковому составу, сохраняя, однако, транскрипционную активность комплексов, выделенных в условиях низкой ионной силы.

ИдентификациюДНК, входящей в состав нуклеоидов, проводили при помощи электрофореза, в геле 0,8^-иой агарозы и электронной . микроскопии. Высокомолекулярная ДНК хлороллзстов на электрофоре-граммах обнаруживалась в виде одной тонкой полосы, что свидетельствует об отсутствии в препаратах щжмосей ядерной ДЖ (рис.5).

Рис^б Эл'ектрофореграша ДНК.изоля- Еис.6 .Электронная микрофотогра-рованпой из ДНК-белкового кода- фия кольцевой молекулы ДНК, изо-лекса хлоропластов a. pinnate. дарованной из ДНК-белкового комплекса' ХЛОрОПЛаСТОВ a. pinnata.

Эдектронномикроскопическое исследование показало, что ДНК, входящая в состав нуклеоидов, представляет собой кольцевую молекулу с длиной контура около 40 мкм, что соответствует размеру ДНК хлоропластов большинства видов высших растений (рис.6).

Ульттаструкттоа ДНК-белкового .комплекса (нтелеоидов) из хлоропластов A. pinnata.

При исследовании в электронном микроскопе тонкой структуры изолированных ДНК-белковых комплексов было установлено, что они состоят из многочисленных петель ДНК разной длины (1-5 мкм), ассоциированных с плот&м центральным телом (рис.7). При этом ДНК обнаруживалась в сверхспирализованном и релаксированном состояниях. Наибольшая длина нитей ДНК, ассоциированных с центральным

Ч , ч

V Um.^vv

»4. i N

Í ^ С

........

i

\

ы

7

í Í4-

^ ! Tvj;

i Л v' (

,т#Г"..........'

igASi'

шш

I -ч

Ж

) <

да? V. Л'

Л

Рис.7 Электронная микрофотография ДПК-белкового комплекса из хлоропластов A. pinnata.

5 - 1 " ,' ' ^ VI

штт^шттщштшЫ|

кввшш

Рис.8 Линейная молекула

ЛДНК после обработки комплекса протеина зой К. Стрелками обозначены сво-

^"■íjf^V'v'y-.í-;д"Vl-rí-/;"ü"';*"°-"i^ír"V"^l*боднно концы молекулы ДНК. Ü.5мки _ •

телом, достигала 250 мкм. Чаще всего, однако, встречались комплексы с длиной нитей ДНК около 40 мкм. Следует отметить, что свободные концы нитей ДНК в комплексах наблюдались довольно редко или вообще не встречались. Для выяснения природы центрального тела перед электронной микроскопией проводили обработку транс-крнпционно-активных комплексов протеиназой К в разных условиях. При более мягких условиях обработки (30 мкг/мл, 6 ч, 25°) наблюдалась значительная деградация центрального тела. Более продолжительная обработка препаратов существенно более высокими концентрациями протеиназы К (500 мкг/мл, 18 ч, 27°+ 1ч,37°) приводила к полному исчезновению центрального тела и освобовдению нитей ДНК. Это свидетельствует о белковой природе центрального тела. Длина нитей ДИК, освобожденных из комплексов, варьирует, при этом обнаруживаются только линейные молекулы. Наиболее длинные молекулы соответствуют по размеру контурной длине кольцевых молекул хлоропластной ДНК высших растений (рис.8). Предполагают,что с помощью центрального'тела мовет. осуществляться связь нуклеоидов с мембранами хлоропластов, однако оно не является фрагментом мембраны, т.к. в препаратах транскрипционко-активннх ДЖ-белко-вых комплексов отсутствуют Х-лнноленовая кислота (Briat et al., 1282) и хлорофилл.

Интересно отметить, что в аналогичных условиях похожую структуру имеют нуклеоидн хлоропластов некоторых видов водорослей (Одинцова, 1987), других видов высших растений (Briat et al.,1982;

Hansasnn etal.J985), митохондрий РЬуввгия! polycephalum (Kuroi-wa ,1982) И клеток Е. coli ( Petti John, Slnden ,1985), что может указывать на сходную упаковку ДНК в нуклеоидах разного происхождения.

Физико-химические свойства ЖК-белкозсго комплекса.дзолг-рованного ИЗ хлоропластов plrmata.

0 размере комплекса судили по скорости его седиментации в градиенте, концентрации сахарозы (10-30$). Коседиментацяя нуклеои-дов хлоропластов a. pinnata с гомологичными 80 s' рибосомами показала, что средний размер их составляет около 150 s (pre.9). При ультрацентрифугировании фиксированного формальдегидом транс-крипционно-активного ДЖ-б?лг.огого комплекса хлоропластов a. pinnata в градиенте плотности ceci были обнаружена два компонента: один с плавучей )i.wmwm> 1,63 г/см" и второй - с плаву-

i 2ёо

l M

i

I 0,2

¡

I

i 0,1

0.3

0,2

<0.1

.J \

10 20 Номера фракций

30

Рис.9 Црофиль седиментации ДНК-белкового комплекса хлоропластов a. pinna ta в градиенте концентрации сахароза (10-30$). Стрелкой обозначен пик 80 & рибосом.

1.55 1,60 1,65 | Плавучая плотность^/см3,

Рис.10 Распределение ДНК-белкового комплекса хлоропластов а. рхппага при центрифугировании в градиенте плотности , хлористого цезия.

чей плотностью 1,57 г/см3 (рис.10). Таким образом, было обнаружено, что комплекс гетерогенен по составу. Возможно,, что в ДНК-белковом комплексе из хлоропластов а. р!ппа1а существует два вида ДНК-белковых взаимодействий: часть белков более прочно связана с хлоропластной ДНК, а часть белков связана менее прочно и отделяется от комплекса в процессе его выделения и очистки.Белки, прочно связанные с ДНК, возможно, играют структурную роль б образовании комплекса, а белки, менее прочно связанные с ДНК, принимают участие в его функционировании.''Они могут участвовать в таких процессах, как репликация, транскрипция и суперспирали-зация ДНК. Следует отметить, что в аналогичных условиях (т.о. в условиях низкой ионной силы) гетерогенные по плотности в СзС1 препараты транскрипционно-активных ДНК-белковых комплексов были

1,57 и 1,01 г/см3)

выделены из хлоропластов шпината ( (8г1а1 в* а1. ,1982) Я Гороха („С1 ( Уиг1па эг л!.,1986). В толе время транскрипциогаю-актиншй

"1,52 и 1,62 г/см3) анскрипциогаю-актин кошлако, выделенный из хлоропластов шпината в условиях одсокой

ионной силы, бил гомогенным по плотности (ycsci 1.66 г/см3) (Lebrun et al., 1986). Показано, что транскрипционная активность комплекса'шло зависит от ионных условий среды ( X =0,15-0,6 М), что подтверждает очень прочную связь ДНК-зависимой ЕНК-полиме-разн со своей матрицей ( Lebrun et al., 1986).

Полнпепишай состав ДНК-белкового комплекса из ^рррплдр-

TOB A. plnnata.

Исследование компонентного состава белков ДНК-белкового комплекса хлоропластов A.pinnata при помощи электрофореза в присутствии ДЦС-Na, позволило выявить около 30 белков с моле-кулярно-массовым распределением от 14 до 135 кД (рис.11). Преобладающими в количественном отношении являются полипептиды с молекулярными массами 43-67 кД и 15-22 кД. При сравнении компонентного состава полипептидов транскрипционно-активного'комплекса, мембранных белков и белков растворимой фракции хлоропластов A. pinnate был обнаружен ряд полипептидов с одинаковой электро-форетической подвижностью (рис.II). Однако не менее 9 полипептидов специфичны для комплекса и не встречаются в других компарт-ментах пластид. К ним относятся полипептиды с молекулярными массами 135; 105; 51; 35; 29,' 26,"24; 22; 20 кД (рис.11, точки).

Кислотной ретракцией транскрипционно-активного ДНК-белкового комплекса выделена фракция белков основного характера. Анализ белков этой фракции при помощи электрофореза в поликриламид- • ном геле .в присутствии ДЦС-ма показал, что они совпадают по подвижности с рядил-полипептидов, обнаруживаемых в суммарном препарате белков комплекса (рис.12). Всего во фракции иислотораст-воримых белков обнаружено 4 мааорных и 7 минорных компонентов. Молекулярные массы мажорных полипептидов составляли 64, 51, 22 и 20 кД.-Белка.с молекулярной массой 22 и 20 кД по размеру молекул И'растворимости при ■ низких значениях рН могли быть гомологами гистонов. Для проверки, этого предположения препарат основных белков ДНК-белкового комплекса подвергли электрофорезу в ПААГ при рН 4,6 по методу Пакийма и Чокли, используемому для разделения гистонов. Полученные электрофореграммы представлены на рис.13..В этой системе основными по интенсивности окрашивания оказались белки, совпадающие по подвижности с Н2Л+Н2В и 113 гистона-т зародышей пшеницы. В-системе Лзммли они, по-видимому, соответствуют полипептидам с молот,-уллриши массами 20 и 22 кД. Белки с молекулярными массаш 43-56 кД, заметные при ДДС-Ма -, ПМГ

кД

1 94 67

43

30

21

_ В!

14

£

а б в

Рис.II Распределение белков растворимой фракции хлоропластом (а), суммарных белков изолированного ДНК-белкового комплекса (б) и мембранных полипептидов (в) при электрофорезе б градиентном ПААГ (10-20$) в присутствии Ю1Р- №» . 'Тс'нст - белки, специфичные для ДНК-болкового хожюг.са. Слэва - молекулярные массы белков-маркёров.

1к _

I

а б

Рис.12 Распределение суммарных (а) и кислоторастворимых (б) белков 'ДНК-белкового комплекса'яри электрофорезе в 17%-ном ПАА1' в присутствии ДДС'-Ма, Сдоьл - молекулярные массы' г ()>ликов-ипрк(цкю.

У

% <5

Рис.13 Распределение кислоторастворимых белков ДНК-белкового комплекса хлоропластов (а) и гистоновпшеницы (б) при электрофорезе в системе уксусная кислота-мочевина. Стрелки - белки,совпадающие по иодвивности с гисто-наш шешцы П2Л+Н2Б ¡1 113,

электрофорез«, в системе Паиийма и Чокли не выявляются. Можно предположить, что они либо плохо растворимы в 0,1 н. (ЛОСОСИ, либо не входят в гель, используемый для разделения гистонов. Долученнне результаты свидетельствуют о том, что во фракции основных белков комплекса есть гистоноподобные белки. Однако поскольку к гистоноподобным белкам относят кислоторастворимые белки сильно выраженного основного характера, которые способны связываться с ДНК, для более строгого доказательства необходимо определить аминокислотный состав этих белков и их сродство к ДНК. . Гистоноподобные белки широко распространены в клетках прокариот. При помощи электрофореза они были обнаружены''в изолированных ДНК-белковых комплексах у ряда видов эу- иархэбактерий. В клетках архебактерий Thermoplaema ectdophilum обнаружен низкомояеку-лярный белок основного характера, НТ„, прочно связанный с ДНК,

ся

который по первичной структуре гомологичен эукариотичеекям гис-тонам Н2Л, НЗ И ни белку клеток Е. coli(searcy, öelage, 1980). Недавно гистоноподобные белки были обнаружены в транскрипцйонно-активных ДНК-белковых комплексах из хлоропластов шпината ( Briat et al.,1982) и гороха!(Yurtna et al.1986). У шпината к преобладающим в количественном отношении гистоноподобгшм белкам относятся 4 полипептида с молекулярными массами 14-21 кД. ■ Один из этих белков (17 кД) дает положительную иммунологическую реакцию о антисивороткой, полученной к FI О белку клеток E.coii и НА белку ципнобактерий Synechocyetis . В аналогичной фракции, вы~ леленнол из ДКК^-белкового кошлекса хлоропластов гороха, обнаружены полшептиды с молекулярными массами 19-37 кД.

Обращает на себя внимание тот факт, что среди мажорных по-лшептидоп основного характера в хлороиластах гороха есть 2-3 белка, совпадающих по электрофоретической подвияности с Н2Л+Н2В и ИЗ глстонами растений (Крика и др. ,1988). Наличие гистонопо-добнпх белков в хлоропластах эволюционно далеких видов растений и вероятное сходство их первичной структуры свидетельствуют об . универсальной роли этих белков в организация ДИК-белковнх комплексов органелл. Яо-вилимону, эти белки, подобно гиотонам, участвуют в структурировании ДПК хлоропластов. Как было показано или хлоропластов япината, при выделении комплекса в условиях выи соксЯ ионной силы шетонопояобные белки не очязляются. Однако транскрипционная активность комплекса сохраняется, причем такой кошлекс стимулкрует элонггпцггс цепей РПК, ''Шстдая синтеза ко-

г

1'ОрЫХ произошш ta vivo (Lebrun et al.,1986). Эти ЗШННЫв СДу-жаг дополнительным указанием на то, что роль гяетоноподобных белков связана лишь со структурированием ДНК хлоропластов. функцию, гистоноподобных белков могут, по-видимому, выполнять таква ДЕЖ-свяэываодие белки, обнаруженные в клетках эу- и ápxe6áKT«p¡i3, а также в органеллах эукариотических клеток, в частности, в хлоропласта*. Эти белки часто называют "гистоноподобннми", хотя не все они имеют сильно выраженный основной характер и по первичной структуре и размеру молекул часто отличаются от гистонов. Опытами до разборке-сборке нуклзоидов показано, что ДНК-связы-ваюшие балки играют важную роль в конденсации ДНК пластид в эти компактные структуры, причем в пропдастидах табака основную роль играйт белки с молекулярной массой 69 и 14 кД, которые наиболее прочно связаны с ДНК пропластид. Если сравнить эти белки с ядерными гистонами и негистоновнш белками хромосом, такими как нма , то сила связывания их с нластидной ДНК, по-видимому, соответствует силе связывания гистона НГ или негистоновых белков хромосом с ДНК ( Nenoto et al., 1989). Не исключено, что более высокомолекулярные мажорные полипептиды (64 и 51 кД), обнаруженные наш во фракции кислоторастворимых белков ДНК-белкового комплекса хлоропластов a. pinnata , являются ДНК-связываюними.

РЩС-пол)швразная активность ДНК-белкового комплекса.дз хлоропластов А. pinna ta♦

'В табл.2 приведена РНК-полимеразная активность ДНК-белново-го комплекса, изолированного из хлоропластов A.pinnata на разных стадиях его очистки.

' Таблица 2

РНК-полимеразная активность ДКК-белкового комплекса

хлоропластов a. pinnota на разных стадиях его очистки ___ »_

Стадия очистки ' ¡Белок! Общая актив-!Уд.активность,¡Выход, ! !ность.иш/мин!иш/шн/мг ! % ! ! 'I0S ! белка . !

Лизат хлоропластов 52,0 10,632 201 100

Су il эрпа та н т, на и о синий на колонку со-фарозн 4В 33,6 14 463 400 136

Изолированный JiíIK-бодковый комплекс 0,24 , , 3 920 . 16 300 37

- 19 -

Как видно из табл.2, когда• очищенные.хлоропласта лпзпруот буфером, содержащим 1^-ннй тритон Х-100, в лизате обнаруживается ИЖ-полпмеразная активпость. Однако удельная активность НЖ-_полимеразц в- лизате хлоропяастов низкая. 11а этой стадии наблтт-дается значительное загрязнение комплекса хлорофиллом и ГНК (см.табл.1). Центрифугирование лизата'при 20 ООО г в течение 30 мил приводят к осаяделив иелкзированного мембранного материала. При этом в супернатанте вдвое, возрастает уделыгая октпеность РНК-полимеразы. Существенное увеличейпе удельной активности фэрмап-та (в 80 раз по сравнению с лязатом) достигается голь-фильтра-цией.супернатанта на сефарозэ 4В. Элваты с колоши сефзрозы. 4В, обладающие РНК-полимеразной активностью, не содержат хлорофилла и содержат РНК исходного лпзата. Хлорофилл и около белка удерживаются на колонке (табл.1). Некоторые свойства связанно"! в комплексе РНК-полимеразн суммировали'в табл.3.

Таблица 3

Характеристика РНК-полимеразной активности,ассоциированной с ДНК-белковым комплексом из хлорошщстов • а. р!лпага 1

Условия опыта ¡Концентрация! Активность, % от

* ! ! контроля

Контроль 100

-АТФ,-ГТФ,-ЦТФ 0,5

-ЦТф 8

-ГТФ 12

-АТФ 28

+РНКаза 10 мкг/мл . 7

+ДНКаза 20 мкг/мл , 0

+Пирофосфат натрия 50. Ш " 5

Как видно из табл.3, включение 3Н-УТФ зависит*от трех других нуклеозидтрифосфатов, причем наиболее сильно сказывается на включении отсутствие ЦТФ. Пирофосфат в концентрации 50 мМ почти -полностью ингибировал взслвчэние метки. Реакция зависела от эндогенно:] ДНК и подавлялась'добавленной к рэагадеоняоЯ смеси РНКазой.'Для проявления РНК-полшлеразноЗ активности абсолютно необходимы иош (рис. 14а).. Максимальная активность наблюдается при концентрации ионов равной 10-15 мМ. Эффективность ионов Мп2+ в этой реакции низка. Отношение РНК-полимераз-

ной активности в присутствии 10 Mil Hg CIg к активности фермента в присутствии тоЗ so концентрации.McCIg составляет 3,0-3,5. Это отличает РНК-полимеразу ЛЙК-балкового комплекса из хлоропластов a. pinnato от ШК-полпмераа ядер эукариотнческпх клеток, которые использует ионы Мп2+ такээ эффективно, как ионы Мз2+. Преииущз ствошгса пспользованиэ ионов %2+ для синтеза FHK обнаружено ранее при исследовании РНК-полимеразной активности хлоропластов кукурузы, пшеницы и клеток Euglena gracilio . Все приведенные данные указывают на .то, что РНК-полимаразная- активность ДНК—белкового комплекса из хлоропластов A.pinna ta является ДШС-завискмой. Матрицей для РНК-поликеразы изолированного комплекса слувит эндогенная ДНК хлоропластов. Дри геяь-фпльтрацаи ,даК--белкового комплекса па колонках сефарозн 4В. РНК-пояимераза остается связанной с хлоропла.стной ДНК и эдгаруется с ней в свободном объеме колошей.. Добавление 'большого избытка денатурированной ДНК зобной кзлэзы теленка (" serva ",ФРГ; ТОО мкг/мл) или нативиой ДНК хлоропластов A.piwmto (10 мкг/мд) практичос-кв не влияет ¡и активность ИЖ-полиморази ДйК-болхового комплекса (табл.4).

Таблица 4

Влияние экзогенной ДНК на РНК-полимеразную активность т ДИК-бОЛКОВОГО КОШЛОЕСа ЗЛОРОШШСТОВ A. pinna ta

Характеристика экзогенной ! • ЩС-полидаразная активность, . J2ÍK-- ! йш/ШН'10-З

Контроль 1,65

-Шативная ДНК хлоропластов 1,75

+Декатурарованиая JiJiK зобной

залозц теленка 1,83 *

Действие ряда ингибиторов па транысриицаэ з ДНК-белковом ' комплексе из хлоропластов A. plnnata сушкровапо в табл.5.

Как следует из табл.5, актшощцин Ü- и этпдпцбромид сильно подавляют НК-полишразкую активность комплекса.. Ркфамшщин (ингибитор РНК-полимораз ирокариотичаских клеток) даже в концентрации 100 мкг/мл не оказывает никакого действия на РНК-полкмараз-

нуя активность. Зто согласуется с данным! других авторов о .....~

нечувствительности фермента хлоропластов к высоким концентрациям рийачшщпнп. Аналогичным образом J. -аманктин,ингибитор НЖ-поди-

Ю 20 30 ,. 20 40

Концентрация двух-валентннх катионов, мН Температура, С

( В О 1

о

I2 - /V

ч 1 ------ а ' 4

'г / у

200 №0 600.. 800'б 8 Ю 12 Концентрация КС1,мМ рН .

Рис,14. Влияние ионов —*—') —<• —'") ( а ),

температуры ( б ), КС1 ( в ) и рН ( г ) на синтез РНК, катализируемый ЛШ-белковкм комплексом из хяоропластов

А. pinnata .

Таблица 5

Влияние различных ингибиторов на активность РНК-поля-мэрави ДНК-белкового комплекса хлоропластов a. pinnata

Ингибитор*' {Концентрация,'¡Активность,# от

! мкг/мл ¡контроля

Актиномецин V 3,5. 50

■■ - . 50,0 28

Этидийбромид , 2,0 48

20,0 44

Рифампицпн .100,0 100

ь£ - Аманитш» 100,0 94

Гепарин 2,0 IÖ0

20,0 100

х) Ингибиторы добавляли к.реакционной смеси перед началом инкубации. В опытах использовали актиномицин в й этндийброшд фирмы " Calbloohco. ",ФРГ; (¿-аШЕИТИН фирмы " Sarve ",ФЕГ; гепарин и рифаыпицин фарш " Signa ",®1А.

мэразц Пив высоких концентрациях PHK-полимерази Ш ядер эукарио-тических клеток, на активность PffiC-полимзраза ДНК-белкового комплекса хлоррйластов A. pinnato практически но действует. Гепарин является мощным ингибитором инициации синтеза РНК РНК -поля-ызразой в клетках е.coli . В изученной нами- бесклетбчкой системе гепарин в концентрации 2,0-20,0 мкг/мл не влиял на активность. РНК-полимеразн. По-видимому, инициация в нашей бесклеточной система обусловлена гепарин-начувстштелыщм комплексом. Нечув--сйзительность ИПС-поднмеразы ДНК-бэлкового-комплекса из хлоро-пластов A.pinnata к Экзогенной .ДНК и отсутствие ингибировашя полианионом гейарином позволяют .предполагать,- что РНК-полимера-за хлоропластов посла завершения цепи РНК не'освобождается от ДНК; " .

Кинетика" синтеза РЕК в условиях in vitro представлена на. рис.IE. Временной ход синтеза РНК и''инициации цепей РНК исследовали, используя 5,6=3Н-УТФ (Ленинградский завод изотопов; уд. активность 0,5-1 ,'5- ыКи/шмоль). 'jura оценки элонгации цепей и .

у -32Р-ЛТФ (НЯФ АН УзССР; уд.активиость 900 Ки/ммоль) для определения в той ко реакции щфцйацни цепей РНК.

Как видно иэ рис. 15, в использованных окопершлзнталыщх уело-■вшк элонгация к инициация in vitro продолжаются в течешга

О О

60 MU« инкубации. Так как цош РНК инициируются ^ - "р-нуклео-

идтрифосфатами в условиях in vitro , по крайней мере, в тече-ие одного часа, можно предположить, что. после терминации цепи НК PIiK-по дилера за перемещается вдоль нетранскрибировашого частка ЛЕК и затем снова инициирует синтез ИИ на той же моле-упэ ДНК. .

Время инкубации, мин

^ Рис.15. Кинетика инициации и ■ элонгации цепей РНК хлоропласт | тов, катализируемых ДНК-белко-

комплексом. Синтез РНН 9' проводили в системе,описанной1 ££ в разделе "Методика",содержа-: ^ . цеЯ по 0,03 мМ ГТФ и ЦТФ;0,05.

8 . мМ 5,б-3Н-УТФ и 4,75 мкМ ¡}3-2Р_ АТ5. Фон радиоактивности был : 4'70 имп/мин для 3Н-УТФ и 630 : и\-п/мин дла ^-32Р-АТ$. '

Температурный оптимум реакции синтеза РНК в.наших опытах вставлял 30°С. Однако реакция была еще очень эффективной при 25° 35°. 70-75% активности обнаруживалось при этих температурах. : оптимум реакции синтеза РНК равен 8,0. ШС-полшлеразная ак-пчость комплекса был- максимальной при низкой ионной силе(0,05 М I). 60$ активности еще сохранялось в присутствии 0,8 М KCl ис.14).

Анализ и характеристика ИЩ-трацсктоттов.- t Для обнаружения'и идентификации транскриптов, синтезируемых л-бо.т;огнм кошлексом хлоропластов А. pinnata , использовали toil: электронной ют;роскотш' и молекулярной гибридизации. !':-:рофотограф:'1ях транскрчпциотто-активпых ДНК-белковых комп-f'co: , изолированных1 из хлоропластов д.pinnata , довольно часто rhо наблюдать, что от. нитей ДИК отходят тонкие фабриллы.кото-з исчезает при обработке препаратов РНК-азой (рис.16). Это тдотольстгует о том, что' они являются РНК-транскриптами. Цри пользовании для- характеристики РШ-транскриптов, считываемых К-полнмеразой ДПК-бэлконого комплекса хлороиластов а. pinnata

ВгсДб.Электронные микрофотографии участков ДНК-белковых комплексов хлороштстов А. р1гаад^а .РНК-транскрипты обозначены стрелками.

"Б- условиях 1п vi.trо , метода молв1{улярной-гибридизации, денатурированный ДНК-зонд, содержащий гени всех видов рРНК хлоропластов табака, иммобилизовали на нитроцаллилозных фильтрах в виде серии дотов. Ваггом фильтры инкубировали в растворе, содержащем мечзнйе РШ-транскрипты, где проходила гибридизация. Результаты одного из опытов представлены на рис.17. В опыте использовали одно и то нз количество РНК, соответствующее 25x1О4 имп/мин, и разные количества ДНК-зонда (А-0,5; Б - 0,25; В - 0,125 мкг).

Рис.17. Гибридизация меченой РНК с ДНК-дотами.

Транскрипцию vitro проводили с меченым радиоактивным предшественником ^ J^P-U'ffi.

Как видно из рис.17, использованный зонд гибридизовался с РНК, синтезированной ДНК-белковым комплексом хлоропластов А. р1тш1:а.

•На фильтре обнаруживалась значительная часть метки. По данным пяти опытов 61,2^3,2$ РНК, синтезированной в использованных условиях, гибрвдизуется с денатурированным фрагментом ДНК хлоропластов табака.

Эти донные позволяют сделать вывод о том, что РНК-пояшэ-раза ДНК-белкового комплекса, изолированного из хлоропластов А. plnnata , считывает гены pPIIK. Для того чтобы выяснить, транскрибирует ли связанная в комплексе РНК-полимераза другие гены хлоропластов, необходимы дальнейшие исследования с использованием различных ДНК-зондов. Показано, что РНК-полимеразэ ДНК-белкового комплекса из хлоропластов Eugleno gracilis считывает преимущественно гены всех видов рРНК (Haillck et al.,1976; Ruo'hlotf, at al.,1980), в то время как сроди In vitro цродуктов транскрипции, обнаруживаемых в аналогичной системе из листьев шпината, рРНК составляет около 40$ (oriat et al. ,1979).

Относительная простота использованной в данной работе модели - транскршционно-активного ДНК-белкового комплекса хлоропластов, состояпгэго из генома, эндогенной HíK-полимеразы, ряда белков л,-по-видимому, регуляторных молекул, п её приближенность к интактной клетке делают эту модель весьма удобной для изучения экспрессии хлоропластных генов и её регуляции.

ВЫГОДЫ

I. Усовераенствовап метод выделения очищенных структурно интактных хлоропластов из ассоциации Azolla plnnata - Anabaana azollae,

'¿. .Методом гель-фпльтрацип на сефарозэ 4В в условиях низкой ионной силы из хлоропластов изолирован транскрипционно-актпвныЯ ДНК-белковый комплекс. Показано, что он содержит ДНК, балок,РНК' и по химическому составу обнаруживает сходство с ДНК-белковым комплексом .митохондрии растении (Physarusi polycaphalura )и клеток е .coll . РПК-полимеразная активность-комплекса составляет I 200-I 500 имп/мин/мкг'белка. t'

3. Изучена тонкая структура изолированного ДНК-белкового комплекса. Показано, что он состоит из многочисленных петель ДНК, ассоциированных с плотным центральным телом белковой природы.ЩК обнаруживается б сверхсппрализованпом и ре лансированном состояниях. Наибольшая длина нитей ЛИК, ассоциированных с центральным телок, достигай! 250 мш. Чаще всего, однако, наблюдаются комплексы с длиной нитей'ДНК около 40 мкм.

4. Сравнение!.! компонентного состава полипёптпдов ДНК-белкового комплекса, мембранной и растворимой фракции хлоропластов

a. plnnata выявлено 9 полидептндов, специфичных, для этого

комплекса, не встречающихся в других компартментах пластид.

5. Наряду с кисльми полипептидами в ДНК-белковом комплексе \И8: хлоропластов A. piunata обнаружены белки основного характера. Два мажорных полипептида с молекулярной массой 22 и 20 кДа по электрофоретичесиой подвижности гомологичны гистонам Н2А+Н2В и Но зародшей пшеницы.

6. Определены оптимальные условия транскрипции генома хлоропластов A. planata в условиях in vitro . Максимальная скорость синтеза РНК наблюдается в присутствии всех четырех рибонуклеозид-трифосфатов при рН 8,0 , температура 30° и низкой ионной силе. Для синтеза РНК необходимы ионы Kg в концентрации 10-15 мМ.

7. Обнаружено, что транскрипционная активность ДНК-белкового комплекса, изолированного из хлоропластов A. pinnata , не подавляется рИфампицином и «¿-аманитином. Это свидетельствует о том, что РНК-полимераза, связанная в комплексе, отличается по своим свойствам как от прокариотической, так и от эукариотических ядерных РНК-полимераз.

42

В. Методом молекулярной гибридизации меченных Р FHH-тран-скриптов с зондами хлоропластной ДНК табака, содержащими гены рРНК, показано, что РНК-полимераза изолированного ДНК-белкового комплекса хлоропластов A. pinaata считывает гены pFHK.

9. Совокупность полученных данных позволяет считать, что ,Щ!К-белковыЙ комплекс из хлоропластов A, pinnate представляет собой удобную модель для изучения экспрессии хлоропластных генов, и, в частности, генов рРНК.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Odintsova M.S., Turisheva M.S., Bralohick I.R., Gaganidze D.I.. In vitro transcriptional activity of chloropla3t genome

' of Azolla pinnata //Physiol. Plant. I989.V.76.Part 2.P.AI20.

2. Bralchiok I., Gaganidze D.L., Turisheva.M.S. BHA-polymarase activity in vitro of the ЩА-protein oomplex of Azolla pinnata ohloropla3ts // "Unity and Diversity in Jlolsoular .Biology" Symposium held in Warsaw, May 1989.P.87.

3. Гаганздзе Д.Л., Турищева М.С., Бральчик И.Р. и др. РНК-полиг меразная активность in vitro ДНК-белкового комплекса из хло-ропластов Azolla pinnata // Тез. докл. Мези. симп. "Молекулярная организация биологических структур". М. I9Q9.T.I. С.51.

4. Гаганидзе Д.Л., Турищева М.С., Бральчик И.Р. л др. Трано-крипционная активность генома хлороплаотов Azolla pinnata

в условиях in vitro // Тез. докл. Всес. конф. "Преобразование световой энергии в фотосинтезируицих системах и моделях". Пущино-нв-Оке. 1989. С.153.

5. Turisheva M.S., Brdlchiok I.H., Gaganidze D.I.., Sinitsa L.A. Isolation 6t a transcriptional active DMA-protein, oomplex (chromosome) from chloroplasts of Azolla pinnata // Soviet-Indian Symp. "flegulation of Photosynthesis".PÜehohino.'I990.

i .53.

6. Турищева М.С., Гаганидзе Д.Л., Бральчик И.Р. и др. Выделение транскрипционно-активного ДНК-белкового комплекса из хлоро-пластов папоротника Azolla pinnata //Физ.. pa ст. 1991. Т. 38. Вып.6. С.

7. Турищева М.С., Гаганидзе Д.Л;, Синица Л.А. и др. Физико-химическая характеристика транскрипционно-актй&ного ДНК-бёлко-вого комплекса из хлоропластов папоротника Asolia pinnata // Физ. раст. В печати.