Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительные характеристики ДНК-топоизомераз I типа из ESCHERICHIA COLI хлоропластов гороха

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительные характеристики ДНК-топоизомераз I типа из ESCHERICHIA COLI хлоропластов гороха"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР .

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

СИТАЙЛО Леонид Анатольевич

МНИТЕЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ. ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗ I ТИПА Э ESCHERICHIA COLI И ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА.

03. 00. 03 Молекулярная биология

Авторе ф .е р а т диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КИЕВ-1991

Работа выполнена в отделе цитофнаиологии и клеточной - инженерии Института клеточной биологии и генетической инженерии раотений АН УССР

Научный руководитель: - академик АН СССР,

ЫИРЗАБЁКОВ А. Л

Официальние оппоненты: - доктор биологических на>

ХРАПУНОВ С. Н.

- кандидат химических наук ГАБИБОВ А. Г.

Вадушаа организация: - Шс-гитут биоорганичеокой химии АН Узб. ССР, г. Ташка«

„2-1 „ ьглмАц-А .„г, 'IV

Зашита состоится " "—•^-----19Э1 г. ь --- час

на заседании специализированного совета Д 016.11.01 Института

молекулярной биологии и генетики АН УССР ао адресу: 262627,

г. Киев-143, ул. Заболотного 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотек Института.

Автореферат разослан " --г. Учений секретарь

специализированного совета, .

кандидат биологических наук Л Л Дукат

шждЕмга

Актуальность проблемы. Оуперспирализащш ДНК в клетках вы-ивает много топологических проблем, которые должны разрешатся яеткой для обеспечения протекания нормальных процессов реплика-■ ш, транскрипции, реко><бинацда и в конечном итоге экспрессии ге-гтической информации (Botchan el al., 1.973; Champoux et al., 380). 'Иерменты, которые контролируют топологические состояния IK - ДНК-топоизомеразн, обнаружены во всех типах живых организ-¡в от бактерий до животных.

Однако ДНК-тоноивомерэзи из растителъннх организмов по >авнению с другими изучены крайне слабо. На сегодняшний день <еется несколько работ, посвященных выделению и физико-химичес-tM характеристикам этого класса ферментов (Fukata et al. , 1986 Совсем мало работ среди них, относящихся к изучению ДНК-топо-гамераз из хлоропластов (Lam et al., 1987; Siedleokl et ..,1985 ). Растительная клетка обьедикяет в себе три различные иетические системы: ядро, хлоропласты и митохондрии, которые сно взаимодействуют между собой. Каждая такая система обладает 'Сственным ферментативным аппаратом, обеспечивающим его функци-:ирсвание. ДНК-топоизомеразы - одни из основных ферментов этого парата. В связи с такой большой важностью и разнообразием фун-;ий, выполняемых. ДНК-топоизоме'разами в растительной клетке, нам едставлялось интересным изучить свойства хлорсшластнык топои-мераэ. С другой стороны, поскольку все больше и больше накап-вается данных в пользу зэдосимбиотической теории происхождения оропластов от прокариотического предшественника (Gill ham et ., 1973 ), то свойства хлороплас:.'ной топоизомеразы, выделенной данной работе, сравнивали превдо всего со свойствами класси-ской прокариотической ДНК-топокзомеразы 1 типа из Escherichia li.

Дель и-задачи исследования. В связи с этим целью работы бы-выделение и изучение физико-химических свойств хлоропластной К- топоизомеразы и сравнение их со свойствами уде известных тоизсмераз. Характерной особенностью функционирования ДНК-топо-эмераз является их способность образовывать " расщепляемый далеко" (Osheroff et al. , 1987 ) между ДНК-топоизомеразой и ккулами ДИК, в котором молекулы белка фермента образуют коварную связь с ДНК. Существует ряд антибиотиков, которые спо-5ны стабилизировать такие "расцепляемые комплексы" (Ross efc , 1985; Liu et al., 1989). Для ряда таких комплексов показана рекомбиногенная активность. (Chlba et al. , 1989 ). В связи с !м в данной работе изучали возможность некоторых антибиотиков кЗилизировать "расщепляемый комплекс" между ДНК и хлоропласт-I ДНК-Гопоизомеразой.

Для достижения поставленной цели потребовалось решить сле-гаще задачи:

-г -

. 1. Выделить и. очистить от других клеточных компонентен (ядер, митохондрий) нативные хлоропласту гороха. 2. Доказать отсутствие примесей растительных ядер или их фрагментов в получен -■ ных хлоропластах. '3. Разработать схему выделения хлоропластной С-ых) ДНК-топоизомеразы (-аз) иа очищенных хлоропластов гороха. 4. Изучить основные физико-химические свойства хлоропластной (-ых) ДНК-топоизсмеразы (-аз). 5.Сравнить основные физико-химические свойства хлоропластной ДНК-тешоизомеразы I типа со свойствами ДНК-топоизомеразы I из Е. coli, включая изучение o6uatx перекрестных иммуноспецифичеоких реакций между двумя белками'. 6. Изучить расщепление ДНК хлоропластной ДНК-топоизомеразой í типа в присутствии некоторых антибиотиков (ювобиоцина, кашготе-цина, амилорида и т. д. ).

Научная новизна исследований. В диссертации Получены следующие результаты, представляющее научную новизну:

1, Предложена система электрофорегических методов с использованием различных буферных систем применительно к хлороплаетным белкам, позволяющая идентифицировать наличие (отсутствие) гисто-нов - маркерных белков растительных ядер в препаратах хлоропластов. Метод позволяет доказывать наличие (отсутствие) "загрязнения" препаративного количества хлоропластов растительными ядрами или их "облоы1сами".

2. Разработана схема выделения хлоропластной ЩЕ-тоноиаомера-аы I типа из гороха, которая включает получение топоизоыеразы из очищенных на ступенчатом градиенте перколла хлоропластов с последующим их солевым лизисом и дальнейшим фракционированием лиза-та в двухфазной системе ПЭГ-6000 / сульфат аммония и на различных хроматографических колонках.

3. Научены основные физико-химические свойства хлоропластной ДНК-топоизомеразы 1 типа из гороха.

4. Проведен сравнительный анализ свойств хлоропластной топои-зомеразы со свойствами классической прокариотической топоизоме-разы Из Е. coll.

Б. Исследовано Взаимное влияние тетрациклина, соли и полиами нов'на релаксирующую активность ДНК-топоизомеразы I типа из Е. coll.

б. Обнаружено изменение релакеирувдей активности топоизомераз I типа из Е. col i и хлоропластов гороха в присутствии тетрациклина

7. Получены предварительные данные о возможности амилорида индуцировать расщепление плазмидной ДНК хлоропластной ДНК-топои-аомеразой.

Практическая ценность работы: 1, Предложена система элект-рофоретических методов с использованием различных буферных сис-

im кап с анионными так и с катионными детергентами для изучения идентификации кислотнорастворимых белков хлоропластов. Данная ютема методов может быть использована для доказательства нали-1Я (или отсутствия) растительных ядер среди получаемых в препа-1тивных количествах хлоропластов. 2. разработана схема выделе-я и очистки хлоропластной ИНК- то по из оме раз w 1 типа. Очищенный «парат топоизомеразьг может бить использован для изучения in tro топологических проблем, возникающих в результате процессов пликации, транскрипции, транспозиции, рекомбинации ДНК. 3. Вы-ленная ДНК-топоизомерааа I типа может быть использована для учения вопросов, связанных с образованием "расщепляемого комикса" между ДНК и топоизомеразой. 4. На основании результатов ияния антибиотиков in vitro на образование "расщепляемого ком-екса" высказывается предположение о применении таких антибио-ков ir» vivo на растительные обьекты с целью получения среди х рекомбинаитных форм.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доклады-лись и обсуддались на VIII двустороннем симпозиуме СССР-Фран-я "Молекулярная биология белков и нуклеиновых кислот" (Ыоск-,1986), II Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии стительной клетки (Москва, 1986), V Украинском биохимическом езде (Ивано-2ранковск,1987), III Всесоюзной школе-конференции груктура биополимеров" (ГССР, п. Пассанаури,1988), а также на учных семинарах отдела иитофизиологии Института ботаники им. Г. Холодного АН УССР (Киев,1988,1989) и Института клеточной би-эгии и генетической инженерии растений АН УССР (Киев, 1990). материалам диссертации опубликовано 3 работы.

Автор выражает глубокую признательность директору Института эточной биологии и генетической инженерии растений АН УССР адемику Ю. Ю. Глебе, а также заведующему лабораторией клеточной лекции д. б. н. В. А. Сидорову, благодарен научным сотрудникам ла-заторин молекулярной биологии и биохимии этого же Института t Климюку, И.Ф. Каневскому. Г. Н. Руденко за помощь и полезные зеты, оказанные в процессе выполнения работы.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, юра литературы, экспериментальной части, обсуждения результа-), выводов и списка литературы, включающего 209 наименований. SoTa изложена на 145 страницах машинописного текста й содержит рисунков и 4 таблицы. '

МАТЕРИАЛ! И МетОДЫ

Определение спектров поглощения растворов антибиотиков.

Для подтверждения структуры используемых антибиотиков сни-м спектры поглощения их растворов. Спектры поглощения раство-I антибиотиков снимали на сканирующем спектрофотометре

"Gilford" (Англия)'в кварцевой кювете с длиной оптического пун 1 см.

Трансформация, выдалекиа, рестрикция плазмидной ДНК.

Трансфоршрование плазмидными ДНК штаммов Е.соН: С-600, НВ-101, J М-109 осуществляли, согласно методикам Ханаганг (Hanahan. . 1083 ). ДНК плазМИД pUC-19, pBR-322, рНС-624, pJW-8C выделяли из клеток Е.coll, содержащих данные плазшды, щелочны. лизисом (Маниатие и др., 1QB4 ). Для увеличения процента выхода суперспиралькой формы (фарш I) плазмид применяли методику "кислого фенола" (Zasloffi. et al. , 1978 ).. Концентрацию очищенной суперепиральной йлаамкдной Д!Ш определяли спектрофотоштричееки (Маниатис и др., 1S84 ).

Ссьект исследований. В качестве источника получения хлороп-ластной топоизомеразы использовали двухнедельные проростки гороха сорта "Днепропетровский".

Получение и очистка хлоропластов us листьев гороха.

Шдучение хлоропластов из листьев двухнедельных проростков гороха осуществляли по методик (Fukata et al. , 1984 ) с некоторыми модификациями.

Экстракция киолоторастворимых белков из хлоропластов_и

- • - -

Экстракцию киолсторастворш.ш белков из ядер производили согласно метода (Bonner et ai. ,19öO ), а из хлоропластов согласно этого же метода, но модифицированного для хлоропластов.

Буферт-ле системы и электрофорез кислогораотворимых белков в первом и во втором направлениях.

Для разделения кислотораствсрш.ш белков из хлоропластов и ядер в кислых условиях с тритоном'-Х-100 (первое направление) использовали простую неоднородную буферную систему (Карпенчук и др. 1937 ).

Для гель-электрофореза второго направления с ДДС-Na использовали систему (Laemmll. ,1Э?0 ), ас цетавлоном - систему (Bonner et al. ,19d0).

Биделение и очиспа бактериальной топоизомеразы 1 типа.

' Выделение топоиьомерази 1 типа из клеток бактерий штамма Е. colt НВ-101, содержащего шазшду pJW-80 (любезно предоставленную проф. Дк. Уонгом, Гарвардский университет, США г осуществляли по методике, описанной в работе (Vang., 1Ü74 ), с некоторыми модификациями. Плазкида pJtf-80 содержит клонированный ген топоизомеразы 1 Е.соН в pBR322 по Sphl/ Sali сайтам.

Выделение и очистка хлоропластной ДШ-топоиаомерааи 1_типа

>13 листьев гороха-.

Выделение и очистку хлоронлаетной ДНК-толоиэомерааы 1 типа осуществляли по схеме, предложенной в данной работе.

- в -

_ PS-Пёк?. ^Ili'KllW?_1

ипа из E.coli и хлоропластов листьев гороха.

Релаксирующую активность ДНК-топоизомеразы I из E.coli оп-гделяли в стандартной инкубационной смеси, приведенной в работе . feng et al. ,1971) Релаксирующую активность ДПК-топоизомеразы .1 з хлоропластов листьев гороха определяли в стандарной инкубаци-яной смеси, описанной в работе (Lam et al, ,1987) с незначительней модификациями.

Реакцию релаксации останавливали добавлением ДДС-Na до ко-гчной концентрации 0,5%, затем ЭДТЛ до 30 мМ. Посла этого до-•шляли 1 мкл протеиназы К (1мг/мл) и инкубировали смесь еще в ¡чение 30 müh.

Реакция расщепления ДНК ДНК-топоизомеразой I типа из хло-гпластов листьев гороха.

В случае реакции расщепления ДНК топоиаомеразой I типа из юрошаетов листьев гороха брали избыток фермента по отношению ДНК. Остальные условия реакции расщепления такие як как и для 1ШШИИ релаксации.

Электрофорез продуктов реакции релаксации (расщепления) ДНК агарозе в первом и во втором направлениях.

Для электрофореза в первом направлении использовали ТВЕ-бу-р (Маниатис и др. ,1964 г.), во втором направлении - ТВЕ-буфер, держащий 0,03 мкМ бромистого этидия.

Перекрестная иммуноспецифическая реакция хлороплаетных бел-в с поликлональными антителами к топоизомеразе I типа E.coli.

Перекрестные иммуноспецифические реакции хлороплаетных бел-в, а также белков топоизомерззн I из эритроцитов птиц (любезно эдоставленной'Белявским А. , Институт молекулярной биологии АН 2Р, г. Москва), топоизомеразы II из тимуса теленка (любезно, ^доставленной Руденко Г. Н., Институт клеточной биологии и ге-гической инженерии АН УССР, г.Киев) с поликлснальными антите-«I к топоизомеразе I из Е. colt проводили' согласно методике зтерман. , 1983). -. . - .

1СОДЕИШМЕ РАБОТЫ

1. Выделение и очистка хлоропластов из листьев гороха

Очистку -хлоропластов.-от растительных-органелл производили . [трифугиройанием их в градйенте лзоосмотического перколла

Для доказательства того, что вона хлоропластов нэ содержит (мэсей растительных ядер применяли несколько методов. Один из включал окраску аликвоти хлоропластов ацетоорсеином (специ-:еским красителем растительных ядер)"'с последующим анализом в

- б -

световой микроскопе. №достатком этого метода являлось то, чт ацетоорсеином частично красилась ДНК хлоропластов и крахмальны зерна. Это снижало объективность данного метода. В связи с эти был применен метод, суть которого заключалась в обнаружении сре да кислотнорастворимых белков хлоропластов маркерных белков рас тительного ядра - гистонов. Для растительных гистонов рааработа на система злектрофоретичёских методов, позволяющая их идентифи цировать и даже выявлять в пределах одной группы гистоны, содер шще одну (две) аминокислотные замены в молекуле белка (Карпе« чук и др., 1987 ). Данные подходы были использованы нами дл: идентификации гистонов среди кислотнорастворимых белков хлоропластов.

Применяя выше приведенные методы, мы однозначно доказывал] отсутствие или наличие примесей растительных ядер в зоне хлоропластов, полученных после центрифугирования на градиенте перютл-ла.

1.2. Выделение и очистка хлоропластной ДНК-топоизомеразы типа из листьев гороха.

На сегодняшний день имеется несколько сообщений об обнаружении ДНК-топэизомеразных активностей в грубых экстрактах и; хлоропластов кукурузы, шпината, гороха, табака (Lam et al. ,198' ). Однако сообщение о выделении фермента в гомогенном виде имеется лишь в одной работе (Nielsen et al., 1S88 ). Зермент П( д&наым электрофореза в полиакриламидном геле представлял собо! шмшептид с молекулярным весом 112 кД. Существенными недостатками этой работы являлось отсутствие строгих критериев доказательства хлоропластной природы фермента и сравнительно низки! его выход. Эти недостатки не позволили провести детальный анаши его ферыетативных свойств.

Общую схему выделения хлоропластной ДНК- т о по из о ме раз и щ листьев гороха, предложенную нами, можно представить в виде сле-дующрй. таблицы.

Таблица 1. Схема очистки хлоропластной ДНК-топоизоме-разы 1 типа из листьев гороха.

Н Фракция Белок Активность Специфическая Степень X

(иг) ф-та (един.) ак-ть (ед/мг).очистки выхода

1. Лизат бЭЕ6) 34600 50 -100 хл-тов.

2. Лизат- 37 34000 919 19 08

ЮгПЕГ.

ДЭАЭ-да- 32 гшш 1047 22 97

ллкшоза

КМ-сефа- 14 зшоо 2143 50 86,6

цекс-Ц-25.

Гепарин- 8 20000 2500 88 57,7

агароаа.

ГАП-1. 1 10000 10000 704. 28,9

йанес. 0,15 8000 53333 4696 23,1

РАП-11.

ГАП-П. 0,050 6000 120000 14090 17.4

а) за едииицу аютвности фермента принято такое его толково, которое способно релаксировать 0,5 икг суперспиральной шмидной ДНК за 1 час в стандартном реакционном буфере,

б) количество хлорофилла (а+в) в мг в лизате.

Нами замечено, что в исходном 2 М NaC'I ливате хлоропластев кассирующая активность фермента детектировалась слабо из-за гакой активности нуклеаэ . Однако от значительной части нукле-юй активности удавалось освободиться после хроматографии хло-[ластного лизата на колонке с ДЭАЭ-52-целлкмюзой. После второй |матографии на колонке с КМ-сефадексом-Д-25 релаксирущая ак-ность топоиэомераэы детектировалась довольно хорошо . Концен-;ция соли KCI с этих фракциях составляла 0,2-0,23 М. фракции с сефадекса-Ц-25 также анализировали на релаксируюшую актив-ть топоизомераз в присутствии АТФ. При этом не выявили допол-ельной АТЗ^зависимой релаксируш' й активности и не заметили енений активности уже локализованных фракций АТФ-независимой -топоизомеразы. Результаты этого анализа говорят об отсутст-АТФ-гависимой релаксирушей активности, то есть об отсутст-активности эукариотической топоизомеразы II типа. Имеются венные данные о наличии в экстрактах из хлоропластов ДНК-ги-ной активности (Lam et al., 1987 ). Однако выделить данный мент в чистом виде пока никому не удавалось. Мы тоже анализи-али фракции с КМ-сефадекса-Ц-25 на наличие гиразной (суперс-ализующей) активности, используя в качестве субстрата релак-эванную плазмидную ДНК, однако обнаружить данную активность ждалось. Поскольку имеются сообщения о АМФ-зависимой релакси-цей активности некоторых лигаэ (МэпЬесиссо et al., 1988 ), то же фракции тестировали и на этот вид активности. Такая ак-тость не была обнаружена.

С гидроксилапгатита хлоропластнзя топоизомераза элюирова-5 в интервале концентраций 260 мМ - 300 мМ калий-фосфата,' рН , что аналогично элюции хлоропластной тоггоизомераэы из листь-

- о -

ев шпината (31ес11еок1 еЪ а1. , 1983 ), (рис.1). Окончательш очистка фермента и одновременно его концентрирование достигал» при повторной хроматографии на гидроксилаппатите (рис. 2). Прет рат фермента после этой хроматографии и анализе его электрофор! вом в 10Х полиакриламидном геле е ДЦО-На бил представлен одн< полосой, молекулярный вес которой составлял 110 кД.

1.2.1._Изучение ферментативных свойств хлоропласта

ДНК-топоизоыерааы.

Бшш изучены некоторые ферментативные свойства хдсроплас ной топоиаомеразы, доказывающие ее прокариотическую природу. И: вестно, что основным отличием прокариотических тоноизомераз типа от эукариотических. является зависимость активности перв] от ионов Нами был проведен всесторонний анализ зависимое: релакеирующэй активности фермента от различных катионов одно-двухвалентных металлов (рис. 3, рис. 4). Релаксирующая активное хлоропластной ДЖ-топоиаомеразы в отсутствие в буфере релаксац: ионов Мё?не проявлялась, что является веским аргументом в полы прокариотической природы фермента. Редаксируиша активность фе] ыента не обнаруживалась и при замене ионов МеГ на ионы или ( . Нами было обнаружено, что релаксирующая активность ДЖ-топо] зоыеразы лучше. проявляется при -наличии в буфере релаксации ион< КС1, чем ионов ИаС1. С другой стороны ингибируюшая концентрат активности ДНК-топоизомерази для ионов МаС! составляла 100 мМ, для ионов КС] - 120 мМ (рис.4, рис. 5). (Еермент в интервале ко1 цектрадий N¿¡31 от 30 Ш до 80 Ш действовал по процесеивному м< хакизму, с: повшениеы ионной силы Оуфе-ра - по дистрибутивном; Изменение механизма действии фермента при изменении ионной си, буфера таксации. указывает на то, что при взаимодействии фе; мент - ДНК важную роль играют ионные силы, релаксирующая акти: ность хлоропластной топоизомеразы наблюдалась при наличии.в б; фере релаксации ионов Сз, Н)э, и+(рис. 4). При наличии в буфе; релаксации ионов (и^выше 25 мМ релаксируюшря активность хлоро: ластной топоиеомеразы ингибировалась (рис.3). Определен интерв; термоустойчивости фермента, релаксирующая активность топоизом раз;, наблюдалась в течение 30 ыин при 40° С. Хлоропласта. ДНК-топоизомераза имела довольно широкий диапазон рН .буфера, котором проявлялась ее активность. Релаксирующую активность фе] мента наблюдали в интерьале рн буфера от 6,2 до 9,0. Извести что актиьность эукариотических топоизомераз в несколько раз ст; мулируется поликатионами (в частности полиаыинами: спермино! спермидшюм, кадаверином) (Карпенчук, Руденко., 1987 ). Хлоро: лазтная на топоизомераза оказалась не чувствительной к действ: полиаминов снермидина и спермина (0,5 мЫ - 3 мМ), кадаверин > мМ - 3 мЫ) оказывал даже некоторое ингибирующее действ:

К 7 . . 131517-. . 23. .->ЯН II

Рис. 1. Релзксирущая активность хлоронластноЯ ДНК-топоизо-Фазы во фракциях с колошей с гидроксилаппатитом-1: 7-29- ноые-I фракций с колошей, К- контрольная плаамида рис-19, Н- начесе-1е на колонку, П- проскок с колонки.

Рис. 2. Электрофорез препарата очишрнной хлоропластной Ж-топоизомеразы 1 типа в 10?.-ном полиакриламидном геле с ГО-11а (фракция с ГАП-П коленки): 1-2 - фракции с: ГЛП-П, со-зржапие очищенную хдоропласгную ДЖ-топоизомеразу I типа, Маркеры молекулярного, ьеса: фосфорилаза в - 94 кД, альбумин - С7 I, овальбумин - 43 кД, кислая янгидраза 30 кД, трипсиновый ии-ябитор - <0,1 кД, -лакгальбумин - 14,4 кД.

Рис. 3. Зависимость релаксирующэй активности хлоропластной ¡Ж-топоиэомеразы от ионол Мг: 1- 1 мМ,, 2- 3 мМ, 3- 5 мМ, 4- 10 М, 5- 15 ММ, б- 20 ММ, 7- 25 мМ, 8- 40 мМ МгСГа,. 9- 10 М ЭГТА 10 мМ МкС , ю- контрольна препарат плазмидн рис-19.

12М

Рис. 4. Зависимость релансирующей активности хлоропластно ДНК-топоизомераац от одно- и двухвалентных катионов: 1- 50, 100 150 uli NaCI, 2- 60, 100, 160 мМ CsCI, 3- 50, 100, 160 мМ RfaCl 4~ 50, 100, 150 мМ LiCI, 5- 5, 10, 20 мМ СаС1£, 6- 5. 10, 20 *t MnCl¿, 7- релаксация плаамидной ДНК топоизомеразой в йтсутствм ионов MgCI¿, 8- контрольная релаксация илаэмидной ДНК топоизомеразой, 9- контрольная плаамидная ДНК pUC-19.

tr-^^r^v-'jriirrrr.T'.-fr-

Ркс.5. Зависимость релаксирующей активности хлоропластно{ ДНК-топоизомеразы от ионов К*: 1- 10 мМ, 2- 30 i,d,(, 3- 50 мМ, 470 мЫ, 5- 90 мы, 6- 110 мМ, 7- 1£0 МЫ, 8- 150 мЫ, 9- 170 мМ, 10190 мМ, 11- ¿10 мМ KCl, 12- контрольный препарат плазмидной ДН1 pBR-322, 13- контрольная релаксация плазмидной ДНК топоизомеразой, 14- релаксирующая активность в присутствии 10 мМ ЭДТА и (15) - в присутствии 20 ым ЭДТА.

pjt» cVju,»,г:»!,!-. < •-,- . .у . , , .. ,-,,'Л-Ч'-V >: i'l.i.^

*г ...VW |Г|-| rv-r |* 7'>- '

tum«.,шш„ ■■ „■,..„,,,.,H.rii;ml.l.lllllM,,ia8

l----_Jl____II__tl______11 1

1 2 3 4 56

Рис. ö. Зависимость релаксирушэй активности хлоропластной ДНК-топоизомеразы от -SH-реагента (N-этилмалёлмида) (1) и полиа-шшов { спермидина (2), спермина (3), кадаверина (4) ): 1- 0,5; 1; 2; 5 мЫ N-этилмалеишда, 2- 0,5; 1; 3 мМ спермидина, 3- 0,5; 1; 3 мЫ спермина, 4- 0,5; 1; 3 mU кадаверина, 5- контрольная релаксация плаамидной ДНК, 6- контрольный препарат плазмидной ДНК pUC-19.

(рис.6). Действие на активность хлоропластной топоизомеразы -SH-реагента N-этилмалеимида неоднозначно. В работе (Nielsen et al., 1988 ) отмечено ингибирование им (2 мЫ) активности фермента. Мы же такого ингибирования не наблюдали в интервале концентраций N-этилыалеимида от 0,5 мЫ до 5 мМ (рис.6). Б этой связи можно отметить, что прокариотическая топоизомераза I типа из Е. coli таюке не чувствительна к действию N-этилмалеимида. Хлороп-ластная топоизомераза оказалась не способной релаксировать положительно суперспирализованную плаэмядную ДНИ Активность ее ин-гибировалась бромистым этвдием в интервале концентраций от 1 до 5 мкг/мл (рис. 7). В то же время ДАШ (неинтер1салирующий в ДНК антибиотик) слабо ингибировал релаксирутсшую активность топоизо-меразы (рис.7).' Гепарин, который имеет свойство связываться с одноцепочечными участками в ДНК, ингибировал активность хлороп-ластной топоиаомерааы в концентрации 5 мкг/мл (рис.7). Анадиа продуктов реакции релаксации ДНК, полученных при действии хло-ропластной ДНК-топоизомеразы и ДНК-топоизомеразы I из эритроцитов птиц на одном и том же геле, позволяет заключить, что хло-ропластная топоизомераза изменяет порядок зацепления ДНК на величину кратную 1 (результат не приведен).

Таким образом, по изученным свойствам хлоропластная ДНК-то-поизомераза во многом аналогична прокариотическим топоизомеразам I типа.

3. Действие антибиотиков и противоопухолевых агентов на активности ДНК-топоизомераз из Е.соИ и хлоропласгов листьев гороха.

Учитывая важность участия ДНН-топоизомераз в основных генетических процессах и влияния на них антибиотиков - ингибиторов тогюизомеразной активности, ш изучали действие некоторых из них на ДНК-топоизомеразы. Было обнаружено увеличение релакеируюшэй активности топоизомеразы 1 типа из Е. coli в присутствии тетрациклина. Реакции релаксации проводили до насыщения - полной релаксации ДНК до состояния равновесного распределения топоиаоые-ров в условиях инкубации. Наблюдаемые эффекты трудно объяснить извлечением ионов Mg"из реакционной среды тетрациклином, молекула которого в растворе координирует до двух ионов М^ (одно сильное и одно слабое место связывания) (Стрельцов и др., 1975 ). Известно, что эукариотическая топоизомераза I типа не нуждается в ионах Mg , которые лишь повышают скорость релаксации суперспиральной ДНК Однако присутствие тетрациклина в буфере релаксации модулировало активность и эукариотических тоноизомераэ (результат не представлен). Ранее методом равновесного диализа было показано связывание тетрациклина с нативной и денатурированной SHK, опосредованное ионами двухвалентных металлов (Mga , Ktrf1 ,Са?

3 4 5

мм«

1 J:-o L.....'

Рис.7. Зависимость релаксирущей активности хлоропластной ЛНК-топоизомеразы от бромистого этидия (1). гепарина (2), диами-нодифенилиндола (3): 1- 1 мкг/мл; 2,5 мкг/мл; 5 мкг/мл бромисто-. го этидия, 2- 1 мкг/мл; 2,5 мкг/мл; 5 мкг/мл гепарина, 3- 5 мкМ, 10 мкЫ ДАШ, 4- контрольная релаксация плаэмидной ДНК, Б- конт-. рольный препарат нлазмиды рШ-19.

Рис. О. Релаксирующая активность топоизомеразы 1 из Е. col i. в присутствии (А)- соли (мЮ ÍJaCI, (Б)- спермидина (мМ), (В)-тетращшииа (мМ); контрольный препарат плазмвдн (К) в присутствии 0,5 мМ'тетрациклина (Г) и 1 мМ спермидина (Д).

12 3 4 5 6^ 8 916 1112131415

Рис. 9. Релаксируюшдя активность хлоропластной ДНК-топоизо-мераеы I типа в присутствии тетрациклина: 1- 50 мкМ, 2- 100 мкМ, 3- 200 мкМ, 4- 250 мкМ, 5- 0,3 мМ, 6- 0,4 мМ, 7- 0,5 мМ, 8- 0,6 мЫ, 9- 0,7 мМ, Ют 0,8 мМ, 11- 0,9 мМ, 12- 1 мМ тетрациклина, 13- контрольная релаксация плаэмидной ДНК в присутствии 5Х-ного этилового спирта, 14- контрольный препарат плаэмидной ДНК рЧС-19 в присутствии 1 мМ тетрациклина, 15- контрольный препарат плаэмидной ДНК рис-19.

,Zn ) (Стрельцов и др. , 19V5). В тех же условиях наблюдали гораздо более слабое связывание антибиотика с молекулами бычьего сывороточного альбумина. Возможность индуцирования тетрациклином в присутствии ионов Мгаконформационных изменений в ЩЖ была проанализирована путем инкубации предварительно релаксированйой ДНК pUC-19 с топоизомеразой I Е. coli при добавлении возрастающих концентраций антибиотика в стандартную реакционную смесь. При этом наблюдали лить небольшие сдвиги в равновесном распределении топоизомеров релаксироваиной ДНК. Однако не исключена возможность того, что тетрациклин-магниевый комплекс, может по-разному взаимодействовать с 'релаксироваиной и суперспиральной ДНК.

Ранее было показано, что топоизомераза I из Е. coli нуждается для своей активности в частично расплетенных или "слабых" участках ДНК (Vang., 1371 ), которые индуцируются при высокой степени суперспирализации ДНК и исчезают при ее релаксации в присутствии спермидина. На рис. 8 показаны результаты анализа взаимного влияния спермидина (0,25 - 1 мМ), тетрациклина (.0,25 -0,75 мМ) и концентраций соли (30,90, 210 мЮ на релаксирухшую активность этого фермента. Следует отметить, что добавление тетрациклина в низких концентрациях предотвращало ингибирующее влияние спермидина на релаксацию суперскрученной ДНК топоизомеразой I Е. coli. Измерение спектров поглощения тетрациклина в области 220-450 нм при добавлении ионов Mg"и спермидина свидетельствуют 'об отсутствии заметных взаимодействий между антибиотиком и епер-мидином, в отличие от ионов MgÄ(результат не показан).

Таким образом кажется вероятным, что восстановление активности топоизомерази I Ё. coli в присутствии спермидина тетрациклин-магниевым комплексом обусловлено изменениями конформации ДНК, которые делают ее приемлемым субстратом для фермента даже в, присутствии полиамина.

Тетрациклин-магниевый комплекс повышал релаксируюшую активность хлс.ропластной ДНК-топоизомеразы в довольно широком интервале концентраций тетрациклина от 100 мкМ до 1 мМ. Это повышение заметно по увеличению количества релаксироваиной да (формы I ) после электрофореза продуктов релаксации в агарозном геле (рис.9). Видимо причини повышения релаксирующэй активности хло-ропластной ДНК-топоизомеразы в присутствии тетрациклина, как и в случае с бактериальной топоизомеразой, связаны с образованием в условиях реакции тетрациклин-магниевых комплексов.

В следующей серии экспериментов мы изучали влияние на релаксируюшую активность хлоропластной топоизомеразы (релаксацию проводили при молярном избытке фермента над ДНК) антибиотиков -индукторов "расщепляемого комплекса": налидиксовой кислоты, но-вобиоцина, амсакрина, камптотешша, амилорида.

В случае использования в наших экспериментах слабого интер-калятора в ДНК амилорида (Drlica et al., 1988 ) характер релаксации плазмидной ДНК имел плавный вид (рис. 10А). После первого направленм электрофореза продуктов реакции релаксации они анализировались во втором направлении в присутствии 0,012 мкг/мл бромистого этидия (рис. 10Б). Как видно из рис. 10В, ингибирование релаксирующей активности хлоропластной гопоиэомеразы нельзя объяснить только интеркаляцией антибиотика в ДНК и за счет этого образовании "положительных" супервитков, которые не способна ре-лаксировать хлоропластная топоизомераза. Из-за того, что в точке, где наблюдается блокирование релаксирующей активности, присутствуют только отрицательные топоизомеры (исходя из данных электрофореза во втором направлении), свидетельствует то, что во время проведения реакции отсутствовал пул "положительно" суперс-пирализованной ДНК. В связи с этим можно предположить, что ингибирование амилоридом релаксации ДНК хлоропластной ДНК-топоизоме-равой скорее связано с влиянием амилорида на сам фермент, чем на ДНК или же на комплекс фермент-ДНК. По увеличению количества "никованной" ДНК после реакции в присутствии амилорида (1-50 мкМ) по сравнению с контрольной релаксацией (рис. 16Б) можно предполагать, что в этом интервале концентраций амилорвд индуцирует расщепление ДНК хлоропластной ДНК-топоизоу.еразой.

4. Анализ перекрестных иммуноепепифических реакций хлороп-лаотных белков с полчклональными антителами к топоизомеразе I типа Е. coli.

Учитывая то обстоятельство, что хлоропласты имеете довольно много родственных черт с бактериальной клеткой, о чем уке упоминалось выше, мы проанализировали сходство антигенных свойств то-поиэомераэ 1 типа из Е. coll и хлоропластов листьев гороха По этому вопросу имеется одна работа (Руке et al., 1989 ), в которой сделана попытка обнаружить среди хлоропластных белков пшеницы топоизомеразу II типа с помощью антител к дрожжевой топоиао-меразе II. Авторам удалось идентифицировать два белка с молекулярными массами 96 и 101 кД, которые даваяи положительный сигнал с антителами.

Однако утверждать то, что эти два белка являются компонентами хлоропластной топоизомераэы 11 типа пока рано, поскольку для этого требуется более детальный анализ. Мы предполагаем, что для иммунологической детекшш хлоропластной топоизомераэы И типа, вернее было бы использовать антитела к субьединицам бактериальной ДНК-гиразы, исходя опять таки из предположения родственных эволюционных связей между хлоропластами и бактериями.

Поскольку в нашей работе выделена и охарактеризована хлоропластная ДНК-топоивомераза I типа, то мы анализировали ее ан-

Рис. 10А- Растепление плазмидной ДНК риС-19 в присутствии ашлорида (первое направление электрофореза продуктов расщепления): 1- 1 мкМ, г- 3 мкМ, 3- 5 ыкЫ, 4- 10 мкЫ. Б- 50 мкМ. 6- 100 ыкЫ, 7- 125 мкМ, 8- 150 мкМ, 9- 175 мкМ, 10- 200 мкЫ, 11- 500 мкМ, 12- контрольное расщепление плаашдной ДНК в присутствии 0,6% ДМСО, 13- контрольный препарат плаэмидной ДНК.

Рмс. 10а Расцепление плаашдной, ДНК pUC-19 в присутствии Ешилорида (второе направление электрофореза продуктов расвепле-пия): обэначения те же, что и на рис. 10А.

тигенные свойства с помощью поликлональных антител к топоизоме-разе 1 бактерии. Довольно хорошая иммуноспецифическая реакция наблюдалась на стадии 3 (фракция с ГАИ-II колонки, содержащая очищенную топоизсмеразуМрезульт ат не приведен). В тоже время нами не било обнаружено перекрестной иммуноспецифической реакции антител Е. coli с препаратами зукариотических топоизомераз (топоизомеразы I из эритроцитов цыпленка и топоизомеразы II из тимуса телешк). Огсугсвовал положительный сигнал и на дотах, где в качестве антигенов использовал)! белки ДНК-топоизомеразы 1 из эритроцитов цыпленка и ДНК-топокэомераэы II из тимуса теленка и различные разЕедения сыворотки Е. coli (1:100, 1:1000, 1:100000). Эти данные позволяют предположить наличие общих анти-геша детерминант у топоизомераз ! типа из хлоропластов и бактерий. Подобие изученных свойств хлоропластной ДНК-топоизомеразы со свойствами топоизомеразы I из бактерий служит еде одним аргументом в пользу прокариотической теории происхождения хлоропластов.

вывода.

1. Предложена система электрофоретических методов, позволяющая идентифицировать кислотнорастворимые белки хлоропластов. Данная система молк г быть использовакз для доказательства наличия примесей растительных ядер в препаративнъж количесвах хлоропластов, основываясь на сравнении электрофоретических подвиж-ностей кислогнорастзоримых белков хлоропластов и маркерных белков растительных ядер - гистонов.

' 2. Из очищенных на ступенчатом градиенте перколла хлоропластов выделена хлороллзстная ДНК-топоизомераза со степенью очистки 14090 раз и специфической активностью 120000 ед/мг.

3. Хяоропластную ДНК-толоизомераэу по зависимости ее релак-сирующей активности от ирнов Mg^ по блокированию активности бромистым этидием, по отсутствию стимулирования -активности полиаминами можно охарактеризовать как прокармотическую, а по характеру распределения топоигомеров в геле как I типа. В польэу прокариотической природы фермента указывает также наличие перекрестной иммуноспецифической реакции между полшслональннми антителами к топоизомеразе I из Е. coll и очищенным препаратом хлоропластной топоизомеразы.

4. Показано стимулирующее влияние тетрациклин-магниевых комплексов на релзксирущую активность топоизомераз I типа из Е. coli и хлоропластов гороха. Изучено взаимное влияние концентраций соли, спермидина и тетрациклина на редаксируюиута активность топоизомеразы I Е. coll. Показано, что низкие концентрации тет-

рациклина предотьрашакт ингибирующее действие спермидина на рь-лаксацию суперокручешгай ДНК топсизомеразой I К. coli.

5. Исследовано влияние некоторых антибиотиков на реакции расщепления плагмидной ДНК хлоропластной ДНК- топоиэомера&оЯ с помощью гель-электрод«за продуктов расщепления в агарозе в первом и во втором направлениях. "

Список работ, опубликоганных но теме диссертации.

1. Карпенчук К. Г., Ситаило ДА., Руднике Г. il Релаксация отрицательно суиерскрученной ДНК толонссиэраззди двух типов в присутствии тетрациклина // Джл. АН ССОР. - 1990. - т. 310, ИЗ. о. 74.1-743.

2. Карпенчук К. Г. , Оигдйло Л. Д. , Рудеико Г. Н. ЛНК-топош>см5-vaoU ецсюих растений V структура и функции биополимеров: Тез. ЮКД. копф. Льг-иь, USO. - Киев: J vise. -С. ГО.

3. Карпенчук К. Г. , Рудник о Г. ¡I. , Ситайло Л. Д. да-тс-гк.н;.-оие-•азы растений, ти.тнш и бактерий // Хиуш» 41!зиоайП№?к» ак-

'ИЕННХ Б«Ы?;СТК: Т«&. ДОКЛ. койф. Н-ЧЛЫШК, 19Í.S. - ftWIJ-'KIK: 1088. о. 98.

4. Сигайло JLÁ. Хч',[.оипчстиая ДНИ топазом* ¡ а^а I ' -итн па :iu:rteb rofoxa // [«¡.полимеры и клетка. - I'j'.M. - v. 7, 1)4. -. 97 I Г„">.

Г) Си-тйло Л. Д. Цг.»шш1* am iiöHci't йкоб >1 протиьоипухолевих генгпв на pe.Tíb'oupyMiiytj зктшшеегь хло; оплести Л Д|{К тоиглшош-tw.u ! urna ¡is листьев гордо* .•/ Ишкуд^им биология. - 1391. . £{), Bi:n. 3. - о. 57 С5.

СИТЛЙЛО Леонид Анатольевич СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ДНК-ТШЖЮМЕРАЗ I ТИПА ИЗ ESCHERICHIA COLI И ХПОРОПЛ/iCTOR ГОРОХА.

Подписано в печать 15. X. 91 г. Формат бумаги 60 х 84 /16 Бумага офсетная 80 r/t£- Офсетная печать. Усл.-печ. листов 1,16. Уч.- изд. листов 0,94. Тираж 100. Зак. 188. Бесплатно.

Институт физики АН УССР, ОНГИ. 252028, Киев - 28, ГСП, проспект Науки, 46.