Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование свойств растительной ДНК-топоизомеразы I ядер и митохондрий в системах in vitro и in vivo

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование свойств растительной ДНК-топоизомеразы I ядер и митохондрий в системах in vitro и in vivo"

На правах рукописи

ТАРАСЕНКО ВЛАДИСЛАВ ИГОРЕВИЧ

РГБ од

2 2 т 200'

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ РАСТИТЕЛЬНОЙ ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗЫI ЯДЕР И МИТОХОНДРИЙ В СИСТЕМАХ IN VITRO И IN VIVO

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск-2000

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

Научный руководитель:

доктор биологических наук Ю.М. Константинов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.С. Романенхо

кандидат биологических наук А.М. Титенко

Ведущая организация:

Иркутский государственный университет

Защита диссертации состоится "1" июня 2000 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 003.25.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан" -¿6" О гф&л £{ 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ГЛ. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. ДНК-топоизомераза I типа (топо I) -один из важнейших ферментов метаболизма нуклеиновых кислот, необходимый для нормального протекания в клетке основных генетических процессов. Данный фермент играет ключевую роль в контроле топологического состояния молекулы ДНК, регулируя степень ее суперспирализации путем введения разрыва в одну из цепей нуклеиновой кислоты. Установлено, что ДНК-топоизомераза I может участвовать также в регуляции экспрессии генетической информации, влияя на активность генов посредством изменения топологического состояния соответствующих регуляторных областей. В последние годы наблюдается резкое возрастание интереса к ДНК-топоизомеразам, связанное в первую очередь с идентификацией этих ферментов в качестве первичных мишеней для ряда соединений с противоопухолевым действием. Растительные топо I охарактеризованы в значительно меньшей степени. Мало известно об участии этих ферментов в росте и делении растительных клеток. Неизвестно также, действуют ли ингибиторы топо I, подавляющие рост животных опухолей, сходным образом в отношении процессов неоплазии у растений. В этой связи свойства и механизм действия ДНК-топоизомераз растительного происхождения требуют своего детального исследования.

Большинство исследований топо I производилось на ферментах ядерной локализации. Поскольку растительный геном состоит из трех частично независимых генетических систем, представляется необходимым исследовать ферментативный аппарат, регулирующий функционирование каждой из них. Уже получены данные, свидетельствующие о существовании в хлоропластах топои-зомераз прокариотического типа, что рассматривается как аргумент в пользу эндосимбиотического происхождения этих органелл. В то же время топоизоме-раза растительных митохондрий изучена недостаточно. На данный момент совершенно неисследованными остаются вопросы участия фермента в митохонд-риальной транскрипции и репликации, а также о возможных путях регуляции его активности in organelle.

Цели н задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение свойств и возможной физиологической роли ДНК-топоизомеразы I ядерной и митохондриальной локализации растений нескольких видов (Zea mays, Scorzon-era hispanica, Daucus carota) на уровне очищенного фермента, изолированных органелл и целых растительных клеток.

В рамках работы были поставлены следующие задачи: - осуществить выделение и очистку до гомогенности ДНК-топоизомеразы I из ядер и митохондрий кукурузы;

- произвести сравнительную характеристику биохимических свойств ферментов ядерной и митохондриальной локализации;

- изучить влияние соединений, известных как ингибиторы ДНК-топо-изомеразы I в животных клетках, на релаксирующую активность растительных ферментов различной клеточной локализации и на ростовые характеристики культур клеток растений;

- исследовать возможные пути регуляции активности ДНК-топо-изомеразы I в растительных органеллах, в частности влияние на фермент ре-докс-условий.

Научная новизна. Впервые проведено исследование биохимических свойств митохондриальной и ядерной ДНК-топоизомеразы I кукурузы, продемонстрировавшее существование четких различий между данными ферментами. Показано, что топо I митохондрий проявляет иной характер зависимости активности от дивалентных катионов, полиаминов и рН среды, а также обладает отличиями в сродстве к одноцепочечной ДНК.

Продемонстрирован эффект соединений, ингибирующих топоизомеразы животного происхождения, на активность ядерного и митохондриального фермента из клеток Zea mays и Scorzonera hispánico. Впервые обнаружен чрезвычайно высокий уровень подавления роста суспензионной культуры ауксин-независимых клеток Scorzonera hispánico камптотецином -ингибитором топо I, обладающим значительной противоопухолевой активностью в животных клетках. Зафиксировано возрастание активности ядерной и митохондриальной топо I в клетках суспензионной культуры Daucus carota в условиях их активной пролиферации.

Показано, что митохондриапьная ДНК-топоизомераза I обладает четко выраженной зависимостью от редокс-состояния митохондрий, проявляющейся в активации фермента в восстанавливающих условиях и ее подавлении в условиях окисления. Совокупность полученных данных об изменении активности топо I под влиянием редокс-системы глутатиона указывает на вероятное участие этого фермента в редокс-контроле генетических функций в митохондриях.

Теоретическая и практическая значимость работы. Установлено, что такой важный фермент нуклеинового обмена как топо I в генетической системе растительных митохондрий проявляет свойства редокс-чувствительного фермента. Полученные данные о модуляции активности топо I под воздействием биотиола глутатиона открывают новые возможности для изучения механизмов регуляции генетических процессов в органеллах растений in vivo с позиций существования редокс-контроля экспрессии митохондриальных генов.

Результаты экспериментов, проведенных на суспензионных культурах клеток корончатого галла Scorzonera hispánico, демонстрируют возможность

использования культур растительных клеток в качестве системы для скрининга ингибиторов топо I.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Ежегодном симпозиуме "Physical-chemical basis of plant physiology", (Пенза, 1996), на Международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 1999), на Всероссийском симпозиуме "Изучение генома и генетическая трансформация растений" (Иркутск, 1999), на международной рабочей конференции по проекту ИНТАС N 97-0522 (Реймс, Франция, 1999), а также на 1-ой Российской электронной конференции по биоинформатике "RECOB-2000".

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 9 печатных работах. Одна работа находится в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 180 работ зарубежных и отечественных авторов. Работа изложена на 132 страницах, содержит 25 рисунков и 8 таблиц.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования были выбраны проростки кукурузы (Zea mays, гибрид ВИР 42МВ) и суспензионные культуры клеток Scorzonera hispánico и Daucus carota. В работе использовались 4-дневные этиолированные проростки кукурузы, выращивавшиеся при температуре 27°С. Суспензии клеток Scorzonera hispánico и Daucus carota культивировались в темноте при 26°С на среде, состоявшей из солей МС (Murashige, Skoog, 1962) и 2% сахарозы.

Выделение митохондрий и ядер проводилось методом дифференциального центрифугирования (Konstantinov et al., 1988) с дополнительной очисткой в градиенте концентрации сахарозы. Органеллы подвергались солевому лизису, после чего производилось фракционирование полученного экстракта сульфатом аммония. Дальнейшая очистка топо I включала ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-тойоперл (Toyo-Soda, Япония) и аффинную хроматографию на дцДНК-целлюлозе (Pharmacia, Швеция) для митохондриального фермента; хроматографию на ДЭАЭ-тойоперл и на оцЦНК-целлюлозе (P-L Biochemicals, США) для ядерного фермента. Определение активности ДНК-топоизомеразы I осуществляли путем оценки релаксации суперспирализованной плазмидной ДНК (Echeverría et al., 1986). В качестве субстрата использовалась ДНК плаз-мид pTZ19 и pRT104, выделенная методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989). Электрофоретический анализ форм плазмидной ДНК производился в

агарозном геле (1%) в буфере TBE. Количественную оценку активности топо I осуществляли с использованием программы SigmaGel (PKWARE Inc., США).

Содержание белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951). Элек-трофоретический анализ белков проводили в блоках полиакриламидного геля в модифицированной системе Лэммли (Laemmli, 1970). Определение молекулярной массы полипептидов осуществляли, используя в качестве стандарта набор белков (Sigma, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение и очистка ДНК-топоизомеразы I ядерной и митохондри-альной локализации

Нами была осуществлена очистка топо I из ядер и митохондрий проростков кукурузы. Выделены и частично очищены также ферменты из суспензионных культур клеток Scorzonera hispánico и Daucus carota. Следует отметить достаточно высокий уровень топоизомеразной активности, зафиксированный в митохондриальных экстрактах кукурузы. Большая часть активности фермента обнаруживалась в солюбилизируемой фракции уже при концентрациях КС1, составляющих 400-500 мМ, что свидетельствует об отсутствии тесной ассоциации топо I с митохондриальными мембранами in vivo. Активность топоизомера-зы I не детектировалась в суспензии интактных митохондрий и в постмитохон-дриалыюм супернатанте, что указывает на внутримитохондриальную локализацию фермента.

5 : -Í Í

66 66

45 45

36 36

24"- ... 24

20 • -j 4 - »

20 14

12 3 12 3 4

Рис. 2. Электрофоретический анализ в 10% SDS-полиакриламидном геле фракций, содержащих активность mono I из ядер (А) и митохондрий (Б) кукурузы, на различных стадиях выделения. А: 1) — маркерные белки; 2) — экстракт ядер; 3) — хроматография на оцДНК-целлюлозе. Б: 1) - маркерные белки; 2) — экстракт митохондрий; 3) - хроматография на ДЭАЭ-тойоперл; 4) - хроматография на дцЦНК-целлюлозе.

Как митохондриальная, так и ядерная топо I обладали идентичным сродством к ДЭАЭ-тойоперл, десорбируясь с колонки при одной и той же ионной силе буфера элюции. Однако поведение ферментов резко отличалось на заключительном этапе очистки - хроматографии на оцДНК-целлюлозе. В противоположность ядерной топо I, митохондриальный фермент кукурузы оказался полностью неспособным к связыванию с данным субстратом. Этот факт свидетельствует о существовании определенных различий в механизме работы топо I ядер и митохондрий.

Электрофоретический анализ фракций, полученных при хроматографии на оцДНК-целлюлозе, выявил наличие единственного полипептида, молекулярная масса которого была оценена приблизительно в 67 кДа (рис. 1). На заключительной стадии очистки митохондриальной топо I нам не удалось зафиксировать присутствие в содержащих ферментативную активность фракциях даже минимального количества белка, поэтому оценка степени очистки на данном этапе не осуществлялась.

2. Сравнительная характеристика биохимических свойств митохондриальной и ядерной ДНК-топоизомеразы I

Одним из типичных свойств ДНК-топоизомераз I типа различных организмов является зависимость ферментативной активности от ионов Mg2+. Характер этой зависимости принято считать одним из критериев, отличающих топо I прокариот и эукариот (Pommier, 1998). Для работы прокариотических то-поизомераз требуется обязательное присутствие ионов магния, активность эу-кариотических ферментов существенно стимулируется Mg2+, но не является абсолютно зависимой от катиона.

Продолжительность инкубации

А--

$ £ ^ ¿г ^ & с

Рис. 2. Проявление активности митохондриальной и ядерной mono I кукурузы при исключении из реакционной смеси ионов Mg2+. Буфер инкубации содержал 5 мМ EDTA. Инкубация осуи!ествлялась в стандартных условиях при 2fC в течение 30, 60 и 120 мин. FI и FII обозначают, соответственно, суперспирализованную и релаксирован-ную формы плазмидной ДНК.

Нами было проведено изучение влияния ионов Mg2+ на активность топо I, изолированной из митохондрий кукурузы. Показано, что оптимальная для проявления релаксирующей активности фермента концентрация MgCb в буфере инкубации составляет 10-15 мМ. При дальнейшем повышении концентрации соли наблюдается постепенное снижение активности топо I. В отсутствие ионов Mg2+ митохондриальный фермент полностью неактивен. Сходная зависимость показана нами для митохондриальных топоизомераз I Scorzonera hispánico и Daucus carota. В противоположность митохондриальному ферменту, активность топо I из ядер кукурузы проявляется в отсутствие катиона (рис.2). Таким образом, нами продемонстрировано существование достоверных различий в воздействии ионов Mg2+ на ядерную и митохондриальную топоизо-меразу I высших растений.

Поскольку известно, что взаимодействие между топоизомеразой I и молекулой ДНК по существу является электростатическим, ионная сила раствора имеет важное значение для проявления активности фермента. Изучение влияния концентрации КС1 на релаксацию ДНК ядерной и митохондриальной топоизомеразой показало, что максимальная активность топо I проявляется при 50 - 75 мМ концентрации соли. Дальнейшее увеличение ионной силы раствора оказывает на ферменты ингибирующее действие. Полное подавление активности обоих ферментов происходит при концентрациях КС1 от 250 до 300 мМ. Подобная зависимость от ионной силы раствора является типичной для эука-риотических топоизомераз I типа (Wang, 1985).

V-

Ядерная топо I Митохондриальная топо I

.¿г* <о <ъ Л <ь о> 's* <о <оА,<ЬР>

^ S S < < 3 $ $ $ $

Рис. 3. Влияние рН буфера инкубации на активность mono I из ядер и митохондрий кукурузы. Инкубация осуществлялась в стандартных условиях при 27°С в течение 30

Изучение рН-зависимости топо I показало, что ядерный и митохондриаль-ный ферменты имеют близкий оптимум рН, лежащий в пределах 7.0 — 8.0 (рие.З). В то же время митохондриальный фермент обладает несколько более высокой устойчивостью к повышенным значениям рН.

Активность ДНК-топоизомераз I из ядер и митохондрий кукурузы проявляется в широком интервале температур (от 10 до 45°С). Максимум релакси-рующей активности приходится на 25 - 30°С. Интересно отметить, что растительные топо I обладают весьма высокой термостойкостью, некоторое время сохраняя активность даже при 45°С. Инкубация при температурах выше 50°С вызывает полную инактивацию фермента.

Известно, что активность ряда ферментов метаболизма нуклеиновых кислот, в том числе и ДНК-топоизомераз, модулируется полиаминами, такими как спермидин (5пуеп1^ора1 е1 а1., 1985). Для топоизомераз I эукариот характерна стимуляция релаксирующей активности полиаминами. Противоположное наблюдается для прокариотических ферментов: их активность частично инги-бируется данными соединениями. Проводившееся нами исследование воздействия спермидина на активность топо I митохондрий и ядер продемонстрировало существование принципиальных различий в реакции ферментов на данный агент (рис. 4). В то время как активность ядерной топо I стимулируется в присутствии полиамина, уровень активности митохондриального фермента остается неизменным. Более того, при добавлении в реакционную смесь высоких концентраций спермидина происходит снижение активности топо I митохондрий, чего не наблюдается для ядерной топо I.

Концентрация спермидина /---

/ # # * / # #

Рис. 4. Воздействие спермидина на активность ДНК-топоизомеразы I из ядер и митохондрий кукурузы. Инкубация осуществлялась в стандартных условиях при 27°С в течение 30 мин. Инкубационная смесь содержала 0,5 ед.акт. mono I.

Абсолютная зависимость от ионов магния и отсутствие стимуляции полиаминами сближают митохондриальный фермент с топо I, изолированными из прокариотических организмов. Тем не менее эти критерии нельзя считать достаточными для отнесения митохондриальной топоизомеразы к семейству прокариотических ферментов.

FII Fl

1 2 3

Рис. 5. Способность ДНК-топоизомеразы I митохондрий кукурузы релаксировать положительно суперспирализованную ДНК: 1) - контрольный препарат pTZ19; 2) - I ед. акт.; 3) - 5 ед. акт. mono I. Инкубация осуществлялась в стандартных условиях при в течение 30 мин. Реакционная смесь, содержащая ДНКpTZl9, прединкуби-ровалась в течение 30 мин в присутствии 1 мкг/мл бромистого этидия.

Наиболее характерным признаком, позволяющим сделать вывод о принадлежности изучаемого фермента к подклассу про- или эукариотических топо I, является способность топоизомеразы использовать в качестве субстрата положительно суперспирализованные молекулы ДНК. Изучение данного свойства у хлоропластных топо I шпината и гороха выявило неспособность этих ферментов релаксировать положительные супервитки, что послужило весомым аргументом в пользу родства прокариотических и хлоропластных топоизомераз (Nielsen et al., 1988). С целью выяснения вопроса о природе ДНК-топоизомеразы из митохондрий кукурузы нами производилось определение активности фермента с использованием в качестве субстрата положительно су-перспирализованной ДНК pTZ19, полученной обработкой препарата плазмиды бромистым этидием (рис. 5). Данный эксперимент выявил способность фермента релаксировать положительные супервитки в ДНК. Это свойство топо I митохондрий кукурузы безусловно сближает изучаемый фермент с эукариотически-ми топоизомеразами.

Таким образом, изучение биохимических свойств ядерной и митохондриальной топо I кукурузы выявило существование четких различий между ферментами (табл. 1). В данном разделе работы показано существование в растительных митохондриях самостоятельной формы топо I, обладающей свойства-

ми, в определенной мере занимающими промежуточное положение между свойствами прокариотических и эукариотических ДНК-топоизомераз типа I.

Таблица 1

Сравнительная характеристика свойств mono I из митохондрий и ядер Zea mays

Свойство Tono I митохондрий Tono I ядер

Зависимость от ионов Mg2+ Абсолютная Нет абсолютной зависимости. Стимуляция активности

Оптимальная концентрация КС1 50-75 мМ 50-75 мМ

Оптимум рН 7.5 - 8.0 7.5 - 8.0

Интервал рН, в котором фермент проявляет активность 6.0-10.0 6.0 - 9.0

Температурный оптимум 25 - 30°С 25 - 30°С

Диапазон температур, в котором сохраняется активность фермента 10 - 45°С 10-45°С

Снижение активности изолированного фермента в 2 раза при 4°С 1,5-2 ч 4- 5 ч

Способность релаксировать положительные супервитки Имеется Имеется

Действие спермидина Частичное ингибирование Стимуляция

Молекулярная масса в денатурирующих условиях - Около 67 кДа

3. Эффект ингибиторов топо I in vitro и in vivo

Следующим этапом работы явилось изучение действия соединений, инги-бирующих топо I в животных клетках (камптотецина и малобороздочных ли-гандов), на активность топоизомераз из растительных органелл, а также на ростовые характеристики суспензионных культур клеток растений.

Камптотецин (СРТ) - типичный ингибитор топо I, принадлежащий к классу блокираторов активности фермента. Ингибирующий эффект данного соединения обусловлен стабилизацией ковалентного комплекса топо I/ДНК на стадии религирования молекулы нуклеиновой кислоты. Считается, что ингибиро-вание СРТ характерно для всех эукариотических топоизомераз типа I.

- камптотецин + камптотецин

Fill Fil

FI

Рис. 6. Образование одноцепочечных разрывов в ДНК pTZ19, производимое ядерной mono I кукурузы в отсутствие и присутствие камптотецина (10 мкМ). Инкубация осуществлялась в течение 10 мин при 27°С. Реакцию останавливали добавлением SDS до конечной концентрации 0,5%. Связавшиеся с ДНК белки удаляли обработкой про-теиназой К в течение 30 мин при 37°С. Электрофоретический анализ осуществлялся в присутствии бромистого этидия (0,1 мкг/мл) на заключительной стадии. Fill представляет форму плДНК, несущей одноцепочечный разрыв.

Изучение действия камптотецина на релаксирующую активность ядерной топо I из суспензионной культуры клеток Scorzonera hispanica показало отсутствие какого-либо детектируемого эффекта в пределах всего исследованного диапазона концентраций алкалоида (5 мкм - 1 мМ). Однако применение методики, позволяющей зафиксировать образование одноцепочечных разрывов в ДНК плазмиды-субстрата (Champoux et al., 1989), показало, что СРТ взаимодействует с ферментом in vitro (рис. 6). Накопление плазмидной ДНК, имеющей одноцепочечный разрыв, свидетельствует о происходящей в присутствии агента стабилизации комплексов топо I/ДНК. Влияние камптотецина на мито-хондриальный фермент было сходным с воздействием на ядерную топоизоме-разу. Таким образом, обнаруженный в работе эффект камптотецина на мито-хондриальную топо I указывает на родство изучаемого фермента с эукариоти-ческими топоизомеразами I типа.

В противоположность многочисленным исследованиям воздействия камптотецина и его производных на рост клеток животных, полностью отсутствуют работы, посвященные изучению влияния соединения на растительные клетки. Целью следующего этапа работы явилось выявление возможного эффекта СРТ на суспензионную культуру ауксин-независимых клеток Scorzonera hispanica. Тестирование камптотецина выявило исключительно высокую ак-

тивность соединения в отношении угнетения роста клеток суспензии (рис. 7). Полное подавление роста наблюдалось уже при концентрациях СРТ, составляющих менее 20 нМ. Воздействие камптотецина в подобных концентрациях было продемонстрировано ранее только для культур клеток ряда опухолей животных (Низат й а1., 1994).

Концентрация, мкМ

Рис. 7. Биомасса клеток суспензионной культуры Бсоггопега 111$рап1са, выращивавшейся в течение 8 дней в присутствии камптотецина.

К другому классу ингибиторов топоизомеразы I — супрессоров активности фермента - относятся различные малобороздочные лиганды (МЛ). В отличие от камптотецина и его производных, данные агенты связываются с ДНК в области малой бороздки без существенного изменения конформации молекулы нуклеиновой кислоты, подавляя релаксирующую активность фермента без образования тройных комплексов. В нашей работе изучены эффекты ряда МЛ (НоесЬ$133258, НоесЬБ133342, дистамицин А, нетропсин, бис-нетропсины) на активность топо I митохондриальной и ядерной локализации из суспензионной культуры опухолевых клеток Бсоггопсга Ызратса, а также из проростков кукурузы.

При сравнении влияния НоесЬ8133258 и НоесЬ5133342 на релаксацию ДНК топоизомеразой из ядер Бсопопега Ыяратса установлено, что 50%-ное ингиби-рование активности ядерного фермента наблюдается уже в присутствии 2,5 мкМ НоесЬ5133342, тогда как НоссЬз133258 вызывает аналогичный эффект только в концентрации, составляющей 7,5 мкМ. Сходную чувствительность к ингибиторам проявляет и топо I митохондрий (рис. 8).

Hocchs133342

Hocchst33258

Fll-

Fl-

/

■Vr

<Y

1

V

/

«V

ÍV

Рис. 8. Действие бисбензимидазолов Hoechst33258 и Hoechst33342 на активность митохондриальной ДНК-топоизомеразы I из суспензионной культуры ауксин-независимых клеток Scorzonera hispánico. Инкубация осуществлялась в стандартных условиях при 27°С в течение 30 мин.

Поскольку имеются данные, демонстрирующие повышенную активность ряда производных антибиотика нетропсина в отношении ингибирования топо I из клеток человека (Sukhanova et al., 1998), в следующей серии экспериментов нами производился сравнительный анализ действия данных агентов на ядерный и митохондриальный фермент Scorzonera hispánico. Были отобраны четыре соединения, отличающиеся пространственной ориентацией исходных молекул нетропсина - бис-Нт(—>5<—), бис-Нт(«-6->), бис-Нт(->4«-), бис-Нт(Р(.). Результаты этого и предыдущих исследований суммированы в таблице 2. Неожиданным явился тот факт, что все производные нетропсина оказались менее активны в отношении ингибирования митохондриальной и ядерной топо I растительных клеток сравнительно с исходным соединением. В то же время нетроп-син вызывал 50%-ное подавление активности топоизомеразы скорзонеры при концентрации 2,5 мкМ, что почти в 20 раз меньше концентрации, необходимой для 50%-ного ингибирования фермента человека (44 мкМ). Сходное действие нетропсина и бис-нетропсинов было установлено нами также для митохондриальной и ядерной топо I проростков кукурузы.

Исходя из данных, полученных для топо I митохондрий животных (Fairfield et al., 1985; Lazarus et al., 1987) продемонстрировавших резко выраженью отличия во влиянии на активность ферментов малобороздочного лиганда беренила, можно было предположить, что митохондриальная топоизомераза I растений также будет обладать иной чувствительностью к ингибированию MJI сравнительно с ферментом ядерной локализации. Однако в нашем исследовании не было отмечено существенных различий в подавлении топоизомеразной

активности из ядер и митохондрий тем или иным малобороздочным лигандом. В то же время обнаружены отличия в чувствительности к нетропсину и его производным между топо I растительного и животного происхождения. Исходя из того факта, что данные соединения имеют различные сайты связывания в молекуле ДНК, можно предположить, что топоизомеразы растений обладают определенными различиями в специфичности взаимодействия с ДНК, обуславливающими иной эффект ингибиторов.

Таблица 2

Действие различных ингибиторов на релаксирующую активность ядерной и мито-хондриальной ДНК—топоизомеразы I из суспензионной культуры Scorzonera hispánico. Представлены средние значения концентраций соединений, при которых происходит 50%-ное ингибирование релаксации ДНК в стандартных реакционных условиях (1С;о), полученные в нескольких независимых экспериментах.

Соединение Ингибирование ядерной топо I 1С50 , мкМ Ингибирование митохондриальной топо I 1С5о , мкМ

Дистамицин А 1,25 1,25

Hoechst33258 7,5 7,5

Hoechst33342 2,5 2,5

Нетропсин 2,5 2,5

бис-Нт(—>5<—) Не ингибировал Не ингибировал

бис-Нт(->4<-) 50 40

бис-Нт(<-6—>) 10 7,5

бис-Нт(Р0 5 5

*Погреимость измерения не превышала 20%.

Исследованные МЛ, в частности НоесЬз133258 и НоесЬз133342, были активны также и на уровне клеток суспензионных культур. При сравнении эффектов данных соединений на релаксирующую активность изолированной топо I и ростовые характеристики культуры клеток 5со попе га ]тратса ясно прослеживается сходство в степени их воздействия на эти процессы. В обоих случаях Н1-342 оказывается в 2,5 - 3 раза более эффективен, чем Ш-258. Подобная корреляция между ингибированием активности топо I и подавлением роста клеток суспензии обнаружена также для нетропсина и его производных.

Таким образом, в данном разделе работы показан выраженный ингиби-рующий эффект соединений, подавляющих релаксирующую активность топоизомеразы I в животных клетках, на активность ядерной и митохондриальной

топо I растений in vitro, а также воздействие этих агентов на рост растительных клеток. Продемонстрирована определенная корреляция между эффективностью ингибирования топо I и подавлением пролиферации клеток суспензионной культуры, свидетельствующая в пользу предположения о том, что топо I является основной мишенью малобороздочных лигандов в растительных клетках.

4. Связь активности топо I с пролиферацией растительных клеток

На ряде животных объектов показано, что активность топо I может существенно возрастать в клетках, подвергающихся воздействию различных стимуляторов роста (Cardellini et al., 1993). В то же время для топоизомеразы I растительного происхождения не существует убедительных данных, показывающих зависимость между уровнем активности фермента и пролиферацией клеток.

В данном разделе работы в качестве объекта исследования были выбраны суспензии клеток Daucus carota. Культивирование клеток осуществлялось в течение 5 дней в присутствии 0,5 мг/л нафтилуксусной кислоты. В качестве контроля выступала суспензия моркови, выращивавшаяся без добавления НУК. Измерение активности топо I, детектируемой в экстрактах ядер, выделенных из обработанных НУК клеток, показало достоверное увеличение ферментативной активности сравнительно с контрольным препаратом. Удельная активность топоизомеразы возрастала в среднем в 1,85 раз (табл. 3). Существенное повышение удельной активности топо I (около 2,1 раза) обнаруживалось также и в ми-тохондриальных экстрактах пролиферирующих клеток.

Таблица 3

Сравнение активности mono I в суспензионных культурах Daucus carota, обработанных нафтилуксусной кислотой (0,5 мкг/л) и в отсутствие обработки фитогормоном

Источник фермента Клеточная локализация фермента Количество белка, мг Активность топо I, ед.акт. Удельная активность, ед.акт./мг

Контрольная суспензионная культура Ядра 0,090 1625 17990 ±2410

Митохондрии 0,261 600 2295 ± 225

Суспензионная культура, обработанная НУК Ядра 0,087 2900 33450 ±4750

Митохондрии 0,226 1100 4850 ±550

Таким образом, полученные результаты ясно показывают, что в клетках суспензионной культуры, подвергающихся активной пролиферации, происходит повышение уровня удельной активности топо I, экстрагируемой из ядер и митохондрий. По аналогии с данными, полученными для топоизомераз живот-

ных (Сагс1еШт е1 а!., 1993; е1 а1., 1989), можно предположить, что наи-

более вероятными механизмами регуляции активности топо I в растительных клетках являются изменение уровня экспрессии кодирующих ферменты генов либо посттрансляционные модификации белка, в частности фосфорилирование.

5. Редокс-зависимость митохондриальной и ядерной ДНК-топо-изомеразы I

Зависимость различных клеточных процессов, в том числе и связанных с метаболизмом нуклеиновых кислот, от редокс-условий в последние годы является объектом активного исследования. Особенно интересным представляется изучение возможности редокс-регуляции генетических процессов в митохондриях. Проводившееся ранее исследование влияния редокс-условий на транскрипцию в изолированных митохондриях показало, что в условиях окисления, создаваемых добавлением феррицианида калия, наблюдается активация транскрипции, а в условиях восстановления (добавление дитионита натрия) происходит торможение этого процесса (КотШапйпоу е1 а1., 1995). Исходя из этого, имеет существенный интерес поиск редокс-зависимых белков, осуществляющих регуляцию экспрессии генома митохондрий. Одним из таких белков может являться и митохондриальная топо I.

СУ

.

-с J¡ <У ¡9

/

^ Л

<У О

v

FII

йшаш • ji^^^gb tj^s^to

Fl

Рис. 9. Влияние редокс-условий на активность митохондриальной ДНК-топо-изомеразы I Daucus carota. Инкубация осуществлялась в стандартных условиях при 27° С в течение 30 мин. Концентрации редокс-агентов в инкубационной смеси составляли 5 мМ. В качестве контроля выступала топоизомеразная реакция в отсутствие редокс-агентов.

Нами показано, что митохондриальная топо I изученных растений имеет выраженные свойства редокс-зависимого фермента (рис. 9). В условиях окисления, создаваемых добавлением феррицианида калия или окисленного глута-тиона, наблюдается снижение активности топо I, тогда как в присутствии ди-тионита натрия или восстановленного глутатиона регистрируется активация фермента. Ингибирование топо I является обратимым. При смене окисляющих условий в реакционной смеси на восстанавливающие наблюдается возобновление активности фермента. Обратимость действия редокс-условий на митохонд-риальную топо I является веским аргументом в пользу возможности существования редокс-регуляции активности фермента in vivo.

Изучение воздействия феррицианида калия, дитионита натрия и двух форм глутатиона на ядерную топо I Daucus carota показало, что активность фермента проявляет сходный характер зависимости от редокс-агентов. Подобная зависимость продемонстрирована нами также для топо I ядер и митохондрий Zea mays. Следовательно, чувствительность к редокс-условиям среды может оказаться общим свойством, характерным для всех топоизомераз растений.

N-концевой домен

Центральный домен

Линкерныи С-концевой домен домен

Cys Cys Cys Cys Cys 430 525 651 652 771

Рис. 10. Локализация консервативных остатков цистеина в молекуле белка ДНК-топоизомеразы I моркови. Схема построена с использованием данных работы (ВакзПат е/ а1, 1996). Су5 - цистеин, Туг - тирозин активного центра. Звездочкой обозначены сайты, цистеиновые остатки которых по данным компьютерного моделирования способны образовывать дисульфидную связь.

Обнаруженное нами влияние редокс-системы глутатиона на активность растительной топо I свидетельствует о вероятном участии в регуляции активности фермента реакций тиол-дисульфидного обмена на уровне цистеиновых остатков в молекуле топоизомеразы. При этом такой важный представитель клеточных биотиолов как глутатион имеет, предположительно, непосредственное отношение к редокс-регуляции активности топоизомеразы типа I. Исходя из вероятной консервативности свойства редокс-зависимости среди всех раститель-

ных топоизомераз типа I, нами было проведено выравнивание аминокислотных последовательностей изученных на сегодняшний день топо I растений с целью поиска возможных консервативных остатков цистеина, обеспечивающих чувствительность фермента к изменению редокс-состояния окружающей среды. Результаты анализа показывают наличие 6 остатков цистеина, общих для всех известных последовательностей топо I растений, причем 5 из этих остатков локализованы в центральном домене белка, а 1 - в каталитически активном С-концевом домене (рис. 10). Можно предположить, что определенная пара из этих остатков способна к обратимому формированию регуляторной дисуль-фидной связи, приводящему к модуляции активности фермента. В частности, остатки цистеина в позициях 651-652 расположены достаточно близко к остатку цистеина в позиции 771 и согласно предсказанной третичной структуре белка возможно способны образовывать дисульфидную связь.

В последние годы установлено, что многие события в регуляции клеточных процессов у прокариотических и эукариотических организмов, такие как фосфорилирование белков (в том числе регуляторных), связывание транскрипционных факторов с регуляторными сайтами ДНК, контролируются физиологическим редокс-гомеостазом, в особенности тиол-дисульфидным балансом (Sen et al., 1996; Sun et al., 1996). В нашей работе редокс-зависимость впервые обнаружена у фермента, участвующего в нуклеиновом обмене в растительных митохондриях, что может свидетельствовать об универсальности феномена ре-докс-контроля генетических процессов среди всех организмов.

Таким образом, согласно выдвинутой гипотезе, ДНК-топоизомераза I может являться одним из белков, участвующих в редокс-регуляции активности митохондриального и ядерного генома.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлено выделение и очистка ДНК—топоизомеразы I из митохондрий и ядер кукурузы с использованием методов солевого фракционирования, ионообменной и аффинной хроматографии.

2. Продемонстрировано существование четких различий между свойствами митохондриальной и ядерной ДНК-топоизомеразы I кукурузы. Tono I митохондрий проявляет иной характер зависимости активности от дивалент-ных катионов, полиаминов и рН среды. Кроме того, митохондриальный и ядерный ферменты обладают различиями в сродстве к одноцепочечной ДНК.

3. Соединения, известные в качестве ингибиторов ДНК-топоизомеразы I в животных клетках (Hoechst33258, Hoechst33342, дистамицин А, нетропсин,

бис-нетропсины), активны в отношении растительных топоизомераз различной клеточной локализации. Типичный ингибитор топо I, камптотецин, не подавляет релаксирующую активность фермента. Тем не менее зафиксированное образование одноцепочечных разрывов в ДНК свидетельствует о взаимодействии данного соединения и топо I in vitro.

4. Ингибиторы ДНК-топоизомеразы I угнетают рост клеток суспензионных культур Scorzonera hispanica. Ряд малобороздочных лигандов проявляет различия в уровне ингибировании клеточного роста, коррелирующие с выявленными отличиями в ингибировании топо I. Камптотецин обладает исключительно высокой эффективностью в отношении подавления роста растительных клеток.

5. Уровень каталитической активности топо I, экстрагируемой из ядер и митохондрий, возрастает в клетках Daucus carota, подвергающихся пролиферации под воздействием нафтилуксусной кислоты.

6. Митохондриальная и ядерная ДНК-топоизомераза I изученных высших растений обладает четко выраженной редокс-зависимостью, проявляющейся в стимуляции активности фермента в восстанавливающих условиях и ее подавлении в условиях окисления.

7. Совокупность полученных данных об изменении активности топо I под воздействием редокс-системы глутатиона указывает на вероятное участие этого фермента в редокс-контроле генетических функций в растительных митохондриях.

Публикации по материалам диссертации

1. Tarasenko V.I., Konstantinov Yu.M. The purification of type I DNA-topoisomerase from maize seedling mitochondria and its properties // Abstr. Annual RSPP Symposium "Physico-Chemical Basis of Plant Physiology" (5-8 February, Penza). - Pushchino, 1996. p.16.

2. Tarasenko V.I., Konstantinov Yu.M. Type I DNA-topoisomerase activity in mitochondria//Maize Genet. Coop. Newslett. 1997. V.71. P.39-40.

3. Тарасенко В.И., Константинов Ю.М. Выделение и характеристика мито-хондриальной ДНК-топоизомеразы I типа из проростков кукурузы (Zea mays)//Биополимеры и клетка, 1998. Т. 14, N 2. С.111-116.

4. Konstantinov Yu.M., Tarasenko V.I. Changes of DNA-topoisomerase I activity from maize mitochondria under the influence of redox coditions // Maize Genet. Coop. Newslett. 1999. V.73. P.39-40.

5. Konstantinov Yu.M., Tarasenko V.I., Grokhovsky S.L., Sukhanova A.S., Zhuze A.L. Effects of different types of inhibitors on mitochondrial DNA-topoisomerase I // Maize Genet. Coop. Newslett. 1999. V.73. P.40-41.

6. Константинов Ю.М., Тарасенко В.И., Гамбург K.3., Гроховский C.JI., Жузе A.JI. Применение ингибиторов топоизомеразы I в изучении роли топологии ДНК при функционировании геномов ядра и митохондрий растений // Материалы Всероссийского симпозиума "Изучение генома и генетическая, трансформация растений" (23-27 августа 1999 г., Иркутск). С.20-21.

7. Константинов Ю.М., Тарасенко В.И. ДНК-топоизомераза I как возможный фактор редокс-контроля генетических процессов в митохондриях растений //Материалы Всероссийского симпозиума "Изучение генома и генетическая трансформация растений" (23-27 августа 1999 г., Иркутск). С.28.

8. Константинов Ю.М., Тарасенко В.И., Гамбург К.З., Гроховский C.JL, Жузе A.JI. Ингибирование ДНК-топоизомеразы I ядерной и митохондриальной локализации в суспензионной культуре клеток Scorzonera hispanica // Материалы международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" Москва, 1999 г. с.600.

9. Тарасенко В.И, Константинов Ю.М. Модуляция активности ДНК-топоизомеразы I растительных митохондрий под влиянием редокс-условий: возможные физиологические приложения // Материалы международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" Москва, 1999 г. с.781.

10.Konstantinov Yu.M., Tarasenko V.I. Characterization of nuclear and mitochondrial DNA topoisomerases I // Maize Genet. Coop. Newslett. 2000. V.74. (submitted)

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тарасенко, Владислав Игоревич

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Топологические состояния ДНК.

2. Механизм действия ДНК-топоизомераз.

2.1. Топоизомеразы типа 1А.

2.2. Топоизомеразы типа 1В.

2.3. Топоизомеразы типа II.

3. Ингибиторы топо 1.

3.1. Камптотецин и его производные.

3.2. Малобороздочные лиганды.

4. Геном митохондрий и регуляция его активности.

5. Характеристика ДНК-топоизомераз из различных объектов.

5.1. Ферменты ядерной локализации.

5.2. ДНК-топоизомеразы I хлоропластов.

5.3. ДНК-топоизомеразы I митохондрий.

6. Биологическая роль ДНК-топоизомераз.

6.1. Роль топоизомераз в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК.

6.2. Роль ДНК-топоизомераз в процессах экспрессии генов.

6.3. Протеинкиназная активность ДНК-топоизомеразы I.

7. Регуляция активности ДНК-топоизомеразы 1.

7.1. Изменения уровня активности топо I в эукариотической клетке.

7.2. Регуляция экспрессии гена топо 1.

7.3. Фосфорилирование и поли(АДФ-рибозилирование) молекул белка.

7.4. Ассоциация топо I с другими белками.

8. Итоги обзора литературы.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Объект исследования.

2. Использованные методы.

2.1. Выделение митохондрий.

2.2. Лизис митохондрий Тритоном Х-100 и фракционирование сульфатом аммония.

2.3. Выделение ядер.

2.4. Солевой лизис ядер и митохондрий.

2.5. Хроматографическая очистка митохондриальной топо I.

2.6. Хроматографическая очистка ядерной ДНК-топоизомеразы 1.

2.7. Определение активности ДНК-топоизомеразы 1.

2.8. Электрофоретический анализ ДНК.

2.9. Детекция одноцепочечных разрывов в плазмидной ДНК.

2.10. Определение содержания белка.

2.11. Электрофоретический анализ белков.

2.12. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК.

2.13. Выделение плазмидной ДНК.

2.14. Приготовление растворов ингибиторов и редокс-агентов.

2.15. Повторность и статистическая обработка результатов.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Выделение и очистка ДНК-топоизомеразы I ядерной и митохондриальной локализации.

2. Сравнительная характеристика биохимических свойств митохондриальной и ядерной ДНК-топоизомеразы 1.

2.1. Зависимость активности ферментов от ионов

2.2. Влияние ионной силы раствора.

2.3. рН-зависимость изучаемых ферментов.

2.4. Воздействие на топоизомеразную активность температуры.

2.5. Эффект спермидина.

2.6. Способность фермента релаксировать положительные супервитки.

2.7. Стабильность изолированных ферментов.

3. Эффект ингибиторов топо I in vivo и in vitro.

3.1. Действие камптотецина на активность топо I из ядер и митохондрий

3.2. Эффекты камптотецина на культуру растительных клеток.

3.3. Действие малобороздочных лигандов на активность топо I.

3.4. Эффекты малобороздочных лигандов на культуру растительных клеток.

4. Связь активности топо I с пролиферацией растительных клеток.

5. Редокс-зависимость митохондриальной и ядерной ДНК-топоизомеразы 1.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование свойств растительной ДНК-топоизомеразы I ядер и митохондрий в системах in vitro и in vivo"

ДНК-топоизомераза I типа - один из важнейших ферментов метаболизма нуклеиновых кислот, необходимый для нормального протекания в клетке основных генетических процессов. Данный фермент играет ключевую роль в контроле топологического состояния молекулы ДНК, регулируя степень ее суперспирализации путем введения разрыва в одну из цепей нуклеиновой кислоты. Известно, что суперспирализация ДНК и контролирующие ее ферменты оказывают значительное влияние на процессы транскрипции и репликации. Установлено, что ДНК-топоизомераза I может участвовать в регуляции экспрессии генетической информации, модулируя активность генов посредством изменений топологического состояния соответствующих регуля-торных областей. В последние годы наблюдается резкое возрастание интереса к ДНК-топоизомеразам, связанное в первую очередь с идентификацией этих ферментов в качестве первичных мишеней для ряда соединений с противоопухолевым действием. В противоположность достаточно детально изученным топоизомеразам клеток животных, растительные топо I охарактеризованы в значительно меньшей степени. Мало известно об участии этих ферментов в росте и делении растительных клеток. Неизвестно также, действуют ли ингибиторы топо I, подавляющие рост животных опухолей, сходным образом в отношении процессов неоплазии у растений. В этой связи свойства и механизм действия ДНК-топоизомераз растительного происхождения требуют своего детального изучения.

Большинство исследований топо I производилось на ферментах ядерной локализации. Поскольку растительный геном состоит из трех частично независимых генетических систем, представляется необходимым исследовать ферментативный аппарат, регулирующий функционирование каждой из них. Уже получены данные, свидетельствующие о существовании в хлоропластах топоизомераз прокариотического типа, что рассматривается как аргумент в пользу эндосимбиотического происхождения этих органелл. В то же время топоизомераза растительных митохондрий изучена недостаточно. На данный момент совершенно неисследованными остаются вопросы участия фермента в митохондриальной транскрипции и репликации, а также возможных путей регуляции его активности in organelle.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение свойств и возможной физиологической роли ДНК-топоизомеразы I ядерной и митохондриальной локализации из нескольких видов высших растений {Zea mays, Scorzonera hispanica, Daucus carota) на уровне очищенного фермента, изолированных органелл и целых растительных клеток.

В рамках работы были поставлены следующие задачи:

- осуществить выделение и очистку до гомогенности ДНК-топоизомеразы I из ядер и митохондрий кукурузы;

- произвести сравнительную характеристику биохимических свойств ферментов ядерной и митохондриальной локализации;

- изучить влияние соединений, известных как ингибиторы ДНК-топоизомеразы I в животных клетках, на релаксирующую активность растительных ферментов различной клеточной локализации и на ростовые характеристики культур клеток растений;

- исследовать возможные пути регуляции активности ДНК-топоизомеразы I в растительных органеллах, в частности влияние на фермент ре-докс-условий.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведено исследование биохимических свойств митохондриальной и ядерной ДНК-топоизомеразы I кукурузы, продемонстрировавшее существование четких различий между данными ферментами. Показано, что топо I митохондрий проявляет иной характер зависимости активности от дивалентных катионов, полиаминов и рН среды, а также обладает отличиями в сродстве к одноцепочечной ДНК.

Продемонстрирован эффект соединений, ингибирующих топоизомеразы животного происхождения, на активность ядерного и митохондриального фермента из клеток Zea mays и Scorzonera hispanica. Впервые обнаружен чрезвычайно высокий уровень подавления роста суспензионной культуры ауксин-независимых клеток Scorzonera hispanica камптотецином - ингибитором топо I, обладающим значительной противоопухолевой активностью в животных клетках. Зафиксировано возрастание активности ядерной и мито-хондриальной топо I в клетках суспензионной культуры Daucus carota в условиях их активной пролиферации.

Показано, что митохондриальная ДНК-топоизомераза I обладает четко выраженной зависимостью от редокс-состояния митохондрий, проявляющейся в стимуляции активности фермента в восстанавливающих условиях и ее подавлении в условиях окисления. Совокупность полученных данных об изменении активности топо I под влиянием редокс-системы глутатиона указывает на вероятное участие этого фермента в редокс-контроле генетических функций в митохондриях.

Результаты экспериментов, проведенных на суспензионных культурах клеток корончатого галла Scorzonera hispanica, демонстрируют возможность использования культур растительных клеток в качестве системы для скрининга ингибиторов топо I.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Ежегодном симпозиуме "Physical-chemical basis of plant physiology", (Пенза, 1996), на Международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 1999), на Всероссийском симпозиуме "Изучение ге9 нома и генетическая трансформация растений" (Иркутск, 1999), на международной рабочей конференции по проекту ИНТАС N 97-0522 (Реймс, Франция, 1999), а также на 1-ой Российской электронной конференции по биоинформатике "КЕСЮВ-2000".

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 9 печатных работах. Одна работа находится в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 180 работ зарубежных и отечественных авторов. Работа изложена на 132 страницах, содержит 25 рисунков и 8 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Тарасенко, Владислав Игоревич

ВЫВОДЫ

1. Осуществлено выделение и очистка ДНК-топоизомеразы I из митохондрий и ядер кукурузы с использованием методов солевого фракционирования, ионообменной и аффинной хроматографии.

2. Продемонстрировано существование четких различий между свойствами митохондриальной и ядерной ДНК-топоизомеразы I кукурузы. Tono I митохондрий проявляет иной характер зависимости активности от дивалентных катионов, полиаминов и рН среды. Кроме того, митохондриальный и ядерный ферменты обладают различиями в сродстве к одноцепочечной ДНК.

3. Соединения, известные в качестве ингибиторов ДНК-топоизомеразы I в животных клетках (Hoechst33258, Hoechst33342, дистамицин А, нетропсин, бис-нетропсины), активны в отношении растительных топоизомераз различной клеточной локализации. Типичный ингибитор топо I, камптотецин, не подавляет релаксирующую активность фермента. Тем не менее зафиксированное образование одноцепочечных разрывов в ДНК свидетельствует о взаимодействии данного соединения и топо I in vitro.

4. Ингибиторы ДНК-топоизомеразы I угнетают рост клеток суспензионных культур Scorzonera hispanica. Ряд малобороздочных лигандов проявляет различия в уровне ингибировании клеточного роста, коррелирующие с выявленными отличиями в ингибировании топо I. Камптотецин обладает исключительно высокой эффективностью в отношении подавления роста растительных клеток.

5. Уровень каталитической активности топо I, экстрагируемой из ядер и митохондрий, возрастает в клетках Daucus carota, подвергающихся пролиферации под воздействием нафтилуксусной кислоты.

6. Митохондриальная и ядерная ДНК-топоизомераза I изученных высших растений обладает четко выраженной ре-докс-зависимостью, проявляющейся в стимуляции активности фермента в восстанавливающих условиях и ее подавлении в условиях окисления.

7. Совокупность полученных данных об изменении активности топо I под воздействием редокс-системы глутатиона указывает на вероятное участие этого фермента в редокс-контроле генетических функций в растительных митохондриях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тарасенко, Владислав Игоревич, Иркутск

1. Gellert М. DNA topoisomerases // Ann. Rev. Biochem. 1981. - 50. - P. 879 - 910.

2. Benham C.J. Torsional stress and local denaturation in supercoiled DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - 76. - P. 3870-3874.

3. Stillman B.W., Gluzman Y. Replication and supercoiling of simian virus 40 DNA in cell extracts from human cells // Mol. Cell. Biol. 1985. - 5. - P. 2051-2060.

4. Mattern M.R., Painter R.B. Dependence of mammalian DNA replication on DNA supercoiling // Biochim. Biophys. Acta. 1979. - 563. - P. 293-305.

5. Smith G.R. DNA supercoiling: another level for regulating gene expression // Cell. 1981. - 24. - P. 599-600.

6. Futcher B. Supercoiling and transcription, or vice versa? // Trends Genet. -1988. -4. P. 271-272.

7. Weisbrod S. Active chromatin // Nature. 1982. - 297. - P. 289-295.

8. Caserta M., Camilloni G., Venditti S., Venditti P. Conformational information in DNA: Its role in the interaction with topoisomerase I and nucleosomes // J. Cell. Bioch. 1994. - 55. - P. 93 - 97.

9. Wang J.C., Lynch A.S. Transcription and DNA supercoiling // Curr. Opin. Genet. Dev. 1993. - 3. - P. 764-768.

10. Wang J.C. DNA topoisomerases // Annu. Rev. Biochem. 1996. - 65. - P. 635-692.

11. Якубовская E.A., Габибов А.Г. Топоизомеразы. Механизмы изменения топологии ДНК // Мол. биология. 1999. - 33,N3. - С. 368-384.

12. Mizushima T., Natori S., Sekimizu K. Inhibition of E. coli DNA topoisomerase I activity by phospholipids // Biochem. J. 1992. - 285. - P. 503 - 506.

13. Zhu C.-X., Roche C.J., Tse-Dinh Y.-C. Effect of Mg(II) binding on the structure and activity of Escherichia coli DNA topoisomerase I // J. Biol. Chem. 1997. - 272. - P. 16206-16210.

14. Yuk-Ching T.-D. Bacterial and archeal type I topoisomerases // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - 1400. - P. 19-27.

15. Touet A., Sirard J., Mock M. Bacillus anthracis pXOl virulence plasmid encodes a type I DNA topoisomerase // Mol. Microbiol. 1994. - 13. - P. 471 -479.

16. Ferrero S., Touet A. DNA topoisomerase I from Staphylococcus aureus II Mol. Microbiol. 1994. - 13. - P. 641 - 653.

17. Zhang H.L., Malpure S., DiGate R. Escherichia coli DNA topoisomerase III is a site-specific DNA binding protein that binds asymmetrically to its cleavage site // J. Biol. Chem. 1995. - 270. - P. 23700-23705.

18. Hanai R., Caron P.R., Wang J.C. Human TOP3: a single-copy gene encoding DNA topoisomerase III // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 1996. 93. - P. 3653-3657.

19. Wallis J.W., Chrebet G., Brodsky G., Rolfe M., Rothstein R. A hyper-recombination mutation in Saccharomyces cerevisiae identifies a novel eukaryotic topoisomerase // Cell. 1989. - 58. - P. 409-419.

20. Lima C.D., Wang, J.C., Mondragon A. Three-dimensional structure of the 67K N-terminal fragment of E. coli DNA topoisomerase I // Nature. 1994. -367.-P. 138-146.

21. Pommier Y., Pourquir P., Fan Y., Strumberg D. Mechanism of action of eukariotic DNA topoisomerase I and drugs targeted to the enzyme // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - 1400. - P. 83-106.

22. Stivers J.T., Hams T.K., Mildvan A.S. Vaccinia DNA topoisomerase I: evidence supporting a free rotation mechanism for DNA supercoil relaxation // Biochemistry. 1997. - 36. - P. 5212-5222.

23. Slesarev K.M., Young L. Purification and characterization of DNA topoisomerase V // J. Biol. Chem. 1994. - 269. - P. 3259 - 3303.

24. Shuman S., Prescott J. Specific DNA cleavage and binding by vaccinia virus DNA topoisomerase I //J. Biol. Chem. 1990. - 265. - P. 17826 - 17836.

25. Gupta M., Zhu C.-X. An engineered mutant of vaccinia virus DNA topoisomerase I is sensitive to the anti-cancer drug camptothecin // J. Biol. Chem. 1992. - 267. - P. 24177 - 24180.

26. Christiansen K., Westergaard O. Characterization of intra- and intermolecular DNA ligation mediated by eucaryotic topoisomerase I // J. Biol. Chem. 1994. - 269. - P. 721 - 729.

27. Gupta M., Fujimori A. and Pommier Y. Eukaryotic DNA topoisomerases I // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - 1262. - P. 1-14.

28. Wigley D.B. Structure and mechanism of DNA topoisomerases // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995. - 24. - P. 185-208.

29. Tan R.K., Harvey S.C., Di Mauro E., Camilloni G., Venditti P. DNA topological context affects access to eukaryotic DNA topoisomerase I // J. Biomol. Struct. Dyn. 1996. - 13. - P. 855-872.

30. Krogh S., Mortensen U.H., Westergaard O. Eucaryotic topoisomerase I -DNA interaction is stabilized by helix curvature // Nucl. Acid. Res. 1991. -19. - P. 1235 - 1241.

31. Madden K.R., Stewart L., Champoux J.J. Preferential binding of human topoisomerase I to superhelical DNA // EMBO J. 1995. - 14. - P. 53995409.

32. Stewart L., Champoux J. The domain organization of human topoisomerase I // J. Biol. Chem. 1996. - 271. - P. 7602-7608.

33. Stewart L., Ireton G.C., Champoux J. Reconstitution of human topoisomerase I by fragment complementation // J. Mol. Biol. 1997. - 269. -P. 355-372.

34. Redinbo M.R., Stewart L., Kuhn P., Champoux J.J., Hoi W.G. Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA//Science. 1998.-279.-P. 1504-1513.

35. Stewart L, Redinbo M.R., Qiu X., Hoi W.G., Champoux J.J. A model for the mechanism of human topoisomerase I // Science. 1998. - 279. - P. 15341541.

36. Wang, J.C. DNA topoisomerases: why so many? // J. Biol. Chem. 1991. -266.-P. 6659-6662.

37. Downes C., Clarke D., Mullinger A. A topoisomerase II dependent G2 cycle check-point in mammalian cells //Nature. - 1994. - 372. - P. 467 - 470.

38. Huang H.-W., Liu H. The recognition of DNA cleavage sites by porcine spleen topoisomerase II // Nucl. Acid. Res. 1992. - 20. - P. 467 - 473.

39. Pognan F., Paoletti C. Does cruciform DNA provide a recognition signal for DNA topoisomerase II ? // Biochimie. 1992. - 74. - P. 1019 - 1023.

40. Berger, J.M. Structure of DNA topoisomerases // Biochim. Biophys. Acta. -1998. 1400. - P. 3-18.

41. Roca J., Wang J.C. DNA transport by a type II DNA topoisomerase: evidence in favor of a two-gate mechanism // Cell. 1994. - 77. - P. 609-616.

42. Pommier Y. Diversity of DNA topoisomerases I and inhibitors // Biochimie. 1998.-80.-P. 255-270.

43. Malonne H. and Atassi G. DNA topoisomerase targeting drugs: mechanism of action and perspectives // Anti Cancer Drugs. - 1997. - 8. - P. 811-822.

44. Nitiss J.L., Rose A., Sykes K.C., Harris J. and Zhou J. Using yeast to understand drugs that target topoisomerases // Ann. NY Acad. Sci. 1996. -803.-P. 32-43.

45. Knab A.M., Fertala J. and Bjornsti M.-A. Mechanism of camptothecin resistance in yeast DNA topoisomerase I mutants // J. Biol. Chem. 1993. -268. - P. 22322-22330.

46. Pommier Y., Schwartz R., Zwelling L. Effects of DNA intercalating agents on topoisomerase II induced DNA strand cleavage // Biochemistry. 1989. -24.-P. 6406-6410.

47. Gallo R.C., Whang-Peng J., Adamson R.H. Studies on the antitumor activity, mechanism of action, and cell cycle effects of camptothecin // J. Natl. Cancer Inst. 1971.-46.-P. 789-795.

48. Hsiang Y.H., Hertzberg R., Hecht S., Liu L.F. Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase I // J. Biol. Chem. -1985.-260.-P. 14873-14878.

49. Kyeldsen E., Gromova I., Alsner I., Westergaard O. Camptothecin inhibits both the cleavage and religation reactions of eucaryotic topoisomerase I // J. Mol. Biol. 1992. - 228. - P. 1025 - 1030.

50. Kaufmann S.H. Cell death induced by topoisomerase-targeted drugs: more questions than answers // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - 1400. - P. 195-211.

51. Del Bino G., Lassota P., Darzynkiewicz Z. The S-phase cytotoxicity of camptothecin // Exp. Cell Res. 1991. - 193. - P. 27-35.

52. Knab A.M., Fertala J., Bjornsti M.A. A camptothecin-resistant DNA topoisomerase I mutant exhibits altered sensitivities to other DNA topoisomerase poisons // J. Biol. Chem. 1995. - 270. - P. 6141-6148.

53. Reid R.J., Benedetti P., Bjornsti M.-A. Yeast as a model organism for studying the actions of DNA topoisomerase-targeted drugs // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - 1400. - P. 289-300.

54. Cole A.D., Heath-Pagliuso S., Baich A., Kmiec E.B. In vitro analysis of a type I DNA topoisomerase activity from cultured tobacco cells // Plant Mol. Biol. 1992. - 19. - P. 265-276.

55. Champoux J.J., Aronoff R. The effects of camptothecin on the reaction and the specificity of the wheat germ type I topoisomerase // J. Biol. Chem. -1989.-264.-P. 1010-1015.

56. Pommier Y., Covey J.M., Kerrigan D. DNA unwinding and inhibition of mouse leukemia L1210 DNA topoisomerase I by intercalators // Nucl. Acid. Res. 1987.- 15.-P. 6713 -6731.

57. McHugh M.M., Woyanorowski J.M., Sigmund R.D. Effect of minor groove binding drugs on mammalian topoisomerase I activity // Biochem. Pharmacol. 1989. - 38. - P. 2323-2328.

58. McHugh M.M., Sigmund R.D. Beerman T.A. Effect of minor groove binding drugs on camptothecin-induced DNA lesions in L1210 nuclei // Biochem. Pharmacol. 1990. - 39. - P. 707-714.

59. Neidle S., Pearl L. H. and Skelly J. V. DNA structure and perturbation by drug binding // Biochem. J. 1987. - 243. - P. 1-13.

60. Beerman T.A., McHugh M.M., Sigmund R.D., Lown J.W., Bathini Y. Effects of analogs of the DNA minor groove binder Hoechst33258 on topoisomerase II and I mediated activities // Biochim. Biophys. Acta. 1992. -1131. -P. 53-61.

61. Chen A.Y., Yu C., Gatto B. and Liu L.F. DNA minor groove-binding ligands: A different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. - 90. - P. 8131-8135.

62. Wang Z., Zimmer C., Lown J.W., Knippers R. Effects of bifunctional netropsin-related minor groove-binding ligands on mammalian type I DNA topoisomerase // Biochem. Pharmacol. 1997. - 53. - P. 309-316.

63. Zhao R., al-Said N.H., Sternbach D.L., Lown J.W. Camptothecin and minor-groove binder hybrid molecules: synthesis, inhibition of topoisomerase I, and anticancer cytotoxicity in vitro II J. Med. Chem. 1997. - 40. - P. 216-225.

64. Sukhanova A., Grokhovsky S., Zhuze A., Roper D., Bronstein I. Human DNA-topoisomerase I activity is affected by bis-netropsin's binding to DNA minor groove // Biochem. and Mol. Biol. Int. 1998. - 44. - P. 997-1010.

65. Крюков Е.Ю., Суханова A.B., Гроховский C.JI., Жузе А.Л., Набиев И.Р. Исследование комплексов бис-нетропсинов с ДНК методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния // Мол. биология. -1999. -t.33,N3. С. 462-470.

66. Goldman G.H., Yu С., Wu H.-Y., Sanders M.M., La Voie E.J., Liu L.F. Differential poisoning of Human and Aspergillus nidulans DNA Topoisomerase I by bi- and terbenzimidazoles // Biochemistry. 1997. - 36. - P. 6488-6494.

67. Войников В.К., Константинов Ю.М., Негрук В.И. Генетические функции митохондрий растений. Новосибирск : Наука. Сибирское отд-ние, 1991. - 183 с.

68. Taanman J.W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - 1410. - P. 103-123.

69. Binder S., Marchfelder A., Brennicke A. Regulation of gene expression in plant mitochondria // Plant Mol. Biol. 1996. - 32. - P. 303-314.

70. Tracy R.L., Stern D.B. Mitochondrial transcription initiation: promoter structures and RNA polymerases // Curr. Genet. 1995. - 28. - P. 205-216.

71. Buzan J.M., Low R.L. Preference of human mitochondrial RNA polymerase for superhelical templates with mitochondrial promoters // Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 1988. - 152. - P. 22-29.

72. Fauron C., Casper M., Gao Y., Moore B. The maize mitochondrial genome: dynamic, yet functional // Trends Genet. 1995. -11. - P. 228-235.

73. Champoux J.J., Dulbecco R. An activity from mammalian cells that untwists superhelical DNA a possible swivel for DNA replication (polyoma-ethidium bromide-mouse-embryo cells-dye binding assay) // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. - 1972. - 49. - P. 143 - 146.

74. Liu L., Miller K. Eukaryotic DNA topoisomerases: two forms of type I DNA topoisomerases from HeLa cell nuclei // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1981. -78.-P. 3487 - 3491.

75. Jahaverian K., Tse Y., Vega J. Drosophila topoisomerase I: isolation and characterization // Nucl. Acid. Res. 1982. - 10. - P. 6945 - 6955.

76. Goto T., Wang J.C. Cloning of yeast TOPI, the gene encoding DNA topoisomerase I, and construction of mutants defective in both DNA topoisomerase I and DNA topoisomerase II // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1985.- 82.-P. 7178-7182.

77. Koiwai O., Yasui Y., Sakai Y., Watanabe T., Ishii K., Yanagihara S., Andoh T. Cloning of the mouse cDNA encoding DNA topoisomerase I and chromosomal location of the gene // Gene. 1993. - 125. - P. 211-216.

78. Pandit S.D., Richard R.E., Sternglanz R., Bogenhagen D.F. Cloning and characterization of the gene for the somatic form of DNA topoisomerase I fromXenopus laevis //Nucl. Acid. Res. 1996. - 24. - P. 3593-3600.

79. Heck M.S., Hittelman W.N., Earnshaw W.C. Differential expression of DNA topoisomerases I and II during the eukaryotic cell cycle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - 85. - P. 1086-1090.

80. Dynan W.S., Jendrisak J.J., Hager D.A., Burgess R.R. Purification and characterization of wheat germ DNA topoisomerase I (nicking-closing enzyme) // J. Biol. Chem. 1981. - 256. - P. 5860-5865.

81. Руденко Г.Н. Выделение и характеристика двух различных ДНК-топоизомераз I типа из листьев Pisum sativum II Мол. биология. 1991. -т.25, N5. - С. 1316- 1331.

82. Agris P.F., Parks R., Bowman L., Guenther R.H., Kovacs S.A., Pelsue S. Plant DNA topoisomerase I is recognized and inhibited by human Scl-70 sera autoantibodies //Exp. Cell. Res. 1990. - 189. - P. 276-279.

83. Carbonera D., Cella R., Montecucco A., Ciarocchi G. Isolation of a type I topoisomerase from carrot cells // J. Exp. Bot. 1988. - 39. - P. 70-78.

84. Chiatante D., Claut V., Bryant J.A. Nuclear DNA topoisomerases in Pisum sativum L. // J. Exp. Bot. 1993.-44.-P. 1045-1051.

85. Carbonera D., Gramegna M., Cella R., Montecucco A. DNA topoisomerase I: Evidence for an additional form in carrot cells // J. Exp. Bot. 1990. - 41. -P. 1475-1478.

86. Srivenugopal K.S., Morris D.R. Differential modulation by spermidine of reactions catalyzed by type 1 prokaryotic and eukaryotic topoisomerases // Biochemistry. 1985. - 24. - P. 4766-4771.

87. Reddy M.K., Nair S., Tewari K.K. Cloning, expression and characterization of a gene which encodes a topoisomerase I with positive supercoiling activity in pea // Plant Mol. Biol. 1998. - 37. - P. 773-784.

88. Kim J., Kim Y.C., Lee J.H., Jang Y.J, Chung I.K, Koo H.S. cDNA cloning, expression, and chromosomal localization of Caenorhabditis elegans DNA topoisomerase I // Eur. J. Biochem. 1996. - 237. - P. 367-372.

89. Hsieh T.S, Brown S.D, Huang P, Fostel J. Isolation and characterization of a gene encoding DNA topoisomerase I in Drosophila melanogaster II Nucl. Acid. Res. 1992. - 20. - P. 6177-6182.

90. Stewart L, Ireton G, Madden K, Champoux J. Biochemical and Biophysical Analyses of Recombinant Forms of Human Topoisomerase I // J. Biol. Chem. 1996. - 271. - P. 7593-7601.

91. Reddy M.K., Nair S„ Tewari K.K, Mudgil Y, Yadav B.S, Sopory S.K. Cloning and characterization of a cDNA encoding topoisomerase II in pea and analysis of its expression in relation to cell proliferation // Plant Mol. Biol. 1999.-41.-P. 125-137.

92. Balestrazzi A, Toscano I, Bernacchia G, Luo M, Otte S, Carbonera D. Cloning of a cDNA encoding DNA topoisomerase I in Daucus carota and expression analysis in relation to cell proliferation // Gene. 1996. — 183. — P. 183-190.

93. Siedlecki J, Zimmermann W, Weissbach A. Characterization of a procaryotic DNA topoisomerase I in chloroplast extracts from spinach // Nucl. Acid. Res. 1983. - 11. - P. 1523 - 1537.

94. Nielsen В., Tewari К. Pea chloroplast topoisomerase I: purification, characterization, and role in replication // Plant Mol. Biol. 1988. - 11. - P. 3-14.

95. Ситайло JT.А. Хлоропластная ДНК-топоизомераза I типа из листьев гороха // Биополимеры и клетка. 1991. - т.7, N4. - С. 97 - 103.

96. Mukherjee S.K., Reddy М.К., Kumar D., Tewari K.K. Purification and characterization of a eukaryotic type 1 topoisomerase from pea chloroplast // J. Biol. Chem. 1994. - 269. - P. 3793-3801.

97. Fukata H., Mochida A., Maruyama N., Fukasawa H. Chloroplast DNA topoisomerase I from cauliflower // J. Biochem. (Tokyo). 1991. - 109. - P. 127-131.

98. Echeverria M., Martin M.T., Litvak S. A DNA topoisomerase type I from wheat embryo mitochondria // Plant Mol. Biol. 1986. - 6. - P. 417-427.

99. Meisner K., Dorfel P., Borner T. Topoisomerase activity in mitochondrial lysates of higher plant (Chenopodium album) // Biochem. International -1992.-27. P. 1119- 1125.

100. Fairfield F.R., Bauer W.R., Simpson M.V. Mitochondria contain a distinct DNA topoisomerase // J. Biol. Chem. 1979. - 254. - P. 9352-9354.

101. Fairfield F.R., Bauer W.R., Simpson M.V. Studies on mitochondrial type I topoisomerase and on its function // Biochim. Biophys. Acta. 1985. - 824. -P. 45-57.

102. Castora F.J., Lazarus G.M., Kunes D. The presence of two mitochondrial DNA topoisomerases in human acute leukemia cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. - 130. - P. 854-866.

103. Kosovsky M.J., Soslau G. Immunological identification of human platelet mitochondrial DNA topoisomerase I // Biochim. Biophys. Acta. 1993. -1164. -P. 101-107.

104. Brun G., Vannier P., Scovassi I., Callen J.C. DNA topoisomerase I from mitochondria of Xenopus laevis oocytes // Eur. J. Biochem. 1981. - 118.-P. 407-415.

105. Lazarus G.M., Henrich J.P., Kelly W.G., Schmitz S.A., Castora F.J. Purification and characterization of a type I DNA topoisomerase from calf thymus mitochondria // Biochemistry. 1987. - 26. - P. 6195-6203.

106. Lin J.H., Lazarus G.M., Castora F.J. DNA topoisomerase I from calf thymus mitochondria is associated with a DNA binding, inner membrane protein // Arch. Biochem. Biophys. 1992. - 293. - P. 201-207.

107. Topcu Z., Castora F.J. Mammalian mitochondrial DNA topoisomerase I preferentially relaxes supercoils in plasmids containing specific mitochondrial DNA sequences // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - 1264. -P. 377-387.

108. Murthy V., Pasupathy K. Evidence for the presence of topoisomerase like activity in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - 198. - P. 387-392.

109. Wang J., Kearney K., Derby M., Wernette C.M. On the relationship of the ATP-independent, mitochondrial associated DNA topoisomerase of Saccharomyces cerevisiae to the nuclear topoisomerase I // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. - 214. - P. 723-729.

110. Tua A., Wang J., Kulpa V., Wernette C.M. Mitochondrial DNA topoisomerase I of Saccharomyces cerevisiae // Biochimie. 1997. - 79. -P. 341-350.

111. Nitiss J.L. Investigating the biological functions of DNA topoisomerases in eukaryotic cells // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - 1400. - P. 63-81.

112. Camilloni G., Di Martino E., Di Mauro E., Caserta M. Regulation of the function of eukaryotic DNA topoisomerase I: topological conditions for inactivity // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 1989. 86. - P. 3080-3084.

113. Kaguni J., Kornberg A. Replication initiated at the origin of E. coli chromosome reconstituted with purified enzymes // Cell. 1984. - 38. - P. 183 - 190.

114. Kaufman W., Boyer J., Estabrooks L., Wilson S. Inhibition of replication initiation in human cells following stabilization of topoisomerase DNA cleavable complexes//Mol. Cell. Biol. - 1991. - 11. - P. 3711 - 3718.

115. Lam E., Chua N. Chloroplast DNA gyrase and in vitro regulation of transcription by template topology and novobiocin // Plant Mol. Biol. 1987. - 8. - P. 415 -424.

116. Heinhorst S., Cannon G., Weissbach A. Chloroplast DNA synthesis during the cell cycle in cultured cells of Nicotiana tabacum: inhibition by nalidixic acid and hydroxyurea // Arch. Biochem. Biophys. 1985. - 239. - P. 475479.

117. Skov M., Miller T. A DNA topoisomerase inhibitors causes increase of sensitivity to low doses//Radiat. Res. 1994,- 138. - P. 117 - 120.

118. Lanza A, Tornatelli S, Rodolfo C, Scanavini M.C. Human DNA topoisomerase I-mediated cleavages stimulated by ultraviolet light-induced DNA damage // J. Biol. Chem. 1996. - 271. - P. 6978-6986.

119. Kumagai M, Ikeda H. Molecular analysis of the recombination junctions of lambda bio transducing phages // Mol. Gen. Genet. 1991. - 230. - P. 6064.

120. Cheng C, Kussie N, Pavlevitch N, Shuman S. Conservation of structure and mechanism between eukaryotic topoisomerase I and site-specific recombinases // Cell. 1998. - 92. - P. 841-850.

121. Wang Z, Droge P. Differential control of transcription-induced and overall DNA supercoiling by eukaryotic topoisomerases in vitro II EMBO J. 1996. - 15.-P. 581-589.

122. Георгиев Г. П. Гены высших организмов и их экспрессия // М.: Наука, 1989.- 255 с.

123. Gilmour D.S, Pflugfelder G, Wang J.С, Lis J.T. Topoisomerase I interacts with transcribed regions in Drosophila cells // Cell. 1986. - 44. - P. 401407.

124. Masse E, Phoenix P, Drolet M. DNA topoisomerases regulate R-loop formation during transcription of the rrnB operon in Escherichia coli II J. Biol. Chem. -1997. 272. - P. 12816-12823.

125. Chen D, Bowater R.P, Lilley D.M. Activation of the leu-500 promoter: a topological domain generated by divergent transcription in a plasmid // Biochemistry. 1993.-32.-P. 13162-13170.

126. Thompson R.J., Mosig G. Stimulation of a Chlamydomonas chloroplast promoter by novobiocin in situ and in E. coli implies regulation by torsional stress in the chloroplast DNA // Cell. 1987. - 48. - P. 281-287.

127. Thompson R.J., Mosig G. An ATP-dependent supercoiling topoisomerase of Chlamydomonas reinhardtii affects accumulation of specific chloroplast transcripts //Nucleic Acids Res. 1985. - 13. - P. 873-891.

128. Choder M. A general topoisomerase I-dependent transcriptional repression in the stationary phase in yeast // Genes Dev. 1991. - 5. - P. 2315-2326.

129. Schultz M.C., Brill S.J., Ju Q., Sternglanz R., Reeder R.H. Topoisomerases and yeast rRNA transcription: negative supercoiling stimulates initiation and topoisomerase activity is required for elongation // Genes Dev. 1992. - 6. -P. 1332-1341.

130. Megonigal M. D., Fertala J., Bjornsti M. Alterations in the catalytic activity of yeast DNA topoisomerase I result in cell cycle arrest and cell death // J. Biol. Chem. 1997. - 272. - P. 12801-12808.

131. Di Mauro E., Camilloni G., Verdone L., Caserta M. DNA topoisomerase I controls the kinetics of promoter activation and DNA topology in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell Biol. 1993. - 13. - P. 6702-6710.

132. Parvin J.D., Sharp P.A. DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II // Cell. 1993. - 73. - P. 533-540.

133. Meyer K.N., Kjeldsen E., Straub T., Knudsen B.R., Hickson I.D., Kikuchi A., Kreipe H., Boege F. Cell cycle-coupled relocation of types I and II topoisomerases and modulation of catalytic enzyme activities // J. Cell. Biol. 1997. - 136.-P. 775-788.

134. Kretzschmar M., Meisterernst M., Roeder R. Identification of human DNA topoisomerase I as a cofactor for activator-dependent transcription by RNA polymerase II // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - 90. - P. 11508-11512.

135. Merino A., Madden K., Lane W., Champoux J. DNA topoisomerase I is involved in both repression and activation of transcription // Nature. 1993. -365. - P. 227-232.

136. Rossi, F., Labourier E., Divita G., Derancourt J., Riou J., Antoine E., Cathala G., Brunei C., Tazi J. Specific phosphorylation of SR proteins by mammalian DNA topoisomerase I // Nature. 1996. - 381. - P. 80-82.

137. Tazi J., Rossi F., Labourier E., Gallouzi I., Brunei C., Antoine E. DNA topoisomerase I: customs officer at the border between DNA and RNA worlds? // J. Mol. Med. 1997. - 75. - P. 786-800.

138. Kimura K., Sajio M. Growth state- and cell cycle-dependent fluctuation in the expression of two forms of DNA- topoisomerase II // J. Biol. Chem. -1994. -269. P. 1173 - 1176.

139. Fukata H., Ohgami K., Fukasawa H. Isolation and characterization of DNA topoisomerase II from cauliflower inflorescences // Plant Mol. Biol. 1986. -6. - P. 137- 144.

140. Xie S., Lam E. Abundance of nuclear DNA topoisomerase II is correlated with proliferation in Arabidopsis thaliana II Nucleic Acids Res. 1994. -22.-P. 5729-5736.

141. Liu L., Wang J. Supercoiling of the DNA template during transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - 84. - P. 7024-1027.

142. Cardellini E., Durban E. Phosphorylation of human topoisomerase I by protein kinase C in vitro and in phorbol 12-myristate 13-acetate-activated

143. HL-60 promyelocytic leukaemia cells // Biochem. J. 1993. - 291. - P. 303-307.

144. Mattern M.R., Mong S., Mong S.M., Bartus J.O., Sarau H.M., Clark M.A., Foley J.J., Crooke S.T. Transient activation of topoisomerase I in leukotriene D4 signal transduction in human cells // Biochem. J. -1990. 265. - P. 101107.

145. Carballo M., Gine R., Santos M., Puigdomenech P. Characterization of topoisomerase I and II activities in nuclear extracts during callogenesis in immature embryos of Zea mays II Plant Mol. Biol. 1991. - 16. - P. 59-70.

146. Chiatante D. and Bryant J.A. Activity of DNA topoisomerase I and quiescence of embryo cells in seeds of Pisum sativum L. // J. Exp. Bot. 1994. -45.-P. 959-965.

147. Scott S., Yoshiko S., Toshikatsu N. Phosphorilation of DNA topoisomerase I is increased during the response of mammalian cells to mitogenec stimuli // Biochem. et Biophys. acta. Mol. Cell. Res. 1994. - 1223. - P. 77 - 83.

148. Hwong C.L., Chen M.S., Hwang J.L. Phorbol ester transiently increases topoisomerase I mRNA levels in human skin fibroblasts // J. Biol. Chem. -1989. 264. - P. 14923-14926.

149. Tse-Dinh Y.C., Wong T.W., Goldberg A.R. Virus- and cell-encoded tyrosine protein kinases inactivate DNA topoisomerases in vitro II Nature. -1984.-312.-P. 785-786.

150. D'Arpa P., Liu L.F. Cell cycle-specific and transcription-related phosphorylation of mammalian topoisomerase I // Exp. Cell. Res. 1995. -217. -P. 125-131.

151. Kordiyak G.J., Jakes S., Ingebritsen T.S., Benbow R.M. Casein kinase II stimulates Xenopus laevis DNA topoisomerase I by physical association // Biochemistry. 1994. - 33. - P. 13484-13491.

152. Park J.K., Kim W., Choi H.S., Han D.M. Inhibition of topoisomerase I by NAD and enhancement of cytotoxicity of MMS by inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase in Saccharomyces cerevisiae II Cell. Mol. Biol. 1991. — 37. - P. 739-744.

153. Bharti A.K., Olson M., Kufe D.W., Rubin E. Identification of a nucleolin binding site in human topoisomerase I // J. Biol. Chem. 1996. - 271. - P. 1993-1997.

154. Gobert C., Bracco L., Rossi F., Olivier M., Tazi J., Lavelle F., Larsen A.K., Riou J.F. Modulation of DNA topoisomerase I activity by p53 // Biochemistry. 1996. - 35. - P. 5778-5786.

155. Murashige T. and Skoog F. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. - 15. - P. 473-497.

156. Konstantinov Yu.M, Lutsenko G.N. and Podsosonny V.A. Inhibition of adenine nucleotide translocation in maize seedling mitochondria by anionic detergents // Physiol. Plant. 1988. - 72. - P. 403-406.

157. Lowry O.H, Rosebrough N.J, Farr A. L, Randall R.J. Protein measurements with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - 193. - P. 265-275.

158. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. -1970. 227. - P.174-182.

159. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Гловера Д. М.: Мир, 1988.- 538 с.

160. Der Garabedian P.A, Mirambeau G, Vermeersch J.J. Mg2+, Asp", and Glu~-effects in the processive and distributive DNA relaxation catalyzed by a eukaryotic topoisomerase // Biochemistry. 1991. - 30. - P. 9940-9947.

161. Froelich-Ammon S.J, Osheroff N. Topoisomerase poisons: harnessing the dark side of enzyme mechanism // J. Biol. Chem. 1995. - 270. - P. 2142921432.

162. Lin J.H, Castora F.J. Response of purified mitochondrial DNA topoisomerase I from bovine liver to camptothecin and m-AMSA // Arch. Biochem. Biophys. 1995. - 324. - P. 293-299.

163. Mortensen U.H, Stevnsner T, Krogh S, Olesen K, Westergaard O, Bonven B.J. Distamycin inhibition of topoisomerase I-DNA interaction: a mechanistic analysis //Nucl. Acid. Res. 1990. - 18. - P. 1983-1989.

164. Glab N, Labidi B, Qin L.X, Trehin C, Bergounioux C, Meijer L. Olomoucine, an inhibitor of the cdc2/cdk2 kinases activity, blocks plant cells at the G1 to S and G2 to M cell cycle transitions // FEBS Lett. 1994.-353. -P. 207-211.

165. Jacobsen H.J. Regulation of ribonucleic metabolism by plant hormones 11 Annu. Rev. Plant Physiol. 1977. - 28. - P. 537-564.

166. Konstantinov Yu., Lutsenko G., Podsosonny V. Genetic functions of isolated maize mitochondria under model changes of redox conditions // Biochem. and Mol. Biol. Int. 1995. - 36. - P. 319 - 326.

167. Sen C.K., Packer L. Antioxidant and redox regulation of gene transcription // FASEB J. 1996. - 10. - P. 709-720.

168. Sun Y., Oberley L.W. Redox regulation of transcriptional activators // Free Radic. Biol. Med. 1996. -21. - P. 335-348.

169. Piette J., Piret B., Bonizzi G., Schoonbroodt S., Merville M.P., Legrand-Poels S., Bours V. Multiple redox regulation in NF-kappaB transcription factor activation // Biol. Chem. 1997. - 378. - P. 1237-1245.

170. Akamatsu Y., Ohno T., Hirota K., Kagoshima H., Yodoi J., Shigesada K. Redox regulation of the DNA binding activity in transcription factor PEBP2 // J. Biol. Chem. 1997. - 272. - P. 14497-14500.

171. Duh J., Zhu H., Shertzer H.G., Nebert D.W., Puga A. The Y-box motif mediates redox-dependent transcriptional activation in mouse cells // J. Biol. Chem. 1995. - 270. - P. 30499-30507.132

172. Arnone M.I., Zannini M., Lauro R. The DNA binding activity and the dimerization ability of the thyroid transcription factor I are redox regulated // J. Biol. Chem. 1995. - 270. - P. 12048-12055.

173. Huang L., Arany Z., Livingston D.M. Activation of hypoxia-inducible transcription factor depends primarily upon redox-sensitive stabilization of its subunit // J. Biol. Chem. 1996. - 271. - P. 32253-32259.

174. Hidalgo E., Leautaud V., Demple B. The redox-regulated SoxR protein acts from a single DNA site as a repressor and an allosteric activator // EMBO J. 1998. - 17. - P. 2629-2636.

175. Martin M.E., Chinenov Yu., Schmidt T.K., Xiu-Ying Y. Redox regulation of GA-binding protein DNA binding activity // J. Biol. Chem. 1996. - 271. -P. 25617-25623.