Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ДНК-топоизомеразы млекопитающих
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "ДНК-топоизомеразы млекопитающих"
АКАДЕМИЯ НАУК СССР
ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОШИ имени В.А.ЭНГЕЯЬГАРДТА
На правах рукописи
ГРОМОВА Ирина Игоревна
УЖ 577.151.042
ДНК-ТОПОИЗОМЕРАШ МЛЕКОПИТАЩК: МНОЖЕСТВЕННЫЕ ФОРШ И САЙТСПЕЦИФИЧНОСТЬ
03.00.03 - молекулщ)ная биология
Автореферат
диссертации на соискание ученой
степени кандшдата биологических наук
1
Москва - 1980
Работа выполнена в Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта АН СССР
Научные руководители: доктор биологических наук кандидат биологических наук
К.А. ШИАНИ И.Б. БРОНШТЕЙН
Официальные оппоненты: доктор биологических наук кандидат химических наук
В.С. МИХАЙЛОВ А.Г. ГАЖБОВ
Ведущая организация: НИИ канцерогенеза ВОНЦ АМН СССР
Защита состоится
на заседании специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта АН СССР по адресу: Москва, 117984, ГСП-1, ул. Вавилова, 32
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта АН СССР.
Автореферат разослан
Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук
пгдед ^Ai гуатность проблемы. Среди задач, стоящих перед современ-^ой^ю^екулярной биологией и биохимией, на первый план выдвигают-
ся проблемы, связанные с расшифровкой механизмов репликации,транскрипции и рекомбинации. Все перечисленные процессы тесно связаны со структурными изменениями в ДНК. Природа таких структурных преобразований, а гai®о механизмы, обусловливающие их, к настоящему времени мало изучены. Старые представления о молекуле ДНК как о линейной структуре со свободными концами оказались неверны. К настоящему времени показано, что ДНК в эукариотическом лире образует сверхспиралыше пег ли, концы которых фиксированы на ядерном матриксе. Очевидно, что' для успешного протекания любого из генетических процессов необходимы топологические преобразования такой замкнутой структуры. В этой связи большой интерес представляет изучение ферментов и белков, изменяющих конформацию ДНК. Особая роль здесь принадлежит ДНК-топоизомеразам - ферментам, катализирующим in vitro различные топологические превращения в ДНК, включая введение и удаление супервитков, завязывание и развязывание _ узлов, а также образование катенанов (сцепленных колец) и их дека-тенизашю. Основываясь на этих свойствах топоизомераз, им отвцдит-оя важная роль в структурных перестройках хроматина, а также в контроле над основными генетическими процессами.
В последние годы был достигнут значительный прогресс в изучении функциональной роли ДНК-топоизомераз, особенно топоизомераз П типа, у прокариот и низших эукариог (дрожжей). Это связано в первую очередь с достаточно широкой возможностью получения мутантов у этих организмов. Исследования функциональней.роли топоизомераз у высших эукариог проводятся в настоящее время преимущественно косвенными методами, значительная часть которых основана на измерении ферментативной активности на разных стадиях клеточного цикла,а также на выявлении определенных участков и последовательностей ДНК in vitro и in vivo, о которыми преимущественно взаимодействуют то-поизомеразн. 5
Цель работы. Целью настоящей работы было изучение множественности топоизомераз in vivo и in vitro, их свйтспепифичности.а так-, se динамики топоизомеразной активности I типа в клеточном цикле.
Научная новизна и практическая ценность работы. Проведенные в настоящей работе исследования охватывают широкий круг вопросов, касающихся овойатв топоизомераз I типа. Подобное исследование позволяет связать в единое целое та ora е, на первый взгляд шло стыкую-
шиеоя ыезду собой проблемы. Нами впервые было проведено изучение динамики топсизомеразной активности в клеточном цикле наряду с количественным и качественным анализом уровня гопоизомеразы I типа in vivo. Иммунохимический подход открывает возможность обнаружения новых молекулярных форм ферментов этого типа и изучение ряда их свойств, главным из которых является взаимодействие с ДНК.Картирование нескольких эукариотичвских генов молекулярными формами топоизомераз I типа, полученными из одного источника, позволило выявить последовательности ДНК, с которыми преимутественно взаимодействуют гопоизомеразы, и соотнести такие участки с известными функционально значимыми последовательностями этих генов.
Использование при картировании каштотецина - модулятора то-поизомеразы I, избирательно действующего на одну из стадий топо-изомеразной реакции, впервые позволило провести дифференциальный „анализ нуклеотидных последовательностей, окрунаюших место разрыва. Было выявлено несколько типов топоизомеразных сайтов: кампго-гецин-зависшые и камптотецин-независимые. Основные различия между этиш группами, ronol сайтов сводятся к изменению интенсивности растепления ДНК в присутствии ингибитора о сохранением нуклеотид-ной специфичности в месте разрыва. Таким образом, было показано, что влияние каштотецина сводится-не только к ингибированию стадии восстановления фосфодиэфирной связи в результате топоизоме-раэной реакции, как это считали ранее, но и к тонкому регулирований всей реакции топоизомеризации, включая выбор ферментом места разрыва, а, возмоено, и места посадки на ДНК.
Интересные перспективы открываются также и в связи с рбнару-яением.в пролиферируюших клетках нескольких балков, содержащих об-пув с топоизомеразой I антигенную детерминанту. Сравнительное изучение структуры этих белков и время их появления в клеточном цикле выходит за рамки данной работы. Однако следует заметить, что проведение такого анализа может решить ряд задач, связанных с регуляцией меточной пролиферации и репликации ДНК.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Апробация диссертации. Материалы диссертации были доложены на международных симпозиумах: "Структура и функция геномгГ; "Мак-ро.лолакулы б функционирующей клетке"; "Структура и функции нукла-ичозых кислот", а тайхе ка научных конференциях -1.15 АН СССР.
0?пуктура и объем работы. Работа состоит га введения, обзора л..-.о(пгурк, bk.i-jtamero 5 разделов, и экспериментальной части, в
которой описаны материалы и методы, результаты собственных исследований автора и их обсуждение. Завершают работу выводи и список цитируемой литературы, включающий 220 наименований. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста и иллюстрирована 4 таблицами и 22 рисунками.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
I. ДШАШКА ТОПОйЗСКЗРАЗНОл АКТИВНОСТИ В КЛЕГОЧНШ ЦИКЛЕ ШШГШ1 МЗТОК ЙШРОЕЛАСТОВ КИТАЙСКОГО ХСЫЯЧКЛ '
Сразу же после открытия ДНК-топоизомераз била высказана идея о значении суперспирализации в контроле репликации ДНК и о возможном участии в этом процессе топоизомераз I и П типов. Изучение функциональной роли топоизомераз у высших эукариот проводятся в настоящее время в основном косвенными методам!. Значительная часть этих методов основана на изменении ферментативной активности на разных стадиях клеточного цикла. Для изучения динамики топоизомераз ной активности I типа в клеточном цикле наш была использована синхронизированная культура клеток фибробластов китайского хогляч-ка, линия 431. Топоизомеразнал активность определялась в частично очищенных ядерных и цитоплазматических экстрактах через определенные промежутки времени после стимуляции клеток к пролиферации.На рис. I видно, что топо I релаксируюшая активность ядерной фракции возрастает и быстро достигает максимума к 10 часам после стимуляции клеток. Таким образ ом, пик топо I релаксируюшей активности примерно на 10 часов опережает массовое вступление клеток в реплика-тивнуга фазу (кривая 3). Активность топо I в клетках на Q-q и Gj фазах примерно в 10 раз выше, чем в поксяшихся клетках.
В цитоплазматической фракции (пост-ядерная фракция) топо I релаксируюшая активность не выявлялась при использовании-в качестве субстрата плазмидной ДНК рВВ322. Однако при замене ДНК рВВ322 на ДНК вируса SV-40 релаксируюшую активность топо I в посг-ядер-ной фракции удалось обнаружить. Динамика изменения топо I активности в цитоплазме совпадала с изменениями, наблюдаемыми в ядерной фракции. Подобное усиление релакоируюией активности с сохранением характера ее изменения набладалось и в ядерных фракциях при использовании в качестве субстрата ДНК вируса SV-40.
По-видимогду, обнаружение топоизомераз ной активности в цитоплазматической фракции является результатом частичного разрушения ядер при гомогенизации. подтверждается визуализацией под ник-
nuclear
s'g,
P ni
O
4
8
16 10 28 32 36 40
hrs after serum addition
Рис.1. Изменение топоизомеразяой активности в клеточном цикле фибробластов китайского хомячка. I. активность топоизо-ыеразы I (% релаксированной ДНК рВВ322) в супернатанте после осаждения полиэтиленглшсолем нуклеиновых кислот и части белков из лизага выделенных ядер. Концентрация белка одинакова во всех фракциях. Реакцию релаксации , проводили в стандартных условиях - 10 мин при 25°0. 2. процент клеток в 3 - 02 фарах клеточного цикла, определенный путем ШФ; 3. активность гопоизомеразы I в циго-плазматяческой фракции, определенная по релаксации ДНК вируса 37-40. По оси абсцисс - время после смены среды с 0,5% ЭТО на среду с 10$ ЭТО. По оси ординат - единицы ферментативной активности, отнесенной к единице белка в исследуемых фракциях.
роскопом в ядерной фракции мембранных и другах элементов, характерных для разрушенных ядер. Разница в уровне топоизомеразной активности, полученная при использовании двух близких по размеру субстратов - рВВ322 и аУ-40, может объясняться разницей в структуре етих ДИК.
Дявзшка изменения топоизомеразной активности в.клеточном цикле гсибробтастов китайского хомячка отранает изменение в активности только тойо I, а не суммарного возрастания ферментативной
активности топоизомераз I и П типов. Нами было показано, что в клеточных экстрактах, полученных тагам способом, топоизомеразная активность П типа не выявляется не только по релаксируюшей.но также и по характерной для топо П декатенирушюй активности с использованием кинетопластной ДНК.
Длл более подробного изучения субстратной специфичности топо-изомеразы I мы сравнивали релаксирутаую активность топо I в частично очишенных препаратах покоящихся фпбробластов китайского хомячка. В качестве субстрата были использованы две различные супер-спирализованнне плаз модные ДИК: рВВ322 и pNV 18 (любезно предоставленные Е.Р. Забаровским), незначительно отличавшиеся по размеру, но с разной, первичной структурой: ДНК плазмиды pHV-78 представляет собой вектор pUR 22?, со вставкой псевдогена o-moe человека, длиной в 840 и.о. (этот фрагмент содержит последовательности ДНК, гомологичные "сильным" сайгам, характерным для топо I, обнаруженным в работе Бина и Шампу).
Сравнение топоизомеразной активности в экстрактах покоящихся клеток с использованием двух субстратов - рВ8322 и pKV 18- показало, что ДНК pNV 18 гак же как и ДНК вируса sv-4-O является более чувствительным субстратом для определения топоизомеразной релакси-руташей активности по сравнению о ДНК рВК322.
Таким образом, нами впервые была показана различная чувствительность эукариотической топоизомеразы I типа по отношению к'ДНК субстрату, т.е. определенная субстратная специфичность топо I. Подобная специфичность может являтьоя характерным признаком эукаряо-тических топоизомераз I типа.
Полученные данные ставят целый рад вопросов. И прежде всего -чем обусловлено возрастание топоизомеразной активности при переходе клеток от покоя к делению. Синтезом ли de novo топо I, как это показано для топоизомеразы II или se регуляцией активности депонированного в клетке фермента. Ответ на этот вопрос можно получить о использованием метода иммунофлворесценгного анализа, позволявкего непосредственно измерять количество и локализацию фермента в клетке, а также методом иммуноблоттинга, который позволяет проследить не только количественное, но и качественное изменение фермента в клетке. Следует отметить, что до настоящего времени остается открытым вопрос о существовании in vivo множественных фор;,! топоизомеразы I, обнаруживаемых in vitro. Для решения поставленных вопросов были получены моноклональные антитела к топоизомеразе I типа.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЪШХ АНТИТЕЛ К Т0П0ИЗШЕРАЗЕ I ИЗ ТИМУСА ТЕЛЕНКА
. Моноклональныв антитела били получены к топоизомвразо I типа, ввделенной из тимуса теленка по стандартной методике. Специфичность полученных ыоноклоналышх антител (AT 155) к топо I определяли как показано на рис. 2. Ферментативный препарат топоизомеразы,включающий пять основных полипептвдов, подвергали электрофорезу в полиак-риламидном геле в денатурирующих условиях, с последующим переносом белков на нитроцеллюлозную мембрану и специфическим окрашиванием их антителами. Взаимодействие AT 155 происходило только с теми полипептидами, для которых была показана топонзомеразпая активность. Белки другого происхождения, в число которых входили маркеры, гис-тоны, а такие некоторые примесные полцпепгиды из ядерного препарата,с AT 155 не взаимодействовали. Не наблкдалось гаклсе взаимодействия AT 155 с ДНК и с препаратами топо 1/55 кДа и топо I/I35 кДа, выделенными из тимуса теленка (см. раздел 4). В то же время антитела другой специфичности (моноАТ к липопротеидам) с топо I не взаимодействовали.
Кроме взаимодействия с топо I из тимуса теленка AT 155 взаимодействуют с топоизомеразой I, ввделенной из эритроцитов цыпленка, а также с топоизомеразой I из плаценты человека. Одной из важных характеристик моноклоналышх антител к топо I является их влияние на ферментативную активность. Нами было показано, что антитела при 5-10-кратном молярном избытке по отношению к ферменту не ин-гибируют реакцию релаксации. То же наблкдалось и при увеличении избытка антител в 50 раз. Так как отсутствие ингибирования может быть связано с недостаточным временем взаимодействия антител с антигеном, был проделан опыт с предварительной инкубацией топоизомеразы I с AT 155 в течение различного времени, после чего проводили измерение ферментативной активности топо I. Показано, что после 10 минут прединкубашш фермента (разведение 1:1000) в отсутствие ангигел происходит частичная инактивация фермента, определяемая по релаксации топо 1/82 кИа плазмвдной Д!К рис 19. Полная инактивация фермента наступает уже после 20 минут прединкубации. В то же время предин-кубация топо I в присутствии AT 155 не только не ингибирует ферментативную активность, но несколько стабилизирует ее даже при малых концентрациях AT 155 (6 мкг/мл). Стабилизирующее воздействие AT 155 на топо I усиливается при соотношении ангигел: фермент (25:1).
По-в;цшмому, стабилизирующий эффект связан со специфическим
97r 68.
2 3 4 5
-
кг КЗ
29_
Рис.2. Электрофорез и иммуноблогтинг гопо I из тимуса теленка. I. Электрофорез белков суммарного ядерного препарата из тимуса теленка. 2. Нитроцеляюлозная мембрана,окрашенная аг.идочерлцм, после переноса на нее суммарного препарата гопо I после Bio-Rex-70. 3. Иммуноблоттинг этого же препарата mono I с антителами к топо I. из тимуса теленка. 4. Фракция топо I, очищенная на Bio-Rex-70 и содержащая только два из пяти полипептвдов: 79 и 82 кЦа (топо 1/82 гДа). Электрофорез в 10% полиакриламидном геле (нигро-целлюлозная мембрана, окрашенная амццочершм). 5. Имму-ноблоттинг фракции гопо 1/82 кДа с антителами к топоизо-меразе I. Маркеры: 97 кДа - фосфорилаза, 68 кЦа - БСА, 29 кДа - карбоангддраза.
взаимодействием антиген-антитело, т.к. при проведении предшпсуба-ции топо I о БСА, взятым в тех же концентрациях, что и антитела стабилизирующего эффекта при малых концентрациях БСА не наблюдалось. Полученные данные об отсутствии ингибируюшего воздействия AT 155 на топо I дополняются экспериментами по влиянию AT 155 на ДНК-расшепляюшую активность.Фраллеят е6А-глобинового гена размером 340 п. о. одинаково хорошо расщеплялся под действием топо I как. в присутствии, гак и в отоутствие моноклоналышх антител.
Сохранение ферментативной активности топо I в присутствии
AT 155, по-видимому, объясняется пространственной разобщенностью антигенной детерминанты и активного центра ферлента.
Наличие моноклональных антител к топоизомеразе I позволяет, используя иммунохнмический подход, хотя бы частично ответить на вопрос о причине увеличения гопоизомеразной активности I типа,наблюдаемой при стимуляции фибробластов китайского хомячка к делению.
3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИЗСЖШ1Е Т0П0ИЗШЕРАЗЫ I ТИПА В КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ ФИБРОБЛАСТОВ КИТАЙСКОГО ХШЯЧКА
На культуре клеток фибробластов китайского хомячка нами было показано увеличение активности топоизомеразы I типа при стимуляции клеток к пролиферации. Используя моноклональные антитела к топо--изомеразе I, нагл удалось показать методом иммуноблотгинга количественное и качественное изменение спектра белков, обладающих обшей адгигенноЗ детерминантой к топо J, на разных стадиях клеточного цикла фибробластов китайского хомячка (рис. 3).
На рис. 3 показана электрофореграмгла белков из покоящихся и делящихся клеток. На электрофореграмме не видно количественных или качественных различий ыевду двумя типами клеток. В белковал препарате из покоящихся клеток с AT'155 взаимодействуют преимущественно два полипептида рЮО и р97 кДа. На соседней дорожке среди белков, выделенных из клеток, находившихся в s-фазе, окрашивается 10 полос. Так как неопецифичность взаимодействия исключается (отсутствие окраски маркерных белков и большинства других белков клеточного экстракта); это означает, что 8 полипептидов клеточного экстракта из пролиферируюших клеток обладают общей с топоизомеразой I антигенной детерминантой. В делящихся клетках существенно увеличивается количество топо I, представленной полипептидом с молекулярной массой 72 кДа, что объясняет полученные наш ранее данные об увеличении топо I активности при переходе клеток к пролиферации.Данная работа является первым экспериментальны.! подтверждением предположения об увеличении количества топонзомеразы I при подготовке клеток к S-фазе.
Таким образоы, благодаря иммунохимическому подходу, в проллфе-рирушеи культуре клеток фибробластов китайского хомячка, пошило увеличения количества тоиоизоцеразы I, in vivo удалось обнаружить 8 специфических г.оллпептццов с молекулярной массой от 72 кДа до 15 хДа (рис. 3), имеющих сбпую антигенную детерминанту с топоизомеразой I типа. Происхождение белков с обпей детерминантой сбъяс-
63
'I
—ч
.....i
■fcf'
97
68
29
Гл*
4Z i
а p
M К Q P
Рио.З. Ишуноблотгинг белков из покоящихся и делящихся фиброблас-тов китайского хомячка. Электрофорез белков из покоящихся и делящихся фибробластов китайского хомячка проводили в 10$ полиакриламядном геле в присутствии ДСН; На каждую ячейку наносили одинаковое количество белка. А, Нитроцел-лгаозная мембрана, окрашенная амвдочерным, после переноса на нее белков. В. Иммуноблоттинг белков с антителами к гопо I (AT 155). Q - белки из покоящихся клеток; Р - белки из пролиферируших клеток*, К - очищенный препарат топо I из тимуса теленка; M - маркеры: 97 кДа - фосфорилаза, 68 кЦа - БСА; 29 кДа - карбоангвдраза.
няетоя, по-видимому, активным метаболизмом топо I в делящихся клетках, но это не исключает, однако, самостоятельной рола этих белков, которые могут и не обладать топоизомеразной активностью.
Для дальнейшего доследования набора этих белков необходимо получение и очистка каждого белка• определенной молекулярной массы.
Однако из культуры клеток не представляется возможным в настоящее время получить достаточное количество различных молекулярных форы топо I, обнаруживаемых in vivo.
Поэтому для выделения молекулярных форм топо I и проведения их сравнительной характеристики нами была выбрана ткань тимуса га-ленка Г из которой можно получить значительные количества топоизо-меразы I типа, представленной целым рздогд молекулярных форм.
4. ВЩЩЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОРМ ТШОИЗШЕРАЗЫ I ТИПА ИЗ ТШУСА ТЕЛЕНКА
Наделение топоизомеразы проводили по методу Шмитта и соавт. с нашей модификацией, позволяющей получать не один, a Tpi препарата топоизомеразы, отличающиеся друг от друга по молекулярным весам. Следуя оригинальному методу вадеяешш Шлгга и соавг., монно лолучигь препарат, включающий пять полипептидов о молекулярной массой от 70 кДа до 100 кДа (см. рис. 2). По размеру преобладающего в этом препарате полипептида он был'назван топо 1/82 кДа. Входящие в состав этого препарата долипептиды незначительно отличаются по своему орсяству к В1о-йех-70. Поэтому уменьшая объем собираемых фракций, элюируемых с колонки линейным градиентом, можно получить препарат топо I, состоящий преимущественно из двух полипептидов с молекулярными массами 75 и 82 кДа (см. рис. 2). Такой препарат топо 1/82 кДа и был использован наш в дальнейших экспериментах. Паш было показано, что все пять полипептвдов из суммарного препарата топо 1/82 кДа взаимодействуют с моноклональными антителами, полученными против топо 1/82 кДа (рис. 2). То есть все семейство полипептвдов с молекулярной массой от 70 до 100 кДа ше-нт по крайней мере одна обший эпитоп. Кроме того, ранее было показано, что .каждый из пяти полипептэдов топо 1/82 кДа обладает ДНК релаксируюаей активностью.
Второй препарат гопоизомзразц, полученный нами, был обозначен топо 1/55 к2а. Этот препарат элшровался с Bio-Rex-70 при более высокой ионной силе, чем любая молекулярная форма семейства топо I/ 82 кДа. Белковая фракция, обладающая ферментативной активностью,состояла цз двух полипептвдов с молекулярными массаш 55 и 57 кДа. Иммуноблотгингом было показано, что топо 1/55 кДа (оба полипептида, входящие в этот препарат) не взаимодействует с моноклональны-ми ангнтелагш, получешшш к топо 1/82 кДа. Этим же методом было показано, что топо 1/55 кДа на содеркпг примесей ни одного из по-
липептидов топо 1/82 кДа.
Третий гопоизомеразный препарат, полученный нами, был обозначен топо Г/135 кДа,- Препарат, обладающий тоползомеразной активностью п обо гашенный этим белком, отделялся еще на стадии хроматографии на гепарин-сефарозе, предшествующей хроматографии на Bio-Rex-70. Tono I/I35 кДа элюировалась с колонки о гепарин-с ефарозой в виде отдельного пика активности при более низкой ионной силе,чем топо 1/82 кДа и топо 1/55 кДа фракции. Активная ферментативная фракция состояла из двух основных полипептидов о молекулярными массами 135 я 145 кДа. Гак же как и в случае топо 1/55 кДа был проведен анализ на присутствие какого-либо полипепглда из препарата топо 1/82 кДа в препарате топо I/I35 кДа. Методом имчуноблот-тинга было показано, что препарат топо I/I35 кДа не содержит ни одного из пятя поляпептидоз топо 1/82 кДа и не взаимодойствуёт с антителами к топо 1/82 кДа.
Двумерный анализ пептидов р135 и р145 выявил различия в их пептидных каргах. В то же время пептидная карга р135 имеет ряд общих черт о прогволигическиш аубфратептат известных топоизоме-раз - таких как топо 1/82 кДа из тимуса теленка, толо 1/97 кДа из эритроцитов цыпленка.
Можно было бы предположить, что топо I/I35 кДа является высокомолекулярным предшественником топо 1/82 кДа п топо 1/55 кДа. Однако в этом случае топо I/I35 кДа должна была бы содержать детерминанту, общую для всех размерных форм топо 1/82 кДа. Мезду тем выявить обшй эпитоп у топо 1/82 кДа и топо I/I35 кДа методом аи-муноблотмшга не удалось.
Таким образом, мы получили три препарата топо I из тимуса теленка, которые отличаются по своему молекулярному весу, аффинности к раз личным сорбентам. Все три препарата топоизомеразы I типа из тимуса теленка обладали одинаковой удельной ДНК релаксирующей активностью. Поэтому для проведения сравнительной характеристики молекулярных форм топоиздаеразы I мы последовали другую'характерную для топомераз активность - ДНК-расшепляюиую. Изучение продуктов реакции расщепления под действием топоизомеразы представляет значительный интерес, так как позволяет определить последовательности ДНК, преимущественно расщепляемые топотаомеразой I типа.
Однако прежде чем приступить к сравнительной характеристике ДНК-расшепляюшей активности молекулярпнх форм топо I, необходимо было подобрать оптимальные условия для проведения реакции расщеп-
дения. Эта задача была выполнена о использованием основного препарата sono I, получаемого пря выделении фермента из тимуса теленка (топо 1/82 кДа).
5. ШРдаШШЕ ШТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ДЛЯ КАРТИРОЩНШ ЭУКАРЛОТИЧВСКИХ ГЕНОВ ÏOHO I
Как ука говорилось вше, для успешного проведения картирования генов топо I необходимо найти оптимальные условия проведения реакции растепления, В качестве оубстрага наш быж использована ДНК клонированного прогоонкогена На-raa. Наш была показана зависимость образования прочного ДНК-гопо I кшплекса, оса-здаемого додецил-сульфатом калия, от рН. Оптимальные значения рН для образования ДНК-топо 1/82 кДа комплекса лежат в интервале значений рН-7,0-8,0. В то ко время другая молекулярная форма топо I, выделенная из тимуса теленка - топо 1/1Э5.кДа, преимущественно образует ковалонткые ДНК-белковые комплексы при значениях *рН, лежащих в более кислой области. Такке было показано, что характер и степень расщепления клонированного гена Ка-гав топо 1/82 кДа практически на зависит от времени проведения реакции. Начиная о минимального времена проведения реакции растепления не наблвдаегся изменения интенсивности и характера распределения образуемых фрагментов.Зависимость реакции растепления от ионной силы была изучена с использованием клонированного гена вйА-глобина кур (см.раздел ?).
Таким образом, можно заключить, что способность гопоизшеразы I образовывать прочный расщепляемый комплекс с ДНК зависит в основном от рН и ионной силы и практически не зависит от времени проведения реакции.
6. ВЛИЯНИЕ ШПТОТЩШ1А НА да-РШКСИРУЩУЮ И ДКК-РАСЩЭДЛЯЩГО АКТИВНОСТЬ ТОПШЗСМЕРАЗЫ I ИЗ ШУСА ТЕЛЕНКА
В настоящее время камптотецин - специфический модулятор эука-рцотаческгос топонзокераз I типа - используется для детального ио-оледованая локализации топо I in situ. Однако для дальнейшего ио-, пользования каштогецана при изучении специфичности топоизомераз 3 типа необходимо иметь уверенность, что действие этого ингибитора ограничивается блокированием второго этапа гопоизомеразного цикла разрыва-замыкания.
Изучение воздействия камптотецина на расщепляющую активность
проводили с использованием линейной двухцепочечной ДНК двух клонированных генов человека: гена На-гаа и гена р-53.
На рис. 4 показано расщепление кодирующей цепи гена На-гав длиной 6450 нуклеотидов. Несмотря на большой молярный избыток фермента и низкую ионную силу (40-50 ьй), которая способствует снижению константы диссоциации комплекса фермента и ДНК, часть молекул остается нерастеплашой. Тем не менее образующиеся в результат е расщепления фрагменты ДЕК образуют видимые полосы на радиоавтографе (рис'. 4). Расщепление этого фрагмента тем не препаратом гопо I в присутствии ухе 10 ми'Л камптотецина приводит к полному исчезновению целого фрагмента и большей части высокомолекулярных фрагментов. Преобладавшими после такого расщепления остаются фрагменты длиной 1100, 750 и 450 нуклеотидов. Действие камптотецина начинает проявляться уже при концентрации менее I мкМ, а затем с увеличением концентрации усиливается и выходит на плато при 50 мкМ. Даже в условиях электрофореза в агарозном геле можно ввдеть, что "в присутствии камптотецина цроисходит незначительное изменение злектрофоретической подвинностн фрагментов и появление новых фрагментов, например, фрагментов размером 1900 и 1000 нуклеотидов.
Проведение реакции без камптотецина обнаруживает только наиболее сильные сайты, находящиеся лишь в диотальной части меченого по одному концу фрагмента ДНК. Увеличение числа разрывов в присутствии камптотецина приводит к накоплению более низкомолекуллрных фрагментов и таким образом облегчает локализацию сайтов, находящихся вблизи меченого конца ДНК.
Установление размера фрагментов, разделенных в агарозном геле, в денатурирующих условиях с применением реотриктазных маркеров, дает в среднем разрешение не более ±50 нуклеотидов для фрагментов 1000-2000 нуклеотидов и ±20 для фрагментов 300-500 нуклеотидов. Но дане в условиях такого грубого разрешения мояно наблюдать изменения в спектре образующихся фрагментов вследствие действия камптотецина. Прежде всего это относится к появлению дополнительных полос. Одна из таких полос, соответствующая фрагменту размером 1900 нуклеотидов, появляется при расщеплении гена На-гав и располагается меаду фрагментами 1950 и 1450 нуклеотидов (рис.4). Появление этой, а тагасе других дополнительных полос не является артефактом, я это подтверждается разделением фрагментов в секве-нируюием геле, позволяющем с точностью до одного нуклеотцда опре-
I 2 3 4,5 6
— 6440
• 1950 ¡"1450 ; j-if oo
1 750 I 450
Рио.4. Влияние камптотецина на ДНК-расшепляюшую активность топо-изомеразы I. Раошелление кодирующей цепи ДНК гена Ha-ras гопо 1/82 кДа. I. ДНК без обработки топо I. 2. ДНК + го-по I без каштотецина. 3-6. ДНК + топо I/ + камлтотецин: 1,5,10,50 мкМ соответственно. Цифрами справа указаны положения маркеров (<Х< + pstl).
j Sac i Xb.il sac i ¡
......i - * + ____n !
; ........!
400bp
Рио.5, Схема расщепления гена Ha-гав топоизомеразой I. Стрелками указаны места разрывов. Черные прямоугольники - транслируемая часть экзонов. Треугольниками обозначены места инициации и терминации транскрипции, Незаштрихованный прямоугольник - зона повторяющихся последовательностей.
делить место разрыва.
На рис. 5 показана охема гена Ha-ras с нанесенными на нее местами разрывов под действием гопо 1/82 кДа. Как ввдно из схемы» ".оильные сайты" растепления находятся вблизи учаотков инициации и
терминации транскрипции, а также в области 4700-5600-го нуклвоти-дов, где располагается вариабельная область гена, содержащая прямые повторы. Так яе как и в случае Л А-глобинового гена (см.раз-дел 7) сильные топоизомеразные сайты локализованы на границе инт-рон-экзон и внутри интронов.
Таким образ<чл, картирование гена На-raa человека in vitro топо I позволяло обнаружить участки, содержащие последовательности, преимущественно расщепляемые топоизомеразой I.
Для изучения точной локализации толоизомерззных сайтов на нук-леотщишл уровне, а также влияния камптотецина на специфичность топо I выбранные фрагменты ДНК обрабатывали топоизомеразой I как в отсутствие, так и в присутствии каштотецина.
Установление локализация разрывов на нуклеотидном уровне на двух участках гена На-raa и участке гена р-53 человека показало, что в присутствии камптотецина наблвдается изменение сайтспецифич-ности расщепления ДНК топоизомеразой I, что подтверждает наблвде-ния, сделанные при анализе продуктов расщепления топоизомеразной реакции в агарозном геле (pjc. 4). Первое, что мсжно увидеть поо-ле расщепления на секвенируюшем гела (рис. 6), - это так называемое "усиление" интенсивности расщепления. Степень усиления может изменяться в широких пределах. Например, в положениях 306, 522 (рис. 6) и в пояснении 331 на рис. 7. Такие сайты были обозначены наш как "камптотешш-зависимые". К камптотецин-зависимым относятся также сайты, которые выявляются только в присутствии камптотецина. На рис, 7 таковыми являются разрывы, образующие фрагменты длиной 352 и 331 нуклеотидов. Можно видеть, что в отсутствие камптотецина топо 1/82 кДа не образовывала измеримого количества таких фрагментов. На ряс. 6 "скрыты®" являются сайты, в которых фермент производит разрывы в положениях 319 и 504. В то же время на рис.? можно увидеть сайты, не изменявшиеся в присутствии камптотецина ("камптогецин-независише"), например, сайт, разрыв в котором происходит в положении 426. На рис. 6 такие сайты представлены в положениях НО, 208, 258, 312, 516.
Довольно редко встречается тип сайтов, обозначенный наг,а как "неоднозначные", который характеризуется гам, что в таком участке ДНК фермент Moser произвести разрыв меяду любыми двумя аз грех (иногда более) соседних нуклеогддшх остатков, образуя набор фрагментов, различающихся по длина на один нуклеогдд. Таковы, например, разрывы в зоне 366 нуклеотида на гзне ,На-гав {рис.?)и разрыв в поло-
Hind III
168 ------~
110
86
Д7 54
S
ST - г
«
0
\
в i 67 891
»• <
Z шЛ
- -.5 208м—
213—-
Í-».
222»~v
•з»
\
£J
.. » <
Г" к i
253"— "''4 256——g g
r- g i
§
V
1. äi * С
л
279 — 290- *
|8б 312 —
319 . 321W» 324 • '
1011« с
1?1 W!
-и
£1 Б f?
и
- a
434ь 437»
44f
456»-—* "
- r S
472.
£ 6
492ма~о'Г jj
« s
504 « ~ ¿
- В
509 — « г
512 - Ь & 516i"i» ■ g
522 ч»- ff
2 i
Рис.6. Локализация одноцепочечннх разрывов в фрагменте гена р-53. А. схема плазмиды рОБН. В. электрофорез продуктов гоцоизо-меразного расщепления ДНК р-53 в секвенирующем геле. I.кодирующая цепь фрагмента Hindin - Bon I (340 п.о.) + топо1/ 82 кДа. 2, то se + топо 1/82 кДа + камптотецин. 3. то же + топо 1/55 кДа. 4. го же + топо 1/55 кДа + камптотецин. 5.то же + топо I/I35 кДа + каштотеция. 6. некодируюшая цепь фрашента Hindin - Bon I (340 п.о.) + гопо 1/82 кДа. 7. то же + гопо 1/82 кКа + камптотецин. 8. то яе + топо 1/55 кДа+ + камптотецин. 9. то же + топо 1Д35 кДа + камптотецин. 10. некодируюшая цепь фрагмента Bon I - Hindin (180 п.о.)+ + гопо 1-82 кЛа. II. то же + гопо 1/62 кДа + камптотецин. 12. то же + топо 1/55 кДа. 13. го ке + топо 1/55 кДа + камптотецин. 14. то же + гопо I/I35 кДа + камптотецин. С,С - соответствующие фрагменты ДНК р-53, расшепленше йо Ыаксаму-Гилбергу (контрольные дорожки). Цифрами указаны номера нук-леогидов.Концентрация камптотецина 25 мнМ.Отсчет нуклеоти-дов идет от Hindin сайта на 5*-конце.
А дВ "
GG5C1 2
t «._ 454
»4 - х , *
BamHLXhol !« <
¿SacI »» t r-l—1
Kl :
ni. •а .367
366
ni га " _ V363
* « ♦ 352
ФЛ -л и —I 331
5:1 а — 315
5а. JË --311
Saci BamHI
Рис.7. Локализация одноцепочечных разрывов в кодирующей цепи фрагмента ХЬо! - хъа! гена Ка-гав. А. Схема плазмиды рУР, В. Электрофорез продуктов расщепления топо 1/82 кДа в лолиакр:ма;.ьчдном геле. Ог,С+А,С+Т,Т - фрагмент хьо1 _ хьа1 (1700 п.о.).расщепланный по Ыаксаму-Гилбер-ту. I. - хъа1 - фратазнт+топо 1/62 хЛа. 2. то хе + 25 мк.1 кампгогецнна.
яешш 253 на рио. 6. Вероятность разрывов между одним из нуклео-гидов в соседних положениях может быть равно;', но чаше преобладает один из возможных вариантов, как в указанных случаях. Кампто-гецин влияет на положение преобладающего разрыва: в данном случае он снимает "неоднозначность" сайта, способствуя взаимодействию фермента с одним из двух, узнаваемых в отсутствие камптотецина, соседних остатков.
В табл. I представлены данные об относительной встречаемости каждого из четырех нуклеотидов в кампготешш-заЕИсимых и камп-тогецин-независимых сайгах в 5 - и 3 -областях относительно места разрыва.
Таблица I
ОТНОСИТЕЛЬНОЕ РАСПРЕДЕШИЕ НУКШЛЭДОВ В МЕСТАХ РАЗРЫВОВ,ВНОСИМЫХ ТОПО 1/82 кДа ВО ФРА1МЫГГ ГЕНА р-53
А. Кампгогецин-зависимые сайты
-6 -5 -4 -3 -2 +1 +2 +3 +4 +5
А 18 32 18 27 32 13 9 - 14 14 23
Т 18 18 23 18 36 50 45 13 37 18 18
С* 23 27 41 36 23 27 27 73 32 41 27
С 41 23 18 19 9 10 19 14 27 27 32
Б. Камптотецин-нззавиоимые сайги
-6 -5 -4 -3 ¿г -I +1 +2 . +4 +5
А 20 27 47 53 28 13 13 20 40
Т 20 33 20 13 13 94 47 27 27 20 20
40 33 20 27 27 6 27 53 40 40 27
С 20 7 13 7 32 - 13 20 20 20 13
В таблице указана относительная частота каждого из четырех нуклео-тидных остатков относительно точки разрыва под действием топо I/ 82 кДа, выраженное в цроценгах. В габл. А проанализировано 22 сайга, выявленных во фрагменте гена р 53 под действием топо I. В табл. Б проанализировано 17 топо I сайтов, выявленных во фрагменте гена р-53. Цифрами указано положение нуклеотидных остатков относительно точки разрыва. Раошеплениз полинуклеогвдной цепи ДНК происходит меяду +1 и -I нуклеотидами.
7. СРАВНИТЕЛЬНОЕ КАРТИРОВАНИЕ ^-ГЛОШНОВОГО СТА КУР ТРЕЛЯ ФОНДАМИ ТОПО I РАЗЛИЧНЫХ МОЛЖУЛЯРНЫХ МАСС ИЗ ТИМУСА ТЕЛЕНКА
Наш было проведено расщепление двух цёпей гена о!/А-глобина тремя препаратами топоизомераз. Сравнение спектра фрагментов, образующихся при расщеплении «И-глобинового гена разными формами топо I, показывает, что топо 1/55 кДа и топо 1/82 кДа расщепляет о4А-глобиновый ген в одинаковых местах. Все различия сводятся,главным образом, к соотношению количества разных фрагментов. Особенно хорошо это выражено в случае расщепления некодируюшей цепи jh-глобинового гена. Расщепление <£А-глобинового гена топо I/I35 кДа удается достичь лишь в присутствии камптотецина. В этих условиях образуется характерный спектр фрагментов, сходный с распределением, полученным под действием топо 1/55 кДа и топо 1/82 кДа. Зави-, симость реакции расшеплачия топо I/I35 кДа от камптотецина свидетельствует, что данный препарат действительно обладает ДНК-расшеп-ляюшей топо I активностью.
В присутствии камптотецина все три препарата топо I из тимуса теленка расщепляют «¿А-глобяновый ген примерно в одинаковых местах, хотя некоторые участки ДНК расщепляются только под действием топо 1/55 кДа и топо 1/82 кДа, но не топо I/I35 вДа.
На рис. 8 показана карга ^^-глобинового гена с обозначением мест, где происходит расщепление ДНК под действием гопоиэомера-зы I. Наиболее сильные сайты сосредоточены в транскрибируемой области гена, что особенно ярко выражено в случае топо I/I35 кДа. С уменьшением размера фрагмента избирательность растепления ДНК под действием топо I падает.
Определенную закономерность моано проследить и в распределении сайтов мекду экзснами и нитронами. Большая часть сильных сайтов оказывается либо в интронах, либо в пограничной с широкой части экзона, что совпадает с результатом, полученным при картировавши протоонхогена Ha-ras.
Вторым существенным отличием препарата топо I/I35 кДа от топо 1/55 кДа и топо 1/82 кДа, выявленным таким методом, является более высокая устойчивость комплекса ДНК-топо I/I35 кДэ к повыше- . нию ионной силы при проведении реакции расщепления» Увеличение ионной силы от 50 ¡Ü до 150 ц',1 i.'aci приЕодлг к значительному уменьшении количества зафиксированных разрывов з ДНК, вызываете топо, I/ 55 кДа и топо 1/82 кДа. В то не время количество разрывов, вознл-
ACGACTGTTCTTGTTGCAGTTC С CGTAGAA
А А AAA А
82 к D Г
~ГТТ"
-JjJ-lp..^
135 kD Щ-—4xkjgW^j
I'll 1
Рио.8. Схема растепления ^-глоОиноеого гена тремя молекулярными формами топо I. I. Растепление топо 1/55 кДа. 2. топо 1/82 кДа. 3. топо I/I35 кДа. Стрелкагли указаны места разрывов. Длша стрелок пропорциональна силе сайтов. Черные прямоугольники - транслируемая часть экзонов. Под одним из сильных сайтов (на границе первого экзона) выне-. сена нуклеотидная последовательность с указанием мест расшепления топо I,
каюших в ДНК под действием топо I/I35 кДа, практически не изменяется при повышении ионной силы от 50 t.í.I до 150 t.ivl HaCl,
Для определения нуклеотвдных последовательностей, преимуществ венно расщепляемых топо 1,мы исследовали некоторые сайты расшепления в секвенируюием геле. Было показано, что некоторые из сильных сайтов (см. рис. 8), обнаруженные на низком уровне разрешения ■ (при изучении продуктов реакции расшепления методом щелочного ага-розного электрофореза),при анализе па нуклеотидном уровне представляют собой кластер близкорасположенных сайтов. Вероятность расшепления цепи ДНК в любом из сайтов внутри кластера одинакова.
В соответствии с данными, полученными на низком уровне разрешения, было показано, что топо 1/55 кДа и топо 1/82 кДа расщепляют
ДНК в одинаковых нуклеогидных последовательностях. В то же время топо 1/135 кДа расшепляет цепь ДНК не во всех местах, характерных для топо 1/55 кДа я топо 1/82 кДа.
Анализ на нуклеогидном уровне-показал, что 340 нунлеогидный фрагмент «бА-глобинового гена, включающий первый экзон и 5* фланкирующую область, содержит 17 сайтов растепления. Нуклеогддные последовательности, расположенные в 5 - и 3 -областях ог меота разрыва, носят выровденный характер. В табл. 2 представлена вероятность обнаружения каждого из четырех нунлеотидных остатков в различных положениях относительно места разрыва. Анализу подвергалась кодирующая (нижняя) цепь 340 п.н. фрагмента.Из полученных данных можно заключить, что все изучаемые наш формы топо I обычно расщепляют ДНК между двумя Т, окруженными короткими С-О богатыми участками.
Таблица 2
ОТНОСЙТЕЯШОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ НУЮТЕОЩЦОВ В МЕСТАХ РАЗРЫВОВ об^-ГЛОБШОВОГО ГША,ВНОСИМЫХ ТСШШАЕРАЗОЙ I
-7 - 35 24 41
-6 18 18 47 17
-5 18 29 18 35
-4 18 35 12 35
-3 — 18 60 22
-2 23 35 та 12
-I 6 65 - 29
+1 23 23 53 -
+2 6 30 41 23
43. 18 23 6 53
+4 II • 24 18 47
+5 5 47 30 18
В таблице указана встречаемость каадого из четырех нуклеотвдных остатков,относительно точки разрыва под действием топо 1/82 кДа, выраженная в %. Проанализировано 17 гопоазомеразннх сайтов, обнаруженных в 340 нуклеогидном фрагменте А-глобинового гена кур.' Цифрами указано полокение нуклеотэдных остатков относительно точки разрыва. Растепление полинуклеотидной цепи ДНК происходит мевду +1 и -I нуклеотдцама. '
Результаты картирования J> А-глобинового гена топоизомераза-ми I типа из тимуса теленка подтверждают результаты, полученные на других генах, о неслучайном распределении мест разрывов по цепи ДНК. Однако в случае А-глобинового гена, так же как и при картировании генов Ha-ras и р-53 человека (см. раздел 6), гонов теплового шока дрозофилы и ДНК вируса SV-40, полученные сайты растепления отличаются от согласованной последовательности, найденной Веотергаардом. Исходя из всех имеющихся данных, можно предположить, что описанная Веотергаардом последовательность в других генах встречается крайне редко.
ВЫВОДЫ
1. Показана зависимость изменения топоизомеразной активности от пролиферативного статуса клеток. Максимальный уровень активности достигается во время, предшествующее вступлению клеток в s-фазу.
2, Впервые методом иммуноблоттинга о моноклональными антителами к топо I показано существование нескольких форм гопоизомеразы I in vivo и количественные изменения в соотношении этих форм в клеточном цикле.
3, Выделено несколько форм гопоизомеразы I типа из тимуса теленка, различавшихся по молекулярной массе, аффинности к используемым при очистке фермента катионообыеннакам, ДНК-раотепляюшей активности, а также по влиянию ионной силы на образование кова-ленгного ДНК-ферментного комплекса.
4. Осуществлено картирование нескольких эукарногических генов, гена На-гав человека, гена р-53 человека и J*^-глобинового гена кур, различными формами гопоизомеразы I из тимуса теленка. Показана зависимость расщепления генов от молекулярной маосы иопользуе-ного препарата гопоизомеразы I. Определены нуклеогидные последовательности в местах расщепления.
5.,Впервые показано влияние камптотецина на изменение сайг-опецафичносги гопоизомеразы I. Обнаружены каштотецин-зависимые и кампгогецин-независимые топоизомеразнне сайты.
6. Впервые охарактеризованы моноклональные антитела к топо-изомеразе I из тимуса теленка. Показана их ввдоспецафичность и влияние на ДНК-расшепляшую я ДЯК-релаксируюшую активность гопо I.
Основные результаты диссертации изложены в работах:
1. Терских В.В., Бронштейн И.Б., Громова И.И., Тимофеев A.B., Кафиани К.А. ДНК-топоизомеразы пролиферируших животных клеток. - Биополимеры и клетка, 1985, т. I, с. 32-40.
2. Кафиани К.А., Бронштейн И.Б., Громова И.И., Иахбазян Г.К., Тимофеев A.B., Терских В.В. ДЩ-топоизрмеразы животных клеток. - Молекулярная биология, 1985,..т.-Г9, с. 438-449».
3. Kafiani С.А., Bronetein I.B. , Timofeev A.V., Gromova X.I.and , Tarskikh V.V. DNA-topoisomerasea and. regulation of, cell.proliferation. - Advances in enzyme-regulation, 1986, v.25,p.439-457.
4. Громова H.H., Бронштейн И.Б.,.Кафиани К.А., Прасолов B.C. • Специфическое растепление онкогена■Ha-ras топоизомеразой I. - Докл. АН СССР, 1907, т. 294,. tó 4, е.- 995-997.
5. Громова И.И., Бронштейн И.Б., Тимофеев A.B., Разин C.B., Калавдадзе А.Г., Кафиани К.А., Специфическое расщепление ¿¿А-глобинового гена изоформами ДНК-гопоизомераз I типа из тимуса теленка. - в печати: "Биохимия".
6. Бронштейн И.Б., Громова Й.И., Бухман В,Л., Кафиани К.А. Влияние камптотецина на ДНК-релаксарутацую и ДНК-расшепляю-щую активность топоизомеразы I из тимуса теленка. - в печати: "Молекулярная биология".
7. Bronstein I.B., Grc¡mova I.I., Kafiani O.A., Prasolcv V.3. Sceoifio cleavage of Ha-ras oncogene with topoiacmeraae I. 1B-tb PEBS Meeting, 1987, p. 158.
- Громова, Ирина Игоревна
- кандидата биологических наук
- Москва, 1988
- ВАК 03.00.03
- Подвижность разорванных концов протоонкогенов в условиях ингибирования ДНК топоизомеразы II
- Характеристика доменного уровня организации эукариотического генома
- Топоизомераза II и ее участие в незаконной рекомбинации
- Сравнительные характеристики ДНК-топоизомераз I типа из ESCHERICHIA COLI хлоропластов гороха
- Экспериментальное и клиническое обоснование применения ципрофлоксацина при лечении сальмонеллеза и колибактериоза свиней