Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Подвижность разорванных концов протоонкогенов в условиях ингибирования ДНК топоизомеразы II

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Подвижность разорванных концов протоонкогенов в условиях ингибирования ДНК топоизомеразы II"

На правах рукописи

ГЛУХОВ Сергей Игоревич

ПОДВИЖНОСТЬ РАЗОРВАННЫХ КОНЦОВ ПРОТООНКОГЕНОВ В УСЛОВИЯХ ИНГИБИРОВАНИЯ ДНК ТОПОИЗОМЕРАЗЫ II

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 ДЕК 2013

005543347

Москва-2013

005543347

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» и в лаборатории структурно-функциональной организации хромосом Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена РАН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор

Разин Сергей Владимирович

кандидат биологических наук

Рубцов Михаил Александрович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Николаев Лев Григорьевич, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук, лаборатория структуры и функций генов человека, старший научный сотрудник

Кибанов Михаил Викторович, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, лаборатория биохимической генетики животных, младший научный сотрудник

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Защита диссертации состоится 20 декабря 2013 года в _ на заседании диссертационного

совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, стр. 12, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций)

Автореферат разослан "_" ноября_ 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного I

кандидат биологических наук [у^^лс*^, _—^—¡^л. И.А.Крашенинников

диссертационного совета, Л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Борьба с онкологическими заболеваниями представляет одну из наиболее важных задач современной медицины. Высокоэффективными химиотерапевтическими агентами, используемыми для борьбы с широким спектром онкологических заболеваний, являются яды ДНК топоизомеразы II (Nitiss J.L., 2009, Pommeir Y., et al., 2010).

Фермент ДНК топоизомераза II у высших эукариот отвечает за разделение дочерних молекул ДНК в процессе репликации, а также за снятие позитивной суперспирализации ДНК. В процессе работы фермент связывается с молекулой ДНК, вносит двунитевой разрыв, осуществляет транспорт другого участка ДНК через разрыв и затем восстанавливает целостность разрезанной молекулы (Nitiss J.L., 2009). Известно, что накопление двунитевых разрывов ДНК в клетке в конечном итоге приводит к ее гибели. Яды ДНК топоизомеразы II препятствуют религированию двунитевых разрывов, либо способствуют внесению новых разрывов ДНК топоизомеразой II. Высокая токсичность таких веществ по отношению к раковым клеткам основана на свойстве этих клеток активно делиться, что невозможно без высокого уровня репликативной активности и работы ДНК топоизомеразы II.

Несмотря на высокую эффективность ядов ДНК топоизомеразы II в качестве агентов, подавляющих рост опухолевых клеток, применение этих веществ может приводить к развитию так называемых вторичных онкологических заболеваний, как правило, лейкемий. Для лейкемий, развившихся после курса химиотерапии ядами ДНК топоизомеразы II, характерно наличие хромосомных перестроек (Felix С.А., 1998; McClendon А.К., Osheroff N., 2007). При возникновении таких перестроек происходит объединение фрагментов двух протоонкогенов, с образованием функционально активного слитого гена. Продукты слитых в результате образования перестроек генов способствуют процессу перерождения здоровых клеток в раковые. Считается, что перестройки образуются при ошибках репарации двунитевых разрывов, возникающих, в частности, при ингибировании активности ДНК топоизомеразы II. В клетках высших эукариот основной механизм репарации двунитевых разрывов — негомологичное соединение концов (Chapman J.R., 2012). Негомологичное соединение концов позволяет соединять концы разорванных молекул ДНК безотносительно их гомологии, принадлежности к той или иной хромосоме. Точность восстановления двунитевых разрывов обусловлена высокой скоростью данного механизма и сложной

пространственной организацией ядра высших эукариот, препятствующей свободной диффузии концов разрыва.

В ядрах клеток высших эукариот в интерфазе хромосомы занимают компактные, непересекающиеся области - хромосомные территории. Помимо хромосомных территорий, образованных хроматином одной хромосомы, в ядре выделяют ряд компартментов, где в непосредственной близости оказываются участки разных хромосом. Так, в образовании ядрышек принимают участие ядрышкообразующие центры, которые в геноме человека расположены на пяти различных хромосомах. Недавно было показано, что в околоядрышковой области располагаются многочисленные локусы всех хромосом (Nemeth А, Langst G, 2011). Другими компартментами, где в пространстве ядра могут встречаться фрагменты разных хромосом, являются транскрипционные фабрики — области, содержащие активно транскрибирующие РНК полимеразы и необходимые для транскрипции белковые факторы (Davidson S., et al., 2012).

В настоящее время механизм образования хромосомных перестроек активно исследуется с учетом пространственной организации ядра. Для образования хромосомных перестроек необходим физический контакт генов-партнеров. Было выдвинуто две гипотезы. Согласно первой, хромосомные перестройки возникают в ходе репарации двунитевых разрывов при ошибочном объединении изначально расположенных рядом друг с другом фрагментов негомологичных хромосом. Такая модель образования хромосомных перестроек известна как «гипотеза первенства контакта» (Savage J.R., 2000; Nikiforova M.N., et al., 2000). Альтернативой выступает «гипотеза первенства разрыва». Согласно данной гипотезе, в роли инициатора формирования перестройки выступает двунитевой разрыв ДНК. Далее концы разрыва перемещаются в пространстве ядра для поиска партнеров по репарации. Перестройки возникают при встрече и лигировании концов порванных негомологичных хромосом (Aten et al., 2004).

В ходе работы мы анализировали перемещения концов разорванного гена MLL, наиболее часто перестраивающегося гена при развитии вторичных лейкемий, опосредованных применением ядов ДНК топоизомеразы II. Двунитевые разрывы ДНК индуцировали этопозидом, широко применяемым при терапии онкологических заболеваний ядом ДНК топоизомеразы II. Расшифровка молекулярного механизма формирования онкогенных хромосомных перестроек в клетках, обработанных этопозидом, может показать пути снижения риска возникновения таких перестроек, а, стало быть, и риска возникновения вторичных лейкозов. Именно это и определяет актуальность данной работы.

Цель работы и экспериментальные задачи

Цель работы - проанализировать перемещения района локуса 1Ц23, содержащего протоонкоген МЬЬ, в ядрах лимфоидных клеток при ингибировании ДНК ядом ДНК топоизомеразы II этопозидом.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. Подобрать условия ингибирования ДНК топоизомеразы И, при которых детектируются разрывы внутри гена МЬЬ.

2. Охарактеризовать радиальные распределения нормальных и разорванных аллелей гена МЬЬ при индукции двунитевых разрывов этопозидом.

3. Оценить частоту колокализации генов-партнеров по хромосомным перестройкам МЬЬ и АР9, АМЫ и ЕТО при индукции двунитевых разрывов этопозидом.

4. Оценить частоту колокализации генов МЬЬ, АМЫ, АР9, ЕТО и ядрышек при индукции двунитевых разрывов этопозидом.

5. Выяснить, могут ли аллели гена МЬЬ полностью или частично выходить за пределы собственной хромосомной территории при индукции двунитевых разрывов ДНК этопозидом.

Научная новизна работы

В ходе работы впервые определена доля аллелей МЬЬ, разорванных в области ВСЯ непосредственно в результате обработки клеток топоизомеразным ядом этопозидом. Впервые продемонстрировано, что инкубация обработанных этопозидом клеток в течение одного часа в среде без этопозида приводит к возрастанию количества визуально детектируемых разорванных аллелей МЬЬ. Впервые продемонстрировано, что концы разорванных аллелей гена МЬЬ приобретают повышенную подвижность внутри ядра, что выражается в изменении их радиальных позиций по сравнению с неповрежденными аллелями МЬЬ и в частом расположении разорванных аллелей МЬЬ за пределами собственной хромосомной территории. Продемонстрировано удвоение числа колокализаций генов МЬЬ и АР9. а также АМЫ и ЕТО при ингибировании ДНК топоизомеразы II.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на 4-ой международной конференции «The EMBO Meeting» (2012, Ницца, Франция), на 4-ой и 5-ой международных конференциях «Early events in Human Pathologies» (2011, Ереван, Армения; 2012, Литвянка, Байкал, Россия), на 37-ом международном конгрессе FEBS «From single molecules to Systems Biology» (2012, Севилья, Испания), на 19-ой международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (2012, Москва, Россия), на конгрессе гематологов России (2012, Москва, Россия).

Публикации по теме работы

По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в рецензируемых научных изданиях и 6 сообщений международных и российских конференций.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Цели и задачи», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Список цитированных источников». Работа изложена на 90 страницах, содержит 12 рисунков, 5 таблиц, в работе процитировано 120 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Культура клеток. В работе использовали перевиваемую культуру клеток Т-лимфоцитов человека Jurkat. Клетки культивировали при 37°С в присутствии 5% COj в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка.

Ингибирование ДНК топоизомеразы II. Клетки инкубировали в среде с этопозидом (100 мкг/мл) в течение полутора часов, после чего либо сразу использовали для приготовления препаратов, либо перед приготовлением препаратов переносили на один час в среду без этопозида (далее по тексту -«стадия репарации»). Для приготовления контрольных препаратов брали необработанные этопозидом клетки.

Приготовление препаратов. Клетки фиксировали в гипотоническом растворе, благодаря чему архитектура организации ядра сохранялась близкой архитектуре живых клеток. Модифицированным в нашей лаборатории методом трехмерной флуоресцентной in situ ДНК-ДНК гибридизации (3D FISH) выявляли гены MLL, AF9, AML1, ЕТО, CCND1, а также территорию хромосомы 11. Использовали коммерчески доступные флуоресцентные зонды, условия гибридизации были оптимизированы в зависимости от набора зондов. Тотальную ДНК окрашивали неспецифичным интеркалирующим красителем DAPI. Ядрышки окрашивали двухслойным каскадом антител (первичные мышиные моноклональные антитела против ядрышкого белка нуклеофосмина, вторичные куриные антитела, конъюгированные с флуоресцентным красителем Alexa 647).

Микроскопия препаратов и анализ изображений образцов. Для получения изображений объемных препаратов использовали конфокальную лазерную сканирующую микроскопию. В результате конфокальной микроскопии были получены изображения серий оптических срезов образцов. Последующую обработку изображений и анализ многослойных изображений проводили с использованием программного обеспечения ImageJ, Imaris, Nemo. Для анализа взаимного расположения генов MLL, CCND1 и территории хромосомы 11 нашими коллегами была разработана специальная компьютерная программа. Статистический анализ данных проводили с применением программного обеспечения Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

Индукция двунитевых разрывов ДНК этопозидом

Область, внутри которой чаще всего происходят разрывы гена MLL при образовании онкогенных хромосомных перестроек, занимает примерно 9% длины гена (кластер точек разрыва или breakpoint cluster region - BCR). Для того, чтобы обнаружить первичные разрывы гена МЬЬ внутри данной области в клетках, обработанных этопозидом, мы проводили флуоресцентную гибридизацию in situ с коммерчески доступным двуцветным зондом. Зонд покрывал геномный локус больший, чем занимает ген МЬЬ. Участок локуса, содержавший фрагмент гена МЬЬ от 5' конца до области BCR, гибридизовался с половиной зонда, меченой зеленым флуорофором; участок локуса, содержавший фрагмент гена МЬЬ от BCR до 3' конца, - с половиной зонда, меченой красным флуорофором (рис. 1).

ARCN1 D11S614

_I_I_

Рисунок 1. Генетическая карта фрагмента локуса д23 хромосомы 11. содержащего ген МЫ. Район гена обозначен черной линией, район ВСЯ гена МЫ обозначен жирной оранжевой чертой. На карте показаны первый и последний экзоны гена МЫ, а также экзоны, фланкирующие область ВСЯ. Красный и зеленый прямоугольники отображают цвет зонда, использованного для гибридизации в данной области генома. Длины гена МЫ, красного и зеленого участков гибридизационного зонда приведены в тысячах пар оснований (т.п.о.).

Целая аллель гена МЬЬ окрашивалась красным и зеленым цветами одновременно и на изображении представлена желтым сигналом (рис. 2А). При наличии разрыва в области ВС11 аллель гена была представлена на фотографии отдельными красным и зеленым сигналами (рис. 2Б).

В ходе первой части работы клетки обрабатывали этопозидом и, либо готовили препараты сразу после обработки, либо после стадии обработки инкубировали клетки в течение часа в среде без этопозида. В результате было обнаружено, что непосредственно после обработки клеток этопозидом обнаруживаются двунитевые разрывы ДНК внутри области ВСЯ гена МЬЬ (рис. 2Б). После инкубации обработанных этопозидом клеток в среде без этопозида было обнаружено увеличение числа детектируемых разрывов в области ВСЯ

гена МЫ примерно в два раза (рис. 2Б). Увеличение числа детектированных разрывов, возможно, является следствием начала репарации ДНК после удаления этопозида. Так, протеолиз заблокированной этопозидом ДНК топоизомеразы И, освобождает концы разрыва, последующая миграция концов разрывов приводит к увеличению числа удаленных друг от друга красных и зеленых сигналов.

Совмещение & фрагМент гена ^^ гена МЫ- ^ „ вы6ор«е

А > 5 рт • 80400- Ё

Б 4 « > 5 рт * « » 642-oJ Л Л

В т* г» 5 рт Л • » 12-1 8 4-О-1

Г г* 5 |jm ' * # • 42- J

Рисунок 2. Результаты in situ гибридизации с двухцветным зондом против гена MLL. 5' конец гена MLL окрашен зеленым цветом, 3' конец - красным. А) аллели гена MLL не повреждены (целые аллели помечены головкой стрелки), Б) двунитевой разрыв внутри области BCR гена MLL (концы порванной аллели гена помечены стрелками), В, Г) двунитевой разрыв представлен одним цветным пятном (помечен стрелками). Гистограммы показывают долю клеток (% от выборки), имеющих один из четырех типов окрашивания гена MLL, черный столбик - контроль, белый столбик - этопозид 1,5 часа, серый столбик - этопозид 1,5 часа, стадия репарации 1 час. Каждая из трех выборок содержала 310-320 клеток. Планки погрешностей показывают стандартную ошибку. На рисунке представлены конфокальные срезы. Количественный анализ проводился на трехмерных моделях, построенных на основании серий конфокальных срезов.

А

дрДНК образуется вне области BCR гена MLL

Рисунок 3. Схемы возникновения

Желп

BCR

Дополнит зеленый с

|S

Желтый сигнал

BCR

дополнительного одноцветного гибридизационного сигнала.

В дрДНК образуется внутри области 8CR гена ULL на одной из сестринских хроматид

Желтый

Когезиновое кольцо D BCR

ДОПОЛНИ1

зеленый

Сестринские хроматиды

Помимо клеток, где двунитевые разрывы внутри гена МЬЬ были представлены разделенными в пространстве красным и зеленым сигналами, были обнаружены клетки, где разрыв был представлен одним (либо красным, либо зеленым) сигналом в непосредственной близости от желтого сигнала (рис. 2В, Г). Возможно, в таких клетках произошло образование разрыва внутри геномной области, покрытой зондом, но вне района, где зонд меняет цвет и происходят разрывы, в норме свойственные онкогенным хромосомным перестройкам (рис. ЗА). С другой стороны, такая картина может соответствовать двунитевым разрывам ДНК в области ВСЯ гена МЫ, одной из сестринских хроматид, сцепленных между собой когезиновыми кольцами, концы разрыва свободные от когезиновых сшивок могут быть видны как одноцветные, красные либо зеленые пятна (рис. ЗБ).

Анализ радиальных распределений гена МЬЬ

На втором этапе работы были проанализированы радиальные позиции целых аллелей и концов порванных аллелей гена МЬЬ. За радиальную позицию принимали расстояние между центром сигнала либо целой аллели, либо конца разрыва и центром ядра. Чтобы оценить изменения радиальных позиций аллелей были построены их распределения (Сгетег М., е1 а1., 2003). Для этого объем ядра был разбит на пять концентрических равных объемов (рис. 4А). Далее подсчитывали количество сигналов аллелей внутри каждого из объемов. Было обнаружено, что радиальные распределения целых аллелей (двуцветные сигналы) идентичны для клеток контрольной и двух экспериментальных

Ю

выборок (рис. 4Б, В, Г). В то же время концы двунитевых разрывов гена МЫ смещаются к периферии ядра сразу после обработки клеток этопозидом (рис. 4Д) После инкубации обработанных этопозидом клеток в среде без этопозида распределение радиальных позиций концов разрыва гена МЫ становится практически идентичным распределению неповрежденных аллелей (рис. 4Е). В настоящее время трудно судить о том, является ли кратковременное перемещение разорванных концов МЫ направленным процессом или простым следствием понижения упорядоченности пространственной организации интерфазных хромосом после индукции разрывов в ДНК. В этой связи не следует забывать о том, что в условиях ингибирования ДНК топоизомеразы II разрывы вносятся не только в ген МЫ, являющийся объектом нашего исследования, но и в другие участки генома.

контрль.

двухцветные сигналы

этопозид -1,5 часа, стадия репарации отсутствует двухцветные сигналы

2 3 4 номер ядерного слоя

номер ядерного слоя

ядерные слои -1 0-58% радиуса

2 58-73% радиуса

3 7 3-84% радиуса

4 84-94% радуиса

5 94-100% радиуса

§ 40 £

Е 30 2« 20 10 0

этопозид - 1,5 часа, стадия репарации 1 час двухцветные сигналы

11

д

II.

этопозид -1.5 часа, Е

стадия репарации отсутствует одноцветные сигналы

о 40 \

12 3 4 номер ядерного слоя

2 3 4 5 номер ядерного слоя

этопозид -1.5 часа, стадия репарации 1 час одноцветные сигналы

8 ||

I I I I . I I

I

1 2 3 4 5 номер ядерного слоя

Рисунок 4. Радиальные распределения гена МЫ. А) схематическое разбиение ядра на пять равных концентрических объемов. Границы ядерных слоев лежат на расстоянии в 58, 73, 84, 94 и 100% ядерного радиуса. Б - Е) Подсчет количества поврежденных и целых аллелей гена МП в каждом из пяти ядерных слоев. Б) контроль, неповрежденные аллели, В, Г) неповрежденные аллели (двухцветные гибридизационные сигналы) В) этопозид 1,5 часа, Г) этопозид 1,5 часа, стадия репарации 1 час, Д, Е) концы порванных аллелей (одноцветные гибридизационные сигналы), Д) этопозид 1,5 часа, Е) этопозид 1,5 часа, стадия репарации 1

11

час. Планки погрешностей на всех графиках показывают стандартную ошибку. Двухцветные сигналы подсчитывали в выборках -300 клеток, одноцветные сигналы ~50 клеток.

Анализ частоты колокализации генов МЬЬ, АР9, АМЫ, ЕТО между собой

Как было показано выше, через час после инкубации обработанных этопозидом клеток в среде без этопозида наблюдается увеличение числа двунитевых разрывов гена МЬЬ, регистрируемых с помощью двухцветной гибридизационной пробы, т.е. наблюдается возрастание числа разорванных и разошедшихся в пространстве ядра 5'- и З'-фрагментов аллелей гена МЬЬ. С точки зрения центральной задачи настоящей работы наиболее важным представляется вопрос о том, сопровождается ли этот процесс повышением частоты колокализации партнеров по хромосомным транслокациям.

На третьем этапе работы мы проанализировали взаимное расположение гена МЬЬ и его партнера по хромосомным перестройкам гена АГ9 друг относительно друга в условиях, при которых мы наблюдали наибольший уровень двунитевых разрывов гена МЬЬ. Помимо пары генов МЬЬ/АЕ9 мы проанализировали взаимное расположение генов АМЫ и ЕТО. которые также являются партнерами по перестройкам, ассоциированными с вторичными лейкозами. В данной серии экспериментов каждый из генов гибридизовали с зондом красного или зеленого цвета. Было обнаружено, что частота колокализации сигналов для каждой пары генов-партнеров по перестройкам возрастает примерно в два раза (табл. 1).

Таблица 1. Частота колокализации пар генов АМЫ/ЕТО в контрольных клетках и

клетках, обработанных этопозидом.

Пара объектов Необработанные клетки Обработанные клетки Экспериментальное значение/ контрольное значение

N клеток % колокализации сигналов N клеток % колокализации сигналов

МШАР9 -200 0,70% -200 1,81% 2,57

АМЬ/ЕТО -100 1,12% -100 2,06% 1,83

Анализ частоты колоколизации генов MLL, AF9, AML1, ЕТО и ядрышек

Известно, что ядрышки формируются с участием ядрышкообразующих центров, которые в геноме человека расположены на пяти различных хромосомах. Согласно последним исследованиям, участки всех хромосом человека находятся в непосредственном контакте с ядрышком (Nemeth А, Langst G, 2011). Это позволяет предположить, что именно в околоядрышковом пространстве могут происходить встречи партнеров по транслокациям. Если это действительно так, то процесс незаконной рекомбинации между разными хромосомами мог бы стимулироваться нуклеолином (одним из ядрышковых белков), который, как было показано (Kobayashi J, et al., 2012), играет важную роль в репарации двунитевых разрывов ДНК.

Для проверки предположения о том, что околоядрышковое пространство может способствовать встрече партнеров по хромосомным перестройкам, был проведен подсчет колокализации генов MLL, AF9, AML1, ЕТО и ядрышек после обработки клеток этопозидом и часовой инкубации в среде без этопозида. Полученные результаты не подтвердили нашего предположения. Было продемонстрировано, что в клетках, обработанных этопозидом, возрастает лишь уровень колокализации с ядрышком гена MLL (табл. 2).

Таблица 2. Частота колокализации генов MLL. AF9. AML. ЕТО и ядрышек в контрольных клетках и клетках, обработанных этопозидом.

Пара объектов Необработанные клетки Обработанные клетки Экспериментальное значение/ контрольное значение

N клеток % колокализации сигналов N клеток % колокализации сигналов

MLL/Ядрышко -200 6,87% -200 12,85% 1,87

AFWЯдрышко -200 16.84% -200 14,29% 0,85

А A/Z/Ядрышко -100 27,42% -100 22,46% 0,82

£ГО/Ядрышко -100 8,82% -100 7,92% 0,89

Анализ взаимного расположения гена МЫ, и территории хромосомы 11

В течение интерфазы хромосомы высших эукариот занимают в ядре компактные, практически не пересекающиеся области - хромосомные территории. Эта организация создает очевидные препятствия для возникновения хромосомных перестроек. Действительно, для того, чтобы быть сшитыми системами репарации двунитевых разрывов ДНК, разорванные куски разных хромосом должны встретиться в пространстве ядра. Физический контакт между партнерами по перестройкам может произойти при условии выхода участка хотя бы одного из них за пределы территории своей хромосомы. В этой связи весьма важным представляется вопрос о том, приобретают ли концы разорванных ДНК топоизомеразой II генов повышенную подвижность.

С целью получения ответа на данный вопрос мы проанализировали расположение З'-конца гена МЬЬ по отношению к территории хромосомы 11 в контрольных клетках и клетках, обработанных этопозидом. Аллели гена МЬЬ гибридизовали с двухцветным зондом (рис. 1), территорию хромосомы 11 гибридизовали с набором одноцветных зондов зеленого цвета (коммерческая проба на хромосому 11 человека). Было обнаружено, что после инкубации клеток с этопозидом и последующего одночасового культивирования в обычных условиях З'-фрагмент гена МЬЬ часто выходит за пределы территории 11 хромосомы (рис. 5 В, Г и таблица 3).

Рисунок 5. Выход 3' конца гена МЬЬ за пределы территории 11 хромосомы. Зеленым окрашена территория хромосомы 11, красным - 3' конец гена МЬЬ. А) контроль, Б) этопозид 1,5 часа, В, Г) этопозид 1,5 часа, стадия репарации 1 час. Головка стрелки указывает на 3' конец гена МЬЬ вышедшего за пределы территории хромосомы 11.

Аллели гена МЬЬ обнаруживаются за пределами территории 11 хромосомы в два раза чаще, чем в необработанных клетках уже сразу после инкубации клеток с этопозидом (р=0,04, точный критерий Фишера). После инкубации обработанных клеток в среде без этопозида процент выхода аллелей гена МЬЬ существенно возрастает (таблица 3), превосходя таковой в контрольных клетках

практически в пятнадцать раз (р=0,0001, точный критерий Фишера).

В качестве дополнительного контроля мы проанализировали частоту выхода за пределы хромосомной территории гена ССЫй1. Ген ССЫИ1 также лежит на хромосоме 11, но не участвует в перестройках, происходящих в ответ на обработку клеток топоизомеразными ядами и приводящих к развитию вторичных лейкемий. В тех условиях обработки клеток (инкубация с этопозидом и последующее кратковременное культивирование в среде без этопозида) когда ген МЬЬ демонстрирует максимальную частоту выхода за пределы хромосомной территории, ген ССЖ)7 не демонстрирует выход за пределы хромосомной территории (р=0,28, точный критерий Фишера). Частоты выхода генов сведены в таблице 3.

Таблица 3. Выход генов МЬЬ и ССЫР1 за пределы территории 11 хромосомы.

Ген Обработка Число Выход 3'- Выход З'-конца Достоверность

клеток сигналов конца гена за гена за пределы различий

этопозидом / 3'-концов пределы территории 11 (контроль/опыт),

стадия генов в территории 11 хромосомы, ±ЭЕ точный критерии

репарации анализе хромосомы Фишера

-/- -1000 18(1.7%) 1.5%±0.8% -

CCND1 1,5 часа/ 1 час -1200 27(2.1%) 2.7%±1.6% 0,28

-/- -2000 8 (0.4%) 0.5%±0.2% -

МЬЬ 1,5 часа/- -1200 11 (0.9%) 0.9%±0.5% 0,04

1,5 часа / 1 час -1400 121 (8.8%) 7.2%±3.0% <0.0001

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе было показано, что при ингибировании ДНК топоизомеразы II гены-партнеры по хромосомным перестройкам MLL и AF9, AML1 и ЕТО колокализуются в два раза чаще, чем в норме. Продемонстрировано, что при обработке клеток Jurkat этопозидом разрывы гена MLL в области BCR с последующим расхождением разорванных концов являются достаточно частыми событиями. Было показано, что ген MLL демонстрирует высокий уровень двунитевых разрывов ДНК внутри области BCR. Наконец, продемонстрировано, что разорванные в результате ингибирования активности ДНК топоизомеразы II концы гена MLL приобретают повышенную подвижность внутри клеточного ядра. Это выражается в изменении их радиальных позиций (по сравнению с неразорванными аллелями) и предпочтительном выходе за пределы хромосомной территории.

В совокупности результаты работы свидетельствуют в пользу гипотезы, постулирующей, что разрыв ДНК является первичным по отношению к перемещению, необходимому для встречи партнеров по хромосомным перестройкам (Aten et al., 2004). Данное заключение справедливо, во всяком случае, для разрывов, возникающих в результате ингибирования ДНК топоизомеразы II этопозидом. Можно полагать, что выявленная в наших экспериментах мобильность разорванных концов гена MLL связана с многоэтапным процессом репарации вызванных топоизомеразой II разрывов, начальные стадии которого состоят в удалении молекул топоизомеразы, присоединенных ковалентной связью к 5'-концам цепей ДНК. Согласно ряду источников, этот процесс осуществляется при участии протеасомной системы деградации белков и может происходить в определенных функциональных компартментах внутри клеточного ядра (Salmena L., et al., 2001; Zang A., et al. 2006).

выводы

1. В значительной части популяции клеток линии 1игка1, обработанных ядом ДНК топоизомеразы II этопозидом, визуализированы двунитевые разрывы гена МЬЬ в области ВСЯ.

2. В культивируемых клетках Jurkat, обработанных ядом ДНК топоизомеразы II этопозидом, концы разорванного гена MLL кратковременно смещаются к периферии ядра.

3. Колокализация партнеров по хромосомным перестройкам MLL и AF9, AML1 и ЕГО в ядрах клеток Jurkat повышается примерно в два раза при ингибировании ДНК топоизомеразы II этопозидом.

4. Среди генов-партнеров по хромосомным перестройкам MLL, AF9, AML], ЕТО только ген MLL демонстрирует повышение колокализации с ядрышком при ингибировании ДНК топоизомеразы II этопозидом.

5. В клетках Jurkat, обработанных этопозидом, З'-конец гена MLL с высокой частотой локализуется вне территории хромосомы 11.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Glukhov S.I.. Rubtsov М.А., Alexeyevsky D.A., Alexeevski A.V., Razin S.V., Iarovaia O.V. The broken MLL gene is frequently located outside the inherent chromosome territory in human lymphoid cells treated with DNA topoisomerase II poison etoposide [Электронный журнал] // PLoS ONE. 2013. V. 8. I. 9. N. e75871. URL:http://www.plosone.org/article/info%3Adoi% 2F10.13 71 %2Fjournal. pone.0075871.

2. Rubtsov M.A., Glukhov S.I.. Allinne J., Pichugin A., Vassetzky Y.S., Razin S.V., Iarovaia O.V. Treatment of lymphoid cells with the topoisomerase II poison etoposide leads to an increased juxtaposition of AML1 and ETO genes on the surface of nucleoli // Biopolymers and Cell. 2011. V. 27.1. 5. P. 398-403.

Материалы российских и международных конференций:

1. Glukhov S.I.. Rubtsov М.А., Razin S.V., Iarovaia O.V. Mobility of the MLL containing locus in the nuclear space upon the etoposide treatment // 4th International Conference "The EMBO Meeting". Nice. France. 2012. P. 48.

2. Rubtsov M.A., Glukhov S.I.. Ageeva L.V., Razin S.V., Iarovaia O.V. Genes-partners on t-ANLL-associated chromosomal translocations exhibit different behavior in response to DNA topoisomerase II inhibition in lymphoid cells // 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress "From single molecules to Systems Biology". Seville. Spain. 2012. P. 308-309.

3. Rubtsov M.A., Glukhov S.I.. Ageeva L.V., Razin S.V., Iarovaia O.V. Genes-partners on t-ANLL-associated chromosomal translocations exhibit different behavior in response to DNA topoisomerase II inhibition in lymphoid cells // V International Meeting "Early events in Human Pathologies". Listvyanka (Baikal) . Russia. 2012. P. 30.

4. Рубцов M.A., Глухов С.И.. Агеева Л.В., Разин С.В., Яровая О.В. Различия в поведении генов-партнеров по хромосомным транслокациям, ассоциированным с вторичными лейкозами, в условиях ингибировании ДНК-топоизомеразы II // Конгресс гематологов России. Москва. Россия. 2012. С. 23.

5. Агеева Л.В., Глухов С.И.. Рубцов М.А. Оценка влияния сверхэкспрессии нуклеолина на чувствительность клеток HeLa к обработке этопозидом // XIX Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». Москва. Россия. 2012. С. 183.

6. Rubtsov М.А., Glukhov S.I.. Allinne J., Pichugin A., Vassetzky Y.S., Razin S.V. Iarovaia O.V. Treatment of lymphoid cells with the topoisomerase II poison etoposide leads to an increased juxtaposition of AML1 and ETO genes on the surface of nucleoli // IV International Meeting "Early Events in Human Pathologies". Yerevan. Armenia. 2011.

Глухов Сергей Игоревич Подвижность разорванных концов протоонкогенов в условиях ингибирования ДНК топоизомеразы II Формат 60x90/16 Усл.п.л. 1.25 Тираж 100 экз. Подписано в печать 19.11.2013 Заказ № 138 Типография ООО «Генезис» 8 (495) 434-83-55 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Глухов, Сергей Игоревич, Москва



Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», биологический факультет ^ ^^^ у/

^ У^/ На правах рукописи

04201451748 "

Глухов Сергей Игоревич

ПОДВИЖНОСТЬ РАЗОРВАННЫХ КОНЦОВ ПРОТООНКОГЕНОВ В УСЛОВИЯХ ИНГИБИРОВАНИЯ ДНК ТОПОИЗОМЕРАЗЫ II

Специальность - 03.01.03 (молекулярная биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор

Разин Сергей Владимирович кандидат биологических наук Рубцов Михаил Александрович

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ ......................................................................................................6

Глава I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................8

1.1 Вторичные лейкемии................................................................................8

1.1.1 Применение ядов ДНК-топоизомеразы II в химиотерапии первичного

рака приводит к развитию вторичной лейкемии...............................................8

1.1.2 Хромосомные перестройки, вызванные

ядами ДНК-топоизомеразы II....................................................................10

1.1.3 Молекулярный механизм развития вторичных лейкемий,

возникающих после применения топоизомеразных ядов.................................11

1.2 ДНК-топоизомераза II.............................................................................12

1.2.1 Функция в клетке..................................................................................12

1.2.2 Структура ДНК-топоизомеразы II человека...................................................15

1.2.3 Каталитический цикл ДНК-топоизомеразы II.................................................18

1.2.4 Цитотоксический эффект ДНК-топоизомеразы II...........................................21

1.2.5 Яды и ингибиторы ДНК-топоизомеразы II...................................................21

1.2.6 Яды ДНК-топоизомеразы II......................................................................22

1.2.7 Ингибиторы ДНК-топоизомеразы II...........................................................27

1.2.8 Генотоксический эффект применения

ядов ДНК-топоизомеразы II......................................................................27

1.3 Репарация двунитевых разрывов в условиях

ингибирования ДНК-топоизомеразы II.......................................................29

1.3.1 Удаление фермента с концов разрыва.........................................................29

1.3.2 Гомологичная рекомбинация....................................................................30

1.3.3. Негомологичная рекомбинация.................................................................34

1.3.4 Неканонические механизмы негомологичной рекомбинации............................36

1.4 Компартментализация ядра.......................................................................38

1.4.1 Хромосомные территории........................................................................38

1.42 Ядерный белковый матрикс.....................................................................39

1.4.3 Гетерохроматиновые и эухроматиновые области...........................................40

1.4.4 Транскрипционные фабрики, спеклы..........................................................41

1.4.5 Ядрышки.............................................................................................42

1.5 Мобильность хроматина в норме и в условиях образования

двунитевых разрывов..............................................................................42

Глава II ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ.........................................................................45

2 Цель работы и экспериментальные задачи....................................................45

Глава III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................................46

3.1 Культура клеток....................................................................................46

3.2 Гибридизационные зонды.........................................................................46

3.3 Антитела.............................................................................................47

3.4 Реактивы общего назначения....................................................................47

3.5 Буферные растворы................................................................................47

3.6 Реактивы для культивирования клеток.........................................................47

3.7 Реактивы для приготовления препаратов.......................................................48

3.8 Программное обеспечение........................................................................48

3.9 Культивирование клеток ......................................................................48

3.10 Ингибирование ДНК-топоизомеразы II........................................................48

3.11 Приготовление трехмерных препаратов клеток Jurkat....................................49

3.12 Гибридизация с ДНК зондами...................................................................49

3.13 Постгибридизационные отмывки...............................................................50

3.14 Иммуноокрашивание..............................................................................50

3.15 Окрашивание тотальной ДНК неспецифичным красителем..............................51

3.16 Монтирование препаратов........................................................................51

3.17 Конфокальная микроскопия препаратов......................................................51

3.18 Компьютерная обработка изображений......................................................51

3.19 Компьютерный анализ изображений..........................................................51

3.20 Оценка уровня двунитевых разрывов..........................................................52

3.21 Подсчет уровня колокализации генов и ядрышек,

генов и хромосомных территорий..............................................................52

3.22 Построение радиальных распределений......................................:................53

3.23 Статистическая обработка результатов.......................................................53

Глава IV РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ....................................................54

4.1 Индукция двунитевых разрывов ДНК этопозидом.........................................54

4.2 Анализ радиальных распределений гена MLL...............................................59

4.3 Анализ частоты колокализации генов

MLL, AF9, АМЫ, ЕТО между собой...........................................................62

4.4 Анализ частоты колокализации генов

MLL, AF9, AML1, ЕТО и ядрышек..............................................................63

4.5 Анализ взаимного расположения гена MLL

и территории хромосомы 11.....................................................................65

V ВЫВОДЫ............................................................................................69

VI БЛАГОДАРНОСТИ...............................................................................70

VII СПИСОК ЦИТИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ..............................................71

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая

АТФ - аденозин три фосфат

БСА - бычий сывороточнй альбумин

MLL - миелоидная/лимфоидная лейкемия - Myeloid/Lymphoid Leukemia или лейкемия

смешанного фенотипа - Mixed Lineage Leukemia

AML - acute myeloid leukemia - острая миелоидная лейкемия

APL - acute promyeloid leukemia - острая промиелоидная лейкемия

ALL - acute lymphoblastic leukemia - острая лимфобластоидная лейкемия

BCR - breakpoint cluster region — кластер точек разрыва

NHEJ - non-homologous end joining - негомологичное соединение концов

MMEJ - microhomology mediated end-joining - соединение концов, опосредованное

микрогомологией

FISH — fluorescent in situ hybridization — флуоресцентная гибридизация in situ

LSI- locus specific identifier probe — локус специфический зонд

WCP - whole chromosome painting - полно хромосомное окрашивание

SSC - saline sodium citrate - натрий-цитратный буфер

PBS - phosphate buffer saline - натрий-фосфатный буфер

ВВЕДЕНИЕ

Важной мишенью химиотерапии онкологических заболеваний является фермент ДНК-топоизомераза II. В процессе работы ДНК-топоизомераза II обратимо вносит двунитевые разрывы в ДНК. Образование разрыва сопряжено с транспортом через разрыв другого участка молекулы ДНК, благодаря чему фермент ДНК-топоизомераза II является необходимым для разделения дочерних молекул ДНК и демонстрирует высокий уровень активности у пролиферирующих, в том числе раковых, клеток. Применение веществ, блокирующих религирование двунитевых разрывов ДНК-топоизомеразой II, приводит к накоплению токсичных для клетки двунитевых разрывов и в конечном итоге к гибели клетки [1]. Такие вещества получили название ядов фермента ДНК-топоизомеразы II и широко применяются при лечении рака. Однако использование топоизомеразных ядов впоследствии может вызвать развитие вторичных онкологических заболеваний, как правило, лейкемий.

Для вторичных лейкемий свойственно наличие определенных межхромосомных перестроек. При образовании перестроек происходит объединение участков двух разных генов. Продукт слитого гена может играть существенную роль в онкогенезе. Механизм образования таких хромосомных перестроек до конца не известен. Репарация двунитевых разрывов ДНК в интерфазе у высших эукариот, в том числе и человека, происходит преимущественно по механизму негомологичного соединения концов (ЫНЕ1), не требующего гомологии между концами разрыва [2]. Такой механизм может способствовать формированию межхромосомных перестроек. Для образования межхромосомных перестроек необходим физический контакт между партнерами по перестройкам. В свою очередь организация хромосом в интерфазном ядре в виде компактных непересекающихся областей, так называемых хромосомных территорий, препятствует свободному перемещению в ядре партнеров по перестройкам.

Были выдвинуты две гипотезы образования перестроек. Согласно первой гипотезе партнеры должны изначально быть сближены в пространстве ядра. Образование разрывов в генах-партнерах и ошибочное соединение концов разных генов приводит в таком случае к формированию хромосомных перестроек [3]. Согласно второй гипотезе концы двунитевых разрывов мигрируют на значительные расстояния с целью поиска партнеров по репарации. Исходное расположение генов-партнеров не играет решающей роли [4].

В диссертационной работе был проанализирована подвижность гена МЫ, наиболее часто перестраивающегося гена при развитии вторичных лейкемий, в условиях индукции двунитевых разрывов ядом фермента ДНК-топоизомераза II этопозидом.

Глава I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Вторичные лейкемии

1.1.1 Применение ядов ДНК-топоизомеразы II в химиотерапии первичного рака

приводит к развитию вторичной лейкемии.

Одной из важнейшей задач современной медицины является лечение онкологических заболеваний. Основными методами лечения рака в настоящее время являются хирургия, радиотерапия и химиотерапия. Каждый из методов имеет свои недостатки и преимущества. Помимо того, что химиотерапия зарекомендовала себя как высокоэффективный метод лечения, очевидным преимуществом химиотерапии над радиотерапией и хирургией является отсутствие необходимости выявлять расположение очагов развития заболевания. Одними из наиболее эффективных и широко используемых химиотерапевтических агентов являются яды клеточного фермента ДНК-топоизомеразы II [5].

Фермент ДНК-топоизомераза II у высших эукариот отвечает за разделение дочерних молекул ДНК в процессе репликации, а также за снятие позитивной суперспирализации ДНК [6, 7]. Этот фермент вносит двунитевые разрывы в ДНК, осуществляет транспорт участка той же или другой молекулы ДНК через разрыв и затем восстанавливает целостность разрезанной молекулы [8]. Топоизомеразные яды, применяемые в химиотерапии опухолей, блокируют способность фермента религировать двунитевой разрыв ДНК [1, 5]. Ввиду высокой активности ДНК-топоизомеразы II в делящихся, и в том числе раковых, клетках яды фермента ДНК-топоизомеразы II способствуют накоплению двунитевых разрывов ДНК, что в конечном итоге приводит их к гибели [9]. Однако клинический опыт применения ядов ДНК-топоизомеразы II в качестве химиотерапевтических агентов продемонстрировал наличие весьма опасного коллатерального эффекта. Лечение раковых больных с использованием ингибиторов

ДНК-топоизомеразы II может вызывать возникновение так называемых вторичных лейкемий. [10, 11].

Лейкемии представляют собой группу онкологических заболеваний гематологической природы [12]. Виды лейкемии выделяют на основе клинических, морфологических, иммунофенотипических (набор поверхностных молекулярных маркеров, в первую очередь белки семейства CD), генетических черт. В зависимости от того, к какой ветви гемапоэза принадлежал предшественник раковых клеток, выделяют миелоидную, промиелоидную, лимфобластоидную лейкемию либо лейкемию, имеющую смешанный фенотип [13]. В зависимости от характера течения заболевания выделяют острую и хроническую лейкемию. Перерождение здоровых клеток организма в раковые происходит при накоплении определенного набора генетических нарушений, включая точечные мутации, инверсии, межхромосомные перестройки.

После проведения химиотерапии с использованием ядов ДНК-топоизомеразы II вторичная лейкемия развивается у 2-3% пациентов. Как правило, это острая миелоидная лейкемия (acute myeloid leukaemia - AML), реже - острая промиелоидная лейкемия (acute promyeloid leukaemia - APL) и острая лимфобластоидная лейкемия (acute lymphoblastic leukaemia - ALL) [11]. Отличительной особенностью лейкемий, опосредованных применением ядов ДНК-топоизомеразы И, является наличие специфических онкогенных хромосомных перестроек [14]. В процессе образования таких перестроек происходит объединение фрагментов ДНК разных хромосом [15].Численный состав хромосом при этом не изменяется. Продукт слитого гена - белок, несущий частично, либо полностью функционально активные домены, присущие белкам исходных не перестроенных генов играет важную роль в онкогенезе [16, 17].

1.1.2 Хромосомные перестройки, вызванные ядами ДНК-топоизомеразы II.

После ингибирования ДНК-топоизомеразы II химиотерапевтическими ядами чаще всего перестройки затрагивают геномные локусы llq23 (ген МЫ), 21q22 (ген AML1), 17q21 (ген RARA), 16р13 (ген CBFB), I6q22 (ген MY НИ) (11, 14, 15). Перестройки, затрагивающие эти гены, приводят к развитию вторичной острой миелоидной (t-AML), реже лимфоидной (t-ALL) лейкемии. Примерно в 15% случаев t-AML, развившейся после применения ядов ДНК-топоизомеразы II, детектируются хромосомные перестройки, затрагивающие ген AML1 [12]. Продукты генов CBFB и AML1 (другое название CBFA)в норме образуют сложный транскрипционный фактор CBF (core binding factor), ключевой компонент регуляции экспрессии генов в процессе гемапоэза [18]. Продукт гена RARA -рецептор транс- и цисретиноевых кислот является важным фактором дифференцировки и роста клеток. Перестройки, затрагивающие ген RARA, встречаются при развитии 95-97% всех диагностированных случаев вторичной промиелоидной лейкемии [19].

Особого внимания заслуживают перестройки в области гена MLL (локус llq23). Перестройки внутри данного гена встречаются при развитии 30% известных случаев t-AML, а также при развитии примерно половины случаев t-ALL после курсов химиотерапии первичного рака с применением ядов ДНК-топоизомеразы II [13]. На данный момент известно, что в образование перестроек с участием гена MLL вовлечено порядка 70 генов-партнеров [20, 21]. В норме ген М£Дмиелоидная/лимфоидная лейкемия - Myeloid/Lymphoid Leukemia или лейкемия смешанного фенотипа - Mixed Lineage Leukemia) кодирует гистометилтрансферазу, важнейший компонент системы регуляции экспрессии генов [22, 23], в том числе и генов отвечающих за гемапоэз у млекопитающих. Ген MLL имеет длину 92 тысячи пар оснований и содержит 37 экзонов. Область разрыва гена MLL при большинстве перестроек ограничена 7 и 13 экзонами и имеет длину 8,3 тысячи пар оснований [24]. В литературе эта область известна, как кластер точек разрыва

или BCR (breakpoint cluster region). В 5'-районе BCR области гена MLL располагается сайт расщепления ДНК-топоизомеразой II [24]. При возникновении перестроек, опосредованных применением ядов ДНК-топоизомеразы II, ген MLL перестраивается в районе 5'-конца BCR, в отличие от de novo лейкемий, при развитии которых, ген MLL перестраивается в З'-районе BCR [25].

1.1.3 Молекулярный механизм развития вторичных лейкемий, возникающих после применения топоизомеразных ядов.

Как уже было сказано выше, для генотипа клеток вторичных лейкемий,

возникающих после химиотерапии с использованием ядов ДНК-топоизомеразы II,

характерно наличие специфических хромосомных перестроек. Как правило, при

образовании таких перестроек объединяются фрагменты двух генов, отвечающих за рост,

пролиферацию и дифференцировку клеток в ходе гемопоэза [15]. Продукты слитых генов

играют ключевую роль в онкогенезе. В настоящее время существуют три основные

гипотезы, объясняющие связь между развитием вторичных лейкемий и присутствием

определенных перестроек после применения ядов ДНК-топоизомеразы II. Первая

основана на том факте, что хромосомные перестройки, характерные для генотипа

лейкозных клеток (например, AML1/ETO), могут присутствовать в геноме здоровых людей

[26]. В связи с этим полагают, что яды ДНК-топоизомеразы II обеспечивают необходимые

условия для отбора наиболее агрессивных клонов в течение онкогенеза, при

перерождении здоровых клеток, уже имевших онкогенные перестройки. В таком случае

яды фермента ДНК-топоизомеразы II вызывают накопление необходимых для

перерождений клеток мутаций. В основе следующей гипотезы лежит способность ядов

ДНК-топоизомеразы II индуцировать апоптотические нуклеазы [27]. Ошибки репарации

двунитевых разрывов, вызванных действием нуклеаз, могут приводить к образованию

онкогенных хромосомных перестроек и дальнейшему онкогенезу. Согласно третьей

11

гипотезе, ДНК-топоизомераза II, заблокированная токсическими агентами в процессе образования двунитевого разрыва, при встрече с машиной репликации и/или транскрипции удаляется, в результате чего образуются свободные двунитевые разрывы ДНК, ошибочная репарация которых и приводит к образованию хромосомных перестроек и развитию вторичных лейкемий [28].

1.2 ДНК-топоизомераза II. 1.2.1 Функция в клетке.

Особенности строения ДНК накладывают определенные ограничения на процесс репликации и транскрипции. Геномная ДНК у всех ж�