Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые подходы к изучению петельной организации хромосом

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Новые подходы к изучению петельной организации хромосом"

На правах рукописи

1 I СЕН Ш5

ЛАГАРЬКОВА Мария Андреевна

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ ПЕТЕЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМОСОМ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в лаборатории структурно-функциональной организации хромосом Института биологии гена РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор С.ВЛ*азин доктор биологических наук Н.В.Гнучев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н.И.Дризе кандидат биологических наук Р.Л.Турецкая

Ведущая организация:

Биологический факультет МГУ им.М.В.Ломоносова

на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена по адресу 117334, Москва, ул.Вавилова, 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Молекулярной Биологии им. В.А.Энгельгардта

Защита состоится

часов.

РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертацинного совета кандидат фарм.наук

Л.С.Грабовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Вопрос о существовании структурно-функциональных доменов в геноме эукариот обсуждается в течение последних 20 лет. В настоящее время считается общепризнанным, что существует несколько уровней компактизации хроматина в клетке. Одним из высших уровней организации хроматина являются квазизамкнутые петли ДНК размером в десятки тысяч пар нуклеотидов, закрепленные на скелетных структурах ядра (ядерном матриксе). Неоднократно высказывались предположения о том, что эти петли ДНК могли бы соответствовать функциональным доменам генома, таким как репликоны и транскриптоны. Многочисленные попытки проверить зто предположение экспериментально привели, однако, к противоречивым результатам. Одной из наиболее очевидных причин этих противоречий является, на наш взгляд, отсутствие надежного метода картирования петельной организации генома. В большинстве исследований основания петель отождествлялись с фрагментами ЦНК, которые могут быть выделены в составе ядерного матрикса госле жесткой нуклеазной обработки ядер. Правильность такого тодхода представляется, однако, сомнительной в свете ряда эезультатов, указывающих на то, что ДНК может временно 1рикрепляться к ядерному матриксу в ходе осуществления различных функциональных процессов. В этой связи не вызывает сомнения геобходимость разработки новых подходов для характеристики :пецифичности организации хромосомной ДНК в петли, что и шилось главной целью настоящей работы.

Л,ель и задачи работы.

Цель данного исследования состояла в изучении специфичности срупномасштабной фрагментации генома высших эукариот Для того предстояло выполнить следующие экспериментальные задачи:

1- Исследовать крупномасштабную фрагментацию укариотического генома нуклеазой Ва131 и сравнить ее с фрагментацией генома эндогенной топоизомеразой II.

2. Исследовать зависимость крупномасштабной фрагментации енома высших эукариот эндогенной топоизомеразой II от [ролиферативного статуса клеток.

3. Исследовать крупномасштабную фрагментацию эукариотического генома в процессе программированной клеточной смерти (апоптоза).

Научная новизна и практическое значение работы.

В настоящей работе' впервые продемонстрировано, что основания петель хромосомной ДНК предпочтительно доступны для нуклеаз, в том числе и для нуклеаз, узнающих неканонические структуры ДНК. Это открывает возможность использования дозированной обработки пермеабилизованных клеток нуклеазами для вырезания петель геномной ДНК и, таким образом, изучения специфичности организации ДНК в "петли. Новым также является демонстрация того, что при изменении пролиферативного статуса клеток происходят существенные изменения на уровне организации ДНК в петли. Впервые показано, что крупномасштабная фрагментация геномной ДНК на ранних стадиях апоптоза происходит специфически посредством вырезания петель ДНК и их олигомеров.

Результаты работы могут быть использованы для создания принципиально новых карт эукариотического генома, которые будут отражать принцип организации ДНК в петли. Разработанные подходы картирования петель ДНК позволят внести ясность в ряд спорных вопросов, касающихся соответствия петель ДНК функциональным единицам генома.

Апробация работы.

Работа была апробирована на следующих симпозиумах и конференциях: Первый международный конгресс по ядерному матриксу (Польша, июнь 1994), симпозиум по строению хромосомы Института Casuza Research (Япония, ноябрь 1994), симпозиум по ядерному матриксу и эпигенетической регуляции транскрипции (США, апрель 1995), Гордоновская конференция по хроматину и регуляции транскрипции (США, июль 1994), Школа молодых ученых в Черноголовке (февраль 1995).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано и находится в печати 8 работ.

Объем и структура работы. _

Диссертация изложена на с/^ страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Библиография включает 7С?¿г источников. Работа проиллюстрирована ^/В рисунками и ^ таблицами. '

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование расщепления ДНК пермеабилизованных клеток на высокомолекулярные фрагменты нуклеазой Ва131.

После обработки пермеабилизованных клеток нуклеазой Ва131 и последующей депротеинизадии фрагменты ДНК были разделены электрофорезом в пульсирующем поле в условиях, позволяющих разделить фрагменты ДНК длиной от 40 до 700 т.п.н. (рис. 1А). Очевидно, что инкубация пермеабилизованных клеток в реакционном буфере без фермента не ведет к сколько-либо заметной фрагментации ДНК. Продукты частичной деградации ДНК размером около 50 т.п.н. наблюдаются в контроле, но являются, видимо, результатом присутствия в культуре небольшого процента мертвых клеток (3-5% от общего количества клеток). Обработка клеток

УМ26 Ва131 д

мкг/мл ед/мл л

50 II 0 200 100 50

Рис. 1. Анализ расщепления геномной ДНК человеческих клеток К562 нуклеазой Ва131 и эндогенной топоизомеразой II.

A. - результаты разделения выщепленных фрагментов ДНК посредством электрофореза в пульсирующем поле.

B. - результаты гибридизации фрагментов ДНК, показанных на рис. 1А, с пробой, содержащей ген 283 рибосомной РНК.

Стрелками показаны позиции, маркера - конкатемеров бактериофага Я.

На 131 ед/мд

О 20 50 100

Рис. 2. Результаты гибридизации препаратов оч-ищенной ДНК, обработанных нуклеазой Ва131 и затем разделенных электрофорезом в пульсирующем, поле, с радиоактивной пробой, содержащей ген 28Э РНК.

нуклеазой Ва131 ведет к образованию фрагментов ДНК размером от 40 до более 600 т.п.н. Количество ДНК, обнаруживаемое в этой области, возрастает с увеличением концентрации фермента.

Высокомолекулярные фрагменты той же величины образуются в результате действия эндогенной, прикрепленной к ядерному матриксу топоизомеразы II при обработке экстрагированных 2М №аС1 пермеабилизованныхклеток ингибитором топоизомеразы II -эпиподофилотоксином УМ26 (рис. 1А).

Для оценки специфичности фрагментации ДНК рибосомальных генов нуклеазой Ва131 была проведена гибридизация продуктов расщепления как Ва131, так и топоизомеразы II с пробой, содержащей последовательность, кодирующую 28Э РНК (рис. 1В).

Очевидно, что обработка Ва131 приводит к появлению тех же фрагментов рибосомальной ДНК, что и прикрепенная к матриксу эндогенная топоизомераза II, обработанная ингибитором. Следует этметить, что подобная картина расщеплеия не может быть получена при обработке нуклеазой Ва131 очищенных препаратов ДНК (рис.2). Гаким образом, сайты предпочтительного расщепления ДНК нуклеазой Ва131 возникают в результате взаимодействия ДНК с некими ядерными белками.

Совпадение паттернов крупномасштабной фрагментации эибосомальных генов топоизомеразой II и нуклеазой Ва131 не обязательно означает, что оба фермента действуют на один и тот же

Расщепление Tono li

Hind 11 Bgl II ф

28 S

Проба 1 <-

Hind II

18 S

1 Т.П.Н.

Проба 2 ->

Hind II

Нетранскрибируемая область

#

В

ВаШ ед/мл

M

150 100 200 0

g VM26 мкг/мл В « r—

10 20 50

Рис. 3.

A. - Карта рибасомного повтора генома человека.

Кодирующие участки для 28S и I8S РНК закрашены. Позиции проб 1 и 2 показаны, стрелками под картой. Позиция участка преимущественного расщепления эндогенной топоизомеразой II и нуклеазой Ва131 показана черным прямоугольником над картой.

B. Картирование позиции преимущественного расщепления ДНК рибосомного повтора нуклеазой Ва131 и эндогенной топоизомеразой II методом непрямого концевого мечения.

Препараты ДНК из пермеабилизованных клеток, обработанных Ва131 и клеток, обработанных VM26, были дополнительно расщеплены рестрчктазой Bgl II и сгибридизованы с пробой 2.

Звездочкой отмечена полоса, соответствующая участку расщепления Ва131 и VM26.

участок внутри рибосомного повтора. (Разумеется, регулярные паттерны полос с шагом, равным размеру единицы рибосомального повтора (44 т.п.н.) должны появляться только в том случае, когда ферменты узнают определенный участок внутри повтора).

Таким образом, было важно сравнить позиции участков преимущественного расщепления рибосомального гена нуклеазой Ва131 и топоизомеразой И. Для этого был использован метод непрямого концевого мечения полученных фрагментов ДНК, дополнительно расщепленных эндонуклеазой Bgl II с зондами, обозначенными на рис ЗА.

Гибридизация с пробой 1 не выявляет никакой разницы между пробами, содержащими ДНК из контрольных клеток и клеток, обработаных VM26 или Ва131 (не показано). Напротив, гибридизация с пробой 2 показала, что оба фермента преимущественно расщепляют ДНК внутри одного и того же участка, локализованного в нетранскрибируемом спейсере в непосредственной близости от начала транскрипционной единицы (рис. 3).

Одинаковая локализация позиций преимущественного расщепления нуклеазой Bal 31 и топоизомеразой II указывает на то, что Ва131 также преимущественно расщепляет ДНК в участках прикрепления к ядерному матриксу. Соответственно, можно заключить, что фрагменты, выщепляемые этим ферментом из ДНК пермеабилизованных клеток, являются петлями и их олигомерами. Причины такого действия нуклеазы не совсем ясны в настоящий момент. Нуклеаза Ва131 обладает целым рядом как эндо-, так и экзонуклеазных активностей. Однако известно, что когда концы ДНК находятся вне доступа фермента, Ва131 расщепляет ДНК в частично денатурированных областях и в областях с неканонической вторичной структурой. Представляется возможным существование гаких областей в участках прикрепления к ядэрному матриксу.

2. Изучение зависимости пространственной организации кластера рибоеомных генов человека от репликативиого статуса клеток.

Новый метод картирования петель ДНК, основанный на способности топоизомеразы II вносить двуцепочечные разрывы в ДНК в присутствии эшшодофилотоксина УМ26 позволил показать, что рибосомные гены организованы в петли, имеющие длину единицы повтора и разделенные участком прикрепления, расположенным в нетранскрибируемом спейсере (Иагт et а!., 1993), а также прокартировать организацию петель в амплифицированном локусе с-тус в человеческих клетках (Оготоуа е! а1., 1995).

Однако, эти результаты были получены при работе с иммортализованными культурами клеток, пролиферативные свойства которых существенно отличаются от пролиферативных свойств нормальных клеток. В этой части работы мы попытались ответить на вопрос о том, одинакова ли организация ДНК в топологические петли в делящихся и покоящихся клетках. В качестве модели был выбран кластер рибоеомных генов в нормальных лимфоцитах периферической крови человека и в лимфоцитах, активированных к пролиферации обработкой фитогемагтлютинином (ФГА).

Лимфоциты донорской крови инкубировали и в присутствие

Рис. 4.

График включения [Н3]-тимиди.на в ДНК нормальных (кривая 1) и активированных ФГА лимфоцитов (кривая 2).

[Н3]-тимидина и активировали к пролиферации обработкой ФГА. Максимум включения метки достигался через 72 часа (рис. 4).

При этом большая часть популяции лимфоцитов вступала в митоз. После обработки активированных лимфоцитов различными концентрациями VM26 препараты ДНК анализировали электрофорезом в пульсирующем поле (рис. 5В). Аналогичному анализу подвергали контрольные (неактивированные) лимфоциты, обработанные VM26 (рис. 5А). Можно видеть, что эффективность расщепления ДНК в активированных лимфоцитах существенно выше, чем в неактивированных. Полученные препараты ДНК гибридизовали с пробой, содержащей фрагмент гена, кодирующего 28S рибосомную РНК. При гибридизации этой пробы с ДНК активированных к пролиферации лимфоцитов выявляется регулярный паттерн фрагментов с размерами, кратными размерам повтора рибосомных генов (рис. 5B-d), тогда как гибридизация той же пробы с ДНК неактивированных лимфоцитов не выявила какой - либо специфичности (рис. 5А-с).

Аналогичные результаты были получены и в тех экспериментах, когда ингибитором топоизомеразы обрабатывали клетки покоящихся и активированных к пролиферации лимфоцитов, экстрагированные 2М NaCl в присутствии неионного детергента (рис. 7). Эта процедура позволяет удалить из ядра растворимую форму топоизомеразы, в силу чего расщепление ДНК происходит исключительно в участках ее прикрепления к ядерному матриксу. Можно видеть, что после высокосолевой экстракции без обработки VM26 деградации ДНК не происходит ни в активированных, ни в покоящихся лимфоцитах. При обработке VM26 предэкстрагированных 2М NaCl активированных лимфоцитов происходит фрагментация ДНК, аналогичная той, что наблюдалась in vivo. Расщепление ДНК нормальных лимфоцитов и в этом случае происходит случайно.

Отсутствие специфической фрагментации ДНК нормальных лимфоцитов в присутствии VM26 может быть объяснено двумя причинами: либо небольшим количеством топоизомеразы II в непролиферирующих клетках, либо различиями в способе упаковки хроматина в непролиферирующих и пролиферирующих клетках.

Для того, чтобы выбрать одну из двух возможных причин, пермеабилизованные активированные и неактивированные лимфоциты обрабатывались экзогенной нуклеазой Ва131. Препараты

Рис. 5. Анализ специфичности, расщепления эндогенной

топоизомеразой Н ДНК нормальных (А) и активированных

к пролиферации (В) лимфоцитов крови человека.

а, Ь • результаты электрофореза в пульсирующем поле;

с, Л - результаты гибридизации, с пробой, содержащей ген 288 РНК.

Рис. 6. Анализ специфичности расщепления геномной ДНК нормальных

(А) и активированных к пролиферации (В) пермеабилизованных

лимфоцитов крови человека нуклеазой Ва131.

а, Ъ - результаты электрофореза в пульсирующем поле;

с, й. - результаты гибридизации с пробой, содержащей ген 28Э РНК.

12 3 4

Рис. 7.

Результаты гибридизации фрагментов ДНК, выщепляемых УМ26 из экстрагированных 2М N001 нормальных (2, 4) и активированных к пролиферации (I, 3) лимфоцитов.

1, 2 • инкубация в отсутствие УМ26; 3, 4 - материал из клеток, обработанных УМ26 в концентрации 50мкг/мл.

ДНК анализировались так же, как и ДНК клеток, обработанных. УМ 26. Как видно из рис. 6, обработка пермеабилизованных лимфоцитов Ва131 ведет к фрагментации ДНК как активированных, так и неактивированных лимфоцитов, однако, для фрагментации ДНК неактивированных лимфоцитов требовалось большее время обработки нуклеазой. Гибридизация выщепленных фрагментов ДНК с фрагментом рибосомного гена выявила специфический паттерн полос рибосомных генов в случае активированных лимфоцитов (рис 6В-с1) и не выявила специфичности фрагментации ДНК неактивированных лимфоцитов (рис. 6А-с). Эти результаты позволяют нам утверждать, что специфичность фрагментации эукариотического генома зависит от пролиферативного статуса клеток и меняется при переходе из состояния покоя в состояние деления. Это может указывать на то, что изменение пролиферативного статуса клеток сопровождается пространственной реорганизацией генома. Возможно, что в пролиферирующих клетках участки начала репликации прикреплены к ядерному матриксу , и арест пролиферации происходит посредством разрушения или реорганизации этих участков.

3. Изучение специфичности крупномасштабной фрагментации ДНК эукариотических клеток в процессе апоптоза.

Одним из существенных признаков апоптоза (программированной клеточной смерти) является расщепление клеточной ДНК эндогенными нуклеазами. Исследования последних лет показали, что в ходе апоптоза деградация ДНК на высокомолекулярные фрагменты (50-600 т.п.н.) происходит раньше расщепления на олигонуклеосомные фрагменты. Несмотря на то, что предположения о том, что эти фрагменты являются петлями

Линия клеток Способ индукции с^рз&гти Процент

апоптоза (час) мертвых

клеток

11РМ1-64Ш без обработки 48 8

КРМ1-64^ ФНО (5 ед/мл) + актиномицин О (1 мкг/мл) 48 64

11РМ1-64Ш ФНО (10 ед/мл) + актиномицйн Б (1 мкг/мл) 48 72

НаД без обработки 0 5

ФНО (5 ед/мл) + актиномицин Б (1 мкг/мл) 48 70

Ь929 ФНО (5 ед/мл) 0 5

Ь929 ФНО (5 ед/мл) 12 57

Ь929 ФНО (5 ед/мл) 18 76

К562 инкубация в среде без сыворотки 24 7

К562 инкубация в среде без сыворотки 96 68

К562 инкубация в среде без сыворотки 168 95

инкубация в среде без сыворотки 24 5

инкубация в среде без сыворотки 96 75

11аД инкубация в среде 168 100

без сыворотки

Табл. 1. Оценка цитотоксического действия при индукции апоптоза.

ДНК , выдвигались многими исследователями, экспериментальных подтверждений этому не было. Для исследования природы высокомолекулярных продуктов деградации ДНК в ходе апоптоза нами был индуцирован апоптоз в нескольких линиях клеток различными способами (табл. 1).

Человеческие лимфобластоидные клетки ИРМ1 64101 ийад были введены в апоптоз обработкой рекомбинантным белком ФНО (фактор некроза опухолей) с предварительной остановкой транскрипции актиномицином Б. Клетки мышиных фибробластов Ь929, чувствительные к ФНО независимо от ингибирования транскрипции, обрабатывались одним ФНО. В клетках эритролейкемии человека линии К562 и клетках Лад апоптоз был вызван длительной инкубацией без сыворотки. Во всех случаях индукции апоптоза большой процент клеток имел ярко выраженную « апоптотическую * морфологию.

Рис. 8. Анализ специфичности крупномасштабной фрагментации геномной ДНК в процессе апоптоза, индуцированного ФНО. А - результаты электрофореза в пульсирующем поле. В - результаты гибридизации с пробой, содержащей последосательность 28 Я РНК. 1 - клетки НРМ164101, обработанные УМ26 в концентации 50 мкг/мл. 2-4 - фрагментация ДНК клеток В.РМ164101, предварительно обработанных актиномицином, X) (1 мкг/мл) и культивированных: в течение 48 часов в отсутствие ФНО, в присутствие 5 ед/мл ФНО и 10 ед/мл ФНО соответственно. 5-7 - фрагментация ДНК клеток 1,929, культивированных в приутствие 5 ед/мл ФНО в течение 0, 12 и 18 часов соответственно.

24

96

168

Рис. О. Анализ специфичности крупномасштабной фрагментации ДНК клеток К562 при индукции апоптоза инкубацией в среде без сыворотки. А -электрофорез в пульсирующем поле. В - гибридизация с пробой, содержащей ген 288 РНК. Цифрами указано время инкубации в часах.

4— 150 т.п.н. ^— 50 т.п.н.

24 96 168

X Hind III

Рас. 10. Препараты ДНК, выделенной после инкубации, клеток К562 без сыворотки, разделенные электрофорезом в 2% агарозном геле. Линиями справа указана позиция маркера.

При анализе ДНК этих клеток электрофорезом в пульсирующем поле большая часть материала обнаруживается в области 50-600 т.п.н. (Рис. 8А, 9А).

В отличие от других исследователей (ЕШрзМ еЬ а1., 1990) мы не обнаружили преимущественной концентрации материала в области 300 т.п.н. и можем объяснить появление такой зоны в работах других исследователей использованием ими электрофореза в инверсионном поле, что часто ведет к искажениям в электрофоретическом разделении высокомолекулярной ДНК.

Представляется интересным, что при разделении препаратов ДНК, выделенной после инкубации клеток без сыворотки обычным электрофорезом,

появление классического набора олигонуклеосомных фрагментов наблюдается только после 168 часов инкубации без сыворотки (рис. 10).

Для проверки предположения о том, что выщепленные в ходе апоптоза высокомолекулярные фрагменты являются петлями и их олигомерами, нами была проведена гибридизация с меченным фрагментом ДНК, содержащим последовательности, кодирующие 28S и 18S РНК. Как видно из рисунков 8В, 9В, в результате гибридизации с рибосомальной ДНК выявляется регулярный паттерн полос с шагом между полосами, равным размеру единицы рибосомального повтора (44 т.п.н.). Важным представляется тот факт, что такой же паттерн полос появляется в результате аналогичной гибридизации продуктов расщепления ДНК эндогенной топоизомеразой II.

Однако, рибосомальные гены являются уникальным случаем регулярного повтора. Поэтому для окончательного подтверждения нашего предположения была проведена гибридизации фрагментов

В

1 2 3 4 5 6 7

Ж

m lili Щзк

Рис. 11. Анализ специфичности расцепления локуса гена с-тус в клетках К562, индуцированных к вступлению в апоптоз инкубацией без сыворотки. А - разделение фрагментов ДНК электрофорезом в пульсирующем поле. В - Гибридизация разделенных фрагментов с радиоактивной пробой, содержащей 3-й зкзон гена с-мус. 1 -конкатемеры бактериофага Л; 2 - ДНК клеток, обработанных VM26 (50мкг/мл); 3-7 - ДНК из клеток, инкубированных без сыворотки 120, 96, 48, 24 и О часов соответственно.

ДНК, выщепленных в ходе апоптоза, с уникальным человеческим геном - участком третьего экзона с-шус (рис. 11). Гибридизация как фрагментов ДНК, выщепляющихся в ходе апоптоза, так и фрагментов ДНК, являющихся результатом действия эндогенной топоизомеразы II, выявляет одну четкую полосу размером 80 т.п.н., соответствующую размеру петли ДНК, в которой находится этот ген.

Таким образом, можно сделать вывод, что ДНК эукариотических клеток в ходе апоптоза независимо от способа его индукции деградирует на петли ДНК и их олигомеры.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что участки прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу предпочтительно атакуются нуклеазой Ва131 при обработке этой нуклеазой пермеабилизованных клеток.

2. Продемонстрировано, что при изменении пролиферативного статуса клеток происходит реорганизация участков прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу.

3. Продемонстрировано, что крупномасштабная фрагментация ДНК на начальных стадиях апоптоза происходит специфическим образом посредством вырезания петель ДНК и их олигомеров.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

1. Лагарькова М.А., Разин С.В. Расщепление генома на структурно-функциональные домены in vivo топоизомеразой II типа. ДАН, 1993, т.330, №3, стр. 383-385

2. Яровая О.В., Лагарькова М.А., Разин С.В. Пространственная организация кластера рибосомных генов человека зависит от репликативного статуса клеток. ДАН, 1995, т. 340, №2, стр. 276-278.

3. Лагарькова М.А., Яровая О.В., Гнучев Н.В., Разин С.В. Обработка пермеабилизованных клеток нуклеазой Ва131 ведет к вырезанию петель из генома. ДАН, 1995, т. , № , стр.

4. larovaia O.V., Lagarkova М.А., Razin S.V. The specificity of the eukaryotic genome long range fragmentation by endogenous topoisomerase II in living cells and in high salt - extracted nuclei depends on cell proliferation status. Biochemistry, 1995, V.34, №12, p.4133-4138.

5. Lagarkova M.A., larovaia O.V., Razin S.V. Excision of chromosomal DNA loops by treatment of permeabilized cells with nuclease Bal31. MGG, 1995, V , № , p.

6. Lagarkova M.A., larovaia O.V., Razin S.V. Large-scale fragmentation of mammalian DNA in the course of apoptosis proceeds via excision of chromosomal DNA loops and their oligomers. Journal of Biological Chemistry, 1995, V.270, №35, p.1-3.

7. Лагарькова M.A., Яровая О.В., Разин С.В. Изучение специфичности крупномасштабной фрагментации ДНК эукариотических клеток в процессе апоптоза. ДАН, 1995, в печати.

8. Razin S.V., larovaia O.V., Lagarkova М.А., Gromova I.I. and Hancock R. Functional architecture of the chromosomal DNA domains. J. of Cell. Biochem., Suppl. 21B, p.120.