Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Петельно-доменная организация хромосом животных

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Глазков, Михаил Васильевич, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт общей генетики им.Н.И. Вавилова

.5 СЖТОРА

наук

' « V Россия ЗКО

УДК 575.113.1;576.316

хашгЧЗ^сизтьевич

ИЕТЕЛЬНО-ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ХРОМОСОМ ЖИВОТНЫХ

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук (генетика - 03.00.15)

Москва 1999 г

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ:

ГСПХ - гранулярный слой периферического хроматина;

ДТТ - дитиотреитол;

ИГ - иммуноглобулины;

мДНК - фрагменты хромосомной ДНК, прочно связанные с ядерным

матриксом; ПААГ - полиакриламидный гель;

СК - синаптонемный комплекс;

скДНК - фрагменты хромосомной ДНК, выделенные из СК;

слДНК - «случайные» фрагменты ДНК, смоделированные на основе равномерного распределения всех 4-х нуклеотидов с помощью датчика случайных чисел; срДНК - фрагменты хромосомной ДНК, выделенные из сердцевин

розетко-подобных структур; ФМСФ - фенилметилеульфонилфторид;

2-м.э. - 2-меркаптоэтанол;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

ялДНК - фрагменты хромосомной ДНК, выделенные из ядерной ламины;

яоДНК - фрагменты хромосомной ДНК, выделенные из ядерных оболочек;

5'флДНК - фрагменты ДНК, фланкирующие 5'-области ткане-специфич-

ных эукариотических генов; ARBP - Attachment Region Binding Protein;

ARS - автономно реплицирующиеся сегменты ДНК;

BSA - бычий сывороточный альбумин;

CNM - Chicken Nuclear Membrane; DCR - Dominant Control Region; HMG - High Mobil Group; HRE - Hormone Responsive Element; LCR - Locus Control Region;

LINE - длинные диспергированные по геному повторы ДНК; LIS - 3', 5'-дииодосалицилат лития; MARs/SARs - Matrix/Scaffold Associated Regions; ra-AMSA - amsacrine;

RAP-1 - Repressor Activator Binding Protein-1;

SAF-A - Scaffold Attachment Factor A;

SAF-B - Scaffold Attachment Factor B;

SATB1 - Special AT-rich Sequence-Binding Protein 1;

scs/scs' - specialized chromatin structures;

SINE - короткие диспергированные по геному повторы ДНК;

SDS - додецил сульфат натрия;

VM26 - teniposide;

5'HS, 3'HS - сверхчувствительные к ДНКазе I сайты, располагающиеся в 5'- и в 3'-областях генов, соответственно;

ОГЛАВЛЕНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ....................................................................................10

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................15

ПЛ. Интерфазные хромосомы соматических клеток............................15

II. 1.1 .Ультраструктурный анализ интерфазных хромосом......................15

II. 1.2. Нуклеазный метод анализа организации интерфазных хромосом... .18

II. 1.3. Ассоциация интерфазных хромосом с ядерной оболочкой..............19

11.2. Петельная организация метафазных хромосом...........................30

11.2.1. Линейная неоднородность метафазных хромосом.......................33

И. 3. Петельная организация хромосом в мейозе................................36

11.4. Нуклеоиды - экспериментальная модель для изучения петельной организации хромосомной ДНК в интерфазных ядрах...................40

Н.4.1. Молекулярный анализ нуклеоидов...............................................40

П.4.2. Электронно-микроскопический анализ нуклеоидов

и лишенных гистонов интерфазных хромосом.............................48

11.5. Ядерный матрикс.......................................................................52

11.5.1. Состав ядерного матрикса............................................................52

Н.5.2. Остаточные ядерные белки,

ассоциированные с хромосомной ДНК.....................................56

II.5.3. Нуклеотидные последовательности хромосомной ДНК,

ассоциированные с ядерным матриксом....................................62

П.5.4. Репликация хромосомной ДНК и ядерный матрикс......................68

II.5.5. Транскрипция хромосомной ДНК и ядерный матрикс...................74

II.6. Петелъно-доменная организация генов в

эукариотическга хромосомах......................................................83

11.6.1. Методы выявления MARs/SARs эукариотических хромосом.........84

11.6.2. MARs/SARs в хромосомных доменах генов..................................88

11.6.3. Характерные черты структурной организации MARs/SARs.........102

11.6.4. Функции MARs/SARs...............................................................111

11.6.5. MARs/SARs и внутриядерные структуры.................................115

11.6.5.1. Индивидуальные белки ядерного скэффолда,

специфически связывающие MARs/SARs..................................116

11.6.5.2. ДНК топоизомераза II и петельная организация хромосом........124

11.6.5.3. Внутриядерные структуры, с которыми

взаимодействуют MARs/SARs.................................................128

11.6.6. MARs/SARs и границы структурно-функциональных

единиц хромосом животных и растений......................................129

III. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.................... ..............................148

III. 1. Выделение ядер гепатоцитов мыши и крысы.............................148

111.2. Выделение и фракционирование ядер

сперматогониальных клеток мыши и крысы.................................148

111.3. Выделение нуклеоидов гепатоцитов крысы...............................149

111.4. Выделение нуклеоидов сперматогониальных клеток крысы..........150

111.5. Выделение ядерного матрикса гепатоцитов и

сперматогониальных клеток крысы..............................................150

III.6. Выделение ядерных оболочек гепатоцитов мыши.........................150

III. 7. Седиментационный анализ нуклеоидов гепатоцитов крысы..........151

III. 8. Выделение мДНК гепатоцитов и сперматогониальных

клеток крысы.....................................................................152

III. 9. Электронная микроскопия...........................................................152

III. 10. Флуоресцентная микроскопия....................................................153

III. 11. Электрофоретический анализ ДНК..............................................153

III. 12. Гибридизационные эксперименты..............................................154

III. 13. Трансформация клеток Е. coli и выделение плазмидных ДНК......154

III. 14. Клонирование и определение первичной нуклеотидной последовательности "структурных" участков интерфазных

хромосом...........................................................................155

III. 15. Выделение фрагментов ДНК из плазмид..................................156

III. 16. Анализ специфичности связывания фрагментов срДНК

и яоДНК с хромосомными/ядерными субструктурами..................157

III. 17. Анализ белков в ПААГ и ЭФ-перенос белков на мембрану...........158

III. 18. Вестерн-блот анализ хромосомных/ядерных белков....................158

III. 19. Радиоавтография гелей..............................................................159

III.20. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК.. 159

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...............................................160

IV. 1. Нуклеоиды и ядерный матрикс гепатоцитов и сперматоцитов... 160

IV. 1.1. Седиментационный анализ нуклеоидов гепатоцитов крысы.......161

IV. 1.1.1. Седиментационный анализ нуклеоидов

в градиенте сахарозы, содержащем ЭДТА..............................161

IV. 1.1.2. Седиментационный анализ нуклеоидов

в градиента сахарозы, не содержащем ЭДТА..........................162

IV. 1.2. Флуоресцентный анализ нуклеоидов гепатоцитов крысы............164

IV. 1.3. Электронно-микроскопический анализ

нуклеоидов гепатоцитов крысы...............................................168

IV. 1.3.1. Морфология нуклеоидов на отдельных

этапах их выделения.............................................................168

IV. 1.3.2. Интеркалирующие в ДНК агенты и морфология нуклеоидов ... 171

IV. 1.3.3. Ионы меди и морфология нуклеоидов...................................172

IV. 1.3.4. Дисульфидные связи и морфология нуклеоидов.....................175

IV. 1.4. Транскрипционная организация хромосомной ДНК................179

IV. 1.5. Линейная неоднородность интерфазных хромосом.................183

IV. 1.6. Репликативная организация хромосомной ДНК.....................186

IV. 1.7. Организация ДНК в лишенных гистонов

ядрах сперматогониальных клеток.........................................190

IV. 1.8. Морфология остаточных ядерных структур

соматических и мейотических клеток.....................................199

IV. 1.9. Фрагменты мДНК соматических и мейотических клеток........204

IV. 1.9.1. Общая характеристика фрагментов мДНК

соматических и мейотических клеток...................................204

IV. 1.9.2. В-подобные повторы в составе ядерных матриксов

соматических и мейотических клеток...................................209

IV. 1.10. Обсуждение результатов......................................................212

ГУ.2. Хромосомные домены............................................................225

1У.2.1. Выделение субструктур интерфазных хромосом мыши,

различающихся по чувствительности к ДНКазе 1....................226

IV.2.2. Локализация транскрипционно-активных и неактивных генов во фракциях хроматина, различающихся по чувствительности

к ДНКазе 1.........................................................................231

IV.2.3. Организация генов каппа-ИГ в элементарных хромомерах..........232

IV.2.4. Фрагменты срДНК интерфазных хромосом...........................238

1У.2.4.1. Специфичность фрагментов срДНК...................................239

ГУ.2.4.2. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов

срДНК................................................................................239

IV.2.4.3. Специфичность ДНК-белковых взаимодействий

при формировании розетко-подобной организации

интерфазных хромосом....................................................253

Г/.2.4.4. Специфичность ДНК-белковых взаимодействий при

ассоциации интерфазных хромосом с ядерной оболочкой.........254

IV.2.4.5. Белковые сердцевины розетко-подобных структур и ядерные оболочки "узнают" разные

конформационные состояния ДНК.....................................258

IV.2.4.6. ДНК-связывающие белки розетко-подобных структур

интерфазных хромосом....................................................259

IV.2.4.7. ДНК топоизомераза II - компонент сердцевин

розетко-подобных структур....................................................263

IV.2.6. Триплексные структуры ДНК и компактизация

хромосомных доменов генов..................................................263

IV.2.6.1. Компьютерное моделирование компактизации

хромосомных доменов генов.............................................266

IV.2.7. Фрагменты яоДНК гепатоцитов мыши.....................................273

IV.2.7.1. Специфичность фрагментов яоДНК гепатоцитов мыши...........273

IV.2.7.2. Эволюционная консервативность

фрагментов срДНК и яоДНК.............................................274

IV.2.7.3. Анализ нуклеотидных последовательностей

яоДНК гепатоцитов мыши...............................................275

IV.2.8. Компьютерный анализ фрагментов ДНК,

предположительно участвующих в петельной организации хромосом животных и растений...........................................281

IV.2.9. Обсуждение результатов..........................................................287

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................. .................307

VI. ВЫВОДЫ....................................................................316

VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................320

I. ВВЕДЕНИЕ

Хромосомы играют главную роль в процессах роста, развития, наследственности и эволюции живых организмов (Восток, Самнер, 1981). Это обусловлено основной функцией хромосом - носителей генетической информации и является причиной существования одного из разделов общей генетики - цитогенетики (Суонсон и др., 1969). "Современная цитоге-нетика выходит за рамки простого изучения передачи и непрерывности генов и хромосом. Она исследует также строение хромосомы на молекулярном уровне и устанавливает связи между молекулярной структурой и генетическими функциями" (Суонсон и др., 1969). Это обусловливает широкий размах исследований и большое разнообразие подходов в изучении структурно-функциональной организации хромосом.

В настоящее время накоплен большой фактический материал о структурной организации эукариотических хромосом, о структуре генов и регуляции их активности (см.: Кикнадзе, 1972; Ченцов, Поляков, 1974;.Восток, Самнер, 1981; Льюин, 1987; Георгиев, 1989; Прокофьева-Бельговская, 1986; Збарский, Кузьмина, 1991; Жимулев, 1992,1994). Однако, например, такие классические вопросы цитогенетики, как: организация генов в отдельных структурных единицах хромосом, преобразование этих субструктур при активации или репрессии генов, роль пространственной организации хромосом в ядре в функционировании (репликации, транскрипции, ре-

комбинации) генетического материала остаются до сих пор не вполне ясными. Эти вопросы на протяжении многих лет исследовались цитологическими и классическими генетическими методами. Использование новых молекулярно-генетических, иммуноцитохимических методов исследований, модельных систем (нуклеоиды, ядерный матрикс, система рекомбинации in vitro) позволило перейти в изучении структурно-функциональной организации эукариотических хромосом на качественно новый уровень. В частности, было установлено, что единство структурных и функциональных единиц генетического материала реализуется на петельном уровне организации хромосом. В результате был сформулирован петельно-домен-ный принцип организации хромосом (Benyajati, Worcel, 1976; Igo-Keme-nes, Zachau, 1978).

Изучение петельной организации хромосомной ДНК позволило установить многие элементы принципов организации генов в эукариотических хромосомах, механизмов регуляции дифференциальной активности генов, механизмов реорганизации структуры самих хромосом. Установление петельно-доменного принципа организации генов в хромосомах легло в основу нового направления в конструировании трансгенов при создании трансгенных животных и растений (Stief et al., 1989; Bonifer et al., 1990; Poljak et al., 1994; Thompson et al., 1994; Yu et al., 1994), что направлено на практическое использование результатов фундаментальных

исследований в медицине, селекции сельскохозяйственных животных и растений.

Установлено, что отдельные участки хромосомной ДНК вовлекаются в структуризацию эукариотических хромосом и генов в хромосомах (Gasser, Laemmli, 1987; Gasseretal., 1989; Phi-Van, Stratling, 1990; Laemmli et al., 1992), а также могут быть компонентами "рекомбинационной машины" эукариотов подобно Chi-сайту Е. coli (Steinmetz et al., 1987; Jardan, Wells, 1989; Murnane, 1990; Rudiger et al., 1995). Показано (Earnshaw et al., 1985; Gasser et al., 1986; Moens, Earnshaw, 1989), что некоторые ферменты, например, ДНК топоизомераза II, могут являться также структурными белкам эукариотических хромосом. Такая двойственная роль некоторых участков хромосомной ДНК (выполняющих собственно генетическую функцию и участвующих в структуризации хромосом) или хромосомных белков (обладающих ферментативной активностью и вовлекаемых в структуризацию хромосом) является одним из примеров взаимосвязи структурной и функциональной организации эукариотических хромосом.

Однако, например, цитологические и цитогенетические данные о линейной неоднородности хромосом животных полностью не учитываются в молекулярно-генетических исследованиях структурно-функциональной организации генетического материала эукариот и в соответствующих моделях организации хромосом (Igo-Kemenes, Zachau, 1978; Hancock, 1982; Bodnar, 1988; Filipski et al., 1990).

В некоторых цитологических исследованиях (Sonnenbichler, 1969; Comings, 1978; Okada, Comings, 1979; Zatsepina et al., 1983; Prusov et al., 1983; Martinkina et al., 1983; Зацепина и др., 1985) в составе интерфазных и метафазных хромосом выявлены розетко-подобные структуры, получившие название "элементарные хромомеры" (Zatsepina et al., 1983). Показано (Зацепина и др., 1985; Zatsepina et al., 1989), что элементарные хромомеры преимущественно локализуются в G-сегментах метафазных хромосом животных и в дисках политенных хромосом дрозофилы, в то время как R-сегменты метафазных хромосом и междисковые участки политенных хромосом обеднены этими субструктурами. Таким образом, неравномерное распределение хромомеров вдоль хромосомы может быть структурной основой линейной неоднородности не только метафазных, но и интерфазных хромосом. Однако, элементарные хромомеры совершенно не изучены с молекулярно-генетической точки зрения.

В связи с изложенным выше, были сформулированы цели настоящего исследования. Основной задачей данной работы являлось изучение принципов структурно-функциональной организации хромосом животных с целью установления связи между их молекулярной структурой и выполняемыми генетическими функциями. При этом особое внимание было уделено совместному использованию цитологических и молекулярно-генети-ческих методов исследования эукариотических хромосом. В частности, конкретные задачи работы состояли в следующем:

1. Провести электронно - микроскопический анализ структурно-функциональной организации лишенных гистонов хромосом соматических и мейотических клеток.

2. Отработать условия выявления и разработать метод выделения структурных единиц эукариотических хромосом - элементарных хромомеров, имеющих розетко-подобную организацию.

3. Провести анализ генетического содержания элементарных хромомеров.

4. Исследовать принципы организации генов в элементарных хромомерах.

5. Выделить, клонировать, определить первичную нуклеотидную последовательность "структурных" участков интерфазных хромосом, провести анализ их структурно-функциональной организации.

6. Исследовать молекулярные механизмы формирования розетко-подобной организации хромомеров.

7. Изучить возможность локализации ДНК топоизомеразы II в сердцевинах розетко-подобных структур (элементарных хромомерах).

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Хромосомы являются сложными, многокомпонентными внутриядерными структурами, идеально приспособленными для выполнения основных функций генетического материала (стабильность, изменчивость, редупликация, реализация генетической информации). При этом структурная и пространственная организация хромосом в ядре прямо направлены на выполнение тех или иных функций. Это находит свое отражение в различных типах организации хромосом на стадиях интерфазы и метафазы соматических клеток, на различных стадиях мейоза.

II.1. Интерфазные хромосомы соматических клеток II. 1.1. Ультраструктурный анализ интерфазных хромосом

В настоящее время выделяют несколько уровней организации хроматина: 10 нм-, 25-30 нм-, 100-200 нм фибриллы (Igo-Kemenes et al, 1982; Martinkina et aL, 1983; Zatsepina et al., 1983; Chentsov et al., 1984; Горнунг и др., 1986a,6; Tsanev, Tsaneva, 1986). На электронно-микроскопических препаратах 10 нм фибриллы хроматина имеют вид "бус на нитке". "Бусы" соответствуют нуклеосомному кору, а "нитки" - межнуклеосомным участкам. ДНК в составе нуклеосомы регу