Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ протеолитической активности в ядерных фракциях при прорастании семян пшеницы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вафина, Гюльнар Хамидовна, Уфа

УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РОССТЩСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

Институт Биологии

На правах рукописи

Вафина Гюльнар Хамидовна

АНАЛИЗ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ В ЯДЕРНЫХ ФРАКЦИЯХ ПРИ ПРОРАСТАНИИ СЕМЯН ПШЕНИЦЫ

( 03. 00. 04 - биохимия)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

д. б. н. Иванова Э.А.

Уфа 1998 г.

СОДЕРЖАНИЕ •

стр.

ВВЕДЕНИЕ ............................................ 4

ГЛАВА I. Структурно-функциональные особенности

организации клеточных ядер...............6

1.1. Структурно-функциональные особенности надмолекулярных структур клеточных ядер...........................б

1.1.1. Нуклеоплазма.............................9

1.1.2. Хроматин.................................11

1.1.3. Ядерный матрикс..........................18

1.1.4. Заключение...............................27

1.2. Ограниченный протеолиз...................28

1.2.1. Протеиназы клеточных ядер................28

1.2.2. Протеиназы нуклеосом..................35

1.2.3. Заключение...............................36

ГЛАВА II. Объекты исследования и методика работы...38

2.1. Выбор объекта............................38

2.2. Изолирование клеточных ядер..............51

2.3. Получение ядерных фракций................55

2.4. Определение содержания белков и нуклеиновых кислот и углеводов...........58

2.5. Аффинная хроматография ядерных про-теиназ и ингибиторов.....................60

2.6. Определение протеолитической активности ....................................65

ГЛАВА III. Анализ надмолекулярных структур клеточных ядер (ядерных фракций) в процессе развертывания морфогенетичес-кой программы развития в течение гетеротрофной фазы онтогенеза (результаты и их обсуждение)....................77

3.1. Результаты экспериментов с надмолекулярными структурами клеточных ядер пшеницы Мироновской....................77

3.1.1. Физиологическая оценка зародышей и проростков сорта пшениц Мироновской, используемых для выделения клеточных ядер и их надмолекулярных структур, в период гетеротрофной фазы ювениль-ного онтогенеза........................77

3.1.2. Анализ протеиназ и ингибиторов из ядерных фракций растущих проростков пшеницы методом аффинной хроматографии ....................................80

3.2. Результаты экспериментов с надмолекулярными структурами клеточных ядер пшеницы Московской-35 (урожай 1986 г. )...............................90

3.2.1. Физиологическая оценка зародышей и проростков сорта пшеницы Московской-35 (урожай 1986 г.), используемых для выделения клеточных ядер и их надмолекулярных структур...................90

3.2.2. Анализ методом аффинной хроматографии ядерных фракций на содержание "трип-синоподобных" протеиназ и "ингибиторов" трипсина в растущих проростках пшеницы................................93

3.3. Результаты экспериментов с надмолекулярными структурами клеточных ядер пшеницы Московской-35 (урожай 1988 г. )...............................98

3.3.1. Физиологическая оценка зародышей и

проростков пшеницы, используемых для

выделения клеточных ядер, в период

гетеротрофной фазы онтогенеза..........98

3.3.2. Активность "трипсиноподобных" протеи-наз (ТП-) и их "ингибиторов" (ИТ-) в надмолекулярных структурах клеточных ядер (субстрат протамин)...........103

3.3.3. Анализ ядерных фракций на содержание "трипсиноподобных" протеиназных (ТП-) и (ИТ-) комплексов в растущих проростках пшеницы методом аффинной хроматог-

рафии..................................110

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................111

V. ВЫВОДЫ....................................115

VI. ЛИТЕРАТУРА................................116

ВВЕДЕНИЕ

Проблема исследования молекулярно-генетических основ онтогенеза у растений является актуальной. Одним из подходов к анализу этого вопроса может быть исследование функциональной активности клеточных ядер. В 1988 г. и 1991 г. вышло в отечественной научной литературе две книги: И.Б.Збарского "Организация клеточного ядра" [42] и И.Б.Збарского, С.Н.Кузьминой "Скелетные структуры клеточного ядра" [43]. Эти книги представляют сводку мировой и отечественной литературы по всем аспектам структурной нефункциональной организации клеточных ядер, главным образом, представленных животными объектами. Что касается растительных объектов, то в вышепредставленных источниках имеются обрывочные сведения по растительным объектам.

В настоящее время ограниченный протеолиз рассматривается как одна из стадий посттрансляционной модификации белков [61, 62]. На уровне ядерных белков этот процесс взаимосвязан с реализацией, хранением и воспроизведением генетической информации [30].

Цель данной работы изучить закономерности проявления ограниченного протеолиза в ядерных фракциях в течение прорастания семян пшеницы.

В нашей работе в качестве объекта исследования молекулярно-генетических основ индивидуального развития растительного организма были использованы семена пшеницы, которые проращивали в течение гетеротрофной фазы онтогенеза и через определенные интервалы (24 ч), начиная от воздушно-сухого зародыша (0 ч) до окончания роста колеоптиля (120 ч), выделяли клеточные ядра и их фракции (нуклеоплазму, хроматин, ядерный матрикс) из отдельных органов проростков. О функциональной активности ядерных фракций судили по наличию ограниченного трипсиноподобного протеолиза и его ингибирования.

В нашу задачу входило изучение: 1. Провести отбор относительно физиологически равноценных семян и растущих проростков;

2. Определить количество клеток в органах растущих проростков;

3. Определить трипсиноподобную протеолитическую активность в ядерных фракциях;

4. Определить ингибитор-трипсиновую активность в ядерных фракциях;

5. Выделить методом аффинной хроматографии трипсиноподобные протеиназы и ингибитор-трипсиновые компоненты из ядерных фракций;

6. Определить компонентный состав трипсиноподобных протеиназ и их ингибиторов из ядерного матрикса.

Принятые сокращения и обозначения: Хр-1 - хроматин неп-рочносвязанный с ядерным матриксом; Хр-11 - хроматин прочносвя-занный с ядерным матриксом; ЯМ - ядерный матрикс; Я0- ядерный остаток; ТП- трипсиноподобные протеолитические комплексы; ИТ-ингибитор-трипсиновые комплексы; ТЭА - триэтаноламин; БАЭЭ•НС1 - Ы-бензоил-аргинин этиловый эфир; БА - бензоил аргинин; ШУЮ -высокоподвижная группа белков; ЬМС - низкоподвижная группа белков; ЭПР - эндоплазматический ретикулум;

- б -

ГЛАВА I

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ

КЛЕТОЧНЫХ ЯДЕР

1.1 Структурно-функциональные особенности надмолекулярных структур клеточных ядер

Оформленное клеточное ядро хорошо просматривается в обычном световом микроскопе только в интерфазе клеточного цикла. Перестройка внутриядерных структур в митозе является настолько значительной, что до последнего времени в этом вопросе остается еще много неясного [68, 121]. Ядра соматических и гаплоидных клеток высших эукариот в зависимости от типа клетки обладают определенными морфологическими и позиционными характеристиками. По-видимому, неоднозначная ориентация ядер в клетках имеет определенный физиологический смысл [16, 42, 86]. Диаметр ядер находится в пределах от 1 до 10 мкм [42]. Большинство клеток имеют по одному ядру, однако, существуют двуя-дерные (некоторые клетки печени, хрящевой ткани) и многоядерные (поликариоциты костного мозга, волокна поперечно-полосатых мышц, а также ткани генеративного периода развития некоторых растений [88]). Многоядерные клетки могут обнаруживаться при развитии ряда патологических и физиологических процессов. Наиболее часто они встречаются в очагах воспаления и опухолевом росте [81].

В последние годы были получены сенсационные результаты по искусственному получению клеточных ядер, которые не только морфологически, но и функционально не отличались от естественных [142]. Микрургические исследования значительно уточнили наши представления о физиологии ядра [83]. Вязкость ядра меньше, чем у цитоплазмы. По отношению к воде вязкость цитоплазмы в два раза превосходит ядерную. рН ядра щелочнее цитоплазмы (рН 7.78) [83]. В ядерной оболочке высших растений около 3 ООО пор. В световом микроскопе ядерная мембрана (кариотека) не

м ГУ /с/эоггуэу-'¿е^ое/ггека.

фогерКеи / ет.

кл бт^гс

у/эаг-

' ио-nJ/Odf

i елифаза

СЖОСО&-Ы

Рис. 1.1.1. Схема фаз митоза (М.С.Ledbetter, К.R.Porter 1970) [см. 82]

'¿г.

¥

Рис. 1.1.2. Модификация ядер в течение митоза [182]

видна, но электронная микроскопия показывает, что она образует непрерывную систему с мембраной эндоплазматического ретикулума (ЭПР), а приядерное пространство связано с внутренним пространством эндоплазматических ретикулярных трубочек и пузырьков [88]. Несмотря на чрезвычайное разнообразие в морфологии клеточных ядер у различных представителей эукариот, их общие функции, внутренний план организации, биологическая роль неизменны и однотипны [42, 113].

Клеточные ядра в течение клеточного цикла разбираются и собираются вновь (см. рис. 1.1.1; 1.1.2). Есть типы клеток (ситовидные трубки высших растений, эритроциты млекопитающих), в которых на протяжении большей части жизни ядро отсутствует. Оно имеется только в тот период, когда клетка не полностью дифференцирована. Такие безъядерные клетки, по мнению К.Свенсон, П.Уэбстера [88], не способны к делению и живут относительно недолго.

1.1.1 Нуклеоплазма

Биохимически нуклеоплазма отделяется от клеточного ядра при низкой ионной силе раствора. Подробно пока изучена нуклеоплазма ооцитов, в которой обнаруживается кариофильный белок -нуклеоплазмин с ММ 165 ООО дальтон, представляющий собой кислый пентамер [125, 126]. Его роль заключается в сборке нуклео-сом путем образования комплексов с гистонами. Для нуклеоплаз-мина впервые был применен термин "шаперон". Это семейство неродственных белков, обнаруженных в клетках всех типов способных специфически связываться со взаимодействующими поверхностями белков. Считают, что шапероны не несут информацию о структуре белка, а лишь катализируют этапы сборки, сдвигая равновесие в направлении "правильного" пути [132]. В настоящее время поиски шаперонов привели к предложению следующей их классификации : 1. нуклеоплазмины - ядерные белки, участвующие в сборке нуклеосом; 2. шаперонины - шапероны прокариот, митохондрий, хлоропластов; 3. hsp 70 - Bip - группа белков тепло-

вого шока [51 ] .

Предполагают, что нуклеоплазма через перинуклеарное пространство и эндоплазматический ретикулум сообщается с внеклеточной средой [45]. Ядерно-цитоплазматические отношения осуществляются с помощью поровых каналов диаметром 9-12,5 нм, и 26 нм; соответственно, способствуя пассивной и активной диффузии и транспорту веществ [136]. Считают, что в нуклеоплазме имеется своя полная система гликолиза, протеинфосфатаз и ки-наз, через систему которых осуществляется обмен метаболитами, ионами, а также транспорт информационных молекул [ см. 42]. Транспорт белка в ядро прежде всего зависит от кариофильности молекулы и ее размера. Кариофильность белка определяется наличием в нем сигнальных последовательностей. При протеолизе сигнальных "хвостов" пяти субъединиц пентамера - нуклеоплазмина, кариофобный остаток молекулы теряет способность проникать через поры ядра. После окончания Б-фазы клеточного цикла, то есть в С2-фазе, в нуклеоплазме в диспергированном состоянии обнаруживают участки начала репликации, которые вновь проявляются только в период репликации [179]. При этом следует отметить, что разные хромосомы по всему объему клеточного ядра располагаются не диффузно, а локализуются в отдельных, оп- ре-деленных, ограниченных его областях [89].

Таким образом, в клеточном ядре при участии нуклеоплазмина происходит сборка нуклеосом, хроматина, ядерной мембраны [167], формируются единицы репликации ДНК и периодичность ее синтеза [168]. Количество сайтов в хроматине, находящихся в контакте с ядерной мембраной невелико, но свободное перемещение хроматина по нуклеоплазме лимитировано; в то же время вы-сокоповторяющиеся нуклеотидные последовательности образуют высокоспецифическую нуклеоплазматическую сеть [146].

А.Нейфах [74] считает, что сейчас накапливается все больше данных о том, что белки, участвующие в сборке и разборке структур мембран, цитоскелета определяют форму клеток, их поведение и отношение друг к другу. Все белки компактны: "сухие" внутри, "мокрые" снаружи; некоторые из них обладают спо-

собностью "липнуть" друг к другу [87]. Следует отметить, что некоторые авторы [96] считают, что сборка клеточных органелл из более мелких субъединиц это физико-химический, а не ферментативный процесс.

Таким образом, нуклеоплазма - высокоструктурированная система и основная ее функция заключается в ядерноцитоплазма-тических-межклеточных взаимодействиях; осуществлении сборки нуклеосом и метаболизма ядра.

1.1.2 Хроматин

Хроматином называют хромосомы на стадии интерфазы in vivo, а также препарат очищенных интерфазных хромосом in vitro [19]. Кроме гистонов, основных белков хроматина [198] то есть белков несущих положительный заряд, в его состав входят многочисленные негистоновые белки и РНК [20, 192]. Гистоновые и не-гистоновые белки участвуют как в структурной, так и функциональной организации хроматина. Связь между гистонами и ДНК осуществляется за счет электростатического взаимодействия; однако между самими белками, связь может осуществляться за счет ионных, водородных и гидрофобных сил [29].

Гистоны Н2А, Н2В, НЗ, Н4 называют коровыми белками [160, 210], они способствуют укладке ДНК в нуклеосомную нить (рис. 1.1.2.1) [133]. Не вызывает сомнений, что в нуклеосомной организации хроматина фундаментальная роль принадлежит гистону HI, при участии которого осуществляется образование петельной доменной организации хроматина [33] (рис. 1.1.2.2) [39]. Однако, в этом процессе также немаловажная роль принадлежит негистоно-вым ДНК-связывающим белкам [29]. Метафазные и интерфазные хромосомы, по-видимому, организуются вокруг одного и того же непрерывного белкового - скаффолда [166]. Обычно митотические хромосомы несут на своей поверхности множество других молекул, в том числе и большое количество рибонуклеопротеидов. Предполагают, что вся система митотических хромосом имеет оболочку, в состав которой входят липиды [см. 15]. Возможно, что в составе хромосом имеются центры, индуцирующие сборку ядра и мемб-

А

И2В

В

Рис. 1.1.2.1 Модель структуры октамера-коровых гистонов с; двумя оборотами ДНК [133]: А-С - стадии разборки; Д-Е - стадии переукладки.

Рис. 1.1.2.2 Схема организации гистонов в мононуклеосоме [39].

ранных структур [см. 63]. В интерфазном ядре каждая хромосома специфически взаимодействует с определенными участками поверхности ядра и занимает в нем определенную область - домен [см. 63]. В фазе Gj, по-видимому, каждая хромосома состоит из одной единственной хроматиды, содержащей одну молекулу ДНК [36]. Время протекания этой фазы у разных представителей эукариотов разное (в меристематических клетках Allium сера 2,4 ч). В этот период ядро активно в плане регуляции клеточной активности. В S-фазе клеточного цикла происходит удвоение хромосом и содержание ДНК удваивается (в меристематических клетках на этот период приходится 7,4 ч). Надо отметить, что в конце G1 и начале S-фазы клеточного цикла происходит изменение доступных транскрипции генов; решающим фактором в этом процессе - перепрограммирования генома, являются внешние воздействия, опосредованные через клеточную мембрану [см. 63]. В G2-фазе синтез ДНК прекращается. В ядре появляется идентичная хроматида, содержащая идентичную ДНК [36] (в меристематических клетках Allium сера эта фаза длится 5,2 ч). В фазе митоза хромосомы становятся короткими и толстыми. Эта фаза длится 2 часа (Allium сера). Это самая короткая фаза клеточного цикла. В меристематических клетках зародышей пшеницы S-фаза наступает через 24 часа после начала прорастания семян [см. 95]. Считают [146], что каждый новый клеточный цикл развертывания информации начинается с образования ядерной мембраны, структурного остова ЭПР и мембран эндоплазматического ретикулума (ЭПР). На основе методов топологического моделирования интерфазных ядер млекопитающих формируются взгляды на структуру и топологию хромосом [146]. В организации хроматина выделяют четыре уровня: О-нуклеосомный; 1-соленоидный, составленный из 12 нуклеосом; 2-петельный, закручивание соленоидов в петли диаметром 30 нм; 3-розеточный, формирование хроматиновой нити размером 200-300 нм (уровень формирования гексамерных "розеток"); 4-хроматидный [139; 181] (рис. 1.1.2.3). В процессе митоза происходит существенное перераспределение структурных элементов ядра, некоторые из них переходят в цитоплазму [110; 182] (рис. 1.1.6.6). В ряде работ

Tlie Formation Of. The Radial Loop Chromosome. Naked DNA

o.Wnm 'Beads On A String

У1УУ)

urn

I. 30 nm So itno'id

и

m

IK

Ь Wudeosowes/ Turn

30*m J SO Turns/Loop

I

>0 DS

Matrix (Topoiiomerajt

Mini bcmcl os4^5

<f8 Loops

МаЫх

(Зса{{о\с1 | (Епс! \Ziew)

1<f Stacking

Chromosome (5{de

Base Paiк£ per Тики Packing Ratio

10 ь.р. 1

80Ь.р. {60b.p.ptK2luwj г fe-7

1200 b. p. (per turn) 40±

60.000b.p. Iftr loop) 680

11*106b.f>.± (per minibonrf 1.2 "10 4

18 loops/ Miniband 12*10"

Рис.:. 1.1.2.3 Схема организации ДНК в хромосоме [181]:

О. Двойная спираль ДНК дважды закручена вокруг гистонового октамера, формируя нуклеосому; I.

■ Шесть нуклеосом формируют соленоид и 30 нм фила-мент;- II. 30 нм филаменты формируют петельные домены ДНК, прикрепленные к ядерному матриксу и то-поиз�