Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности белкового комплекса и протеолитической активности озимого тритикале

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности белкового комплекса и протеолитической активности озимого тритикале"

'л

^ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

<\'*/ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ

Ч ч* ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОТАНИКИ им.В.Ф.КУПРЕВИЧА

ч

УДК С633.11+633.14):631.524.б

ГОНЧАРОВА Людмила Владимировна

ОСОБЕННОСТИ БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОЗИМОГО ТРИТИКАЛЕ

03.00.04 - "Биохимия'

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических* наук

Минск - 1995

Работа выполнена в лаборатории биохимии и биотехнологии растений Института экспериментальной ботаники им. В.Ф.Купре-вича АН Беларуси

Научные руководители: чл.-корр. АНБ,

■ доктор биологических наук, профессор Решетников В.Н. доктор биологических наук Гордей И. А.

Официальные оппоненты: чл.-корр. АНБ,

доктор биологических наук, профессор Чайка М.Т. кандидат биологических наук Василевская Г.А.

Оппонирующая организация - Всероссийский Институт защиты растений (г. Санкт-Петербург)

Зашита состоится СМ.Ск£уЛ 1095 г. в часов на

заседании совета по защите диссертаций Д 01.38.01 в Институте экспериментальной ботаники им. В.Ф.Купревича АН Беларуси (220072, г. Минск, ул. Ф.Скорины, 27).

С диссертаций можно ознакомится в Центральной научной библиотеке им. Я.Коласа АН Беларуси".

Автореферат разослан 1995 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций, ч ^

кандидат биологических наук М- У^^-у и.В.Рогульченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш диссертации. Одной иг важнейших особенностей тритикале является сочетание геномов пшеницы и ржи, приводящее к проявлению новых биологических и хозяйственных признаков, в той числе высокому содержанию белков и незаменимых аминокислот. Достижения последних лет по генетике, селекции и биохи-шш тритикале указывает на возможность использования его не только как зернофуражной культуры, но и в хлебопекарной промышленности CAmaya et al., 1986; Beaux et 'al.-,.,1935; Marci et al., 1686; Schuller, 19863. Так как биология культуры и хлебопекарное кзчество муки в значительной степени определяются количественными и качественными характеристиками входящих в ее состав белков, значительный интерес представляет изучение изменчивости и наследования свойств белкового комплекса исходных форм пшеницы и ржи у тритикале. По зтой проблеме нет единого мнения, иногда пру изучении одних и тех же линяй тритикале авторы приходят к противоположным выводам.

Среди основных недостатков тритикале как зерновой культуры следует выделить недовыполненное^ и предуборочное прорастание его зерна в.колосе. Проросшим и недовыполненным семенам тритикале характерно наличие более высокого уровня амилолитической и протеолитичвекой активности [Ching et al., 19763. В "морщинистом" типе зерна тритикале уровень этих'ферментов возрастает на последних стациях созревания зерна и может, создавать биохимический дисбаланс. Рядом авторов проводились и проводятся исследования по выяснении взаимосвязи между активностью гидролаз в зерне и хлебопекарным качеством муки тритикале и пшеницы CShanna et al., 19S7; Sur et al., 1993; Zawistowska et al., 19883. Показано, в частности, что протеолитическая активность муки тритикале значительно выше, чем у пшеницы. Прорастание зерна в колосе и при хранении повышает этот показа?ель, что неблагоприятно сказывается на хлебопекарных качествах муки, так как иротеазы, расщепляющие белки клейковины, уменьшают их способность удерживать газ во время брожения теста CBushuk, 19933.

. Таким образом, изучение особенностей' белкового комплекса зерна тритикале с разной долей генома ржи и пшеницы редставля-

ется актуальным как в теоретическом плане, так и для решения ряда задач практического использования этой зерновой культуры.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Тема диссертации связана с выполнением, научно-исследовательской работы "Биохимическое изучение растений с выраженным биосинтезом запасных и биологически активных веществ с целью выявления оптимальных путей их использования на основе новых биотехнологий" (Ы госрегистрации 1994871), входящей в комплексную программу фундаментальных исследован;т "Продуктивность растений".

Еель и задачи исследования. Цель настоящей диссертационной работы - дать целостное представление об особенностях белкового комплекса, активности протеазо-ингибиторной системы созревающего, покоящегося и прорастающего зерна озимых тритикале и сека-лотритжумз, определить характер, формирования белкового комплекса в сравнении с родительскими формами. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

- провести сравнительный анализ белка зерновок озимого тритикале и его родительских форм по электрофоретической гетерогенности;

- изучить количественный и качественный состав фракции белков: альбуминов, глобулинов, проламинов и глютекинов и выявить характер наследования компонентного состава белков семян пшеницы и ржи у озимого тритикале;

- исследовать особенности компонентного состава фракции водорастворимых белков семян тритикале и его родительских форм на стадиях созревания, покоя и прорастания;

- разработать методические подходы исследования закономерностей накопления и разрушения запасных белков, изменения активности и компонентного состава протболитических ферментов в ходе созревания и прорастания семян тритикаде, ржи и пшеницы;

- выявить основные системы ингибиторов протеияаз у тритикале, ржи и пшеницы в связи с возыояяостьо использования ингибиторов в качестве маркеров генетических систем я идентификации устойчивых к предуборочному прорастают форм зерновых культур.

Научная новизна подученных результатов. Впервые проведено исследование белкового кошиекса ржано-пшеничного амфидиплоида -секалотритикум, селекционно новой формы, созданной на цитоплазме ржи. Впервые осуществлен.комплексный анализ протеазо-ингибиторной системы трипкале. Экспериментально обоснованы эффектив-

иые методические подходы к исследованию протеазо-ингибиторного комплекса, основанные на электрофоретическом разделении;! с последующим выявлением протеолитических ферментов в полиакриламид-ных гелях, содержащие сополимеризованный субстрат и выявлением ингибиторов протеолитических ферментов с помощью желатина. Показаны отличия по компонентному составу эндопептидаз в ходе онтогенеза семян тритикале, ржи и пшеницы. Охарактеризованы системы ингибиторов трипсино-, химотрипсино-, субтилизиноподобных и тио-ловых протеиназ. Показано, что ингибиторы протеолитических ферментов из эндосперма тритикале, ржи и пшеницы характеризуются видовой специфичностью и представлены большим числом компонентов, отличающихся по молекулярным массам, изоэлектрическим точкам.

Практическая значимость полученных результатов. Использование полиморфных белковых систем растений позволяет проводить идентификацию сортов, исходного материала и новых форм. Показана возможность использования ингибиторов протеаз для маркирования различных геномов и хромосом.

Получена база данных по белковому комплексу семян межродовых гибридов - тритикале и секалотритикума, которая дает генетика-биохимическое обоснование'селекционной работе с этими культурами. Результаты по динамике протеолитической активности и компонентному составу протеиназ в онтогенезе семян, по активности, накоплению и компонентному составу ингибиторов протеаз переданы селекционерам для отбора генотипов о хозяйственно полезными признаками (по качеству зерна). Результаты проведенной работы используются селекционным центром БелНИИ'земледелия и кормов в процессе создания новых форм тритикале и секалотритикума.

Экономическая значимость полученных результатов. Использование биохимических данных и методов анализа позволит проводить целенаправленный отбор селекционно-ценных генотипов, что будет-способствовать повышению эффективности и ускорению селекционного процесса на качество зерна пшенично-ржаных амфидишюидов - тритикале.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. На защиту выносятся следующие положения:

- особенности белкового комплекса семян пшенич] -ржаных и ржано-пшеничных амфидиплоидов и их родительских форм;

- специфичность проявления протеолитической активности и

изменение компонентного состава протеинаэ в ходе онтогенеза семян тритикале, ржи и пшеницы;

- выявление и характеристика ряда систем ингибиторов проте-олитических ферментов семян тритикале, секалотритикума, пшеницу И ржи.

Личный вклад соискателя. Весь экспериментальный материал получен лично автором. Выбор условий эксперимента, интерпретация результатов и анализ данных проведены соискателем самостоятельно. В работе обобщен экспериментальный материал, полученный с использованием современных биохимических методов исследований. Полученные автором результаты экспериментально обоснованы и достоверны.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты работы были представлены на конференции молодых ученых Беларуси и Литвы (14-17 ноября 1991 г., Беловежская Пуша), VII съезде БРБР (25-27 мая 1993 г., Березинский биосферный заповедник), конференции "Генетическая инженерия и биотехнология" (29-20 марта 1994 г., Минск), республиканской конференции "Современные проблемы генетики и селекции" (4-6 июля 1995 г., Минск), биохимических семинарах ИЗБ АНБ.

Опубликованность результатов. Основные положения работы освещены в 4 статьях и 3 тезисач.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, включая 20 рисунков, и состоит из введения, общей характеристики работы, 5-ти глав, выводов, списка литературы (173 источников) и 3 приложении.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объектов исследования использовались семена гек-саплонднэй пшеницы (Tritlcunr aestivum), диплоидной и тетраплоид-ной ржи (Secale cereal©), гибридных форм: гексаплоидных озимых пшенично-ржаных амфидиплоидов (Tríticale) и,ржано-пшеничного ам-фидиплоида (Secalotriticuro). Тритикале Л-246 - гибрид на цитоплазме пшеницы, его родительские формы: мягкая пшеница Безостая-1 и диплоидная рожь Чулпан; совершенно новый объект - секалотрити-кум Л-160 - гибрид на цитоплазме ржи, его родительские формы:

тетраплсидная .рожь Верасень и тритикале АД-206; тритикале Л-240-■ гибрид на цитоплазме пшеницы, у которого 2{?-хромосома генома ржи вмещена 20- хромосомой генома пшеницы - К/О-замещенный тритикале. Материал предоставлен отделом генетики и биотехнологии Белорусского НИИ земледелия и кормов (селекционер - Гордей И.А.) в 1992-1995 г.г. и характеризуется генетическими различиями.

Выделение белковых фракций из семян проводили по методу Т.Б.Осборна в модификации В.Г.Конарева и сотр. [Гаврилки и. сотр., 1973, Пенева и сотр., 1981, Конарев Ал.В,, 1936). Количественное содержание белка определяли по методу Лоури С1951].

Белковые компоненты семян анализировали методом электрофореза в 12% или градиентных 12-247. полиакриламидных гелях (ПААГ) в щелочной системе о додецилоульфатсм Иа (ДСН) НаеттН, 10703; методом изоэлектрофокусирования (ИЗЭ) на полиакриламидных пластинах Зегуа1уЬ РгеаЛеа широкого диапазона рН (3-10) с учетом методических указаний прилагаемой инструкции. Электрофоретичес-кое разделение проламиков семян проводили в 6,5Х ПААГ в кислой системе по методу Конарева В.Г. с модификациями Пеневой Т.И. и сотр. [19893. По окончании разделения гели окрашивали на белок Кумасси И-250 или 0-250 [Остерман, 19813.

Общую активность протеаз" определяли, используя 17. азоказеин в качестве субстрата [Биопрепараты сегодняшнего и завтрашнего дня, 1985). Метод основан на гидролизе субстрата протболитичес-кими ферментами, находящимися в исследуемом растворе, с последующим осаждением непрогидролизсванного белка ТХУ и колориметрическом определении насажденных окрашенных пептидов при длине волны 360-410 нм.

Выявление протеолитических ферментов осуществляли о помощью метода, основанного на электрофоретическом разделении белковых молекул ферментов в ПААГ с ДСН, содержащем сополимеризованный желатин, и последующем протеолизе субстрата разделенными компонентами протеаз [Неиззеп et а1., 1980; ЩЬниКаБЬ! е1 а1., 1986). Гели после протеолиза окрашивали амидочерным,

Выявление ингибиторов протеиназ осуществляли, используя методы, разработанные Ал.В.Конаревым [1984, 1986). После ИЭФ-раз-деления белковых фракций, содержащих ингибиторы протеолитических ферментов, проводили адсорбцию белковых компонентов н; желатиновый сдой фотопленки. Полученные.реплики инкубировали с 0.8Х ага-роэными гелями," содержащими растворы ферментов-стандартов (трип-

сина, химотрипсина, субтилизина и фицина). Зоны неразрушенного желатина, соответствовавшие компонентам ингибиторов данной про-теиназы, проявлялись на фотопленке как темные полосы на более светлом фане.

Статистическую обработку данных проводили по методу Рокиц-кого [Рокицкий,1907; Кахнович, 1989]. С целью более точной идентификации компонентов в злектрофоретических спектрах белков использовали специально разработанную программу для ПЭВМ по определению молекулярных масс белковых зон.

ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА С0.1ЯН ТРИТИКАЛЕ, РЖИ, ПШЕНИЦЫ

Злектрофоретический анализ фракции альбуминов созревающих и прорастающих семян. Исследовали семена тритикале Л-246 и его родительских форм. Следует отметить высокую гетерогенность группы белков-альбуминов, в компонентном составе которых обнаружено по крайней мере 20 полипептидкых компонентов с молекулярными массами (М.м.) от 10 до 110 кД. В процессе созревания семян спектр компонентов альбуминов претерпевает изменения: с одной стороны, наряду с уже синтезированными, происходит образование новых компонентов и увеличение количества отдельных из них; с другой стороны, в зрелом зерне отмечено отсутствие некоторых полипептидов, характерных для созревающих семян. У пшеницу к моменту полного созревания более четко выражена группа белков с молекулярной массой от 25 до 35 кД, а полипептиды с молекулярной массой от 35 до 50 кД проявляются значительно меньше в количественном отношении, по сравнении с таковыми в белйовых спектрах тритикале и ржи. При прорастании семян можно отметить общую для всех исследуемых растений тенденцию к количественному уменьшению содержания белка в отдельных полипептидных полосах и полному исчезновению некоторых из них с переходом растений на автотрофное питание.

Отмечено, что хотя тритикале занимает в основном промежуточное положение между родительскими формами, детерминацию и специфичность фракции альбуминов семян тритикзле определяет геном ржи. Именно эта фракция содержит основную часть ферментов, в том числе и протеолитических. Учитывая этот факт, можно предположить, что.и протеолитические ферменты тритикале наследуются по

ржаному типу. •

Электрдфоретический анализ фракции глобулинов зрелых семян. Исследования проводили на семенах всех исследуемых форм. Полученные данные о составе полипептидных спектров глобулинов, выделенных из зрелых семян без зародыша, свидетельствуют о том, что незначительная специфичность по этой группе белков наблюдается у всех исследованных форм, но в целом глобулины характеризуются относительной консервативностью по своим количественным и качественным характеристика/я и представлены полипептидами с М.м. от 12,5 до 48 кД.

Злектрофоретический анализ фракции проламинов зрелых семян. Электрофоретическкй анализ фракции проламинов из семян, лишенных зародыша, проводили в кислой системе на семенах всех исследуемых форм. Для удобства обработки информации, заключенной в электро-форетических спектрах проламинов, предложен способ записи их в виде белковых, формул по эталонному спектру, который составлен на основе анализа глиадинов большого числа сортов, форм и видов пшеницы и ее сородичей СКонарев, 19773. Для каждого компонента а-, В-, х- и ы-фракций введены дополнительные обозначения: интенсивные компоненты подчеркивают снизу, слабые - отмечают чертой над номером позиции, очень слабые (следы полос) - двумя чертами, если компонент двойной - над номером позиции ставится две точки. Ниже приведены белковые формулы для исследованных типов спектров злаковых культур:

пшеница Безостая-1 - а Ш? О 2345 т 234 и ? 4 6 89 тритикале Л-246 - а 34В67 015345 т ы 2345 _

рожь Чулпан - В 45 т 5 ш1234 2 111213

тритикале АД-203 - а 5Й7 0 223Ё? г £ 4 и 234Во7 секалотрнтикум Л-160 - а 87 3 Й4В т ей? ыТ234 ¥ _ рожь Верасень - (3 Э4ё т! £ и 234 _ & 111213

тритикале Л-240 - «234 ё7 0 22 В т1 2 и 234567. Триплет компонентов ы 234 отмечен в спектрах проламинов ржи и тритикале, отсутствует на электрофереграмме пшеницы и контролируется хромосомой 11?. Для секалина ржи характерной является "гармошка" из самых слабоподвижных компонентов - и 11 12 13 -контролируемая хромосомой Особенностью глиадина пшеницы Безостая-1 является присутствие группы и 89 и интенс! ной нижней части двойного компонента а б, синтез которых контролируется хромосомами соответственно ЮЗ и 60. Электрофореграмма пролами-

нов тритикале Л-240 по сравнению с электрофореграммами других линий тритикале показывает наибольшее число хорошо выраженных компонентов «-группы, что скорее всего связано с 2R/2D-замещением, характерным для генома этой формы.

Исходя из результатов эксперимента можно сделать заключение, что для тритикале вцелом характерен кодоминантный тип наследования полиморфизма пролачинов от родительских форм. Общее с пшеницей у амфидиплоидов - наличие компонентов во всех 4-х зонах спектра; с рожью их объединяет триплет компонентов и 234. В результате взаимодействия геномов исходных видов у тритикале происходит элиминация некоторых компонентов прсламина и изменение количественного проявления отдельных из них.

Злектрофоретический анализ фракции глдтенинов зрелых семян. Проведен анализ семян всех исследуемых форм по группе высокомолекулярных (В.М.м.) субъединиц глютенина, компоненты внутри которой мы обозначили как 1,2,...,10 (рис.1). Наибольшей гетеро-

М.м. ,1(146.5) .2

.3(137) ^5(127)

,8(115) -9

\Ю(106.5)

А Б В Г Д Е Рис.1. Схема электрофореграмм В.М.м. компонентов глютенинов семян ржи Верасень (А), тритикале АД-206 (Б), пшеницы Безостая- 1 (В), секалотритикума Л-160 (Г), тритикале Л-240 (Д) и Л-246 (Е). 1,2.....10 - номера компонентов. М.м. указаны в кД

генностью по М.м. (от 106,5 до 140 КП) отличается состав В.М.м, субъединиц глютенина тритикале Л-246 (комп.2,3,5,8,10). Интересным на наш взгляд является присутствие пары белковых компонентов (комп.2 и 3) в образце тритикале'Л-246, которые во фракциях ржи и пшеницы содержат по одному компоненту из этой пары полипептидов. Анализ электрофореграмм секалотритикума и его родительских

форм показал, - что для В.М.м. субъединиц глютенина Л-160 характерны только два компонента, один из них - комп.З - наследуется от АД-206, однако, если в спектре "родительской" формы этот компонент двойной, то в ржано-пшеничном амфидиплоиде - одинарный.

Интерес представляет,сравнительный анализ описываемой группы белков в различных линиях тритикале. Только один полипептид (ксмп.З) обнаружен у всех амфидиплоидсв, по остальным компонентам (или их сочетаниям) все линии тритикале заметно отличаются друг от друга, что свидетельствует о внутривидовой-специфичности белков-глютенинов. Исходя из полученных результатов и имеющихся в литературе данных предполагаем, что В.М.м. компоненты (106,5146,5 кД) глютенина могут выступать в качестве белковых маркеров при определении хлебопекарных качеств муки зерновых культур.

'ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ И КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ СЕМЯН ТРИТИКАЛЕ, РЖИ.ПШЕКЩЫ

Исследование общей протеолнтической активности созревающих и прорастающих семян. Анализировали семена тритикале, устойчивого к предуборочному прорастанию (Л-246), и его родительских форм и тритикале, не устойчивого к предуборочному прорастанию зерна (Л-240). В результате проведенных исследований установлено, что для тритикале, пшеницы и ржи характерна общая тенденция: в процессе созревании семян идет увеличение общей прстеолитичеокой активности , а при прорастании происходит снижение этих показателей (рис.2). Отметил некоторые особенности: для ржи характерно плавное увеличение протеолнтической активности до стадии полного набухания зернз, в то время как для пшеницы увеличение заканчивается гораздо раньше (на стадии восковой спелости - зрелого зерна). При прорастании для тритикале Л-246 снижение протеолнтической активности идет наиболее интенсивно и нз стадии первого развернутого листа уровень активности значительно ниже, чем у остальных злаковых. У ржи при прорастании также наблюдается снижение протеолнтической активности, но в значительно меньшей степени, чем это отмечено для тритикале Л-248. Мы предположили, что именно повышенный уровень активности протеолитических ферментов в зрелом и набухающем зерне (как, например, у ржи Тулпан), а также незначительное. ее падение при переходе к автоарофному питанию растений, дают толчок к более быстрому развитию проростков

активпоотв (у«л.»д.) октиамоств (уел.м.)

Рис.2. Изменение общей протеолитйческой 'активности созревающих и прорастающих семян на разных стадиях: I - молочная спелость, II - восковая спелость, III - зрелое зерно, IV - полное набухание, V - рост колеоптиля, VI - первый развернутый лист

и являются одной из причин (или одним из показателей) неустойчивости к предуборочному прорастанию. Подтверждением этому предположению послужило исследование динамики кротеодитической активности семян ржи Чулпан и тритикале Л-240, характеризующихся не-' устойчивостью к предуборочному прорастанию.

Выявление отдельных компонентов протеиназ в электрофооети-ческих спектрах белков созревающих и прорастающих семян. На всех исследуемых стадиях согревания семян тритикале Л-246 и его .родительских ферм выявлены изоферменты, проявивпие зндопептидазную активность и характеризующиеся низкими значениями М.м. - от 25,1 до 27,6 кД (рис.3). Причем один из изоферментов - с М.м. 26,2 кД - присутствует у всех исследуемых образцов на всех стадиях созревания, вероятно, играя немаловажную роль в формировании белкового комплекса семян. Отличия между тритикале, рожью и пшеницей по группе эндопептидаз хорошо заметны на стадии зрелого Семени: в спектре ржи и тритикале проявляется по одному слабовы-

А Б В 12 312 3 1 2 3

I

А Б В 456456456

М.м.

50.2 48.6

.27.6 26.2 -25.1

СОЗРЕВАНИЕ ПРОРАСТАНИЕ

Рис.3. Схема электрофореграмм эндопептидаз созревающих и прорастающих семян тритикале Л-246 (А), ржи Чулпан (В) и пшеницы Безостая-1 (В) на стадиях молочной (1) и восковой (2) спелости, зрелого зерна (3), полного набухания (4), роста колеопти-ля (5) и первого развернутого листа (6)

раженному компоненту с М.м. 27,6 и 25,1 кД соответственно, в то время кзк у пшеницы обнаружены оба эти изоферментз, но проявляющие значительно большую активность. В прорастающих семенах представлена совершенно отличная от предыдущей группа изсфермен-тов, состоящая из двух компонентов с более высокгми значениями М.м. - 50,2 и 48,6 кД. Эти высокомолекулярные компоненты протео-литического комплекса появляются у ржи на стадии роста кслеопти-ля и не исчезают при переходе к автотрефному питан;®, а у тритикале и пшеницы зндопептндаза с М.м. 50,2 кД появляется только на последней исследуемой стадии и проявляет меньшую активность чем "ржанзя". Если проанализировать полученную электрофоретическую картину для прорастающих семян вцелом, можно сделать вывод, что экдоп^-птидазы представлены большим числом компонентов у пшеницы, в то время как высокомолекулярные эндопептидагнке компоненты проявляют Сольную активность у ржи и тритикале.

РАЗЛИЧНЫЕ СИСТЕМЫ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР

В водорастворимой фракции белков зрелых семян, лишенных за-

родьшеп, всех исследуемых ферм обнаружены следующие системы ингибиторов прстеинзэ-стзндартов: ингибиторы трипсина (ИТ), ннги-бимтсры хш-ютрнпсинз (ИХт), бифункциональные ингибиторы химот-рипсина-субтилпзинз (Илт-Ст), а-амнлазы-субтилнзннз (ИА-Ст) и ингибиторы тиоловых протепнзз (ИТисШ.

Ингибиторы трипсина из эндосперма тритикале, ржи, пшеницы. Анализ ингибиторов трипсина из эндосперма исследуемых форм показал, что все их компоненты локализованы в щелочной области рН (рис.4). Исходя из полученных нами данных и сопоставления их с ранее опубликованными Конаревым Ал.Е. , в спектре ингибиторов р1 7 6 5 4 3 2 1 10.6 +

- ИТ 19(В)

^ИТ14(Р) ИТ12(10)

7.3

Рис.4. Схема ИЭФ-спектров компонентов ингибиторов трипсина из эндосперма тритикале Л-240 (7), ржи Верасень (6), секалотри-тикума Л-160 (5), тритикале АД-206 (4), ржи Чулпан (3), тритикале Л-246 (2) и пшеницы Безостая-1 (1)

трипсина пшеницы выявлено две группы компонентов, отлтавсуюся по М.м. и генетическому контролю - ИТ12(Ю) и ИТ19(В), характе-ризисщиеся М.м. соответственно 12 и19 кЦ и контролируемые хромосомой Ю и геномом В. Очевидно, что ИТ ржи Чулпан и Верасень представлены компонентным составом, отличным от пшеницы, и выявлены в области р1 7.0-9.5. Три минорных компонента (р1 7.0-7.5) характерны только для ингибиторов ржи, в то время как тритикале наследует практически все остальные зоны "ржаных" ИТ. Наиболее ярко в ингибиторных спектрах ржи и тритикале выражен один компонент - ИТ14(Н). Отмечено, что главные компоненты ИТ тритикале Л-246 наследуются от ржи, тогда как для секалотритикума Л-160 характерен промежуточный характер наследования ИТ, то есть в его спектре обнаружены компоненты обоих родителей.

Ингибиторы химотрипскна и субтилизина из эндосперма трити-

кале, ржи и пшеницы. Показано, что у всех исследуемых злаков ингибиторы химотрипсина и субтилизина - наиболее гетерогенная и изменчивая система зндсспермальных ингибиторов. В белковых спектрах этой группы ингибиторов выявлен ИХт, представленный у всех исследуемых образцов одним компонентом с р1 около 7.5 (рис.5). По дзнным Ал.В.Конаревз ИХт мягких пшениц кснтролирует-р1 1234567 1234567

) ИТ-Хт . ИХт ИА-Ст

СМ СП к f

й ю

«н 1X3

I из

ß ю

I I

Н CD

а

РИПСИН

СУБТИЛИЭИН ХИМ01

Рис.5. Схема ИсФ-спектров ингибиторов субтилизина и химотрипсина из эндосперма тритикале Л-240 (1), ржи Верасень (2), се-калотритикума Л-160 (3), тритикале АД-206 (4), ржи Чулпан (5), тритикале Л-246 <6) и пшеницы Безостая-1 (7)

ся хромосомой 7DS, обладает четвертичной структурой и в натпвном состоянии имеет М.м. 24-29 кД [19913.

У всех образцов, за исключением пшеницы, выявлены компоненты ИТ-Хт, причем только у тритикале Л-240 он представлен тремя компонентами, а для остальных форм змфидпллсидов и ржи характерна одна зона с pl выше 8.0. ИТ-Хт по изозлектрическнм течкам и наличию-отсутствию в исследуемых образцах соответствует вышеописанному компоненту из спектра ИТ - J1T14(R).

ИА-Ст обнаружены в спектрах пшеницы, ржи, . тритикале и представлены хорошо выраженным компонентом с pl около 7,2.

Для всех изучаемых форм характерны компоненты бифункциональных ИХг-Ст. Так как компоненты четко вырачены, не представ-

ляет труда проследить какие из родительских 'ингибитсрных зон наследуются в спектрах ИХт-Ст амфидиплоидов. Очевидно, что по этой системе ингибиторов проявляется кодоминантный тип наследования у тритикале и сёкалотритикума. Все компоненты рассматриваемой группы ингибиторов можно разделить на две фракции .- со значениями р1 в нейтральной и щелочной области рН (ИХт-Ст-1 и ИХт-Ст-2, соответственно)..

■ Ингибиторы тиоловых псотеиназ из эндосперма тритикале, ржи и пшеницы. На рисунке 6 представлены результаты выявления компонентов ИТиоП. Данная системз ингибиторов не обнаружена в белковых спектрах ржи. У всех остальных образцов обнаружено всего 4 компонента и на основании уже имеющихся в литературе данных по-

Р1 1 2 3 4 5 6 7 10.6 Д-

ИТиоП(20)

—|_ИТиоП(2В)

--ИТиоП(А) - ИТиоП(?)

7.3 ..

Рис. б. Схема ИЭЮпектров компонентов ингибиторов тиоловых протеиназ из эндосперма тритикале Л-240 .(1), ржи Верасень (2), секалотрикума Л-160 (3), тритикале АД-206 (4), ржи Чул-. пан (б)., тритикале Л-246 (6) и пшеницы Безостая-1 (7)

казано, что зона с р1 около 9,5 контролируется 2-ой хромосомой генома Б, с р! около 8,7 - 2-ой хромосомой генома В, а двойной компонент о р! около 8,0 - геномом А-ЕКонарев Ал.8., 1091]. И тритикале Л-246, и секалотритикум Л-160 наследуют от родительских форм ИТиоП(2В) и ИТиоП(А). У амфидиплоида Л-240 выявлен компонент ИТиоП, не характерный ни для одного из остальных образцов. '

Таким образом, показано, что ингибиторы представляют собой весьма гетерогенную систему белков, различающихся по заряду, молекулярным массам, генетическому контролю и, вероятно, по функциям. Можно предположить, что результаты подобного рода бцохимичес-

кого анализа могут стать критерием отбора зерновых культур с определенным компонентным составом ингибиторов протеолитических ферментов, соответствующим более устойчивым к ПП формам.

ВЫВОДЫ

1. Показаны особенности белковсго комплекса и характер количественных и качественных его изменении в процессе созревания и прорастания семян генетически различных форм озимых тритикале и их родительских ферм.

2. Подтверждено, что электрофоретические спектры компонентов всех изученных белковых фракций семян специфичны для каждой формы и содержат конкретную информацию сб особенностях геномного состава, отражают степень функционального проявления геномов родительских сортов, выявляют характер взаимодействия исходных геномов.

3. Специфичность водорастворимой фракции белков согревающих и прорастающих зерен тритикале контролируется геномом ржи. Пше-шнно-ржаные амфидиплоиды наследуют от ржи высокое содержание альбуминов и компонентный состав этой фракции белков.

4. По своим количественным и качественным характеристикам фракция глобулинов семян исследуемых линий тритикале, ржи и пшеницы характеризуется относительной консервативностью.

5. Полипептидный состав проламинов семян змфидпплевдов определяется промежуточным характером -наследования компонентов родительских Форм. Общее с пшеницей у амфидиплоидов - наличие компонентов в а-, 3-, т- и ы-эонах спектра; с рожью их объединяет триплет компонентов и 234.

6. Показано,что у тритикале вцелом наблюдается ксдомпнант-ный тип наследования компонентного состава В.М.м. (106,5-146,5 кД) гллтенинов семян. Б детерминации этой фракции участвуют все геномы родительских форм.

7. Показано изменение спектра белков, проявляющих эндопеп-тидазную активность, в семенах тритикале, ржи, пшеницы. Для созревающих семян характерны низкомолекулярные, а для прорастающих семян - высокомолекулярные компоненты эндопептидаз. В ходе онтогенеза выявлены отличия по указанным компонентам между тритикале и его родительскими фермами: эндопептидаэы представлены большим числом компонентов у пшеницы, в .то время как высокомолекулярные

в

эндопептидазные компоненты проявляют большую активность у ржи и тритикале.

3. Среди водорастворшой фракции белков семян тритикале, ржи и пшеницы обнаружены системы ингибиторов трипсина, химотрип-сина, субтилиэина и тиоловых протеинаэ. Компоненты ингибиторов •этих ферментов отличаются по локализации в ИЗО-спектрах, молекулярным массам и геномное контролю.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Спиридович Е.В., Гончарова Л.В. Особенности проявления а-амилазной активности в семенах тритикале при созревании // Сборник трудов молодых ученых Беларуси и Литвы,- Минск, 1952.-С.22-23.

'2. Фоменко Т.И., Малш М. К., Гончарова Л. 3. Сравнительная характеристика каллусных тканей люпина различного происхождения // Генетическая инженерия и биотехнология: Тез. докл. конф.-Минск, 1994.- С.69.

3. Спиридович Е.В., Гончарова Л.Б. Тритикале и его родительские форш: характеристика протеолитического комплекса /У Современные проблемы генетики и селекции: Тез. дошь конф.~ Минск, 1995.- С.70.

4. Спиридович Е.В., Гончарова Л.В. Изучение протеолитичэс-кой активности семян тритикале и родительских форм // Сборник Ботаника: Тез. докл. конф.- Минск, 1995.- N 32.- С.

5. Гончарова Л.В., Решетников В.Н. Протеиназная активность ядерных белков озимого тритикале // Доклады Академии наук Беларуси. -.1995.- N 4.- С.

е. Спиридович Е.В., Гончарова Л.В. Тритикале и его родительские формы: характеристика протеолитического комплекса семян на разных стадиях развития // Еесц1" АкадэмИ назук Беларусь Сер. б1ял. навук. - 1996.- N 1.- С,

7. Spiridovich Н., Goncharova L., Artushevsky A. Inheritance of triticale a-amylase isozymes from wheat and rye parents// Cereal Chem.- 1995.- V. .-P.

17 РЗЗШЕ

Ганчарова Людмйа Уладз1м1рауна. Асабл1васц1 бялковага комплексу 1 пратэал!точная акты£насц1 аз Шага трьгц1кале

Ключазыя словы: трьацкале, жыта, пшан1ца, насенне, бялк1, пратэазы, актыу'насць, дынам1ка, Сялк1-1нг1б1тары, кампанентны склад, спецыф1чнасць. .

АО'ект даследавання - гшан1чна-жытн£выя 1 жытнёва-пшан1чныя амф1дыпло1ды, 1хн1я бацькоуск1я формы. Мэта работы - даць цэльнае ?я?ленне аб асабл1васцях бялковага комплексу, акть^насц! пра-тз1казна-1нг1б1тарнаи о1стэмы паспяваючага, знаходзячагася у стане спакао, прарастаючага зерня аз1мага трыщкале 1 секалатрыц1кума, вызначыцъ характер фарм1равання бялковага комплексу £ пара?-нанн1 а бацько?ск!м1 формам!. Метады даследавзння - электрафарэз у ПААГ, 1гаэлектрафакус1раванне (1ЭФ)¿выявление пратэ1наз 1 бял-коу-1нПб!тарау на аснове субстратна« спецыф1чнасц1. Апаратура -прыбор для электрафарэзу ("<ЗЕ 2/4 ЛКБ, Швеция), лазерны дэнс!тометр ("2202 ииговсап", ЛКБ, Швецыя). прыбор для 1ЭФ ("2117 Ми1ЫрЬог II"; ЛКБ, Швеция), 00-40 (ЛОМА, Рас1я).

Упершыню праведзена даследаванне бялковага комплексу жытнё-ва-пшан1чнага амф!дыпло1да - секадатрьаЦкум, створанага на цытап-лазме кыта ^ БелНД! гемляробства 1 кармой. Упершыню здзейснены комплексны анал1э пратэ1наэна-1нг1С1тарнай с1стэмы трыц1кале. Па-казаны адрозненн! па кампанентнаму складу эндапепц!даз у прашое антагенэзу насення трыц1кале, жыта 1 тпан1цы. Установлена, ото 1нг1б1тары пратзал1тычкых ферментау а эндасперма трьщ1кале, жыта 1 пшан1цы характарызуюцца в!давой спецыф1чнасцо 1 прадстаулены вял!к1м л1кам кампанента?, як1я адроэн1ваюцца па Ф1з1ка-х1м1чным уласц!васцям. Атрымана СагА дадаеных па бялковаму комплексу на-сення мгжродавых г!брыда^, якая дае б1ях!м1чна-генетычнае абгрун-таванне селекцыйнай работы з гзтыщ культурам!. Вын1к1 па динамо пратзал!тычнай актьг>насц1 1 кампанентнаму складу пратэ1наз у антагенэзе насення, па акты?насц1, накапленню 1 кампанентнаму складу 1нг1б1тара? пратэ1нзз перададгены селекцуянерам для адбору генатыпа^ з гаспадарча карысным! прыкметам! (па якасц! зерня).. .

18 РЕЗЮМЕ

Гончарова Людмила Владимировна. Особенности белкового комплекса и протеолитической активности озимого тритикале

Ключевые слова: тритикале, рожь, пшеница, семена, белки, протеаэы, • активность, динамика, белки-ингибиторы, компонентный состав, специфичность.

Объект исследования - пшенично-ржаные и ржано-пшеничные ам-фидкплоиды, их родительские формы. Цель работы - дать целостное представление об особенностях белкового комплекса, активности протеиназно-ингибиторной системы созрезающего, покоящегося и прорастающего зерна озимых тритикале и секалотритикума, определить характер формирования белкового комплекса в сравнении с родительскими формами. Методы исследования - электрофорез в ПААГ, изоэ-лектрофокусирование (ИМ), выявление протеиназ и белков-ингибиторов на основе субстратной специфичности. Аппаратура - прибор_для электрофореза ("6Е 2/4 12", -ЛКБ, Швеция), лазерный денситометр ("2202 иИгозсап", ЛКБ, Швеция), прибор для ИЗО ("211? МиШрЬог II", ЛКЕ, Швеция), 05-46 (ЛиМО, Россия).

Впервые проведено исследование белкового комплекса рла-но-шаеничного амфадиплоида - секалотритикум, созданного ка цитоплазм? ржи в БелНИИ земледелия и кормов. Впервые осуществлен комплексный анализ протеиназно-ингибиторной системы тритикале. Показаны отличия по компонентному составу эндопептидаз в коде онтогенеза семян тритикале, ржи VI пшеницы. Установлено, что ингибиторы протеолитических Ферментов из эндосперма тритикале, ржи и пшеницы характеризуются видовой специфичностью и представлены большим числом компонентов, отличающихся по физико-химическим свойствам. Получена база данных по белкЬвому комплексу семян межродовых гибридов, дающая генетико-биохимическое обоснованна селекционной работе с этим;! культурами. Результаты по динамике протеолитической активности и компонентному составу протеиназ в онтогенезе семян, по активности, накоплению и компонентному составу ингибиторов протеиназ переданы селекционера.) для отбора генотипов с хозяйственно полезными признаками (по качеству зерна).

19 SUMMARY

Gonch&rova ludmila Vladimirovna. Peculiarities of the protein complex a,d proteolitic activity of winter triticale

Key words: triticale, rye, wheat, seeds, proteins, proteases, activity, dynamic, proteins-inhibitors, component structure, specificity.

Object of investigation - wheat-rye and rye-wheat amphydi-ploias and its parental forms. The aim of the work - to give an integral representation about peculiarities cf protein complex, activity of proteinase-inhibitor system in maturating, dormant, germinating1 seeds of winter triticale and secalctriticum; to deterrine character of the formation of protein complex in comparison with its wheat and rye parents. Methods of investigation -electrophoresis in polyacrilaTiid gel, isoelectric focusing; (IEr), revealing: of the proteinases and proteins-inhibitors on th'e basis of its sybstrat specificity. The equipment - device for electrophoresis ("GE 2/4 LS", LKE, Sweden), laser .densitometer ("2202 Ultroscan", LKE, Sweden), device for IEF ("2117 Multiphorll", LKB, Sweden), 3P-46 (LOMO, Russia).

The investigation of. the protein complex of the rye-wheat amphydiploid (secalotriticum, created in the Belarus Institute of agriculture and foreges) was carried out for the first time. The complex analysis of the proteinase-inhibitor system of triticale was represented first. Differences on the component structure of the endopeptidases in the process of ontogeny among1 the seeds cf trirticale, rye and wheat were shown. It was established, that inhibitors of proteolitic enzymes from the endosperm of triticale, rye and wheat are characterized by interspecific specificity and are submitted by the large number of components, distinguished by its physical-chemical properties. A database on the protein complexes of the interspecific hybrids is recieved, giving genetic-biochemical substantation of the selection work with these cultures. The results on dynamics of the proteolitic activity and component structure of proteinases in the process of ontogeny of the grains, on the activity, accumulation and component structure of proteinases inhibitors are transferred for selection of genotype with economic-useful attributes (on quality of a grain).

Гончарова Щэдмила Владимировна

ОСОБЕННОСТИ БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОЗИМОГО ТРИТИКАЛЕ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано б печать 17.11.95г. Формат 60x84 1/16. Бумага типогр. Офсетная печать. Усл.печ.л. (t£ . Усл. кр. - отт. 600 . Уч.-изд.л,. Тираж 100 экз. Заказ N №5

Отпечатано на ротапринте Президиума АН Беларуси