Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ клеточных ядер и их надмолекулярных фракций при прорастании семян пшеницы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Анализ клеточных ядер и их надмолекулярных фракций при прорастании семян пшеницы"

РГ5 ОД

2 Ь НОЯ '007

На правах рукописи

Иванова Эвипина Алексеевна

АНАЛИЗ КЛЕТОЧНЫХ ЯДЕР И ИХ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ ФРАКЦИЙ ПРИ ПРОРАСТАНИИ СЕМЯН ПШЕНИЦЫ

(03.00.04-биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 1997

Работа выпонена в лаборатории математической и молекулярной генетики Института биологии Уфимского научного центра РАН.

Официальные оппоненты -академик РАМН,доктор биологических наук,профессор Збарский И.Б.

доктор биологических наук, профессор Ванюшин Б.Ф.

член-корреспондент РАЕН,доктор биологических наук, Обручева Н.В

Ведущая организация -

Институт биохимии им. А.Н.Ваха РАН.

Защита состоится »юд/тода в час. на ьаседании диссертационного совета Д 053.22.02 в Российском Университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом. 8, медицинский Факультет.

С диссертационной работой можно ознакомиться в научной библиотеке Российского Университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 6.

Автореферат

Ученый секретарь диссертационного совета доктор мс-дицинских наук, профессор

В.Э.Торбек

- 2 -

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Исследование молекулярно-ге-нетических основ онтогенеза относится к разряду фундаментальных проблем как общей, так и физико-химической биологии .

В 1987 г. вышло две отечественные книги: "Теоретические и математические аспекты морфогенеза" и "Биологический морфогенез" Л.В.Белоусова. Общим для них является то, что основательно рассмотрены теоретические и экспериментальные проблемы эмбрионального формообразования у животных организмов. Определяя биологический морфогенез как процесс возникновения и усложнения форм и структур в течение онтогенетического развития организма, исследователи отчетливо понимают необходимость системного подхода при анализе закономерностей структуризации организма от субклеточного уровня до "макроскопического" целого [Белоусов, 1987]. Экспериментальный анализ молекулярных и субклеточных основ механизмов развития животного организма с точки зрения физико-химических событий формообразовательных процессов был впервые начат в 1936 г. Т.Морганом [см.Белоусов, 1987] и продолжен - на растительном объекте В.Г.Кона-ревым в 1958 г. [Нуклеиновые кислоты и онтогенез растительной клетки; Нуклеиновые кислоты и морфогенез растений; 1959]. Анализ этих проблем в лабораториях Дж.Боннера [1968], А.Мирского [см. Олфри и др., 1968], способствовал молекулярно-генетическому направлению как в биологии индивидуального развития, так и в биологии гена.

Молекулярная биология открыла "целый мир" взаимосвязанных внутриклеточных процессов, лежащих в основе цитос-келетно-мембранных преобразований (ЦСМП) клеток в морфогенезе [Исаева, Божкова, 1987]. Но понимание проблемы - на каких все-таки принципах основана формообразовательная самоорганизация живых систем - до сих пор остается дискуссионным. Особенно остро стоит вопрос о биологической организации индивидуального развития организма во взаимосвязи с механизмами генетических и эпигенетических процессов. Эпигенез определяется как изменение экспрессии генов в организме с дифференцированными клетками, наследуемыми митоти-чески [Robin, 1994]. С этой позиции важным в процессе понимания молекулярных движущих основ морфогенеза является интегрирование в одно функциональное целое: цитоскелет-но-мембранных преобразований (ЦСМП) совместно с надмолекулярной структурированностью всех компонентов клеточного ядра.

В отечественной литературе в последние годы появились две книги И.Б.Збарского: "Организация клеточного ядра" [1988] и "Скелетные структуры клеточного ядра [Збарс-

кий, Кузьмина, 1991], в которых делается заключение о том, что ядерный матрикс, выполняя регулирующую роль в процессах репликации и транскрипции, "управляет кардинальными биологическими явлениями роста, развития и клеточной диф-ференцировки". Возможная регуляция морфогенетических процессов при вовлечении определенных последовательностей ДНК, во взаимосвязи с структурированностью ядра, обсуждается в работах К.Шерера [1984]. Общим для всех работ в области исследования индивидуального развития является то, что в них рассматривается биология развития отдельных генов эмбрионального морфогенеза главным образом животных организмов.Процессы ростового морфогенеза основанные на ■размножении и растяжении клеток практически не обсуждаются .

Таким образом, чтобы понять закономерности механизмов индивидуального развития молекупярно-генетических основ, в данном контексте - постэмбрионального онтогенеза (т.е. ростового морфогенеза у растений), не теряя целостности индивидуального развития организма, целесообразно представить биологическую организацию в иерархии системного подхода: полуляция-> организм-> орган-> клетка (субклеточные органеллы - клеточное ядро) -> надмолекулярные структуры клеточного ядра (нуклеоплазма, хроматин, ядерный матрикс).

Цель и задачи исследования. Основная цель - исследовать включение эндогенных внутриядерных механизмов на уровне белковых компонентов, вовлеченных в регуляцию мор-фопроцессов, индуцированных влиянием тепловых свойств воды, прошедшей через эндосперм в покоящиеся зародыши пшеницы .

В связи с этим были поставлены следующие основные задачи:

1. Провести отбор относительно физиологически однородных покоящихся зародышей (О ч) и растущих проростков (24 ч -> 48 ч... через интервалы в 24 ч до остановки роста колеоптиля), используемых для выделения популяции клеточных ядер и их надмолекулярных (фракций) структур (нуклеоплазмы, хроматина, ядерного матрикса).

2. Определить компонентный состав (белок, ДНК, РНК, углеводы) надмолекулярных структур (фракций) клеточных ядер.

3. Определить динамику содержания эндогенного ауксина в надмолекулярных структурах (фракциях) клеточных ядер.

4. Определить активность сериновых протеиназ и их ингибиторов на фоне общей антиоксидантной активности перокси-дазной системы в надмолекулярных структурах (фракциях) клеточных ядер.

5. Выделить из надмолекулярных структур клеточных ядер ме-

тодом аффинной хроматографии трипсиноподобные протеина-зы (ТП-) и ингибиторы трипсина (ИТ-), определить их компонентный состав (белок, ДНК, РНК, углеводы, эндогенный ауксин).

6. Провести анализ молекулярных масс белков ТП- и ИТ-комплексов методом электрофореза.

7. Провести электронномикроскопический анализ ТП- и ИТ-комплексов

8. Определить аминокислотный состав гистонов и негистонов, фракционированных на колонках с амберлитом ИРЦ-50, провести их злектрофоретический анализ и определить включение згР и 14С в гистоновые и негистоновые фракции хроматина.

Научная новизна результатов исследования. Впервые проведено экспериментальное комплексное исследование с учетом закономерностей индукции прорастания: организм-»ор-ган->клеточное ядро, во взаимосвязи с индукцией включения внутриядерных механизмов закономерностей структуризации на уровне белковых компонентов нуклеоплазмы, хроматина, ядерного матрикса.

Примененный экспериментальный подход позволил рассмотреть один из главных механизмов процессинга ядерных белков (молекулярно-генетических основ онтогенеза) - активность ядерных протеиназ, вовлеченных в регуляцию экспрессии генов, на уровне биологической организации: организм -> орган -> клеточное ядро -> надмолекулярные структуры -> фермент.

Получены новые экспериментальные данные общей анти-оксидантной активности пероксидазной системы, главным образом, функционирующей на уровне нуклеоплазмы и хроматина.

Получены новые экспериментальные данные о динамике содержания эндогенного ауксина в надмолекулярных структурах (фракциях) клеточных ядер, которая взаимосвязана с физиологическими особенностями онтогенетического роста и развития колеоптиля.

Получены новые экспериментальные данные о локализации в ядерном матриксе трилсиноподобных протеолитических и ингибитортрипсиновых комплексов, содержание которых также взаимосвязано с физиологическими особенностями роста органов проростков.

Предложена концепция, позволяющая объяснить включение внутриядерных механизмов структурной реорганизации клеточных ядер на уровне белковых компонентов нуклеоплазмы, хроматина, ядерного матрикса при индукции ростового морфогенеза у растений.

Научно^пракл_инеская_^елШ Разработанный

комплекс методов анализа эндогенных механизмов ростового морфогенеза был доложен в 1993 г. на 11-й Московской кон-

'K-^-vumm '-i у.'.чт!>l-u i«'"."!ii v. ¡>a'_^u:'jTi>. , ,:ГГ' :> i.-.¡честно

пленарного jj.»'ji:>r.í» : "<">itroro«.eri!4f<-• ц 4>'.jt«vii» для оцепхм экологический Üöy-Jiii.ti-»J00T« Д'-й с du а прпмоние-

ml;>. Х1-..ЧИ ¡ч : горой ¡.ч-'.м". : v /.:■.. .\-л.. .ч' ;ч-рт-лци -

o;í!í'.'k р.г •'••.. i-. с . íl-.i •_ -».¡ль; в., ¡ .4. s. rt-m-tíii'-w-

paCi4.ii: it. •■"•14-:: S'---. w--.-.^i iI др.,

12S7,13ß9j ,%x .'ipil ЧП-ШШ fUi:iy;ypcci"'í,yií>:u)H">r;'iJiia-í¿:!« а к-

тяв;-0'.:т1- ¡л'--пд-р" ^ Бл^кщк.ком ГУ. ?.A'..iv.t*:OTc;nbi и jíücüííí:::; s;ic. оз:ие:ч"л_-сгм .Tj'.vj/c: тш!':,леяив

¡¿аогите.льнил Kiie-V'j4i-iux ядер, ядерии>. пусичинлз.

Г.-лоас.ц;!« :ил jjiwry: структу-

ры клого-¡iiiix ядер e од._*. pJ¡¡ с-.т ■-••Kjoreunt.'í'i ~ухсин, диидмика которого oaMJCüT ст флд.-.Ч1>лог>ии ¡¿оста прорс соков. 2. Т iw ш аии oroдо -

npùïпprie/тс-:вухт з структура;-: ядер, их активность и «одержал;!е заэ.-.'С.чт от физиологии росг.з лроросткоь. Ядерные надмолекулярные структуры проявляют общую амгиоксидантнуы ciK'íHñbocr^. которая :чшясиг от Фиэмслогни лр-jix-ctkob.

An-o-Saц::>-: i>a'.)Oi-„j. Материалы диссертации доложены на Bct-.Cc.-.-vO-ii'-M 3...^:-;, if^.iком cl .¿.-^ц^нии "?acyi:;чгЛСелки и их биооинго'-" (Мс-лкрс:, . 19751 ; ~ретье;": Ур^льс.-. П к мг^оренцин генетихеда н оелекционер-ов "Генвтнки и селекционеры Урала -Kiiредизну ко:><йстьу" (СБирдле-зск, 18С-1 ) ; Втором Всесоюзном •.•.¡iM.sO:vHy.-it: .-./ст^ч:-; й адаптации" (Ларадйг,

1985:; вс осою «коп i:o:¡;¡it>hijhi-i "Молркулчр-на«- биология генов eucäux р..N-..э" .lí'-'?', : £ а-

C'f-vä: '"^ь "oi'-ibe v-ик..ч растении" (Глщ'.н«.^, 19?,S ) ; X

Всеоскхздим симпозиуме "Ci'pyxryp>a и функции клеточного ядра" (Гродно. IfSOi; 20-th Meeting of the ?cù«r<*tlu« of 2u-гарс-ал 3ioc)í«ú.-al Sjciet its (B.¡dopest., 19S0>; Втором сь-Все .vkj..Ü-.С'-.-о 'facnsi ф.>г.лислогоБ >.-.cv: 4Гч.'¿i (Минек. Ifipc ; Т;-оп-с:и :о.ч o>:;.;:;a-..,riy>;c: "Клста^я.*-.* кй:-;лии:'..чы

i.V,<«.. .'ii.iii.'." " 1 Г;с51 ' ; ЗЬ-'h Ir L. i., i,:w

of 3iocne.:ni.?.try (Ismael, 1SS1); Tîîl-fd International Con¿-of Molecular Biology (Tucson, Arisona, USA,

1991); Третьем съезде Общества физиологов растений СС-Пе-терОург, lSc¡3); Одлнясчдцатом Бсероссийском симпозиуме "Структура ri v/Hiryии клеточного ядра" (С-Пет^рбург, 1933); Второй конфер^енци:! "Регуляторы роста и развития pacTeHiiü" (Моогша, 19£''СЗ) ; 1-ом сье-^ле Завиловского общ^спза генетиков и селекционеров (Саратов, 193-1); Internitional Plant Protection Congress (Hflijue, 1935); всероссийской симпозиуме "Биология клетки в культуре" (С-Петарбург, 1995); всероссийском симпозиуме "Фиаижго-хнмичеокие основы физиологии растений" (Пенза, 15Эв); 10-th FESFP Cemgress "From molecular mechanises to t!ie plant: an integrated spproacli" (Italy, 1S3Ö); 8-th International Congreas of Mycology Division (Israel, 1SS6); XII Всероссийский симпозиум "Структура н Функция клеточного ядра" (С-Петербург, 1S96).

ПуУ-'лигаиип- Материалы диссертации опубликованы в ви~

де 40 работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Объем и структура работы. Работа изложена на 427 страницах, состоит из введения, общего обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 99 рисунком и 22 таблицами и схемами. Список цитируемой литературы содержит 584 работы, из них 357 на русском и 227 на иностранных языках.

Фактический материал диссертации включает в себя результаты изучения функционирования гидролитической и общей антиоксидантной активностей эндогенных механизмов в надмолекулярных фракциях (структурах: нуклеоплазме, хроматине, ядерном матриксе) клеточных ядер, индуцированных инициацией ростовых процессов под действием комплекса внешних факторов в течение гетеротрофной фазы роста и развития проростков пшеницы. Все результаты по изучению эндогенных внутриядерных механизмов, представленные в экспериментальной части работы, методически разработаны и получены автором .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выбор объекта. Опыты проводили на воздушно-сухих зародышах (О ч), 24 ч проклюнувшихся зародышах и 48 ч->72 ч -> 96 ч -> 120 ч органах (колеоптилях, первых настоящих листьях, междоузлиях, корневой системе! пшеницы (Triticum aestivum L.) сортов Московская 35, Мироновская яровая, озимая; а также на 48 ч проростках сорта пшеницы Башкирс-кая-4 (Triticum vulgare L.) и кукурузы сорта Глория (Zea mays L.). Подбор воздушно-сухих зародышей и растущих органов регистрировался графически, путем составления карт относительной физиологической оценки популяции семян и проростков, используемых для выделения клеточных ядер и их надмолекулярных структур. Семена были получены из селекционных и селекционно-семеноводческих учреждений (п.Мироновна, Ровенки: Украина; п.Чишмы, Удряк: Башкортостан).

Стерильные семена проращивали в темноте при 22°С или 26°С в термостате. Наклюнувшимися (24 ч) считали семена, у которых из трещины в кожуре виден апекс корня ™0,5 мм.

Физиологическую оценку проростков осуществляли по росту и развитию колеоптиля (покровного .органа первого настоящего листа), совершающего полный цикл развития в гетеротрофной фазе онтогенеза и прекращающего свой рост в связи с выходом первого листа в условия автотрофного пита-' ния. • • • -

Выделение клеточных ядер проводили глицериновым методом очистки по способу [Иванова, Вафина, 1991]. Получение ядерных фракций, обладающих лротеиназной и ингибируют-

щей активностью, а также количественный анализ белка на основе модификации метода Бредфорд осуществляли по способу [Иванова, Вафина, 1992]. Из очищенных препаратов ядер нук-леоплазму экстрагировали при низкой ионной силе 0,14 М NaCl в 0,01 М трис-буфере с рН 6,8. Непрочносвязанный с ядерным матриксом хроматин (Хр-I) выделяли экстракцией 0,35 М NaCl на том же буфере. Далее осадок суспендировали в 2 М NaCl. После экстракции основной фракции тотального хроматина (Хр-Х1) в осадке оставалась фракция, содержащая ядерный матрикс (ЯМ), который экстрагировали последовательно 6 М гуанидин гидрохлоридом с 0,004% Р-меркаптоэта-нолом в вышеуказанном буфере и 0,2 н. NaOH (ядерный остаток - ЯО). Ядерные фракции хранили при -196°С в азоте.

Количество белка определяли по методам Лоури, турби-диметрии, Бредфорд в модификации [Иванова, Вафина, 1990].

Количество ДНК и РНК оценивали [Спирин, 1958].

Микроколичества углеводов в ядерных фракциях определяли по методике Дише [1967], модифицированной в нашей лаборатории [Иванова, Вафина, 1992]. Сущность метода заключается в том, что при кипячении в присутствии концентрированной серной кислоты от пептидов отцепляются гликозильные группы, которые легко распадаются на моносахара и превращаются в тиоацетали, дающие с антроном синюю окраску с максимумом поглощения при Абго.

Трипсиноподобную активность и ее ингибирование в надмолекулярных фракциях клеточных ядер оценивали: по активности трипсиноподобных сериновых протеиназ, расщепляющих Arg-X, Lys-X связи в протамине; по активности ингибиторов трипсина, препятствующих расщеплению Arg-X, Lys-X связей в протамине. Мерой активности ферментов служило количество растворимых аргининсодержащих пептидов, образующихся при протеолизе экзогенного субстрата - протамина (Merck) (низкомолекулярного ядерного белка) при его расщеплении трипсином или трипсиноподобными протеиназами [Иванова, Вафина, 1990, 1992].Активность протеиназ и ингибирование трипсина выражали в нмоль аргинина'с~1•мг белка.

Общую антиоксидантную активность пероксидазной системы определяли с субстратом бензидином (Reanal) (донор водорода) и акцептором водорода - Н2О2 (пероксид водорода), приняв за основу метод [Гамбург и др., 1977]. Активность реакции выражали в условных единицах образования бензидина голубого 'с-1 ' мг белка.

Иммуноферментный анализ проводили по методике Г.Р.Кудояровой и др. (1986), с некоторыми модификациями. На первом этапе анализируемый материал сорбировался (сенсибилизация) на стенки лунок лолистеролового планшета (Linbro, США). В отдельных вариантах при сенсибилизации к анализируемому материалу добавляли ауксин (&-индолилуксус-

иую кислоту (ИУК), 10 нг/лунку). После промывки к анализируемому материалу добавляли антитела к ИУК. Количество аф-финносорбированных антител к ИУК оценивали с помощью антител диагностических против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой. В случае определения пероксидазной активности самого ядерного материала последняя стадия опускалась.

Аффинная хроматография. Надмолекулярные структуры ядер (нуклеоплазму, Хр-1, Хр-11, ЯМ, ЯО) пропускали через колонки (0,5 см " 1,0 см) с иммобилизованным трипсином или ингибитором трипсина. Трипсиноподобные протеолитические (ТП-) и ингибитортрипсиновые (ИТ-) комплексы элюировали при рН 3,0 ацетатным буфером [Иванова, Вафина, 1992].

Фракции, полученные кислотной элюцией, диалиэовали против 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0 и использовали для определения в них содержания белка, нуклеиновых кислот, углеводов, ИУК, протеолитической, ингибиторной активности, а также гетерогенности белков по их молекулярной массе.

Электрофоретический анализ белков ТП- и ИТ- комплексов проводили методом тонкослойного электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (9%, 25%, 4%) с додецилсульфа-том рН 8,37. Белковые полосы красили кумасси 0-250. Вся эта работа была выполнена в лаборатории химии белка (зав. лаб. д.б.н. Ю.6.Аллахов; г.Пущино).

Электронномикроскопический анализ был проведен на ЭВМ-100 АК при увеличении 55 ООО. Сеточку покрывали форм-варовой подложкой (0,25% формвар в диоксане). Пробы прома-кивали сеточкой, сушили при комнатной температуре в защищенном от пыли месте и контрастировали 1% уранилацетатом (растворенным в 70% спирте) от 5 до 30 мин. При печати фотографий увеличение было в 1,5 раз. Общее увеличение на фотографиях - в 85 ООО.

Фракционирование негистоновых и гистоновых белков. Определение интенсивности включения 2-,4С ацетата и 32Р фосфата, аминокислотный состав, методика работы с физиологически активными веществами выполнены по методу [Иванова, 1977].

Числа в таблицах и точки на графиках представляют среднеарифметическое трех-пяти химических и четырех-пяти биологических повторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Физиологическая характеристика популяции семян и проростков пшеницы, используемых для анализа ростового морфогенеза гетеротрофной фазы онтогенеза

За стандартизацию физиологической оценки роста й

развития проростков пшеницы приняли рост колеоптиля (см) (орган проростка пшеницы, покрывающий первый настоящий лист до выхода его из-под колеоптиля в условия автотрофно-го питания). Эффект формообразования проростка у растений достигается за счет инициации взаимосвязанно функционирующих апикальных, меристематических зон клеток, определяющих индивидуальное развитие отдельных органов побег-корень [Барлоу, 1994]. В данном контексте инициация роста покоящихся зародышей (О ч), рассматривается с момента поступления в эндосперм тепловой водной среды и начала ростовых процессов в интервалах: от 0 ч->24 ч->48 ч->72 ч->96 ч и т.д. до окончания роста колеоптиля [рис. 1; 4; 9].

2. Анализ надмолекулярных структур клеточных ядер постэмбрионального развития зародышей Мироновской пшеницы (репродукция Р!-3)

Схема биохимического анализа гетеротрофного ростового морфогенеза развития зародышей Мироновской пшеницы (семена урожая 1984 г.) представлена на рис.1. Компонентный состав надмолекулярных ядерных структур представлен на рис.2. Анализ данных показывает, что нуклеоплазма и ЯМ являются главным образом рибонуклеопротеидными; Хр-1, Хр-11 - дезоксирибонуклеопротеидными структурами. Во всех надмолекулярных структурах содержатся гексозы. В корневой системе они особенно мешали выделению клеточных ядер и нуклеиновых кислот. Однако способ выделения клеточных ядер и их очистки от цитоплазматических загрязнений (в данном контексте работы) был специально стандартизирован, ориентируясь на 24 ч зародыши, так как нас интересовало возрастание в процессе роста проростков прочности межклеточных->внут-риклеточных->внутриядерных связей, способных выявиться при биохимическом анализе в составе ЯМ или в других его компонентах за счет стягивания внутрь ядер.

На роль веществ - посредников в пространственно-временной координации ростовых процессов у растений, по мнению Уоринга и Филпипса [1984], претендуют фитогормоны. Взаимосвязь гормональной системы с молекулярно-генетичес-кой основой у растений представлена на рис. 3.

Проблема присутствия и функционирования эндогенных фитогормонов - ауксинов - на уровне организации клеточных ядер практически не освещена в мировой литературе. Анализ выявления эндогенного ауксина иммуноферментным методом показал динамику иммунореактивности надмолекулярных ядерных структур (рис. 3), которая четко коррелирует со скоростью роста колеоптиля и корневой системы. В период максимально-

Рис.1. Схема биохимического анализа постзмбрионального развития зародышей Мироновской пшеницы (репродукция ¡3 -3). 1К- 2* - корневая система была отделена вместе с междоузлием

Рис. 2. Компонентный состав надмолекупяр> ь.х ^¡руктур кле-Т( чных ядер при ростовом морфогеп'.. гетеоотрофний фазы онтогенеза проростков Мир-; «• -,ой пшеницы: А-нуклеоплазма; Б: хроматин-Т: р- хроматин-11 ; ["--ядерный матрикс; Д-ядерный ос к ". 1

X

и X

X

£-< о

1—1

<ц

СЗ

р. £

0>

>& «

о о

к о

£ С5 ч

к

Е а

к о

Еч Л Л

О о

О С ©

Ж

^ с;

Рч

'X

с 4) >1

с <и к

о Л

к сх

о

а « О

й- <а

г: £ К

С (5 £

о 3 р.

¡3 к

з ч

И" к

г: к К

X « <и

к о «

ю о

3 р-

к §

<3 н са

л о X

К о

и x й

о с- к

14 (3 ч

о я

>> « •о

1т.

г/.О 0.9 ОЛ О,? 0,6 0,61 0.4 0.3 0,2 о,{-

о,г о,?

ОА 0,6 О,? ОЛ 0,9

т

-а$в--

"о Ъ № 96

о -А -

V -

I

%

.3

н £

Рис. 3. Иммунологический анализ эндогенного ауксин;

ядерных структурах проростков Мироновской пше!

- покоящиеся зародыши;

XI

III

IV

V

-I >48 -(->9 6 ч->30 ч-> 3 6

растущим целый проросток; колеоптиль;

первый настоящий лист; первичная корневая сисгем;

О 27 2 72 72

доузлием.

1-нуклеоплагма;

2-хроматин-т (непрочносвязанный с ЯМ);

3-хрома-ин-1I (прочносаязанный с ЯМ);

4-.чдеркы'! «.гтрикс (ЯМ);

5-ядернь'й "гляток (ЯО); Н-целые яа,г,'1 •

го роста колеоптиля (рис. 1; 72 ч) максимум иммунореакти ности антител приходится на 72 ч (рис. 3, III; 72 ч). окончанием роста колеоптиля содержание эндогенного аукси резко падает и, по-видимому, при участии нуклеоплазмат ческих структур перемещается по внутриклеточным компоне там в активно растущую корневую систему (рис. 3, 96 ч Следует отметить, что целые ядра колеоптиля (рис. 3, 72 не проявляют иммунореактивности и только при экстракции них надмолекулярных структур становится возможным обнар жить эндогенный ауксин. В литературе имеются многочисле ные данные о том, что в надмолекулярных структурах нукл оплазмы, хроматина, ядерного матрикса имеются коровые ф ламенты [см. Збарский, Кузьмина, 1991], которые связанны промежуточными филаментами, а через них - с цитоскелет клетки и межклеточной системой [Поликар, 1976]. На осно такой системы организации клеточных ядер мы предполагав что эндогенный ауксин продвигается по фиброзным и фибри лярным структурам ядер, оказывая физиологическое действ на растущие органы и ткани проростков пшеницы.

С помощью иммуноферментного метода мы не обнаружи эндогенного ауксина в ядерных структурах покоящихся (О и прорастающих зародышей (24 ч), а также 4в ч -> 72 листьях. Однако из этого не следует, что в этих тканях о сутствует эндогенный ауксин. Просто в данном случае, нашему мнению, чувствительность иммуноферментного мето необходимо настраивать на нанограммы белка. В нашем случ мы иммуноферментный метод скорректировали на 10 мкг бел в ядерных структурах.

3. Анализ надмолекулярных структур клеточных ядер постэмбрионального развития зародышей пшеницы Московской-35 (суперэлита)

Схема биохимического анализа гетеротрофного рост вого морфогенеза индивидуального развития зародышей пшен цы Московской-35 (семена урожая 1988г.) представлена рис. 4.

Компонентный состав внутриядерных надмолекулярн £ХВУ.Ю1УШ. Все внутриядерные надмолекулярные структуры г коящихся зародышей (0 ч) и растущих проростков (48 120 ч), помимо белковых, содержат также и углеводные кс поненты. При использовании растущих 48 ч->72 ч->96 120 ч органов мы также, как и в предыдущем эксперимент специально оставили способ очистки ядер, примененный [ 24 ч проростков. Известно, что меристематические зоны с ганов растения, осуществляющие интенсивные процессы репг кации хроматина, деления ядер, синтеза веществ цитопла: образуют новую трехмерную сеть клеточных стенок [Барлс

Рис.4. Схема биохимического анализа постэмбрионального развития зародышей пшеницы Московской -35 (суперэлита).

ТП -трипсиноподобные, ИТ -ингибитортрипсиновые комплексы, выделенные методом аффинной хроматографии на колонках с иммобилизованным ингибитором трипсина или трипсином, соответственно. *- эксперимент проведен только на 96 ч колеоптилях

1994], в основе которых лежит остов, состоящий из агрегированных полимерных цепей целлюлозных микрофибрилл, погруженных в матрикс нецеллюлозных полисахаридов [Уоринг, Фил-липс, 1984]. До последнего времени в растительных клетках не обнаружено промежуточных филаментов белковой природы [Lloyd et al., 1987]. Возможно, промежуточные филаменты растений, связывающие ядерно-цитоскелетно-межклеточный матрикс, имеют главным образом углеводное происхождение и при разрушении клеток коплапсируют на поверхность ядер. Обсуждая формообразование с позиции клеточного аспекта можно еще раз подчеркнуть, что клеточные стенки и связанный с ними цитоскелет (добавив, а также и ЯМ), вместе взятые, ' являются основой эпигенетической информации для мор-фогенетического процесса, который определяется развитием формы органа [Барлоу, 1994]. Развитие проростка, начиная со стационартных (находящихся в состоянии покоя) основ побег-корень, прекрасная модепь для исследования эпигенетической информации (рис. 4).

Ограниченный протеолиз. На основании данных по про-цессингу белков [Локшина, былинкина, 1990], мы предположили , что в клеточных ядрах может работать механизм биологического контроля путем ограниченного протеолиза и его ин-гибирования по Arg-X, Lys-X группам, которыми богаты ядерные белки. В свое время уделялось много внимания исследованию модификации ядерных белков в связи с реализацией генетической информации [Гистоны и перенос генетической информации, 1968]. Появились работы по ацетилированию, фос-форилированию гистонов [Иванова, 1977]. Представление одной из стадий процессинга ядерных белков путем их ограниченного протеолиза и возможности его ингибирования - одна из сторон посттрансляционной модификации белков при реализации генетической информации. Многочисленные ранние работы по реконструкции хроматина с применением трипсина, специфически расщепляющего Arg-X, Lys-X связи главным образом были направлены именно на расщепление лизин- и арги-нинбогатых гистонов [Crampton et al., 1957; Дебабов и др., 1981; Marks et al., 1976] .

Данные, представленные на рис. 5 показывают, что генетические гетерополимерные структуры (нуклеоплазма, Хр-1, Хр-11, ЯМ) подвергаются трипсиноподобному протеолизу и его возможному ингибированию. В некоторых случаях ингибирова-ние (в отдельных фракциях ядер) проявляет сопряженность с трипсиноподобным протеолизом (рис. 5, I: Хр-1, 48 ч; II: Хр-1, 96 ч; IV: ЯМ, 72 ч; Хр-11, 96 ч). В опытах in vitro такой тип реакции доказан [Sweadner, 1991]. В данном случае мы пока не можем утверждать происходит- в одних и тех же клеточных ядрах сопряженная реакция или это итог работы с популяцией клеточных ядер принадлежащих разным тканям

на в надмолекулярных структурах клеточных ядер при ж сгэмбрпсмаль^о;! развитии зародышей Московсьой-32 (суперзлить') г.шиницы. А-трипеи.чо'Юдобный протеолиз ; В-ингибировалие трипсина;

1-нуклеоппазка; 2-хроматин-1; 3-хроматин-1Х; -ядерный магрикс; 1-колеоптиль; 11-первый настоящий лист; Ш-ме^роузлид; 1У-корнездя система

- 1 7 -

растущего органа. Роль ингибиторов трипсиноподобного про-теолиза могут выполнять поли-АДФ-рибозы [Suzuki et al . 1978] или белковые ингибиторы [Hirasawa et al., 1978]. Mi пока также не можем утверждать белковой или небелково! природы функционируют ингибиторы трипсиноподобных протеи-наз. Мы просто констатируем, что на уровне гетерополимер-ных структур ядра могут проявляться реакции как сопряженного, так и разобщенного трипсиноподобного протеолиза \ его ингибирования (рис. 5).

Анализ трипсиноподобного протеолиза, представленный на рис. 5 (III, 24 ч, сплошная кривая) показал, что npv индукции ростовых процессов в зародыше (рис. 4, 24 ч), вследствие прохождения тепловой водной среды через эндосперм в гетерополимерные структуры ядер, наиболее активно развертывается трипсинолодобный протеолиз на уровне ядерного матрикса (рис. 5, III: 24 ч, сплошная кривая) при сопряженном ингибировании (рис. 5; III: 24 ч. пунктир) трипсиноподобных процессов на других гетерополимерных структурах (Хр-1, Хр-II; нуклеоплазма). В процессе развертывания "программы" ростового морфогенеза в период гетеротрофной фазы онтогенеза наблюдается пространственно-временная разобщенность трипсиноподобного протеолиза на уровне хроматина и ядерного матрикса, то есть, если трипсино-лиз осуществляется в ЯМ, то в хроматине он или полностью отсутствует или слабо проявляется. Особенно это хорошо видно в междоузлии (рис. 5; III: О ч->120 ч, сплошная кривая), корневой системе (рис. 5, IV: 48 ч->120 ч, сплошная кривая), в колеоптиле, в период активного роста за счет растяжения клеток (рис. 4, 72 ч-»96 ч; рис. 5, I: 72 ч->96 ч, сплошная кривая); с окончанием роста колеоптиля (рис. 4, 120 ч) трипсинолиз сразу прекращается (рис. 5, I: 120 ч, сплошная кривая). В период роста апекса колеоптиля (рис. 4; 48 ч) активные процессы по ограниченному протео-лизу осуществляются только в хроматине и нуклеоплазме (рис. 5, I; 48 ч, сплошная кривая). Возможно, это связано с запуском и распределением генетических программ на уровне роста апекса колеоптиля, где некоторые клетки растут за счет их деления. Мы склонны думать, что высокая трипсино-подобная активность Хр-II (рис. 5, II: 96 ч, сплошная кривая) также связана со слоями тех клеточных тканей первого настоящего листа, которые растут за счет митотического деления клеток. Однако увеличение трипсиноподобного протеолиза на уровне ЯМ (рис. 5, II; 72 ч->120 ч, сплошная кривая) может свидетельствовать о том, что ряд тканевых слоев первого настоящего листа растет за счет растяжения клеток.

Таким образом, мы предполагаем, что ограниченный протеолиз и его ингибирование в процессе ростового морфогенеза связан с генетическими структурными реорганизациями

хроматина при митотическом делении клеток (например, рис. 5, I: 48 ч; II: 96 ч; III: 48 ч, 96 ч; IV: 48 ч, 96 ч) и организацией на ЯМ при растяжении клеток мест сборки ферментативных комплексов репликации и транскрипции (например, рис. 5; III: 24 ч; I: 96 ч, сплошная кривая).

Общая антиоксидантная активность пероксидазной сис-1емьц. Рассматривая один из возможных молекулярных морфоге-неэных аспектов процессинга ядерных белков в надмолекулярных ядерных структурах (рис. 5), индуцированных к структурно-функциональным преобразованиям при поступлении в покоящийся организм зародыша тепловой водной среды, прошедшей через эндосперм (рис. 4) представляется, что активные динамические события, причастные к ускоренным темпам репликации хроматина, делению ядер, синтезу веществ цитоплазмы, образованию новой трехмероной сети клеточных стенок, развертываются с вовлечением генерации активных форм кислорода (АФК) (например, Н2О2 (рис. 6)). Такому предположению способствовали данные Дион и др.[см. Дубинина, Шуга-лей, 1993], которые считают, что радикальная атака вначале направлена на белки плазматических мембран, способных вызывать их депопимеризацию, а не на липиды. Что касается эндогенного механизма действия трипсина, то показано, что он активнее расщепляет окисленные, чем нативные белки [Дубинина, Шугалей, 1993]. В представленной работе мы не располагаем данными о связи антиоксидантной активности пероксидазной системы с окислительной модификацией белковых молекул, но мы представляем данные по общей окислительно-восстановительной (или антиоксидантной) активности пероксидазной системы, развертывающейся в процессе ростового морфогенеза в структурах клеточных ядер (рис. 6).

В литературе есть данные, из которых следует, что генерация АФК (Н2О2) может быть вызвана активностью серино-вых протеиназ [Никандров, 1988].

Как видно на рис. 6, наибольшая общая активность пероксидазной системы проявляется на уровне нуклеоплазмы (рис. 6: III; IV; 72 ч), в период подготовки проростка к максимальному росту колеоптиля (рис. 4, 72 ч-> 96 ч). Возможно, это связано с активным ядерно-цитоплазматическим обменом веществ или трансформацией энергетических процессов, направленных в русло формообразования ЦСМП. Рассматривая в качестве генератора механических сип морфогенеза цитоскелетно-мембранные преобразования (ЦСМП) во взаимосвязи с ЯМ и Хр, а биохимические реакции с позиции потоков энергии [Фокс, 1992], можно утверждать, что инициация мор-фопроцессов происходит при участии хроматиновых и нуклеоп-лазматических гетерополимерных структур (рис. 6, О ч -> 120 ч). Возможно, наблюдаемая динамика общей антиоксидантной активности пероксидазной системы гетерополимерных

¡10003

за осе

(I гоооо

<<

№000

>

л

V

V, 600

а т

1 £00

§

с С

"¡1 4С ООО

|

¿<2000

3

г ¡0000

8- ¿0000

К ¿00

^ т

к а ш

го«

*

1 О

ъ

И

¿00

?

ш

?

* 6С0

ш

г

£ /ООСО

С!

£ £0000

4 -М ООО

* ¿0000

Рис. 6. Общая антиоксидантная активность перокс/.лаз'.чсм системы в нл.л-'оле.-.улярных структурах клеточньх ядер при постзмбр::ол,.1Льном рлзвитии зародышей Мсс-ковской-35 (суперзли'1а) пшеницы. #

1-колеоптиль; И-лереый лист;

Ш-междоу-злие; 1У-корневач система;

1-нукпеоплаз,.'а;

2-хрома гин-Г;

3-хромат ин-ХГ;

4-ядернь1.'/ метрике.

структур (нуклеоплаэмы, хроматина) клеточных ядер есть проявление сил сокращения, растяжения и гидростатического внутриядерного давления в процессе ростового морфогенеза (рис. 6). На уровне ЯМ мы практически не обнаружили общей антиоксидантной активности пероксидазной системы (рис. 6). Таким образом, анализируя на уровне ядерных гетерополимер-ных структур нуклеоплаэмы, хроматина - процессы гидратации с последующей вероятной дегидрогенизацией субстратов (в ряде случаев которых образуется пероксид водорода (Н2О2)), можно предположить, что донором водорода в образуемой пероксидазной системе может стать любое вещество, например белок, нуклеиновая кислота, углеводы, липиды внутриядерных структур. Обычно реакции окисления-восстановления это сопряженные процессы, идущие со скоростью в долях секунд.

Локализация трипсиноподобных протеиназных (ТП-) и

ингибитортрипсиновых (ИТ-)_комплексов в надмолекулярных

структурах клеточных ядер. Следующий этап работы заключался в установлении с какими структурами клеточного ядра могут быть взаимосвязаны ядерные протеиназы и их ингибиторы. С этой целью мы пропустили надмолекулярные структуры ядер через колонки с иммобилизованным трипсином или ингибитором трипсина. Анализ этих данных показал, что трипсиноподобные протеиназы и ингибитор трипсина, главным образом, локализуются в ядерном матриксе (рис. 7), причем их локализация в ЯМ, по-видимому, взаимосвязана с его структуризацией, так как в покоящихся зародышах мы не обнаружили трипсиноподобных протеиназ и ингибитора трипсина. О том, что в покоящихся клетках ядерный матрикс слабо развит, свидетельствуют и литературные данные на животных объектах [см. Збарский, 1988]. Биохимический анализ трипсиноподобных протеиназ и ингибитора трипсина показал наличие в них помимо белков, ДНК, РНК, гексоз. Поэтому в дальнейшем мы называем трипсиноподобные протеиназы и ингибитор трипсина трипсиноподобными (ТП-) и ингибитортрипсиновыми (ИТ-) комплексами, которые к тому же оказываются подвижными в ЯМ по компонентному содержанию белка (рис. 7) в процессе формообразования организм->орган в течение гетеротрофной фазы онтогенеза (рис.4). Электронномикроскопический анализ по контрастированию с уранилацетатом трипсиноподобных протео-литических и ингибиторнтрипсиновых комплексов (рис. 8), выделенных с колонок с иммобилизованным ингибитором трипсина (рис. 7, I, 96 ч), выявил плотный зернистый слой ядерного матрикса с четкоподобными структурами (рис. 8, На) и крупные розеткоподобные мегакомплексы (рис. 8, Ив), напоминающие реплисомы [см. Nelson et al . , 1986]. Все эти структуры, ассоциированные с ядерным матриксом, выявляются также и с колонок с иммобилизованным трипсином (рис. 8; I). Однако зернистый слой практически полностью

Рис. V Содержание трипсиноподобных протоолитических (ТП-) и ингибитор—г-трипсинозып (ИТ-) комплексов в ядерных фракциях растущих прооосгков пшеницы Московской-35 (суперэлита; "-куклеоплаэма;

2-хроиатин-I; З-хроматин-11; ч-м^ер.ный матрикс; 5-ядерный остаток; 1-колеогп л л1.-.; И-червый лист; X 11-междоузлие; IУ-корневая система; ПР-покоя-щийся (О ч) и проклюнувшийся ггродыш (24 ч)

л-

йе

Рис. 8. Электронномикроскопический анализ (контрастирование уранилацетатом) трипсиноподобных (ТП-) (IX а, в); выделенных на колонке с иммобилизованным ингибитором трипсина); ингибитор-трилсиновых комплексов (ИТ-) (Га, в; выделенных на колонках с иммобилизованным трипсином). ' '""" '' '

Общее увеличение на фотографии 85 ООО

протеолизируется трипсином. Фактически мы пока предприняли первые шаги на пути к злектронномикроскопическому анализу рибонуклеопротеидных трипсиноподобных и ингибитортрипсино-вых комплексов, ассоциированных с ядерным матриксом и проявляющих подвижную взаимосвязь с ним в процессе реализации морфогенеза в гетеротрофной фазе онтоегнеза проростков пшеницы.

4. Анализ трипсиноподобных (ТП-) и ингибитортрипсиновых (ИТ-) комплексов ядерного матрикса постэмбрионального развития зародышей пшеницы Московской-35 (репродукция Я-1 )

На рис. 9 представлена схема биохимического анализа гетеротрофного ростового морфогенеза индивидуального развития зародышей пшеницы Московской-35 (семена урожая 1986 г.).

Содержание ТП- и ИТ- комплексов представлено на рис. 10. Как и в эксперименте представленном на рис.7, ТП- и ИТ- комплексы проявляют "морфогенезную подвижность", которая связана с динамикой содержания в них белковых компонентов. В данном эксперименте клеточные ядра выделяли из всех растущих органов проростков без учета их физиологических особенностей, проявляющихся в течение суток. То есть в эксперимент брали и медленно растущие проростки. Электрофоретическое исследование ТП- и ИТ- комплексов, представленное на рис. 11, выявило гетерогенность белкового состава в пределах ММ 67-57, 39-30, 30-20, 20-14 кДа. Такие же пределы ММ обнаруживают в составе гранулярных частиц, прикрепленных к ЯМ, известных как информатин [см.: Збарский, 1988]. Эти же пределы ММ обнаруживают на участках прикрепления ДНК к ЯМ [см.: Збарский, 1988]. Нужно отметить, что электрофоретически белки ЯМ разделаются на нечеткие полосы, создавая сильно мажущий фон, а часть белков даже не входит в 4% разделяющий слой геля, мы предполагаем, что мажущий фон создают гликопротеиды. На животных тканях было доказано, что гликозаминогликаны скрепляют гранулярные'структуры ЯМ [см.: Збарский, Кузьмина, 1991].

В настоящее время мы пока не можем сказать, какой из белков, входящих в состав ТП-, ИТ- комплексов, является истинно протеиназой или ее ингибитором. Анализ нуклеопро-теидных комплексов на протеолитическую и ингибиторную активности, проведенный в сравнении с активностью трипсина и его ингибированием, показал, что ИТ- комплексы ЯМ 96 ч листьев проростков пшеницы ингибировали трипсин на ~75%, а собственные протеиназы - на ~24% от первичной активности .

Таким образом, в данной работе показано, что ТП-,

-л У'

Рис.9. Схема биохимического анализа постзмбрионального ра»вития зародышей пшеницы Московской - 35 (репродукция й -1). Примечание:х - не исследовали

I

I

40

30

Г I I

1

20

ю

~96

к

\

' /

- 2 а 3 А 4

7 /

96 Яр ел%

?ис. 10. Содержание трипсиноподобных (ТП-) (сплоинлй ,--ри-еая) и ингибитортрипсиновых (ИТ-) (пункт*;-: ая кривая) комплексов ^ ядерном матриксе гокоям.ихся (0 ч), проклюнувшихся (24 ч) зародышей, прпс.^т-ков (48 ч); 1-колеопгилей (72 ч, 98 ч) : ез (72 ч, 96 ч) пшеницы Московской-35 (р^гм.-од'^к-ция .4-1). Определение белка выполнено по пз'^ду ":урб1/,".иметрии. 1-нукпеоплазма; 2-/...¡'.г' ■ ; -•;у.;-.'.\тин-11; 4-ядерный матрикс; 5-яДс.- • . <

'кАа

67 13

10 20 IV

1 2 7 V 1■ е 7 г $ ю н п

Рис. 11.

Схема элетрофореграмм ТП-. ИТ- комплексов ЯМ (6 М гуанидин гидрохлорид + &-меркалтоэтаанол). Элетк-рофорез проводили в токослойком градиентном поли-акриламидном геле (9%, 25%, 4%) с додецилсульфа-том натрия рН 8,37:

1. ИТ-комплексы 24 ч проростков;

2. ТП- -""

3. ИТ-комплексы 48 ч проростков;

4. ТП- -"5. И'.-комплексы 72 ч настоящих листьев (обработка

хлороформом);

6. тп-комплексы 72 ч первых настоящих листьев;

7. ИТ-комплексы 96 ч первых настоящих листьев; 3 . т п - - ~

а. и.т-комплексы 72 ч кодеоптилей;

10. Ги- -"-

II. ИТ - ;и:'.плексы 96 ч колеоптилей;

ИТ- комплексы, главным образом, связаны с ЯМ. Причем белковые компоненты с ММ от 43 до 14 кДа являются лилидо-растворимыми, а от 67 до 57 кДа липидонерастворимыми (рис. 11, N 5). Белки с ММ от 43 до 30 кДа обладают ДНК-аза защитным свойством, так как, в эксперименте с обработкой ИТ-комплексов ДНК-азой (Serva) при нагревании, ДНК-аза четко сохраняет свою зону, а в слоте без ИТ-комплексов она разрушается от предварительной тепловой обработки до нанесения в ее слот. Спектр белков ТП-, ИТ- комплексов ЯМ проростков пшеницы (Triticum aestivum L.) имеет большое сходство со скаффолдом митотических хромосом (Triticum mo-nococcum L.), представленных в работе [Hadlazky et al., 1982].

6. Заключение

Предпринята первая попытка анализа молекулярно-гене-тических основ онтогенеза на примере постэмбриональной фазы роста и развития проростков пшеницы, начиная с покоящихся зародышей (О ч), их ростом (24 ч-»120 ч) и кончая выходом первого настоящего листа в условия автотрофного питания. Первичность этой попытки заключается в том, что в работе основное внимание обращено на координацию всех уровней биологической организации растущего организма: организм -» орган -* клеточное ядро^ с описанием биохимических внутриядерных процессов, происходящих в надмолекулярных (нуклеоплазма, Хр-1, Хр-11, ЯМ) структурах. Предложенный методический подход биохимического анализа (рис. 1, 4, 9) позволил проследить за движением эндогенного ауксина по надмолекулярным структурам (рис. 3) клеточных ядер в течение диффренцированного роста проростков (рис. 1); провести анализ "включения" ограниченного протеолиза и его возможного ингибирования (рис. 4; 5), сделать предположение, что протеолитическая гидролитическая система in vivo может быть связана с генерированием активных форм кислорода (АФК) (рис. 6). Обнаружение "подвижных" трипсиноподобных (ТП-) и ингибитортрипсиновых (ИТ-) комплексов (рис. 7; 10) обращает внимание на взаимосвязь цитоскелетно-мембранных преобразований с ядерным матриксом с позиции молекулярных основ ростового морфогенеза гетеротрофной фазы онтогенеза. Данная работа представляет собой проект методического подхода к исследованию молекулярно-генетических основ постэмбрионального онтогенеза у растений, но может быть с успехом использована и при работе с животным объектом.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена на уровне надмолекулярных структур (нуклеоп-

лазмы, хроматина, ядерного матрикса) внутриядерная активность трипсиноподобных протеиназ и ингибитора трипсина .

2. Показана разобщенность трипсиноподобного ограниченного протеолиза в ядерном матриксе и хроматине.

3. Выявлена общая пероксидазная активность на уровне надмолекулярных структур клеточных ядер.

4. Показана связь общей пероксидазной активности с надмолекулярными структурами: нуклеоплазмой и хроматином клеточных ядер.

5. В надмолекулярных структурах клеточных ядер иммунофер-ментным методом обнаружен эндогенный ауксин.

■ 6. 'Выделены из надмолекулярных структур клеточных ядер трипсиноподобные протеолитические (ТП-) и ингибиторт-рипсиновые (ИТ-) комплексы методом аффинной хроматографии с иммобилизованным ингибитором трипсина и трипсином соответственно.

7. Показана связь ТП-, ИТ- комплексов с ядерным матриксом.

8. ТП-, ИТ- комплексы - гетерополимерные структуры, в состав которых входят: белок, ДНК, РНК, углеводы. По соотношению РНК/ДНК - это рибонукпеопротеидные структуры (РНП-структуры).

9. Содержание ТП-, ИТ- рибонуклеопротеидных комплексов в ядерном матриксе коррелирует с физиологическими особенностями растущих проростков пшеницы.

10. Показано, что электрофоретический белковый спектр ТП-, ИТ-комплексов находится в пределах от 67 до 18 кДа.

11. Белки ИТ- комплексов с ММ от 43 до 14 кДа липидораство-римые.

12. Белки ИТ-комплексов с ММ 67-57 кДа липидонерастворимые.

13. Область белков от 43 до 30 кДа обладает ДНК-аза протекторным свойством.

14. ТП-, ИТ- комплексы способны "связывать" эндогенный ауксин.

15. Электронномикроскопический анализ по контрастированию с уранилацетатом выявляет в ТП-, ИТ- комплексах четкопо-добные и розеткоподобные структуры.

16. Взаимосвязанные с четкоподобными и розеткоподобными структурами сопутствующие "гранулярные" структуры ЯМ сохраняются в присутствии иммобилизованного ингибитора трипсина.

17. Взаимосвязанные с четкоподобными и розеткоподобными структурами "гранулярные" структуры ЯМ протеолиэируются в присутствии иммобилизованного трипсина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Негистоновые белки проростков пшеницы и кукурузы // Фи-зиолого-биохимические основы формирования хозяйственно полезных признаков растений. Уфа, 1986. С.56-64.

2. Изучение модификации белков хроматина растений// Тезисы докладов всесоюзной конференции "Молекулярная биология генов высших организмов", Тез. докл.-М, 1987,- С. 16 (совместно с Ахметовым P.P.).

3. Активность протеиназ и их ингибиторов в клеточных ядрах проростков озимых и яровых пшениц// В кн.: Биохимические и физиолого-генетические основы гетерозиса и гомеостаза

■ ■ растений. Уфа, 1986. С. 56-61 (совместно с Давлетовой Р.Г.).

4. Модификация негистоновых белков в проростках растений// Физиология растений,- 1987Т.34.Ы з .- С. 507-512 (совместно с Ахметовым P.P.).

5. Новые подходы исследования системы хозяин - патоген// Применение достижений биотехнологии в народном хозяйстве. Уфа, 1 987 С.107-108 (совместно с Вафиной Г.Х., Ямалеевым A.M.).

6. Исследование функциональной роли белковых компонентов клеточных ядер при патогенезе пшеницы// Тезисы докладов на конференции: "Физиолого-биохимические основы иммунитета к грибным болезням растений",Уфа, 1988.-С.36 (совместно с Вафиной Г.Х., Ямалеевым A.M.).

7. Молекулярно-физиологические особенности развития сорта пшеницы Московской-35 восприимчивой к пыльной головне// 2-е Всесоюзное совещание "Физиолого-биохимические основы иммунитета растений к болезням и вредителям". Уфа, 1988 (совместно с Вафиной Г.Х.).

8. Исследование функциональной активности клеточных ядер при патогенезе пшеницы// Микология и фитопатология г-1 989 .*• T.23.-rJ 2. - С. 141-146 (совместно с Вафиной Г.Х., Ямалеевым А.М) .

9. Участие ядерных ауксинсвязывающих белков в формировании онтоегенетических адаптивных реакций пшеницы// Тезисы докладов на всесоюзной конференции: "Онтогенетика высших растений", Кишинев. 1989С.320-321 (совместно с Кудоя-ровой Г.Р., Вафиной Г.Х.).

10. Иммуноферментный анализ гормонсвязывающих белков в "про-теолитических" и "ингибиторных" комплексах проростков пшеницы//Тезисы докладов на Всесоюзной конференции молодых ученых, Уфа, 1989 (совместно с Вафиной Г.Х., Кудоя-ровой Г.Р., Мустафиной А.Р.);

11. Применение иммуноферментного метода в исследованиях растительных ядерных белков//Тезисы докладов школы-семинара "Иммуноферментный анализ регуляторов роста растений. Применение в физиологии растений и экологии", Уфа, 1990, С.104-116 (совместно с Кудояровой Г.Р., Вафиной Г.Х.).

2. Методика выделения протеиназ и ингибиторов из клеточных ядер проростков пшеницы// Физиология растений. —1990. Т. 37 .л/3,-С. 609-61 6 (совместно с Вафиной Г.Х.).

3. Роль ядерных протеиназ и их ингибиторов в функциональной активности клеточных ядер прорастающих семян пшеницы// Тезисы докладов: на X Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра", Гродно, М., 1990.-С.138 (совместно с Вафиной Г.X.);

4. Proteinases of nuclei and their role in the plant cellular nuclei function// 20-th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, Budapest, 1990. P.421 (совместно с Вафиной Г.Х.).

5. Функциональная активность клеточных ядер при патогенезе пшеницы// Тезисы докладов на 2-ом Всесоюзном съезде Общества физиологов растений, Минск, 1990.—С.36 (совместно с Вафиной Г.Х., Ямалеевым A.M.).

6. Возможность участия ядерных протеиназ и их ингибиторов в молекулярно-генетических механизмах клеточной адаптации у растений//Тезисы докладов на 3-ем Всесоюзном симпозиуме "Клеточные механизмы адаптации", Киев, Чернигов. 1991. "Цитология". N 6.-С. 8 (совместно с Вафиной Г.Х.).

7. Способ выделения растительных клеточных ядер. Авторское свидетельство N 1 701747 // БИ. 1991. N 48.-С. 93 (совместно с Вафиной Г.Х.).

8. Формирование антиоксидантной системы как адаптивной реакции на уровне морфогенетических программ развития проростков пшеницы//Тезисы докладов на IV Всесоюзной конференции "Экологическая генетика растений, животных, человека", Кишинев, 1991 (совместно с Вафиной Г.Х.).

9. Анализ ядерных "протеолитических" и "ингибиторных" комплексов в процессе прорастания семян пшеницы// Физиология растений. —1991. Т.38.д/3. -С.574-579 (совместно с Вафиной Г.Х.) ;

0. Molecular-genetic and biochemical approaches to study of early stages of plant ontogenesis// 15-th International Congress of Biochemistry, Israel. 1991. nr.663 (совместно с Вафиной Г.Х.).

1. The role of nuclear proteinases and their inhibitors in the early of unfolding of genetic programmes during development in wheat seedlings// Therd International Congress of Plant Molecular Biology. USA. 1991 (совместно с Вафиной Г.Х.).

2. Физиолого-биохимический анализ интерфазных ядер в процессе прорастания семян пшеницы// Физиология и биохимия культурных растений. 1992. Т.24. //б.-С.577-584 (совместно с Вафиной Г.Х.).

3. Способ получения ядерных фракций обладающих протеиназной и ингибирующей активностью. Авторское свидетельство N

1733471//БИ.1992. T.18. С.96 (совместно с Вафиной Г.Х.).

24. Мопекулярно-генетические основы онтогенеза растений//Те-зисы докладов VI Съезда Общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова. Авторский указатель, Ч.1.-С.12. Минск. 1992 (совместно с Вафиной Г.Х.).

25. Молекулярные механизмы адаптации и устойчивости надмолекулярных структур клеточных ядер в процессе прорастания семян пшеницы//3-й Всероссийский съезд физиологов растений. С-Петербург. 1993. Т.6.-С.587 (совместно с Вафиной Г.Х.).

26. Структурная и временная организация клеточных ядер при развертывании метаболитических процессов прорастания се-

• мян пшеницы// 3-й Всероссийский съезд физиологов растений. С-Петербург. 1993. Т.2.-С.113 (совместно с Вафиной Г.Х., Бикбулатовой И.Э.).

27. Функциональная активность надмолекулярных структур клеточных ядер в процессе развертывания морфой отдельных этапов онтогенетической программы развития проростков пшеницы// 3-й съезд физиологов растений. С-Петербург. 1993. Т.2.-С.114 (совместно с Вафиной Г.Х., Бикбулатовой И.Э.).

28. Динамика содержания эндогенного ауксина клеточных ядер в процессе развертывания морфо- и онтогенетической программы развития прорастающих семян пшеницы//2-я конференция "Регуляторы роста и развития с.-х. растений". М., 1993.-С.27 (совместно с Вафиной Г.Х., Кудояровой Г.Р.).

29. Онтогенетическая модель для оценки экологической безопасности и механизма действия химических регуляторов роста// Тезисы докладов на 2-й конференции "Регуляторы роста и развития с.-х. растений". М., 1993.-С.3 (совместно с Вафиной Г.Х., Бикбулатовой И.Э.)

30. Возможность конформационных перестроек надмолекулярных структур клеточных ядер при участии ядерных протеиназ //Цитология. 1993. N 6.-С.73 (совместно с Вафиной Г.Х.)

31. The use of immunoassay for detecting endogenic ayxins of cellular nuclei of wheat seedlings// Biology. 1994. N 1. P.78-79 (совместно с Вафиной Г.Х.).

32. Возможность пространственно-временной организации мета-болонов в хроматине клеточных ядер при индукции роствоых процессов у растений// Генетика. 1994. Т.30.— С.58-59 (совместно с Вафиной Г.Х., Бикбулатовой И.Э.).

33. Molecular and genetic bases of wheat seed dormancy and germination. 9-th Congress FESPP. Brno. 1994 (совместно с Вафиной Г.Х., Бикбулатовой И.Э.).

34. Analysis of molecular mechanism of the plant-pathogen system. International Plant Protection Congress. Hague. 1995. nr.:3011/0451 (совместно с Вафиной Г.Х., Бикбулатовой Н.Э., Чернышевой Е.Э.).

35. Использование иммуноферментного метода для обнаружения эндогенного ауксина в клеточных ядрах проростков пшеницы. Известия РАН, Серия биологическая. 1995. N 2. С. 252-253 (совместно с Вафиной Г.Х., Кудояровой Г.Р.).

36. Analysis of molecular mechanisms of fungus-plant interaction in the root system of wheat seedlings// 8-th International Congress of Mycology Division. Israel. 1996 (совместно с Вафиной Г.Х., Чернышевой Е.Э.).

3?. Molecular-genetic basis of development of whoat seedlings organs. 10-th FESPP Congress. Italy. 1996 (совместно с Вафиной Г.Х.).

355. Biochemical analysis of functional activity of cell nuc-: lei of growth morphogenesis of heterotrophic phase of wheat onthogenesis. Всероссийский симпозиум no "Физико-химическим основам физиологии растений". Пенза, 1996 (совместно с Вафиной Г.Х.).

39. Физиологическая роль пероксидазной активности клеточных ядер на ранних этапах онтогенеза растений пшеницы// Физиология и биохимия культурных растений. 1997. Т.29. 2. С.129-132 (совместно с Вафиной Г.Х.).

40. Выявление эндогенного ауксина в субъядерных фракциях прорастающих семян пшеницы // Цитология. 1997. Т.39. 1. С.65 (совместно с Вафиной Г.Х.).