Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные изменения в хроматине зародышей пшеницы при прорастании

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурные изменения в хроматине зародышей пшеницы при прорастании"

« аг^пмэ-зиъ ьч ^пэ-пмэ-зиъ ъиьирирпмэ-зпьъ

ЪРЬЧ1Г№ 'ПЬвиииЪ <иШ1Ш11Ри^ р ^ д

Ргцш^шй РЬшфрЬиШ 2*5' СЕН

ЗПРЬЪГ" оьпл. иишърь ЙРПиивЬЪП вдп-пьзгш&еизкь ФПФШипыэ-зпн/ььре

Q-.00.02 - ЦЬОишф^фЦш йши0ищ[гфтр]1ш1р 1}ЬОишршОш1|шО ффП1р]П100Ьр{7 рЬЦОшйпф ц^фшЦшЦ шицфбшС}! Ьиуу^щй шфЬОифтипвдшй

иьчииаьр

ЪРЬЧиЪ-2000

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Бояджян Беатриса Геворковна

СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ХРОМАТИНЕ ЗАРОДЫШЕЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ПРОРАСТАНИИ

• АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - Биофизикд

ЕРЕВАН - 2000

iö-biluiQ 1iiuuuuuuhIui& t bpUuiGJ) ujhuiuiliuiG hiuüiuiuiupiuGniiS

q-limuilpuG qhljmilmpChp li.q.i]., щрпфЬипр Q-.<. Фшйпщшй

li.q.ij., ицгпфЬипр 4iupqUiuGjuiG

"1ш2шпйшЦшй pQqijliiSmtunuühp' Ij.q.rj., щрпфЬипр L-Ч. l-milpjmü

ф.-ri.q.q., ицтфЬипр 3ni.U. Piupmjuiü

llnuijuiuiiup llшq^Jш^lbpu^nlpJПlG, « Ч-IIU ЦщЬЦхщшДО кЬйишрш-

GnipjuiG hGuinJiinmm

UmhQuifunurupjuiG u|ui2tna[uiüni.pjniQp inhqji IpuGbGui hntGJiuJi 26-JiG 2000p. dmüp 14°"-tiQ bpbiuG{i iqhmuiljuiG hiutfuiiuuipuiGfiQ Ijfig 051 UuiuGuiq|iuuugilui& lunphpqfi GJiuinniiS (375049, bpluuG, Щ. UuiGniljjiuG ф. 1, b^R, ЦЬйишршйш^шй фшЦтрпЬт):

UuihGuitununipjuiGp ЦшрЬф t &шйпршйш[ bplouGJi щЬшшЦшй huiiSuiiuuipiuü|i qpuirpupiuGnitf:

UhqümqlipG шпшрфий t tfiujjiufi 25-JiG 2000p.

051 UuiuGiuqlimuigiliu& Junphprjli qfunuil[iuG ршртпицир, 1}ЬйишршйшЦшй qJiuinipjniGGbpli phljGuiörn Qjvub U.U. InGjuiG

Тема утверждена в Ереванском государственном университете

Научные руководители: Д.б.н., профессор Г.А. Паносян

д.б.н., профессор П.О. Вардеванян

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор JT.B. Давгян

д.ф.-м.н., профессор Ю.С. Бабаян

Ведущая организация: Институт Молекулярной Биологии

HAH РА

Защита состоится 26 июня 2000г. в 1400 часов на заседании Специализированного Совета 051 при Ереванском государственном университете (375049, Ереван, ул. Ал. Манукяна 1, ЕГУ, биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ереванского государственного университета

Автореферат разослан 25-го мая 2000г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

кандидат биологических наук Q^cuw Гонян С.А.

ПШ л*f,а

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Понимание механизмов активации генома и последующей активизации метаболических процессов является весьма актуальным в изучении жизненно важных процессов, происходящих в клетке. Выявление молекулярных механизмов внутренних регуляторных систем растений при прорастании и стимуляции фигогормонами может пролить свет на особенности механизмов действия тех или иных факторов, влияющих на экспрессию генома. Развитие представлений о внутренних регуляторных системах растений, а также практическое применение фитогормонов и других биологически активных соединений может выявить молекулярные механизмы их действия на генетический аппарат клетки.

Особый интерес представляют исследования по выявлению механизмов стимулирующего действия природных гормонов и гормональных соединений как для непосредственного внедрения в сельскохозяйственную практику, так и для разработки и синтеза новых, более продуктивных стимуляторов. Модельная система,- "прорастающий зародыш" предоставляет возможность для исследования процессов развития, которые не могут дать другие живые системы. Биосинтез белка и его регуляция в прорастающем зародыше семян связан с двумя аспектами: а) рассмотрением на молекулярном уровне процессов, "активирующихся" в начальных стадиях прорастания и б) поиском возможных регуляторных звеньев, вызывающих усиление указанных процессов.

"Прорастающий зародыш" можно рассматривать и как модель типа клеток с определенными "характеристиками", а именно исходным состоянием вынужденного покоя, т.е. со свойствами, которые присущи весьма ограниченному числу клеточных систем, и, позволяющих использовать их в качестве удобной модели для исследования механизмов активации клеточного метаболизма.

Гормоны участвуют в регуляции покоя и прорастания семян, и поскольку в семенах часто взаимодействуют несколько гормонов, выработался особый механизм для подавления или усиления действия одного гормона другим. Молекулярные механизмы действия растительных гормонов остаются недостаточно изученными. Как класс растительных гормонов гиббереллины (ГК) вовлечены в регуляцию или контроль некоторых самых разных морфогенетических физиологических и биохимических ответов. Регулирование разнообразных активностей указывает на то, что ГК действуют на хроматиновом уровне (ЗЬэсШаЛ, 1980).

В настоящее время показано, что ядерный матрикс играет немаловажную роль в инициации и репликации ДНК, а также в синтезе, процессинге и транспорте РНК. В составе хроматина и хромосом эукариотических клеток обнаружены липиды и, в частности, фосфолипиды, которые несут определенную функциональную нагрузку. Не исключено, что фосфолипиды, входящие в состав хроматина, принимают активное участие в процессах, затрагивающих ядерные структуры (Геворкян, 1990).

Выявление изменений в хроматине и его компонентах при изменении функционального состояния зародышей пшеницы (прорастание, обработка гормоном) может дать ответ на понимание механизмов действия различных факторов. Изучение происходящих при этом динамических изменений может выявить неизвестные механизмы регуляции и экспрессии растительного генома.

Недостаточная изученность вышеотмеченных проблем делают актуальным исследование хроматина зародышей пшеницы как на структурном, так и на функциональном уровнях при прорастании и обработке гиббереллином.

Цель и задачи диссертации. Целью настоящей работы явилось изучение хроматина зародышей пшеницы при активации, и определение структурных изменений его отдельных компонентов при прорастании и стимуляции гормоном.

Были поставлены следующие задачи:

- выделить и охарактеризовать фракции хроматина в сахарозном граденте после высокоскоростного центрифугирования при их гидролизе в мягких условиях ДНК-азой И,

- провести анализ профилей дифференциальных кривых плавления высокоактивной фракции хроматина и определить параметры плавления фрагментов ДНК, выделенных из высокоактивной фракции хроматина сухих, прорастающих и обработанных гиббереллином изолированных зародышей пшеницы,

- выявить качественные и количественные изменения в составе фосфолипидов хроматина сухих, прорастающих и обработанных гиббереллином изолированных зародышей пшеницы и их влияние на структуру ДНК,

- определить степень перестроек, затрагивающих отдельные классы фосфолипидов и выявить различия, обусловленные активацией генома (прорастание, обработка фитогормоном).

Научная новизна, научно-практическая значимость работы.

В исследовании хроматина и его отдельных компонентов при прорастании зародышей пшеницы показано значительное перераспределение фракций хроматина в сахарозном 1радиенте после высокоскоростного центрифугирования. Выявлены существенные изменения во фракции активированного хроматина прорастающих зародышей пшеницы по сравнению с сухими зародышами. Обнаружены изменения в дифференциальных кривых плавления (ДКП) во фракциях хроматина, а также фрагментах ДНК из прорастающих и обработанных гиббереллином зародышей пшеницы по сравнению с сухими.

Детальное исследование фосфолипвдов хроматина сухих, прорастающих и обработанных гиббереллином зародышей пшеницы выявило шесть индивидуальных классов фосфолипидов (фосфатидилхолины - ФХ, фосфатидилэтаноламины - ФЭ, фосфатадилинозитолы - ФИ, фосфатидил-серины - ФС, лизофосфатидилхолины - ЛФХ, кардиолипины - КЛ). Выявлены значительные сдвиги фосфолипидного состава хроматина при прорастании и обработке гиббереллином.

Полученные в данной работе результаты указывают на то, что отдельные компоненты хроматина при активации подвергаются значительным перестройкам.

Основные положения работы, выносимые на защиту.

1. Прорастание зародышей пшеницы приводит к перераспределению фракций хроматина в сахарозном градиенте.

2. ДКП фракций хроматина и соответствующих фрагментов ДНК подвергается значительным изменениям при прорастании и обработке гормоном зародышей пшеницы.

3. При прорастании зародышей пшеницы имеют место количественные сдвиги в фосфолипидах хроматина и его активной фракции и эти сдвиги связаны со структурными изменениями хроматина.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции, посвященной 75-летию ЕГУ (Ереван, 1994), на конференции, посвященной 30-летию основания отделения биофизики биологического факультета Ереванского государственного университета (Ереван, 1996), и в отделе молекулярной биологии корпорации специализированных лабораторий (Санта-Моника, Лос-Анджелес, США, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 3 в зарубежной печати.

Объем и структура работы. Работа изложена на 127 страницах русского машинописного текста и содержит 6 таблиц и 18 рисунков и списка использованной литературы, включающего 225 наименований.

Диссертационная работа состоит из Введения, трех глав (I - Обзор литературы, II - Материалы и методы исследований, III - Результаты и их обсуждение) и Заключения, а также Выводов и Списка литературы.

В обзоре литературы приводятся сведения о современных представлениях о структурной организации растительного хроматина и методических подходах по изучению его структуры.

Краткое содержание остальных глав приведено ниже.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Зародыши пшеницы семян сорта Безостая I изолировали по методу Джонстона и Штерна (Johnston&Stern, 1957).

В качестве контрольной среды для проращивания зародышей служил раствор, содержащий 5 мМ Трис-HCl, pH 7,6, 20 мМ KCl и 0,06 мМ сахарозы. Для обработки опытных вариантов в контрольную среду добавляли гиббереллин в концентрации 10"4 М. Зародыши проращивали на стерилизи-рованной питательной среде в стерильных чашках Петри в темноте при 26°С.

Хроматин из сухих и прорастающих зародышей пшеницы получали по модифицированному методу Симона и Беккера (Simon &Becker, 1976). К 2-3 г зародышей добавляли 50 мл буфера, содержащего 0,5% тритон Х-100 в 0,05 М Трис-HCl, pH 8,1,1/15 мМ дитиотрейтол (ДТГ) и гомогенизировали в гомогенизаторе Type MPW-302 (Польша) при 13000 об/мин в течение 2-3 минут, после чего перемешивали на качалке при 4°С в течение 10 мин. Осколки разрушенных клеток и неразрушенные зародыши осаждали центрифугированием при 4000 g, а профильтрированный надосадок использовали для дальнейшего выделения хроматина. Хроматин агрегировали, добавляя по каплям к надосадку 3 М сульфат аммония до конечной концентрации 50 мМ, и осаждали центрифугированием при 14000g 10 минут. Полученный осадок ресуспендировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в буфере ДТТ, содержащем 50 мМ сульфат аммония. После двухкратной промывки осадка ресуспендированием в 10 мМ Трис-HCl буфере, содержащем ДТТ и 2 мМ MgCb (ТДМ) и центрифугированием при 4000 g 10 мин получали "грубый хроматин". "Грубый хроматин" очищали центрфугированием при 22000 g 30 мин при 0°С в 1,7 М сахарозе в 10 М Трис-HCl, pH 8,1. Полученный таким образом гелеобразный осадок промывали от сахарозы 2-3 кратным ресуспендированием в ТДМ при 4000 g 10 мин. Полученный осадок представлял собой чистый хроматин.

Все процедуры проводили при 4°С. Во всех растворах присутствовал 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) для предотвращения действия протеаз.

В экспериментах по плавлению хроматин растворяли в конечном буфере, оставляя на ночь. Непосредственно перед измерением суспензию центрифугировали при 1000 % для просветления. После просветления концентрацию хроматина по ДНК доводили до 1 О.Е. и определяли соотношение оптических параметров при указанных длинах волн.

Полученный после мягкого переваривания ДНКазой II гидролизат наносили на линейный градиент сахарозы (7-27%) в количестве 15 ед. опт. плот, по ДНК (к=260 нм) на 15 мл градиента и центрифугировали при 125000 и на центрифуге УЦП-60 в течение 18 ч.

Для сохранения максимально нативной структуры транскрипционно активного хроматина олигонуклеосомных размеров применяли условия мягкого гидролиза ДНКазой II, с некоторыми модификациями, основыванными на методе, схема фракционирования которого позволяет получать олигонуклеосомы, содержащие лишь небольшое количество мононуклеосом (Вардеванян и др. 1995). Условия частичного гидролиза, применяемые в нашей процедуре, приводили к образованию »1% кислоторастворимого материала от общего количества исходного хроматина из сухих и «3% для прорастающих в течение 24 и 48 ч, а также обработанных гиббереллином в течение 24 ч зародышей.

Подбор оптимальных условий сахарозного градиента проводили на сухих и однодневных зародышах (200 ед. О.Е./мл при А.=260 нм) с тем, чтобы выход фракций из сухих и прорастающих зародышей был достаточен для их дальнейшего исследования. Фракции, полученные при центрифугировании хроматина в градиенте плотности сахарозы, извлекали с помощью микронасоса; поглощение регистрировали при А.=260 нм на спектрофотометре ишсат БР-в-ЮО (Англия), в котором устанавливали проточную кювету (у=0.3 мл). Фракции собирали по 1.5 мл со дня пробирки. Для дальнейших исследований объединяли фракции из верхней, средней и нижней частей градиента. Верхнюю фракцию градиента с нарастающим поглощением обозначили А, широкий хроматиновый пик в центре градиента - В, острый пик у дна пробирки - С, приблизительно 20% хроматина оставалось на дне пробирки. Этот материал был собран и обозначен Э.

Фракцию А осаждали в ОДхББС (стандартная цитратная смесь) с двумя объемами спирта, и ДНК выделяли по известному методу (Магтиг, 1961), с некоторыми модификациями (Уагс1еуатап е^а!., 1983).

УФ-спектры поглощения и кривые плавления исследуемых препаратов получены в термостатируемых ячейках спектрофотометра Unicam SP 8-100 (Англия). Данные спеетров поглощения и кривых плавления были накоплены с помощью программируемого калькулятора HP 97S I/O (США). Для снятия кривых плавления использовался непрерывный режим нагрева растворов хроматина и ДНК, скорость нарастания температуры была 0,25 град/мин. Использовали 10 мм кварцевые кюветы с плотно притертыми тефлоновыми пробками. Измерения проводились в интервале температур 30-100°С. Точность измерения температуры - ±0.05°С. Точность измерения оптической плотности - ±5-10"4 O.E. Кривые плавления каждого образца снимались 5-7 раз. ДКП получали путем численного дифференцирования нормированных кривых плавления.

Фосфолипидные пятна идентифицировали с помощью соответствующих свидетелей (ФХ, ФЭ, ФИ, ФС, ЛФХ, КЛ, все препараты фирмы "Sigma", США) и определением величины Rf хроматографических зон на силикагеле D ("Chemapol", Чехословакия) в системе растворителей хлороформ:метанол:аммиак. Хроматограммы проявляли в парах йода. Минерализацию липидного фосфора осуществляли в смеси 5 N. H2S04 и концентрированной HNO3 кислот (1:1). При определении неорганического фосфора использовали реакционную смесь, содержающую 1% H2S04, 0.3% (ЫН4)бМо7024-4Н20 и 0.6% витамина С. Количественное определение липидного фосфора осуществляли спектрофотометрически при Х.=830 нм. В качестве стандартных растворов для определения фосфора использовали разные концентрации КН2Р04. Количество липидного фосфора выражали в мкг фосфолипида на 1 мг ацетонового порошка (Зубер, 1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Фракционирование хроматина на транскрипционно активные и неактивные фракции может служить одним из надежных критериев в изучении экспрессии генов эукариот.

Для выделения транскрипционно активного хроматина с постоянным выходом фрагментов олигонуклеосомных размеров нами применялись условия мягкого переваривания нуклеазой. После переваривания ядра лизировались, и полученные фрагменты разделялись в сарахозном градиенте. Отметим, что такая схема фракционирования приводит к образованию в подавляющем большинстве фрагмнентов олигонуклеосомного размера. Полученные данные приведены в таблице 1.

s

Содержание хроматина по ДНК (в %) во фракциях сахарозного градиента хроматина зародышей пшеницы после мягкого переваривания микрококковой нуклеазой сухих, прорастающих 24ч и 48ч и обработанных гиббереллином (ГК) зародышей пшеницы

Источник хроматина Фракциях роматана

А В С Б

Сухие зародыши 16,3±0,4 38,2±0,5 22,1 ±0,4 21,3±0,4

Прорастающие зародыши 24 ч 48 ч 24 ч + ГКхКГ4 М 18,6±0,3 21,9±0,4 20,1 ±0,4 36,4±0,3 35,8±0,5 37,1 ±0,5 21,7±0,4 20,9±0,4 21,2±0,4 22,9±0,4 20,3±0,4 21,6±0,4

Количественные и качественные изменения во фракции А активного хроматина как при прорастании, так и при обработке гиббереллином могут быть обусловлены не только появлением или исчезновением в них белковых компонентов, но и изменением взаимодействия между ними и ДНК. Взаимодействие ДНК-белок неизбежно должно приводить к лабилизации хроматина и его нуклеосомной части, что в свою очередь является следствием активации хроматина при прорастании и действии гиббереллина. Обработка прорастающих зародышей пшеницы гиббереллином (ГК) сопровождается увеличением выхода активного материала (А) и значительным возрастанием этого выхода при прорастании в течении 48 часов.

При прорастании имеет место количественное перераспределение между всеми фракциями градиента, тогда как при обработке гиббереллином перераспределение происходит, в основном, между фракциями А, В и С. На рис. 1 приведены данные по распределению фракции хроматина в сахарозном градиенте.

Изменения во фракции А сахарозного градиента хроматина зародышей пшеницы указывают, что эти сдвиги во фракции А при прорастании и обработке ГК несомненно значимы. Этот факт является следствием того, что при обработке фитогормоном в активно-транскрибируемую фракцию при градиентном центрифугировании

%

50

О

В

С

в

Рис. 1. Относительные изменения (в %) фракций хроматина прорастающих 24 часа и обработанных ПС зародышей пшеницы по сравнению с сухим после высокоскоростного центрифугирования в сахарозном градиенте.

прорастающие 24 часа.

вовлекаются участки хроматина из фракций В и С, тоща как при прорастании перестройки затрагивают и неактивные участей хроматина.

Все приведенные выше данные обобщены на диаграммах, приведенных на рис. 1, по относительному изменению фракций хроматина из прорастающих и обработанных ГК зародышей пшеницы по сравнению с сухими после высокоскоростного центрифугирования в сахарозном градиенте, откуда видно, что существенным количественным изменениям подвергается фракция А, за счет изменений в остальных фракциях.

Многочисленные эксперименты, проведенные на различных объектах, указывают на то, что при плавлении коровых частиц в начальной стадии денатурации выплавляется примерно 40 пар оснований, затем происходит полное разрушение структуры ДНК-гистонового комплекса, при котором расходятся остальные 100 пар оснований. Исходя из данных по калориметрическим исследовании, а также исследований по круговому дихроизму, выявлено, что денатурирующие в первую фазу 40 пар оснований ведут себя как свободная ДНК и идентифицируются как ДНК-овые концы коровых частиц. Второй переход происходит при разрушении коровой

частицы, и он определяется как выплавление центральной части нуклеосомной ДНК, связанной с коровыми гистонами. Если продолжить аналогию, то для ди- и тринуклеосом можно выделить уже, по крайней мере, три перехода, первый из которых будет соответствовать выплавлению ДНК на концевых участках, второй - плавлению ДНК в линкерных участках, третий - плавлению комплекса ДНК-коровый гистон.

В наблюдаемую картину может вносить дополнительную сложность присутствие гистона Н1, который располагается в области линкерной ДНК, непосредственно прилежащей к ДНК минимальной нуклеосомы и способен взаимодействовать как с линкерной ДНК так и ДНК коровой частицы.

На рис. 2 приведены ДКП моно-, ди- и тринуклеосом из хроматина сухих зародышей пшеницы. Из приведенного рисунка видно, что с увеличе-

-СЯЯ/ЛПу1П'

1-2

о

2

4

а

4

/М/ГП..1П-2 й

о

Рис. 2. Дифференциальные кривые

плавления моно - (а), ди -(б) и три - (в) - нуклеосом из хроматина зародышей пшеницы.

2

4

О

в

40 50 60 70 80 90 т°С

нием размера плавящейся частицы участок предварительного плавления уменьшается, тогда как температура основного перехода проявляет тенденцию к увеличению.

Из всего вышеизложенного можно прийти к выводу, что термическая денатурация позволяет определить степень защищенности ДНК при взаимодействии с гистоновым октамером в составе хроматина, что может быть воспроизводимо выявлено на ДКП. Полученные данные могут относиться только к локальным взаимодействиям и не могут иметь отношения к дальним взаимодействиям, проводящим к образованию структур высшего порядка за счет взаимодействия между прилегающими витками в 30 нм фибрилле.

Прорастание зародышей пшеницы существенно влияет и на профили плавления фракций А. На рисунке 3 приведены ДКП фракций хроматина из сухих, прорастающих в отсутствие и присутствие экзогенной ГК зародышей пшеницы. Как видно из рисунка, при прорастании зародышей в течение 24ч. имеет место значительное снижение температуры плавления нуклеосомной части фракции А, плавящейся в интервале 80-90°С, а также наблюдается возрастание количества легкоплавких участков по сравнению с ДКП аналогичной фракции из сухих зародышей в интервале температуры 60-70°С.

Дальнейшее прорастание приводит к усилению наблюдаемых изменений. ДКП фракции А, обработанных гиббереллином зародышей занимает промежуточное положение между соответствующими профилями плавления из "одно"- и "двудневных" зародышей. Сопоставляя эти данные с результатами по перераспределению во фракциях хроматина (см. табл. 1) в сахарозном градиенте при прорастании можно заключить, что изменение профиля плавления высокоактивной фракции А является следствием такого перераспределения, и качественных сдвигов в самой активной фракции.

В таблице 2 приведены температуры плавления (Тт) тотальной ДНК и ДНК, выделенных из фракции А прорастающих в течение 24ч и 48ч, а также обработанных гиббереллином зародышей пшеницы. Как видно из таблицы, наблюдается заметное понижение Тт фрагментов ДНК выделенных из фракции А при прорастании и обработке гормоном. В случае же тотальной ДНК наблюдается обратная картина - имеет место некоторое повышение Тт во всех случаях. Известно, что при прорастании зародышей пшеницы увеличивается количество сателлитной ДНК, которая, как правило, обогащена ГЦ-последовательносягми и локализована в гетерохроматиновых участках хроматина, что может приводить к указанному эффекту. Не исключено также, что повышение Тт тотальной ДНК может быть следствием увеличения метили-

Рис. 3. Дифференциальные кривые плавления фракций А из сухих и прорастающих в отсутствие и в присутствии экзогенной ГК зародышей пшеницы, а - сухие зародыши; б - прорастающие в течение 24 ч; в - прорастающие в течение 48 ч; г - прорастающие 24 ч в присутствии ГК, 10"4 М.

рованности цитозиновых остатков, что, как известно, приводит к увеличению Тт. В случае же активной фракции, которая богата АТ-последователь-

Таблица 2

Температуры плавления (Тт) тотальной ДНК и ДНК, выделенных из фракции А после ультрацентрифугирования прорастающих в течение 24 ч и 48 ч, а также при обработке гиббереллином (ГК) зародышей

пшеницы

Параметры плавления ИсТОЧНИ!?^- ДНК Температура плавления (Т„ °С)

Тотальная ДНК Фракция А

Сухие зародыши 73,7±0,1 70,3+0,2

Прорастающие зародыши 24 ч 48 ч 24 ч + ГК-10"4 М 74,7±0,2 74,9+0,1 74,5±0,1 69,5±0,1 68,5±0,1 68,3±0,2

ностями, наблюдается иная картина. При этом суммарный вклад ДНК из фракции А оказывается менее значимым, что проводит к возрастанию температуры плавления ДНК. Сопоставление этих данных с дифференциальными кривыми плавления дает полную картину происходящих при этом изменений.

С целью количественной оценки изменений, происходящих во фракции А при прорастании в отсутствие и в присутствии гиббереллина, мы использовали метод зонного анализа интегральных кривых плавления. Интегральные кривые плавления были условно разделены на зоны, в каждой из которых рассчитывали долю расплавленной ДНК. Зоны были подобраны по наблюдаемым основным переходам. В интервале до 60°С, отражающем денатурацию обогащенных АТ-парами последовательностей, доля расплавленной ДНК фракции А несколько больше для ДНК однодневных и двухдневных зародышей по сравнению с сухими. Обработка зародышей гиббереллином приводит к увеличению этого эффекта. Проведенные расчеты обобщены в таблице 3.

Как видно из приведенной таблицы, доля расплавленной в зоне 60-70°С

Доля расплавленной ДНК фракции А в соответствующих температурных

зонах (%)

Вариант <60°С 60-70°С 70-80°С .

Сухие зародыши 5.7±0.1 37.0±0.2 54.7±0.3

Прорастающие зародыши 24 ч 48 ч 24 ч + ГК, 10" М 7.8+0.2 8.3+0.2 9.2±0.2 41.3±0.1 42.4±0.2 40.2+0.2 48.2Ю.1 47.1±0.2 44.5±0.1

ДНК фракции А у однодневных и двухдневных зародышей также больше, чем у сухих. У зародышей, обработанных гиббереллином, она занимает промежуточное положение между сухими и однодневными контрольными зародышами. Температура перехода в этой зоне отражает плавление участков, содержащих умеренное количество АТ-пар. Участок плавления 70-80°С отражает денатурацию последовательностей ДНК, обогащенных ГЦ-парами. Доля расплавленной в этой зоне ДНК у прорастающих в отсутствие и в присутствии гиббереллина зародышей, по сравнению с аналогичной из сухих зародышей, существенно ниже.

В целом, увеличение количества фракции А за счет других фракций по сравнению с сухими, подтверждает ранее полученные данные о возрастании транскрипционной (матричной) активности при инициации процессов активного метаболизма прорастающих зародышей пшеницы (Паносян и др., 1982). Показано также, что не только неги стоповые белки, но и липиды могут принимать участие в регуляции генной экспрессии, либо непосредственно взаимодействуя с ДНК, либо путем изменения активности ферментов, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот (Губский и др., 1991, МапгоН еЫ., 1981).

Для выявления направленности действия ФЛ на структуру ДНК, нами были получены зависимости величин температур плавления - Тт от концентраций ФЛ (ФХ, ФС, ФЭ). Кривые зависимостей Тт от концентраций ФХ, ФЭ, ФС приведены на рисунке 4. Результаты экспериментов проведенных в наших условиях указывают на то, что имеет место монотонное

уменьшение температуры плавления (Тт) ДНК при увеличении концентраций ФЛ. К настоящему времени изучен фосфолипидный состав многих растительных объектов, однако нет данных о составе фосфолипидов хроматина.

Тт°С

75

70

Рис. 4. Кривые зависимостей

изменения Тт ДНК от концентраций фосфолипидов.

1.ФХ; 2. ФС; 3. ФЭ.

-1

0

1 1ДО/Р]

В таблице 4 показано, что в составе хроматина сухих и прорастающих в присутствии или в отсутствие ГК обнаружены шесть основных классов фосфолипидов. При прорастании отмечали примерно 20%-ное повышение суммарного содержания фосфолипидов хроматина по сравнению с сухими зародышами. Степень этого повышения не зависела от присутствия гиббереллина в среде прорастания. Содержание фосфатидилсерина наиболее сильно увеличено, при этом наблюдали снижение содержания фосфатидилхолина.

Из таблицы 4 видно, также, что присутствие ГК в среде проращивания приводило к увеличению содержания фосфатидилэтаноламинов и уменьшало содержание фосфатидилхолинов в хроматине, не оказывая достоверного влияния на другие классы фосфолипидов. При этом уменьшение количества фосфатидилхолинов не сопровождалось сколько-нибудь значительным возрастанием уровня лизофосфатидилхолина, являющегося продуктом деацилирования. Это указывает на то, что уменьшение количества фосфатидилхолинов осуществляется механизмом, не связанным с действием фосфолипаз. Значительное увеличение количества фосфатидилсеринов при активации хроматина, возможно, отчасти связано с взаимопревращениями фосфолипидов, а именно, фосфатидилсерина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина.

Содержание фосфолипвдов (ФЛ) хроматина, выделенного из сухих и прорастающих (24 ч), в присутствии 10 4 М гиббереллина или без него изолированных зародышей

ФЛ Сухие семена Прорастающие семена

Необработанные (контроль) Обработанные гиббереллином

мкг ФЛ на 1 мг хроматина мкг ФЛ на 1 мг хроматина мкг ФЛ на 1 мг хроматина

ФХ 7.10±0.22 5.8510.21 5.0310.25

ФЭ 2.69±0.19 3.29+0.19 4.3610.17

ФИ 1.35±0.11 1.7410.13 2.0310.15

ФС 1.3010.11 3.6710.18 3.7810.19

ЛФХ 1.1910.04 1.35Ю.05 1.32Ю.0

КЛ 1.0110.09 1.4010.11 1.3410.12

Сумма 14.6410.36 17.3010.38 17.8610.41

Примечание. ФХ - фосфатидилхолины, ФЭ - фосфатидилэта-ноламины, ФИ - фосфатидилинозитолы, ФС - фосфатидилсерины, ЛФХ -лизофосфатидилхолины, КЛ - кардиолипины.

Общее увеличение содержания фосфолипидов хроматина при его активации в ходе прорастания происходит в основном за счет увеличения фосфатидилсерина, способного усиливать РНК-полимеразную активность, содержание же фосфатидилхолина, ингибирующего эту активность, при этом уменьшается. Так, при обработке изолированных ядер фосфатидил-сериновыми липосомами наблюдались глубокие изменения в организации хроматина - его деконденсация и дезагрегация гетерохроматиновых участков. Предполагается, что дезагрегация хроматина при обработке фосфатидил-сериновыми липосомами является результатом прямого воздействия фосфатидилсерина на внутриядерные компоненты (Zuniga е1.а1., 1990). О возможной регуляторной роли полярных липидов свидетельствуют также данные об участии фосфатидилсерина и фосфатидилхолина в структурных

изменениях хроматина, которые облегчают доступ ДНКазы I к ДНК, причем фосфатидилсерин повышает, а фосфатидилхолин, напротив, несколько снижает доступность фермента к ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанная и общепринятая в настоящее время модель организации хроматина все больше привлекает внимание исследователей с точки зрения выяснения происходящих в нем механизмов структурных изменений. С другой стороны, отмечается существенное смещение центра тяжести исследований генома с сугубо структурных на функциональные основы, призванные пролить свет на выяснение изменений, происходящих в хроматине при различных функциональных состояниях клетки.

Выделенные и исследованные нами фракции олигонуклеосом из сухих, прорастающих и обработанных гиббереллином изолированных зародышей пшеницы выявили, «по происходит существенное перераспределение фракций хроматина при градиентном центрифугировании последнего после нуклеазной обработки.

Анализ профилей плавления хроматина и ДНК из сухих, прорастающих в отсутствие и в присутствие экзогенного гиббереллина изолированных зародышей пшеницы выявил различия в температурах плавления высокоактивной фракции хроматина и ДНК, что свидетельствует о вовлечении в процесс активации генома разных участков хроматина при прорастании и индукции гиббереллином, так как активирующее действие ГК на синтез нуклеиновых кислот и белков было выявлено у многих распггельных объектов. Как и другие фитогормоны, ГК прежде всего взаимодействует с цитоплазматическими рецепторами белковой природы и, как показано, активирует ферменты, ответственные за синтез фосфолипидов, входящих в состав мембран гранулярного эндоплазматического ретикулума.

Для выявления изменений, происходящих в зародышах пшеницы при прорастании весьма ценным явилось применение дифференциальных кривых плавления в изучении структуры хроматина при различных функциональных состояниях генома. Из ДКП хроматина выявлено, что при прорастании зародышей пшеницы имеет место значительное снижение температуры плавления нуклеосомной части активной фракции, а также возрастание количества легкоплавких АТ-богатых участков по сравнению с аналогичной фракцией из сухих зародышей, указывающей на то, что при прорастании зародыша в процесс активации вовлекаются новые участки генома.

Прорастание и обработка гиббереллином зародышей пшеницы приводят к качественному и количественному изменению фосфолипидного состава хроматина. Исследования содержания отдельных классов фосфолипидов активной и неактивной фракций хроматина, выделенного из сухих и однодневных прорастающих зародышей пшеницы, выявили, что изменения в активной фракции хроматина прорастающих зародышей носят разнонаправленный характер. При этом содержание фосфатидилэта-ноламинов и фосфатидилсеринов повышается, что не обнаруживается в неактивной фракции хроматина при прорастании, что, в свою очередь, дает возможность предположить, что фосфолипиды участвуют в модуляции активности растительного генома при прорастании.

Таким образом, приведенная выше совокупность литературных и экспериментальных данных показывает, что вопрос о контроле и регуляции экспрессии генов у зародышей пшеницы при прорастании еще далек от своего окончательного разрешения. Многообразие процессов, затрагивающих геном при его дерепрессии, делают актуальной дальнейшую разработку вопросов, связанных с особенностями изменений функционального статуса хроматина и его компонентов для выяснения принципов регуляции и контроля функционирования растительного организма.

выводы

1. Прорастание изолированных зародышей пшеницы приводит к перераспределению фракций хроматина в сахарозном градиенте после гидролиза в мягких условиях ДНКазой II. При этом количество активной фракции А существенно возрастает.

2. Анализ профилей дифференциальных кривых плавления фракций А хроматина из сухих, прорастающих и обработанных гиббереллином изолированных зародышей пшеницы выявил изменения как в температурах плавления нуклеосомной части, так и увеличение низкотемпературного плеча.

3. Выявлены определенные изменения в параметрах плавления как тотальной ДНК, так и ДНК, выделенной из высокоактивной фракции А хроматина зародышей как при прорастании, так и после обработки зародышей пшеницы гиббереллином. При этом наблюдается понижение температуры плавления высокоактивной фракции А, что указывает на увеличение АТ-богатых участков в указанных фрагментах ДНК.

4. Идентифицировано шесть индивидуальных представителей фосфолипидов хроматина. Имеющие место сдвиги в отдельных классах фосфолипидов при прорастании и обработке гиббереллином обнаруживают разнонаправленносгь происходящих в них изменений, что является следствием существующего механизма, координирующего их действие.

5. Исследованы комплексы ДНК с фосфолипидами (ФХ, ФЭ, ФС) в интервале изменения концентраций последних 10"7 М<С<10'3 М. Получены зависимости температуры плавления (Тт) от концентраций. Обнаружено, что в указанном интервале изменения концентраций ФЛ наблюдается монотонное уменьшение температуры плавления комплексов.

6. Определена степень выраженности и глубина перестроек, затрагивающих отдельные классы фосфолипидов в тотальном хроматине, которая различна для прорастающих и обработанных гиббереллином зародышей пшеницы. Количественные сдвиги в исследованных классах фосфолипидов хроматина прорастающих зародышей пшеницы в основном происходят в транскрипционно активной фракции хроматина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вардеванян П.О., Тирацуян С.Г., Вардеванян А.О., Бояджян Б.Г., Паносян "

Изучение олигонуклеосом прорастающих зародышей пшеницы, обогащенных транскрипционно-активными генами. // Физиол. раст., 1995, т.42, N 2, С.290-294.

2. Вардеванян А.О., Бояджян Б.Г. Изучение олигонуклеосом проросших зародышей пшеницы, обогащенных транскрипционно-активными генами. // Мат. научн. конф., посвященной 30-летию основания отделения биофизики биологического факультета Ереванского государственного университета, Ереван, 1996, С.82-83.

3. Вардеванян П.О., Бояджян Б.Г.Дирацуян С.Г., Вардеванян А.О., Паносян

Фосфолипидный состав хроматина изолированных зародышей пшеницы при прорастании. // Физиол. раст., 1996, т.43, N 4, С.616-619.

4 Вардеванян П.О., Бояджян Б.Г., Вардеванян А.О., Тирацуян С.Г., Неркарарян A.B., Карапетян А.Т. Фосфолипиды фракций хроматина зародышей пшеницы при прорастании. // Физиол. раст., 1998, т.45, N 6, С.919-921.

5. Вардеванян П.О., Паносян Г.А., Парсаданян М.А., Бояджян Б.Г., Карапетян А.Т. Изучение структурных изменений хроматина при активации генома. //Ученые записки ЕГУ, 2000. N 1 (192), С. 114-119.

Pnjiu2juiû РЬшиуфиш Q-Lnpqji

ЗПРЬЪГ* OLnauuaiTbPb ÊPÎIUIISIA^ чиапьзчио^изьъ ФПФШипмэ-зпьъъьре

ШГФПФИЧ-ЬР

■iuiliqmguijpû ришЬр' gnpbûp (цац uuu¡ú, ppniJuiuiJiû, 0-Ь&, oiPqnûml/ibnuniIûbp, фпифпфщ^щйЬр, h/ipbpbipß

ll2luuimuiGpniií hbinujqnunlui& bG gnpbGfi ¿np, 0рщ U hjipbpbdiûnil uuiipShpti ррпйшифй^ liumnigi[uiöpuijliQ фпфгфлпрзгийСЬрр: Snijg t трфи&, np öibiJiu U hjipbpbijiûnil ¿¿lullbiliu ррт1шифй[1 inpuiGuljpliuigtinG ш1рпЦ U n¿ lulling Ьшш1}ш0йЬр[1 iJJijU inhq]î bQ тйЪйтй фршрш^рлиййЬр: CGq npniiî, llii^-mq II-nil h[uipni|iq}i bGpuiplp]uifr ppmîuiinjiûti hbmuiqui ршдшйтйр uuipjiupnqiujtiG qpmqJihOinniü huiGqbgGniiS t A, В, C, D 3>puiljglnuGhp]i шпш^шдйшйр, pûq npniiî A 3>puiligliuiG оЛпфц£г t inpmûulipliujgpnû mnmi[b|iuqnijC uilpnln|nipjuiúp, [îû^ujhu gnijg t mpqh^ tíbp unîp[mGnu5 tjiuwuipijuid ш2[ишшш GpGbpruú:

A 3>jiiulig{iuijtig uiGguiimluifr 1"Ь0--1ш1 тЬгф niûhgnq фпфп{ип1рр1Мир[1 qûuihmmduiG hujiSuip 1]шшшр4Ь1t ТЫЭ--р ghpi5ujjfiG hiupuiS: UuiipJbpJi &iniiîp U iî2iuljnuîp hfiphphiliGnq huiûqbgûnuî t ршрйршш1цлр4 ^pmljgJimjpg uiG^uiiruluii) oipqnGmlphnuniimjliû huiunlui&Gbpp hmpîuiû upupuiiSbinpbpli фпфп{ит.р.)шО: CGqhuiGnip umúuiúp, A фршЦдр1ифд 0-Ví9--Ji

huipIuiG upupiuiSbinpbpli niunuiûumlipni.pjruGGhpii, ppnùuimliûp шЦиффидйшО diuiiiuGuilj, qijuijruií bû ppniíuiuiJiGnuI uibqfi niGbgnq [unpp i|bpuiliuimngmiiGhpIi tiuiupG, npp Ipupnq t LpQhi. qhûnùp n¿ шфгфЦ ЬштЦш&йЬрр qhnhiqphu^jli hbmbuiGp: £pnriuimpûnitf inUqp niGbgnq фпфп{ип^тОйЬрр üjniu hümpui\}np tfh[uiuGtiqúübptig bû Gnil]|bnuni5Ghpniú uinuiguignq фпфп^ш^тМЬрр, bpp uuiqiîp uiGgGniü t mlpnpi} Gjnipu^npiuiGuilpnpjiuG:

ônijg t трфи&, np й^Ьфи U hJiphphipGnq йгш^Ьфи фпфгфлвдшМЬр bû rnbqji niGbGniú ppnùuimpGp ^nu^nipiqfiqmjliG Ipiiqúniii: CGq npnid, ppnúunnliGli шшррЬр rpuubpfi ilfijU mhq(i bû niûbGnu! t{bpuipui2|unuîûbp: UhqhpujliG фпрйЬрр piuguihuijinbi bG, np фпифпфи^ОЬр^ Ipuqúnui фпфгфтррШйЬрр Gi[uiqbgGniú bG lpujniGmpjmGp, npji hbmbuiGpnil mbii]i t mGbûniiî 0-Ъ1Э--фпи$)П111и}}щ

huiúuii51iujgnipjniGGhp¡i huipSiuG $bpúuiuintiátuGti únGninnG G^qntiS: G|nq umqiSbpti ppnihumJiGJi liuiqiSniiî huijwûujphpiluiiï bG t(bg hpiSGuil)mû фтфпфифцйЬр фпифшшргффлнрО (¿hi), фпи^штргф^ршОгцшйрО (¿t), фпи5)шт}и^]циЬр}1й (3>U), 3>nu3>uiuipqtii]iGnqpwni (bb), i^qn^nu^jminJuitiiluniliG (LiKr), ljtupii{m|]uqfiG (UL): GQq npmii Mu-Ji ршйш^п Gi{uiqnn$ t, Jiulj i>t-¡i b Ьшш^шщЬи ä>U-p puiGuil]ß шйпи! t umqú[i й^Ьфи: <fiphpbi]iGl> mnljmjnipjmi5p GümG фпфп^итрзтООЬрр ш^Ьф nidhq hG mpinmhmjini}m&: