Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

СОСТАВ БЕЛКОВ И АКТИВНОСТЬ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В СЕМЕНАХ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ И ГОРОХА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ПИТАНИЯ РАСТЕНИЙ

ВАК РФ 06.01.04, Агрохимия

Автореферат диссертации по теме "СОСТАВ БЕЛКОВ И АКТИВНОСТЬ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В СЕМЕНАХ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ И ГОРОХА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ПИТАНИЯ РАСТЕНИЙ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи Юрий Алексеевич ВАРИЦЕВ

СОСТАВ БЕЛКОВ И АКТИВНОСТЬ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В СЕМЕНАХ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ И ГОРОХА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ПИТАНИЯ РАСТЕНИЙ

(Специальность № 06.01.04 — агрохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА— 1978

%и/-ь*.-иьу$ %о1> (?•??&/>'•$ - пЫр_У-г-Ии£

Работа выполнена на кафедре агрономической и биологической химии Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Научный руководитель — доктор биологических наук профессор Б. П. Плешков.

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РСФСР доктор биологических наук профессор Н. П. Кузьмина; кандидат биологических наук В. Ф. Лысенко.-

Ведущее предприятие — Всесоюзный научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур.

.защита диссертации состоится «

в «70 » часов на заседании СпеЦ^атизур/анСоС*- Й78т1а

Д-120.35.02 при Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева. Адрес: 127550, г. Москва, И-550, ул. Тимирязевская, 49.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА (корпус ю). /а

Автореферат разослан «'/.У* • ^уУ^^С .... 1978 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Директивами XXV съезда КПСС предусмотрено довести к 1980 г. поставку сельскому хозяйству минеральных удобрений до 115 млн. т.

В связи с возрастающим применением минеральных удобрений перед сельскохозяйственной наукой поставлена задача расширения исследований по изучению влияния удобрений на урожай, качество и биологическую ценность сельскохозяйственной продукции.

Качество зерновых и зернобобовых культур во многом определяется содержанием, и составом белковых веществ. Многочисленными исследованиями советских и зарубежных авторов установлено, что содержание белка и белковых фракций может значительно изменяться под влиянием удобрений, но очень мало известно об изменениях в содержании основных групп белков-ферментов, оказывающих большое влияние на семенные и технологические качества зерна и продуктов его переработки.

Одной из наиболее важных групп гидролитических ферментов семян являются протеазы, образующие совместно с запасными белками специфический белково-протеазный комплекс, играющий исключительно важную роль в физиологических и технологических процессах. Однако закономерности формирования и функционирования этого комплекса в процессах созревания и прорастания семян изучены совершенно недостаточно. Практически отсутствуют сведения о влиянии условий выращивания, в том числе и условий минерального питания, на активность протеолитических ферментов. Нет данных об изменении активности протеаз в проросших семенах, сформированных при различных условиях питания.

Учитывая важность теоретической разработки данных вопросов, в задачу наших исследований входило изучение закономерностей изменения состава белков и активности протеоли-тических ферментов в процессах созревания и прорастания семян яровой пшеницы и гороха при различных условиях пита- „.„»-ния растений. tAlJASlbiSA

Una. ср- Я""8 «ян.-*.

Цель исследований. Цель наших исследований заключалась в изучении следующих вопросов:

1. Изменение содержания и состава белков в созревающих и прорастающих семенах яровой пшеницы и гороха при различных условиях питания растений.

2. Изменение активности протеолптнческих ферментов в созревающих и прорастающих семенах яровой пшеницы и гороха при различных условиях питания растений.

3. Изменение состава протеолитически активных белков в созревающих и прорастающих семенах яровой пшеницы и гороха при различных условиях питания растений.

4. Зависимость между изменением содержания и состава белков под влиянием удобрений и активностью протеолити-ческих ферментов в семенах яровой пшеницы и гороха.

Научная новизна работы. Получены оригинальные данные о закономерностях формирования и функционирования про-теолитических ферментов в созревающих и прорастающих семенах яровой пшеницы и гороха при различных условиях питания растений.

Установлено, что между изменением под влиянием удобрений содержания и фракционного состава белков и активностью протеолптнческих ферментов в семенах яровой пшеницы и гороха существует тесная связь.

Впервые применен метод вертикального диск-электрофореза в полиакриламидном геле для изучения компонентного состава протеолитических ферментов.

Практическая ценность и реализация результатов исследований. Результаты исследований могут быть использованы для теоретических разработок в технологии хлебопечения и системе применения удобрений для получения высоких урожаев семян яровой пшеницы и гороха высокого качества, а также при разработке методов изучения протеолптнческих ферментов семян.

Объем работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, включает 21 рисунок и 38 таблиц. Вспомогательный материал представлен в 2 приложениях. Список использованной литературы включает 268 наименований, в том числе 154 иностранных авторов.

Материал и методы исследования. Экспериментальные исследования проведены на материале, выращенном в селекционном питомнике НИИСХ центральных районов Нечерноземной зоны на высоком выравненном агрофоне (лабораторные опыты), а также в длительном полевом опыте Пермской сельскохозяйственной опытной станции и вегетационных опытах на кафедре агрохимии ТСХА, проведенных в 1974— 1976 гг.

В вегетационных опытах яровую пшеницу Краснозерная и горох Немчиновский 787 выращивали в сосудах Мнтчерлиха емкостью 5,5 кг. в почвенно-песчаной (4,5: 1) культуре.

Пшеницу выращивали на нормальной питательной смеси -(№РК) и на смесях с пониженным (Ко^РК) или повышенным (ЫгРК) содержанием азота. Образцы зерна отбирали в фазы молочной, тестообразной, восковой и полной спелости (Павлов А. Н., 1967).

Горох выращивали на питательной смеси с нормальным (КР0,4К) и повышенным содержанием фосфора (КР1К).,Про-бы семян отбирали из бобов среднего яруса в фазы зеленых, зеленовато-желтых, желтых бобов и полной спелости (Я'бло-ков Ю. Н., 1971).

Образцы зерна яровой пшеницы Стрела были получены с длительного полевого опыта Пермской сельскохозяйственной опытной станции со следующих вариантов. 1. Без удобрений.

2. Известь. 3. Известь -Л-КоКо- 4. Известь+ К90Р90. ,5. Известь + К90Р00К90. 6. Известь+ №2оШоК2о- 7. Известь^ 4-Ш0Р90К90+навоз.

В серии лабораторных опытов суперэлитные семена яровой пшеницы Московская 21 и гороха Московский 73 проращивали в термостате при 22—23° на питательных смесях с различными дозами и формами азотных удобрений. Было проведено две серии опытов. Опыт 1 проводился по схеме:

1. Смесь Гельригеля без азота, фосфора и калия — контроль. 2. Смесь Гельригеля без азота —: вариант РК.

3. Смесь Гельригеля с двойной дозой азота —: вариант К2РК.

4. Смесь Гельригеля с четвертью дозы азота — вариант Ко,25РК. Опыт 2 включал.варианты: 1. Вариант РК; 2. Смесь Гельригеля с заменой Са(ЫОзЬ на СН3СООКН4; рН смеси 7,0—вариант (КТН4 — К)РК. 3. Смесь Гельригеля с рН 5,5 —вариант (N0^—К)РК.

Пробы растительного материала отбирали через 1, 3, 5, 7 и 9 суток после замачивания семян пшеницы и через 1, 3, 5, 7,. 9 и 12 суток после замачивания семян гороха.

Для изучения влияния удобрений на активность протеоли-тических ферментов в проросшем зерне пшеницы, сформированном при различных условиях питания, проращивали семена в течение.трех суток на дистиллированной воде и в отделенных от побегов зерновках определяли активность протеаз.

Общий азот определяли микрометодом Кьельдаля, белковый азот—по Барнштейну (Петербургский А. В., 1968), содержание небелкового азота рассчитывали по разности между общим и белковым азотом. Изотопный состав азота определяли на масс-спектрометре МИ-1305.

Препараты суммарных белков для определения аминокислотного состава выделяли по методике, описанной Плешко-

вым Б. П. (1976), анализ гндролизатов проводили на автоматическом анализаторе ЫД-1200Е.

Фракционный состав белков определяли по Осборну (1935) с некоторыми модификациями (Плешков Б. П., 1976).

Активность протеолитических ферментов определяли по методам Ансона (Anson, 1938) и Крюгера (Kruger, 1971). При определении активности по методу Ансона с казеином и гемоглобином в качестве субстратов за единицу протеолити-ческой активности (ПЕ) принимали такое количество фермента, которое в стандартных условиях переводит к ТХУ — растворимую форму количество белка, которое соответствует. 1 мкг тирозина в минуту. При определении активности по ме- > тоду Крюгера с азоказеином в качестве субстрата активность выражали в условных единицах. Одна единица (Е) равна изменению в адсорбции при 440 нм на 0,01 за 2 часа при рН 6,0 и 37°С.

Компонентный состав протеолитических ферментов определяли после разделения белков в полиакриламидном геле (Raymond el at, 1960, Сафонов В. И., Сафонова М. П., 1964) с включением в него гемоглобина в качестве субстрата по методике, разработанной нами, за основу которой были взяты методики Каминского, Бушука (Kaminski, Bushuk, 1969) и Фурсова О. В. (1975), а также методами ионообменной хро-">% матографии (Simmonds, 1963, Peterson, Sober, 1964) и гель-фильтрации (Детерман Г., 1970).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

АКТИВНОСТЬ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В СВЯЗИ С УРОЖАЕМ И ФОРМИРОВАНИЕМ КАЧЕСТВА СЕМЯН ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ И ГОРОХА ПРИ

РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ПИТАНИЯ РАСТЕНИЙ

1. Влияние удобрений на урожай и формирование некоторых показателей качества зерна

Результаты, полученные в полевом опыте на Пермской сельскохозяйственной опытной станции, показали, что удобрения оказали существенное влияние на урожай и качество зерна яровой пшеницы (табл. 1).

Самый низкий урожай пшеницы был получен в варианте без удобрений. Известкование повысило урожай почти вдвое. Азотно-калийное и азотно-фосфорное удобрения слабо повлияли на урожай пшеницы, но заметно сказались на качестве зерна. Полное минеральное удобрение, особенно в повышенных дозах и в сочетании с навозом, значительно повышало урожай зерна и улучшало его качество. 4

_ >* . * - Таблица 1 Влияние удобрений на урожай и некоторые показатели качества_зерна • пшеницы (полевой опит) • •

Масса Содер- Сбор

Варианты * Урожай, 1000 жание белка с

' ПП. ц/га* зерен, г белка % (КХ 5,7) урожаем, ц/га

1 Без удобрений . - . . . 14,0 33,4 12,9 1,75

. 2 Известь........ 26,6 . 35.9 12,3 ,3,27

3 Известь+ N90X90 . ". • • • • 25,9 38.5 16,4 4,25

.. 4 Известь + КРОо "."...... Известь + КиРмКоо . .' . . 29,0 -37.1 14,7 4,26

Л 5 31,3 36,7 13,2 4,14

^7 H3BecTb+Ni2oPi2aKi2o .'•.* . 31,2 37,6 15,3 \ 4,80

Известь + КюРеоКо+НаВОТ 32,5 36,9 ' 14,8 4,80

* Данные получены с Пермской сельскохозяйственной опытной станции.

Самое крупное'зерно с максимальным содержанием белка Г было получено при внесении азотно-калийного удобрения, на ' фоне извести. Внесение полного минерального удобрения в сочетании с навозомш повышенных доз азотных,- фосфорных и калийных удобрений обеспечило получение максимального выхода белка с единицы площади. " .'

Результаты вегетационных опытов показали (табл. 2), что условия питания пшеницы азотом, а гороха фосфором существенно отразились на урожае и качестве зерна.

..'-'• • . • Таблица 2

Влияние удобрений па урожай и некоторые-показатели качества зерна пшеницы и гороха (вегетационные опыты)

.Урожай, Масса 1000 Содержание СбуроЖелма Варианты " г/сосуд зерен, г белка, % с

КсеРК К,РК

ОТСНК КР1К

8,1 9,4 11,0 HCP0.CS г=1,2

11,8 .14,1 НСРо.05 г = 0,7

дшеница .

• 27,5 29,0 29,5 Sx% = 3,7

Горох .175

192 . Sx % = 1,2

12,4 14,4 16,2

18,8. 16,9

1,00 1,35 1.79

2,22 2.38

Увеличение дозы азота в четыре раза повысили урожай пшеницы на 32%, содержание белка в 1,26 раза; а сбор белка на 59%.' масса 1000 зерен при этом также повышалась.

При повышении уровня фосфорного питания гороха в два с половиной раза урожай семян повысился на 16%, а масса 1000 семян на 10%, содержание белка в семенах при этом снизилось в 1,11 раза. Сбор белка с урожаем при этом несколько повысился. ,; ; •;•> '

Изучение накопления азотистых веществ в созревающих семенах яровой пшеницы и гороха показало, что абсолютное содержание (в мг на 1 зерно) общего и белкового азота наиболее интенсивно возрастало в промежутке между фазами молочной и тестообразной спелости в зерне пшеницы и между фазами зеленых и зеленовато-желтых бобов в семенах гороха.

С повышением уровня азотного питания пшеницы и сни-; жением уровня фосфорного питания гороха содержание общего, белкового и небелкового азота в зерне возрастало.

Аминокислотный состав белков в зерне пшеницы при созревании изменялся в сторону снижения, а в семенах гороха , в сторону повышения содержания суммы незаменимых аминокислот. Биологическая ценность белков пшеницы по сравнению с белками куриного яйца снижалась при созревании от. 71,7:—67,5 в фазу молочной спелости до 66,5—62,0%. в зре- ~ лом зерне, а в семенах гороха повышалась от 67,8—69,1 % в фазу зеленых бобов до 71,1—72,0% в спелых семенах.

С повышением уровня азотного питания пшеницы и снижением уровня фосфорного питания гороха биологическая ценность суммарных белков снижалась во все фазы спелости.':

Фракционный состав белков зерна пшеницы под влиянием азотных удобрений изменялся в сторону снижения содержания альбуминов и глобулинов и повышения содержания про- \ ламинов и глютелинов. В белках семян гороха под влиянием фосфорных удобрений повышалось содержание альбуминов при одновременном снижении содержания солеизвлекаемых* глобулинов. -:*£''

г2. Активность иротеолигических ферментов

Определение нротеиназной активности в созревающем зерне пшеницы проводили, используя два белковых субстрата — азоказеин и гемоглобин (рис. 1), поскольку ферменты зерна пшеницы, действующие на эти субстраты, но литературным/данным (Preston, Kruger, 1976), имеют различную природу,; а между уровнями активности этих ферментов в зерне и хлебопекарными качествами получаемой из него муки существует тесная связь (Bushuk et al., 197I, Kruger, 1973).

Полученные результаты показали, что активность протеи: наз, определяемая по гидролизу азоказеина при рН 6,0 и на-

24 20

16 12

Азоказеиназная активность

ПБ 2,4 f

2,0 - ив

0,8

0,4

Геыоглобиназнан ктивность

Молочная Тестообраз- Восковая Полная'- Полочная. Тестообраз- Восковая Полная спелость ная спелость спелость спелость спелость ная спелость спелость спелость

Рис.1. Протеиназная активность;в зерне пвенивд при созревании А -активность отнесена кЬдноыу зерну л Б -активность отнесена к одному мг бедка

званная нами азоказеиназной, при выражении на одно-зерно возрастала в процессе созревания до фазы восковой спелости (в варианте К2РК до фазы тестообразной спелости),.а затем незначительно снижалась к фазе полной спелости. С повышением уровня азотного питания азоказеиназная активность Е фазы" молочной и полной спелостнЛпрактически не изменялась. в фазу тестообразной спелости она возрастала, а в фазу восковой, спелости! снижалась. В целом "азоказеиназная активность, выраженная таким образом, не изменялась под действием удобрений, несмотря на большие различия в содержании белка и массе 1000 зерен. ,

Азоказеиназная активность, отнесенная к 1 мг белка, снижалась при созревании в период между" фазами молочной и восковой спелости, после чего сохранялась на постоянном уровне. С повышением уровня азотного питания удельная активность азоказеиназы снижалась во все фазы спелости на 14-18%. . ,♦'••:- , -

Активность протеиназ, определяемая по гидролизу гемоглобина при рН 4,4 и названная нами гемоглобнназной, при выражении как на одно зерно, так и на 1 мг белка была максимальной в фазу молочной спелости. В фазу тестообразной спелости.гемоглобиназная активность заметно снизилась: примерно в три раза при выражении на одно зерно и в шесть раз при выражении на 1 мгбелка.

С повышением уровня азотного питания гемоглобиназная активность'"; снижалась во все фазы спелости в том случае, если ее относили к 1 мг белка, и возрастала во все фазы спелости, кроме молочной, при выражении на одно зерно.

Определение протеиназной активности в зерне пшеницы, выращенной, в-длительном полевом «опыте Пермской сельско-хозяйственной'оиытной станции (таблГ 3), и расчет коэффи-

' 'Р* .- • • у Таблица 3

Влияние удобрений на протеиназную активность в.зерне пшеницы

Варианты V - "V ,, -. Азоказеиназная . активность Гемоглобиназная активность ~ ;.

пп. — й Ы 8 • о а о. Ы Я о с" 8 WO

1 Пез удобрений .... 238 7.94 1.84 55,4 1,85 0,42,

2 243 • 8.74 1,98 56,5 2,03 0,46

3 Известь+МаоКяо . . • • 219 8,43 1.34 66,3 2.55 0,40 •

4 1ЪБесТЪ-Р-МжРа» : . :• . 228 8.46 1,55 61,8' 2,29 0,43

5 Известь + ШдРМКМ • . . 233 8,56 1,76 56,9 2,09 • 0.43

С И3БесТЪ-1-№оРпоК12о . . 235 ;8.84 1.54 56,1 2,10 0,37

7 Известь +'№юРооКоо +

+ навоз ....... 222 8.20 1,50 60.6 2,24 0,41 '

циентов корреляции между содержанием белка в зерне и активностью протеолитическнх ферментов (табл. 4) выявило между этими показателями качества зерна пшеницы тесную связь.

Таблица 4

Коэффициенты корреляции между содержанием белка в зерне пшеницы и активностью протеолитическнх ферментов , _ .'."••

Активность отнесена к:

Вид активности 1 г муки 1 зерну 1 мг белка

—0,77 + 0,76 ' +0,10 +0,87 -0,97 —0,49,

Между содержанием белка в зерне пшеницы и азоказеи-назнон активностью, отнесенной к 1 г муки и 1 мг белка, обнаружена высокая отрицательная коррелятивная связь (г— —0,77 и г =—0,97 соответственно). Следовательно, концентрация фермента в сухом веществе и суммарном белке закономерно снижается при повышении белковости зерна. .

Абсолютное содержание фермента практически не коррелирует с изменением содержания белка в зерне (г= -Г-0,10).

Между содержанием белка в зерне и гемоглобиназной активностью, отнесенной к одному грамму сухого вещества и одному зерну, обнаружена высокая положительная коррелятивная связь (г =-г0,76 и г = +0,87 соответственно). Следовательно, концентрация в сухом веществе и абсолютное содержание фермента в зерне возрастают с повышением белковости зерна. Однако концентрация фермента в суммарном белке при этом снижалась (г = —0,49), что связано с преимущественным накоплением неактивных, запасных белков при повышении содержания белка в зерне.

Асмаева А. П. и Авунджян Э. С. (1969) показали, что под действием удобрений протеазная активность, определяемая автолитическим методом, может значительно изменяться, однако какой-либо закономерной связи с изменением качественных показателей зерна этими исследованиями не было выявлено. Наши исследования показали, что между основным показателем качества зерна — содержанием белка и активностью протеолитическнх ферментов—существует тесная связь. При этом следует отметить, что эта зависимость носила аналогичный характер в зерне двух сортов яровой пшеницы, выращенных в различных условиях.

Установление этой закономерности имеет важное теоретическое и практическое значение в связи с тем, что в настоящее 8

~ время установлено, что сорта мягких пшениц, имеющих высокие хлебопекарные качества, обладают более низкой активностью протеиназ в зерне по сравнению с сортами, имеющими " низкие хлебопекарные качества (Bushuk et al., 1971, Kruger,, - 1973), а снижение протеиназной активности в муке, получаемой из зерна пшениц с низкими и средними хлебопекарными. качествами, положительно отражается на качестве хлеба (Johnson, 1965, Pomeranz, 1966).

Поскольку в технологии хлебопечения активность протеи-наз выражают на единицу веса муки или теста, то, исходм из полученных нами данных, можно заключить, что с повышением содержания белка возрастания общей протеиназной активности в муке не происходит и, следовательно, нет оснований . ожидать ухудшения свойств клейковинных белков в процессе тестоведения, так же как и качества выпекаемого хлеба.

Определение протеиназной активности (субстрат казеин) в ♦ -; созревающих семенах гороха показало (рис. 2), что активность, отнесенная к одному семени, достигала максимума в фазу желтых бобов, после чего несколько снижалась.

Протеиназная»активность, отнесенная к 1 г сухого вещест-" > , • ва 1 мг белка, закономерно снижалась при созревании в результате интенсивного накопления сухих веществ и запасных белков. С повышением уровня фосфорного питания протеиназ-ная активность повышалась в семенах в фазу полной спелости, а также в фазу желтых бобов, когда семена имели, максимальный уровень активности, при всех способах ее выраже-' ния. . '

Таким образом, снижение содержания белка в семенах гороха и изменение его фракционного состава в сторону повы-, шения содержания альбуминов под влиянием фосфорных удобрений сопровождается повышением протеиназной активности.

3. Компонентный состав протеолитических ферментов

В процессе созревания семян происходят изменения не ;' только в активности, но ив составе протеолитически активных белков (Prentice et al., 1971, Preston, Kruger, 1976). По; видимому, изменения в активности протеаз каким-то образом . связаны с изменением состава и соотношения активных белков. г*' Методом электрофореза в полиакриламидном геле в зерне

7•*}' пшеницы во все фазы спелости были обнаружены четыре ком-1 понента протеиназ, определяемых по гидролизу гемоглобина. 1 Состав активных компонентов не изменялся при созревании.

зерна и под действием удобрений. В зерне пшеницы, выращен-.»>• н о л в п о л е в о м опыте, обнаруживались аналогичные компонен-;;"♦ ты гемоглобиназы. ' . . .7 :::::: :

. -.-При хроматографии на КМ-целлюлозе в фазу.молочной спе-17" лости в зерне пшеницы было обнаружено четыре.компонента

гемоглобиназы при ионной силе элюирующего раствора 0,01; 0,05; 0,11 и 0,19.

В процессе созревания компонентный состав гемоглобиназы не изменялся, однако отмечены заметные изменения в содержании активных компонентов.

..Активность компонентов, элюируемых при ц, 0,11 и 0,19, сохранялась примерно на одном уровне во все фазы спёло\-сти, а компонентов, элюируемых при \1 0,01 и 0,05, заметно' снижалась в период, совпадавший с резким снижением общей активности, после чего сохранялась практически на постоян-, ном уровне. *

При фракционировании белков гороха на сефадексе О-200 во все фазы спелости обнаруживался один компонент протеи-пазы с молекулярной массой 100 тысяч дальтон. Фермент элюировался совместно с белками, имеющими альбуминовую' природу.

II. АКТИВНОСТЬ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ. В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ И ГОРОХА В СВЯЗИ С КАЧЕСТВОМ ЗЕРНА И РАСПАДОМ БЕЛКОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ПИТАНИЯ ' ПРОРОСТКОВ ./;. У

1. Распад белков и использование проростками азота семян

. Между активностью протеиназ и интенсивностью распада запасных белков в семенах ряда растений установлена теснаял* связь (Башекоп, 1952; Б^сМе, Ба8е1;, 1973).

- Определение содержания белкового азота в прорастающих семенах яровой пшеницы и гороха (табл. 5) показало, что распад белков в них происходил неравномерно. '. • Наиболее интенсивное снижение содержания белкового азота в зерне пшеницы отмечалось в период между первыми и пя-1 тыми, а в семенах гороха между седьмыми и двенадцатыми ' сутками прорастания. В семенах пшеницы и гороха, прорастав-. ших на смесях с аммиачным и высокой дозой нитратного азота, распад белков замедлялся.

В опыте15 1 изучалось также исп1о5льзование проростками меченного 15К азота удобрения Са(15К03)2 и азота семян, ч Потребление проростками азота семян как пшеницы, так и гороха соответствовало изменению интенсивности распада белков в семенах. Использование проростками азота семян на смеси с высокой дозой азота замедлялось, что, по-видимому, связано с перестройкой метаболизма растений на использование минерального азота. •. . Л 10

• — -

ПЕ

---ад

А

В Б

+

Зеленые Зеленовато- Желтые Полная бобы желтые бобы бобы спелость

Рис.г.Протеиназная активность в семенах гороха при созревании

А ПЕ/1 сеыя

Б 11Е/1 ыг белка х 10 В ПЕ/1 г сухого вещества х 10"1

Т а б л к ц а 6

Содержание белкового азота в семенах яровой пшеницы и гороха при прорастании, мг/100 семян

Время прорастания, сутки

Варианты 1 3 5 ; 7 9 12

Опыт I

1 Контроль 77.6 1145 40.1 1054 18.6 928 8.4 726 8.4 509 228

£ РК 76.6 40.2 . 17.9 79 7.8 —

1139 1050 906 715 462 164

3. М,РК 77.8 46.8 20.8 8.9 8.9

1145 1110 987 838 623 219

71.5 37,8 16.9 7.6 7.6

4. ]\о,жРК 1145 Ш87 853 675 460 154

Опыт 2

1. РК 77.4 41.2 19,7 10.0 8.6

1145 999 833 707 445 169

78.5 42.3 22 2 12.3 10.1

2. (]]Н«+—])РК 1145 1030 878 725 462 209

3. (N03—]])РК 72.5 1145 44.6 977 15.9 820 11.1 690 8.8 417 148

Числитель пшеница знамена тель—горох. - . 2. Активность протеолитических ферментов

Изучение изменения нротеиназной активности (субстрат казеин) в прорастающих семенах яровой пшеницы и гороха при различных условиях питания проростков (табл. 6) показало, что характер изменения протеиназной активности в общих чертах совпадает с интенсивностью распада белков.

Покоящиеся и набухшие семена яровой пшеницы обладали очень низкой активностью протеиназ. На третьи сутки прорастания активность возросла до максимума—в 22—29 раз—но сравнению с покоящимися семенами, после чего до конца опыта постепенно снижалась.

В семенах гороха протеиназная активность на девятые сутки прорастания возрастала в 2,8—3,5 раза по сравнению с активностью в покоящихся семенах, а затем снижалась.

В семенах пшеницы и гороха, прораставших в контроле и вариантах РК и К0>28РК в опыте 1, а также в вариантах РК и

*."-•.....-;••'" * '■';'■:' \ У..УГ '.""*> Таблица О

Протенназиая активность в семенах яровой пшеницы и гороха при , ," • , прорастании;. - Ч, ' ' •. •

- :•. л Время прорастания, сутки

.Варианты

1 •••; " 5 • "~1 г : „ 9 • 1 2

Опыт 1

1.9 36.0 /27,8 ,14.9 4.3

-зХ 4,0 7П\2- • .8,4 10,0 7,8

'38.0 28.3 18.2 -"

3,8 4,2 , 5,1 8,8 ; 10,7 8,0

12 31.7~ 29.0 14.9 С 53

3,9 : 3,9 3,2 ■ ;7,4', 8.7 6,2

42.7 27.8 20.6 6.2

4,0 5,6 8,7 10,9 8,5

1." Контроль

ч

2. РК/

3. М2РК

4.'К„.аРК

Опыт 2

2А 25.4.' 17.8 101 7.7

3,1 3,6 5,0 8.5 у 10,4 7,8

и 19.7 15.4 "•'82: •; 4.8

2,9 3,2;;, '4,8 - -7,6 . 8,8 -5,8

25.9": 16.8 10.6-Т 6.7

3,8' 5,1 8,8 - 11,0 7,6

1.'РК

2.-(МЫ4 +—М)РК з" (К08 — К)РК

Числитель—пшеница, ПЕ/100 зерен; знаменатель — горохШЕ/1 семя.

(К03~—К)РК в опыте 2 в течение всего периода прорастания различия в протеиназной активности были < незначительны/ а семена,/; прораставшие*;*, на смесях с аммиачным'"' и высокой "дозой нитратного азота, в'период 'наиболее интенсивного рас-пада'бёлков обладали пониженной активностью проТепЫаз." •. ;; ?;Таким образом, замедление интенсивности распада белков Лв семенах пшеницы и гороха, л..прораставших на смесях с ам-'мначным и высокой.] дозой нитратного азота, связано со спи» жением уровня протеиназной.активности в семенах. и1;С целью изучения характера изменений в активности про-теолитическнх ферментов в]проросшем зерне яровой пшеницы, сформированном при различных условиях минерального питания и вследствие этого имеющим различные качественные по-, казатели, зерно, выращенное в полевом опыте, проращивали в течение трех суток на дистиллированной воде и в отделенных от побегов зерновках определяли активность протеолитическнх

ферментов, используя азоказеин и гемоглобин в качестве субстратов.

: При сравнении полученных результатов (табл. 7) с результатами определения протенназнои активности в непроросших зернах были выявлены следующие закономерности.

В абсолютном выражении азоказенназная активность в проросшем зерне мало изменилась по сравнению с активностью в покоящемся зерне. В то же время азоказенназная активность, отнесенная к единице сухого веещства, и особенно к единице белка, значительно возросла, что связано с распадом сухих веществ и белков при прорастании.

Таблица 7

Протеиназная активность в проросшем зерне пшеницы, сформированном при различных условиях питания

Варианты

Азоказенназная активность Гемоглобиназная активность

Е/1 г сухого вещества Е/1 зерно Е/1 мг белка Е/1 г .сухого вещества Е/1 зерно Е/1 мг белка

288 305 218 290 254 213 7.2 8.8 6,2 9.3 7,2 6,6 4.4 5.5 3,0 5,4 3,9 3.6 69,7 119,7 71,5 111,7 82,9 94,3 1.85 3,55 2,29 3,44 2,29 2,94 1,51 2,79 1,43 2,40 1,62 2,01

Без удобрений . . . .

Известь+М„0Кэо . • • Известь+М№Р9 . . . . Известь+№0РР0к90 . • Известь + МЛсРиоКпо •

пп

Характер изменения азоказеиназной активности, отнесенной к одному грамму сухого вещества и одному мг белка, под действием удобрений сохранился в целом таким же, как в покоящемся зерне, то есть азоказенназная активность снижалась с повышением белковости непроросшего зерна, а в абсолютном выражении активность не изменялась в покоящемся зерне и снижалась в проросшем зерне с повышением его белковости. Между содержанием белка в покоящемся зерне и азоказеиназной активностью в абсолютном выражении в проросшем зерне была обнаружена довольно высокая отрицательная коррелятивная связь (г = —0,48).

Гемоглобиназная активность в проросшем зерне значительно возросла по сравнению с активностью в покоящемся зерне при выражении ее на единицу сухого вещества и белка. По сравнению с непроросшим зерном характер изменения гемо-глобиназной активности под действием, удобрений в проросшем зерне резко изменился. За исключением активности в

; >зерне варианта без,удобрений, которое имело низкую актив- • ность при низком содержании белка в зерне, характер изменения гемоглобиназной активности в проросшем зерне подденет-, гвием удобрений,был аналогичен характеру изменения азока-

зеиназной активности.,-.''; Л':" : Ул" " • ' : • • *"♦/. Следовательно, с повышением содержания белка," протеи-назная активность".УБ проросшем зерне пшеницы снижается. "Сопоставляя этот вывод, с результатами изучения'изменения ч состава белков и активности протеолитических ферментов пУ ♦ созревающем и покоящемся зерне яровой пшеницы, можно* заключить, что условия минерального питания,-способствующие получению зернас высоким содержанием белка оказывают положительное влияние на состояние его белково-проте-,, азного комплекса. "V - - ' * " •'• ' . '

'••/•' Анализ изменениятфотеиназной активности под действием удобрений в созревающих и проросших зернах пшеницы двумя методами позволилЛнайти между ними как различия, так . Л и сходство. По нашему~мнению" метод'определения протеиназ-сной активности с помощью азоказеипа имеет преимущество *, ? перед гемоглобиновым методом.

., 3. Компонентный состав протеолитических ферментов__у

' Изучение компонентного состава протеиназ при прорастании семян яровой пшеницы и гороха проводили с помощью ; ионообменной хроматографии- на' ДЭАЭ-целлюлозе „ нЛдиск- • -; электрофореза в полиакрнламидном геле. - ." -,".*,

»; В покоящемся зерне пшеницы ив* зерновках, прораставших • "три и семь суток, были'обнаружены четыре компонента нро-.'теиназ, определяемых по гидролизу, казеина, при ионной силе -элюирующего раствора 0,05; 0,13; 0,22 и 0,34. В процессе про-врастания состав активных компонентов не изменялся, наблюдались только количественные изменения в содержании.от- , , дельных компонентов.-.';- • ; ,' _ -

•: - В покоящихся семенах гороха и в семенах, прораставших трое суток, было обнаружено три компонента протеиназ, определяемых по гидролизу казеина, при ионной силе * элюирую-"щего раствора 0,20; 0,35 к 0,46. На девятые сутки прорастания, когда протеиназная активность достигла * максимума, в семе, нах гороха обнаруживался , дополнительный компонент при Лионной силе элюирующего раствора 0,12. Активность протси-''наз, элюируемых при ц, 0,20 и 0,35, повышалась в "процессе

прорастания. Л ............;'. •,-•'•*•• . '•• -•

--.Методом диск-электрофореза., в. полиакрил амидном геле в • .проросших семенах пшеницы, сформированных при различных 'условиях питания, были обнаружены те же четыре компонен-.

та иротеиназ, гидролизующих гемоглобин, что и в НеПророс-шем зерне. ,

Условия питания растении как в период форм1фОвания, такив период прорастания семян не оказали влияния на со:"* став протеолитически активных белков. Достоверные количественные изменения в соотношении активных компонентов иод влиянием условий питания также не были обнаружены.

Выводы

1. В нолевом и вегетационных опытах с яровой пшеницей и горохом условия минерального питания растений оказали существенное влияние на урожай, массу 1000 зерен, содержание

';- белка в зерне и сбор белка с урожаем. Одновременное повышение урожая и белковости зерна пшеницы наблюдалось .... ; только при внесении азотных удобрений.

2. В условиях вегетационных опытов наиболее интенсивное накопление азотистых веществ в зерне пшеницы при созревании наблюдалось в период между фазами молочной и тестообразной спелости, а в семенах гороха между фазами зеленых и зеленовато-желтых бобов. Повышение уровня азотного питания пшеницы и снижение уровня фосфорного питания гороха увеличивало содержание общего, белкового и небелкового азота в семенах во все фазы спелости.

3. Аминокислотный состав суммарных белков семян пшеницы и гороха в процессе созревания изменялся незначительно. Повышение уровня азотного питания пшеницы и снижение уровня фосфорного питания гороха вызывали снижение содержания суммы незаменимых аминокислот и биологической ценности суммарных белков.

4. Изменение содержания белков в семенах пшеницы и гороха под действием удобрений сопровождалось изменением их фракционного состава. При повышении уровня- азотного питания пшеницы и снижении уровня фосфорного питания гороха содержание альбуминов в белках гороха и альбуминов н глобулинов в белках кшеницы снижалось, а содержание со-леизвлекаемых глобулинов в белках гороха и проламинов и глютелинов в белках пшеницы повышалось.

-.., 5. Протеиназная активность, определяемая по гидролизу азоказеина, при рН 6,0 повышалась в процессе созревания зерна п1 шеницы до максимального уровня в фазу восковой спело-сти,1 а активность протенназ, определяемая по гидролизу гемоглобина при рН 4,4, резко снижалась в период между фазами молочной и тестообразной спелости, а в более поздние фазы созревания сохранялась на постоянном уровне.

В созревающих семенах гороха протеиназная активность •'•*• повышалась до максимального уровня в фазу желтых бобов.

В

- 6. Протеиназная активность в зерне пшеницы, независимо " от видов и доз вносимых удобрений, изменялась в соответст- .„ вии с изменением содержания:белка. Установлено, что уело-, ,, вня формирования пшеницы, "способствующие повышению со-. -держания белка в зерне,,не вызывают возрастания протеиназ-" ./ ной активности, определяемой при созревании, покое и прорастании зерна, и, следовательно, улучшают его качество как • сырья для хлебопечения. ,-г *" ,- •

' Повышение содержания белка в семенах гороха и измене- . пне его фракционного состава в сторону снижения содержания альбуминов сопровождается снижением протенназной актив-. ' ностн. , .:*"•'."•.': ••"•»*—. " - • • [:. , '. .' -*

7. С помощью хроматографии на КМ-целлюлозе показано, что снижение протенназной активности в зерне пшеницы, определяемой по гидролизу гемоглобина, сопровождалось резким снижением активности .двух из четырех обнаруженных компо- > нентов, состав которых не. изменялся при созревании. Протен-назы. гороха при хроматографии на сефадексе 0-200 элюиро-вались совместно с белками, имеющими альбуминовую приро;" ду. Впервые применен метод дискового вертикального элект-,. •-рофореза для определения „ компонентного состава гемогло-

♦ бин-гидролизующих ферментов пшеницы.. "- •'", V

8. Наиболее интенсивный распад белков при прорастанииЛ,,. наблюдался в период между первыми и пятыми сутками в се-" менах пшеницы и между лседьмыми и двенадцатыми сутками

в семенах гороха. Распад белковых веществ и использование проростками.азота семян замедлялись при прорастании" на смесях с аммиачным и высокой дозой нитратного азота.

9. Характер изменения протенназной активности в общих" чертах совпадал с изменением интенсивности распада запас-" пых белков в.прорастающих семенах пшеницы и гороха.*,

-Активность протеиназ в.семенах, прораставших на смесях с, аммиачным и высокой дозой нитратного азота, снижалась в период наиболее интенсивного распада белков. Следовательно, темпы распада запасных белков в семенах пшеницы и гороха определяются уровнем протеолитической активности в.эндо-.сперме или семядолях. ; у . -

10. С помощью . хроматографических и электрофоретиче-скнх методов показано, что повышение протенназной активно- • ' стн в прорастающих семенах гороха сопровождалось увеличением числа активных компонентов. Состав протеиназ зерня

' пшеницы не изменялся в процессе прорастания, наблюдались только количественные .изменения в соотношении активных. ' компонентов. Условия питания растений как в период формирования семян, так и в период прорастания не оказали влияния на состав.,".и соотношение протеолитически активных белков._. ,';', •,'- •' '. \ 1.

16 • 1 . ...'-"

Полученные нами данные о влиянии условий питания растений на состав белков и активность протеолитических ферментов в семенах яровой пшеницы и гороха могут быть использованы для теоретических разработок в технологии хлебопечения и системе применения удобрений для получения высоких урожаев семян высокого качества, а также при разработке методов изучения протеолитических ферментов зерновых и зернобобовых культур.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Разделение протеолитических ферментов зерна озимой пшеницы на сефадексе О-100. Известия ТСХА, вып. 1, 1976, с. 184—188 (в соавторстве с Плешковым А. С, Плешко-вым Б. П., Кузнецовой Н. Е.).

2. Активность и состав протеолитических ферментов зерна яровой пшеницы в процессе созревания в зависимости от условий азотного питания. Известия ТСХА, вып. 6, 1976, с. 89— 101 (в соавторстве с Плешковым Б. П.).

Л 107591 5/У—78 г. Объем У^ п. л.

Заказ 804.

, Тираж 100 "

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44 ,