Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молибдокофактор растений, влияние нитратов и аккумуляции в семенах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молибдокофактор растений, влияние нитратов и аккумуляции в семенах"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТ.УТ БИОХИМИИ им.А.Н.Баха

На правея рукописи

Шеэцов Александр Анатольевич,

Ш 577.151.33

МОЛИБДОКОФАКТОР РАСТЕНИИ, ВЛИЯНИЕ НИТРАТОВ И АЮСУМУЛЯЦИЯ В СЕМЕНАХ

03.00.04. - биологическая химия •

АВТОРЕФЕРАТ-диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в лаборатории биохимии ассимиляции нитратов Института биохимия им.А.Н.Баха РАН

Научный- руководитель -

доктор биологических наук, профессор Н.П.Львов Офицналыша оппонента:

доктор биологических наук, профессор Г.Я.Еизневская

доктор биологических наук ц. С .Крицкий

Ведущая организация -

Московский Государственный университет

им.М.И.Ломоносова (оиологичесюШ факультет)

Защита диссертации состоится 1992 г в 10 часов

на заседании Специализированного совета (К 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А .Н.Баха РАН (117071, Москва, Ленинский пр. Д.33, корд.2)

С диссертацией ыошо ознакомиться в библиотека биологической литературы РАН (117071, Ыосква, Ленинский пр. д.33, корп.1)

/

I

Автореферат разослан 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совеи доктор биологических науз

и.И.Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тепы. ПтвринсодеркащиЯ молибдокофактор (Мо-со), представляет собой молибдоптериы в тетрагидрофзрме и является активным центром больиой группы окислительно-восстановительных ферментов участвующих в метаболизме нитратов, пуринов, альдегидов и других соединений, игравших важную роль в жизнедеятельности микроорганизмов, грибов, водорослей, растений, животных и человека.

Молибдокофактср растений мало изучен, а сведения о Мо--с"о бобовых растений, а также его возможной корреляции с физиолого-биохимическими показателями, связанными с их продуктивностью и качеством зерна в литературе отсутствуют. Не изучен вопрос о влиянии нитратов на биосинтез Мо-со в растениях. В вегетативных органах растений Мо-со представлен, в основном, в форме двух известных .ферментов: нитратредуктазы (НР) и ксантиндегидрогеназн (НДГ), участвующих в метаболизме азота. Однако, многие вэжиые вопросы, связанные с биосинтезом и регуляцией этих ферментных систем остаются неисследованными, один из которых макет ли Мо-со лимитировать нитратредуктазную активность при возрастающих уровнях нитратного питания. Выяснение этого вопроса представлялось немаловажным и в связи с остро стоящей проблемой "занитрачивания" сельскохозяйственной продукции.

Интерес к Мо-со был также обусловлен тем, что его недостаток и нарушения в биосинтезе приводят к ряду тяжелых авболеваний у животных и человека. В этой связи изучение Мо-со растений представляет определенный практический интерес и для медицины как возможного источника при получении препаратов для лечения ряда урологических и неврологических заболеваний.

Цель и задача исследований. В связи с вышесказанным была поставлена цель: изучить Мо-со некоторых злаковых и бобовых растений.

В задачу работы входило выяснить: I)может ли Мо-со быть лимитирующим фактором НР активности растений при возрастающих уровнях нитратного питания; 2) молекулярные формы Мо-со в растениях; 3)возмо!кнув корреляцию мажду содержанием Ыо-со в растениях с их продуктивностью и качеством зерна, физиолого-биохимическими особенностями; 4)исслодованиб Мо-со, аккумулированного в семенах, как возможного источника для ого выделения, изучения свойств и дальнейшего использования в медицина.

Научная кошзвэ. В работе впервые получено систематическое оксперимантальное доказательство того, что лимитирование НР активности в листьях изученных растений, не вызывается недостатком Мо-со.

Б присутствии нитратов в листьях исследованных растений обнаружен сверхсинтез Ыо-со и его неактивного предаествешшка (молибдоптерина

Впервые обнаружено, что возрастающие концентрации нитратов г питательной среде значительно снижают содержание Мо-со в зерне ячкеш и пшеницы.

В листьях изученных растений впервые обнарукен и изучаг Ыо-са=содэр2эдр18 белок молекулярной массы 400 кДа, способны! восстанавливать Еигротетразолиевый сшшй (НУС) и увеличивающий сво) 8лектронтранслортную активность при повышении концентрации нитратов I среде.

Впервые показано, что возрастающие дозы нитратов могу стимулировать активность не только НР, но твккэ в друтоп Но-со=содергащэго фермента - КДГ. В листьях исследуемых растенк обнаружена Сезиолибденовая форма КЦГ.

В иокоящихся семенах гороха, люшшв и фасоли впервые обнарука мдлибдокофактор.

Содержание Мо-со в семенах генотипов гороха коррелирует вктивностьо НР, продуктивностью свкяя я содержанием в них сырог

протеина.

Обнаружено, что в покоящихся семенах гороха преобладающая часть активного Мо-со связана с белком молекулярной массы 67 кДа, отличающегося по флюоресценции от известннх типов кофактора.

Кодифицированы методы определения Мо-со и НР, позволяющие обнаружить в 5-13 и 3-19, соответственно, раз большую активность этих показателей, тем при стандартном их определении.

Практическая ценность. Установление факта, что Мо-со не лимитирует НР активность растений при возрастающих уровнях нитратного питания может Оыть использовано, в дальнейшем при разработке биохимически обоснованной теории "занитрачиввния" растений.

Установление корреляций между содержанием Мо-со в семенах бобовых и некоторыми физиолого-биохимическими свойствами растений, делает возможным применение этого показателя в качестве теста в гелекционно-генетической работе при оценке продуктивности и ,качества семян генотипов.

Семена генотипов гороха, с высоким содержанием Мо-со могут Оыть гспользсваяы в качестве источника для его выделения, изучения свойств, зтруктуры и дальнейшего применения в медицине.

Модифицированные методы определения содержания Ыо-со и НР активности могут найти применение в ходе дальнейшего изучения софактора и ассимиляции нитратов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из »ведениия, обзора литератур«, материалов и методов исследований, жспериментальной части, заключения, выводов и списка цитированной гитературы (148 наименований). Объем работы 130 страниц, включая 28 >исунков и 8 таблиц.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Втором !с?"юзком съезде обсества физиологов растений (Минск 1990); на XI

Всесоюзной конференции "Микроэлементы в биологии и их применение в сельском хозяйстве и медицине" (Самарканд 1990); на Всесоюзном совещании "Проблема азота в интенсивном земледелии" (Новосибирск 1990); на Всесоюзной конференции "Физиолого-генетические механизмы регуляции азотного питания растений:" (Киев 1991), а также в Институте зернобобовых и крупяных культур на расширенном коллоквиуме лабораторий биохимии, физиологии, селекции и генетики бобовых культур (Орел 1991). Материалы работы докладывались также на конкурсе'Института биохимии им.А.Н.Баха РАБ в 1991 г (отмечены Ш премией).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ и получено решение на выдачу авторского свидетельства на изобретение.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследований были яровая пшеница (Trlticm aeativum. L.) сорта "Московская - 35", ячмень (Eordeum vulgaris.X.) генотипы AHOR -25Э9/бЗО,К-20022; (г6н0тип 6); AH0R - 2550/63,К-20042 (гвнотип 13); Косовский-9,К-20042 (генотип 15); AHOR-3862/64,K-Z0I75 (генотип 22), и горох (PIam sativum L.J copra "Ульяновский 68й. Растения выращивали в условиях оранжереи при возраставших уровнях нитратного питания. Объектом исследований были также 22 генотипа гороха (Plswi sativum I,J из коллекции ВНИИ ЗБК и ВИРа, которые выращивали в полевых условиях.

Экстракцию из листьев я сеияв проводили в калий-фосфатном буфере 0,1Ы, рН 7,5 с добавками Mi no ЭДГА и ЗмМ восстановленного глутатиона на холоду 40-60 мин с последующим центрифугированием (I5000xg).

Определение иолибдокофактора проводили согласно (Nason et el, 1970) модифицированным в работа методом- (Hawices, Bray, 1984-)-.

Содержание нитратов определяли салициловым микрометодом (Bhandary, Simlot, 1986)

Активность NADH-зависиыоЯ нитрагредуктазы In vitro определяли

согласно методике (Львов, Сафаралиев I9&S).

Ксантиндегидрогеназнув активвость определяли методом окрашивания в ПААГ после электрофореза согласно (Mendel, Miiller, "1976).

Активность еттрогеназы in vivo определяли ацетиленовым методом (Hardy et al, 1968).

Определение интенсивности фотосинтеза проводили по методике (Могилев к ., 1978).

Белок определяли по методу Лоури (Lovrry et al., 1951).

Спектры флюоресценции птеринов регистрировали на спектрофлюоримэтре "Hitachi"- НРР-4.

Содержание молибдена определяли атомно-збеорбциенным методом на приборе "Hitachi -170-10".

Печение Мо-со=содераащих белков изотопом вольфрам» (19siv) In vitro проводили по методу Калакуцкого с соавт. (1992).

Определение молекулярной масси Мо-со=содергащих белков проводили методом HPLC на колонке Protein Pao - 300 SW фирмы "Waters" США И гельфильтрацией на колонке sephacryl s - 200.

Нзоэлектрическуо точку Мо-со=сод9раещего белка определяли методом пзоэлектрофокусироввния (Регэтти, 1985) в колонке, модель НО фирма LRB, Швеция.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ШС ОБСУЖДЕНИЕ.

Определение Ыо-со основано на востановлении активности апонитратредуктазы мутанта гриба К. стазза nlt-l, дефектной по кофактору при комплиментации с источником Мо-со. Обычно используют схему комшшментащш 15-40 минут при t=20-25°C, однако известна работа (Hawkes, Bray, 1984) авторам которой удалось значительно повысить чувствительность метода используя более продолжительную комшшментацип на холоду. Нами был модифицирован метод определения Мо-со при этом, в отличие от цитируемой работы мы кехгользовали комшшментацяю 20ч при

t=5°C в присутствие восстановленного глутатиона (ЗмЫ) и аскорбата натрия (1мМ), что позволило в 5-13 раз повысить чувствительность метода. Вероятно 15-40 минут при t=20-25°C недостаточно для комшшментации всех молекул вдонитратредукгазы ntt-I с Мо-со, кроме того, возможна протеолитическая деградация восстановленных молекул НР, вероятность которой вше при комнатной температуре, что в конечном итоге может приводить к заниженным результатам. Поэтому для адекватной оценки содержания Мо-со в работе использовали модифицированный метод.

Ыолибдокофактор в листьях ячменя, пшеницы н гороха при возрастающих дозах азотного питания. Результаты исследований по изучению влияния возрастающих доз нитратов на активность НР и Мо-со, проведенных на пшенице, ячмене и горохе показали, что при повышенна

6

13

. » I

\

Li

s f

»? л

's £

■ кущение

i

•трубкование

ê 13

колоиенив'

JSL

I

РисЛ.Нптратредуктазная активность, содержание Мо-со и его

предшественника (MPÏ) в листьях ячменя при возрастающих дозах нитратного питания. I- активность HP, II- содержание Мо-со, III- содержание ЫРТ. 6 и 13 - номера генотипов ячменя

Дозы азота: I - 0,5 г n-no3~ на сосуд; 2 - 1,5 г n-no3"; 3 - 4,5 г; 4 г n-noa на сосуд.

дозы нитратов в среде содержание Мо-со в листьях, в большинстве случаев, возрастает линейно, в отличие от НР, у которой избыточная и сверхизбыточная дозы не вызывают дополнительной'индукции (рис.1) Нитраты увеличивают содержание не только Мо-со, но и его неактивного предшественника - молибдоптерина (МРТ). Следует отметить, что резкое снижение содержания МРТ в Фазу колошения у генотипа 6 не вызывало адекватного .ниженля содержания Мо-со и активности НР, что может свидетельствовать о том, что Шо-со в присутствии ' нитратов синтезируется в количествах превышающих потребности в нем НР. Результаты, полученные при изучении Мо-со в листьях пшеницы и гороха также подтвердили существование избыточного количества Мо-со в клетке. По-видимому, нитрат вызывает "сверхсинтэз" Мо-со и МРТ, так как для поддержания активности НР на достаточно высоком уровне- требуется лишь часть присутствующего в листьях кофактора. На основании результатов, полученных на трех культурах можно сделать вывод, что Мо-со не лимитирует активность НР в листьях, так как синтезируется в клетке в явном избытке.

Влияние возраставзда доз ттратов иа активность КДГ. Так как Мо-со синтезируется в клетка в присутствия нитратов в избытке, то можно предполагать, что он используется и другими Мо-со=содериащими ферментами. При определении КДГ в листьях гороха и пшеницы было обнаружено, что возрастающие дозы нитратов приводят к существенному увеличению ее активности (рис.2), причем избыточные дозы нитратов в отличие от НР, не ингибируют активность КДГ, а значительно стимулируют ее. Можно предположить, что стимуляция КДГ возрастающими дозами нитратов связана с участием этого фермента в нитратредукции поскольку имеются данные о наличии у КЛГ нитратредуктазной активности (Тг1р1еН а1,19В2).

■Л'!'I1:;Г!:,'- '.¡.;.;:

:! ¡;:! ! ! I

1 :ь;-1

:!:!;! ! ! 1 |!.г'; '■] '' | ;■ ' .1.

Г .! ! '.I ■■'!

I

I

да;-: I

к

;дет !

'КДГ..! .¡I ;

!■■ ■ I

:г< п.

| Ч ! Т:м •■ г '!.'

м ::! ';^'!'^':,;1] м*л .1 ■

ШЗЙ1 Ш1Ш® Ш1

I ¡'.Г.

!КДГ'.;

. ' ¡ч

Ш,

од*-

и

1/10

1/3, .1 3 И°р,ю

Дози азота в питательной смеси Клопа

! ; I

;КДГ

0,2гЫ-Ш3/<;осуЕ

КШ1

I „ | ; ■

£

4.5 Ы-ЫО^/сосуц

Рис.2.Увэлетание активности КИТ в листьях гороха и пшеницы при возрастающих концентрациях нитратов в питательной среде

I - активность КПГ п листьях гороха; II - в листьях пшеницы

1 - аикограмш КДГ в поллвкриламиднсы геле (ПААГ)

2 - двнситограмш? тег.: ;:;в голоЬ

Результаты опытов по изучению КДГ показали, что в листьях пшеница этот фермент мокет сушествовать в виде Оезмолибденового предшественника. Активность КДГ после прогревания (70°С 5 мин.) в присутствии восстановленного глутатиона и экзогенного Мо увеличивалась более чем в два раза (рис.3). Активация 1ЩГ при термообработке е

___: _ П _ •

Рис.3.Влияние прогревания екстрвкта ( 70° С, 5 мин в присутствии восстановленного глутатиона /3 Ш/ и ИагМоО% /10"» М/ на активность КДГ в листьях пшеницы. I - экстракт без прогревания; II - прогретый экстракт.

присутствии Но, по-видимому, связана с конформациояными изменениями приводящими к "разворачивании" ее под влиянием температуры и вероятному "обнажению" центров, которые становятся доступными для включения Мо в состав безмолибденового предшественика. Это предположение согласуется с данными Бесбаевой (1990) по изучению КДГ из зародыша пшешшы. Следует отметить, что Мо-со К1Г более стабилен чем Мо-со НР и выдерживает прогревание без потери каталитической и структурной функций - 70°С 5 минут (для сравнения: стандартная процедура освобождения Ыо-со из НР - прогревание 70°С 90с). Содержание Мо-со в клетке также как и в случае с НР не лимитирует активность КДГ.

Обшруиениа вис окоцолакуляркого Цо-со=содерзащего балка в листьях растений. При определении активности КДГ было обнаружено, что кроме полосы, соответствующей этому ферменту, на геле проявляется вторая полоса, которая окрашивается в рыкий цвет (далее по тексту "рыкий" балок). Этот белок обладал способностью восстанавливать штротетраэолиевый синий (НТС) как в присутствии гипоксантина так и баз него (Рис.4,1). Следует отметить, что при повышении дозы нитрата в среде интенсивность окрашивания "рыжего" белка в гелз после электрофореза экстрактов из листьев пшеницы, ячменя и гороха сильно возрастала. Сравнение гелей, проявленных на ВДГ активность после электрофореза акстракта, прогретого при 70° С 5 минут в присутствии I0"3 н Ыа2МоО^ и непрогретого (Рис.4,II) показало, что "рыкий" белок термолабилен и не обнаруживается на геле после прогревания образца. Результаты сравнения радиоавтографа с треком, проявленным с помощью зимограммы на КДГ, (Рис.4,III) позволяют заключить-, что "рыкий" белок, способен включать ABSw in vitro. По-видимому, это объясняется замещением молибдена вольфрамом в условиях данного опыта. Так 'как приведенные выше данные указывают на возможное участие "рыкэго" бежа в метаболизме нитратов, а такие, принимая во внимание его способность связывать вольфрам, молено было предположить, что он содеркит Мо-со. Результаты определения Мо-со подтвердили это предположение. Получены два пика активности Мо-со в геле (рис.5), больший пик соответствуе' "рыжему" белку (на радиоавтографе - полосе с большей интенсивностью), второй пик соответствует 1СЦТ.

При проведении гельфильтрацш на колонке с Sephaoryl S-2Q0, анализируемые фракции, соответствующие максимальной HP активности, не обладали способностью восстанавливать НТО при определении "рыжего" белка с помощью зимограммы на КДГ, а во фракциях, содержащих исследуемый белок не обнарукево HP активности. Полученные- данные

0,2 г n - n03 4,5 г m - n03"

-----в —листьях пшеницы--*—-

iM-л 'И/

(без прогревания);,,

^llffffiarig

70°С

5 минут в присутствии 10-4""г

Инактивация "рыжего" бэлка при нагревании

"рыкий" белок

б)

СО

" -л

Мечание "рыжего" белка изотопом t3Em tn vitro в экстракте из проростков гороха.

Рис.4.Белок, восстанавливающий нитротетразолиевый синий при проявлении активности КДГ в поливотиламидном гелэ. I - влияние нитратов и неспецифическое (в отсутствие гипсксантина) проявление; II - влияние температуры (70 С) III - включение изотопа вольфрама In vitro : в)- злмограммэ геля, проявленного на активность КДГ и его денситаграмма, б)- радиоавтограф геля и его денситограмма

позволяют сделать вывод о том, что Ыо-со=содеркащий ("рыхий") Оелок не является нитратредуктазой.

2

Рис.5.Распределение Мо-со в геле после электрофореза экстракта из листьев ячменя. : а)- зикогремма; о)- содержание Ыо-со в геле I - рыжий Оелок; 2 - КДГ

Молекулярная масса "рыкего" оелка была определена в препарате, полученном после .электрофореза. Типичная гель-хроматограыма • представлена на рис.6. Бремя выхода "рыжего" Оелка соответствует времени удержания белка молекулярной массы около 400 кДа. Его изоэлектрическая точка равна 4,4 единицы рЯ. Таким образом, кроме известных Ио-со=содеркащих ферментов и низкомолекулярных Мо-со=запасающих белков, кофактор в вегетативных органах растений может находиться в форме высокомолекулярного белка.

Аккумуляция иолибдокофактора в семенах.

Молибдокофактор в саыенах шешщы и ячиеня под влиянием возрвсгагида доз нитратов. Было обнаружено, что нитрат влияют на содержание Ыо-со не только.в вегетативных но и в репродуктивных органах. Возрастающие дозы нитратов в среде приводили к резкому

Рис.6.Определение молекулярной массы Мо-со=содеркащего (рыжего) белка, а) - профиль елюцш образца из листьев ячменя с колонки Protein Pao 300 SW (поглощение 280 нм) ® - Мо-со балок; б)- калибровочная кривая для бпределения молекулярной массы : I - тиреоглобулин (669 кДа), 2 - р-галактозидаза (485 кДа), 3 - Ыо-со бэлок, 4 - фер- . ритив (440 кДа), 5 - каталаза (232 кДа), 6 - альдолаза ÍI&8 кДа). .

снижению содержания Мо-со, особенно его свободной фарш, в зерне пшеницы и ячменя (рис.7). В семенах пшеницы этот показатель уменьшился

" А '

еоо

у ссо

*

ш

а

1 £00

8

3

*

■

5 №

*

1

■

*Г,1

|

0-— но-се

в— свожоянмн ив"с9 . в

.................. 'В

Д о а А Ц-Ш^г/соеац

Рис.7.Влияние возрастающих доз нитратов на содержание Мо-со в зерне ячменя и пшеницы. А - ячмень; В - пшеница

в 18 раз, а у ячменя избыточная доза ио3~ приводила к 6-кратному снижению содержания свободного Мо-со в зерне. Можно предположить, что Мо-со в исследуемых растениях существует в рёзличных формах: в вегетативных органах он находится в метаболической, преимущественно индуцированной мо3~ форме, необходимой для синтеза молабдоферментов, а в семенах - в запасной, вероятно конститутивной форме, которая, по-видимому, синтезируется в зерне, и ее биосинтез может репрессироваться возрастающими дозами нитратов.

, Обпарулзние Мо-со в семенах бобовых в его гевотшшческая обусловленность. В семенах бобовых присутствие какого-либо из описанных ранее Мо-кофакторов до сих пор не было обнаружено. При анализе семян гороха, люпина и фасоли на содержание Мо-со было обнаружено значительное его количество, причем, наибольшим содэрганием Мо-со отличались семена гороха. В дальнейшем в работе была поставлена

задача более детально изучить аккумуляцию Мо-со в семенах 22-х генотипов гороха, отличающихся по семенной продуктивности, крупности семян и содержанию в них сырого протеина.

В растительных и микробных клетках обнаружен как связанный с белками Мо-со, для определения которого проводят прогревание образца (ЦепДе!, 1983), так и свободный, обладающий способностью комшшмвнтироваться с НР я ¿Г-1 без дополнительной обработки. Определение содержания связанного Мо-со в семенах исследуемых генотипов гороха выявило значительные различия между ниш по атому, показателю. Важно отметить, что указанные различия по содерканию Мо-со сохранялись с семенах, полученных в 1988 и 1989 годах, что свидетельствует о генотиличеекой обусловленности этого показателя. Наиболее высоким содержанием связанного Мо-со отличались ыэлкосемянные генотипы с высоким содержанием сырого ¡гротеикз (рис 8). Коэффициент

—I

чА5^ Лт^

► I/л юл

Рис.Э.Содеркание Мо-со в семенах различных генотипов гороха 100-121- номера генотипов

номера генотипов

корреляции между содержанием Мо-со' и крупностью семян был равен г=-о,б87. У изученных ганоишов была выявлена и йоложитэльная

- те -

корреляция (г = 0,535) между содержанием сырого протеина и количеством Мо-со в семенах.

Гермолабильная форма Мо-со в семенах гороха. Было окружено, что значительная часть свободного Мо-со у исследуемых генотипов является термолабильной и инактивируется при прогревании экстрактов (70°С 90 сек.) даже в присутствии протектора - восстановленного глутатиона. Анализ тех ке самых образцов на содержание Мо-со, проведенный-без термообработки показал, что в действительности эти семена содержат в несколько раз больше кофактора, в виде термолабильной Фермы.

Содержание Мо-со в семенах и продуктивность генотипов. При обработке полученных результатов по содержанию Мо-со в семенах различных генотипов была обнаружена корреляция между этим показателем И продуктивностью сорта (риг.9). Чем выше продуктивность генотипа, тек

1

0- . ьодер*аым5 К©-е©

СЛМвМИО« Пр02¥КТи5«ССТк (гАалиО

дшЩшш

■100 «7!«!_«« ю} <оу <аг >05 <м нг «е «а лч «г и> «1 чг' 1« ш не

.Рис.9.Содержание Мо-со и семенная продуктивность генотипов гороха.

ниже содержание Мо-со в его семенах. "Для дальнейшего изучения Мо-со и

выяснения возможной связи между аккумуляцией кофактора в семвнах и некоторыми физиолого-Сиохимическими показателями растений исследовались две контрастные группы сортов гороха: I-низкопродуктивные (100, 102, ЮЗ, 107) и II - высокопродуктивные (114, 115, 118, 119), различающиеся по содержании Мо-со в семенах. Как известно ассимиляция азота у бобовых растений определяется двумя основными процессами: азотфнксацией и нитратредукцией, которые в значительной степени могут определять продуктивность и качество урокая. Определение активности HP и кятрогеназц (КГ) у исследуемых генотипов показало; что сорта Н-й группы обладают большей активностью HP si НГ. Было обнаружено, что чем более обеспечен кофактор молибденом тем больше активность HP в листьях изученных растений, а в конечном итоге и продуктивность растений. Следует напомнить, что ряд авторов находили положительную корреляцию между обеспеченностью семян бобовых растений молибденом их продуктивностью и способностью к азотфиксации и нитратрэдукщш (Львов, I98S, EroderioK,. 1991 и др.). Можно предположить, что низкое содержание Мо-со в семенах высокопродуктивных сортов современной селекции компенсируется интенсивностью физиолого-биохимических процессов, связанных с продуктивностью (взотфиксация, нитратредукция, фотосинтез, и др.). В пользу этого предположения говорят полученные а работа данные об активности HT, HP л фотосинтеза у исследованных генотипов.

Таким образом,, обнаружение Ыо-со в семвнах бобовых,.а также установление описанных выше корреляций связанных с продуктивностью и качеством зерпа ногут быть использованы в селекционно-генетической роботе прп оценке продуктивности и качества генотипов.

:"ор".-п Гз-со з сеивнах гороха. В семенах Мо-со находится в ,:."пектнсм состоянии (поскольку з шех шз обнаружено активности jfckoro-jbîco 133 5ТЗВЭСЕШХ мо-фврмеНТОВ) и ПРПС.УТОТПУОТ IÎQK з связанной

с белком, так и в свободной форме. Представлялось интересным более детально исследовать отмеченные формы Мо-со.

При изучении влияния протекторов на Мо-со в экстрактах из семян гороха обнаружили, что наиболее эффективным стабилизирующим действием обладали восстановленный глутатион, (3 мМ) и аскорбат (I мЫ) когда они применялись вместе (рис.10). Следует отметить, что протекторы

1 т 1 И

I 300

и

¡1 2Ш

.9

'В

е II»

@

Сйчзгтеш

ГО^ПОР

своБодпи

»в^КТОР

1

2

3

Рис.10.Влияние протекторов на содержание Мо-со.

1 - восстановленный глютатион (ЗмМ)

2 - аскорбат натрия (1мМ)

3 - аскорбат(1мм) плюс глютатион (ЗмМ)

действовали только на одну из обнаруженных форм Мо-со (связанную с белком), и не влияли на свободный Мо-со. На основании предварительных данных было предположено, что кофактор в семенах находится в двух оснобных формах: 1)Мо-со, связанный с белком - более стабильный; 2)элементарный, низкомолекулярный - термолабильный кофактор. Результаты ультрафильтрации на анизотропных мембранах ХМ-300, ХМ-100, ГМ-10 (м'ап1ооп") показали, что преобладающая часть Ко-со,.находящегося в экстракте остается на поверхности мембраны ХМ-300, и лишь следы Мо-со обнаруживаются после прохокзенхя эхстрактэ через послэдуюсше

мембраны, что могло свидетельствовать о сорбции Мо-со на поверхности применяемых мембран в данных условиях (из литературы известно свойство элементарного Ио-со сорбироваться на мембранах и оае сефадаксе). Присутствие низкомолекулярной формы Мо-со в экстракте из семян гороха обнаруживалось при диализе образца против экстракта Н.сгааэа п£Г-1 (аэробно при 5°С в присутствии ингибитора протеаз широкого спектра действия РМБР (МЛ) в течение 20 часов). Дефектная по Ыо-со НР гриба И.стзва па~1 после диализа восстанавливала способность утилизировать нитраты, что могло свидетельствовать о том,, что в свежеприготовленном экстракте, значительное количество Мо-со находится в низкомолекулярной, диализуемой форме.

При проведении гельфильтрации экстракта того не образца (все операции проводились на холоду, 5°С, в присутствии I мМ рмзр) на колонке с ЗерКаогу1 3-200 (рис.II) обнаружили,, что Мо-со выходит, тремя пиками: 1-й пик Мо-со активности (фракции прогревали 90 сек. при 70°С) совпадает с пиком флюоресценции характерной для МРТ /возбувдение 370 ны, эмиссия - 450/ и временем удержания белка молекулярной массы 160 ¡{Да, второй, максимальный пик активности Ио-со соответствует белку мол.массы 67 кДа (хотелось бы особо подчеркнуть, что в этой фракции не наблюдалось флюоресценция при 450 нм, максимум флюоресценции в етом пике ссогветствовал-425 ем). По-видимому, обнаруженный Мо-со=содеряащиа белок имеет кофактор несколько отличной структуры чем известные типы !.!о-со. Третий, небольшой по величине пик активности Мо-со, вероятно соответствующий низкомолэкулярной (диализуемой) форме также как п в первом пика содержал кофактор с максимумом флюресценции при 450 нм. Посла гельфильтрации образца на колонке 0-25 и последующей жидкостной хроматографии на колонке С-10 были получены фракции, соответствующие окисленный формам ЫРТ о флюоресценцией при 450 и '425 • нм. . Обнаруженная разница флюоресценции вэроятно связана а

Рис.II.Молекулярные фсимы Мо-со в семенах гороха.

I - профиль элзсаии экстракта с колонки Sephacryi S 200 (поглощение при 280 нм); 2 - содержание Мо-со ео фракциях; 3 - флюоресценция птеринов в тех же фракциях (450 км); 4 - калибровочная кривая для определения молекулярной массы.

существованием неизвестных нам лигандов у Мо-со, связанного о белком мол.массы 67 кДа.

Таким образом, можно-заключить, что Мо-со в покоящихся семенах гороха аккумулируется в нескольких формах: I)низкомолекулярной, диализуемой форме; 2) Мо-со в форме белка молекулярной массы 160 кДа; 3)преобладающая часть активного Мо-со, связана с белком молекулярной массы 67 кДа и отличается по флюоресценции от известных типов кофактора. ' Все отмеченные формы Мо-со обладали способностью восстанавливать активность дефектной апонитратредуктазы мутанта пи-1 в присутствии экзогенного молибдена.

выводи.

1.В листьях гороха, ячменя и пшеницы по мере возрастания уровня нитратного питания увеличивается содержание Мо-со и его предшественника (молибдоптерина).

2.В клетках листьев гороха, пшеницы и ячменя синтезируется значительный избыток Мо-со и МРГ (особенно на высоких дозах нитрата), следовательно Мо-со не является лимитирующим фактором НР активности исследованных растений.

3.Обнаружено, что возрастающие дозы нитратов в листьях гороха и пшеницы значительно увеличивают активность ВДГ. Отмечено, что Мо-со КПГ термостабилен и более прочно связан с апобелком фермента чем Мо-со НР.

4.В листьях гороха, пшеницы и ячменя обнаружен и изучен Мо-со=содернащий белок молекулярной массы 400 кДа, не проявляющий какой-либо из известных активностей Мо-ферментов и обладающий способностью восстанавливать НТО, которая , увеличивается при возрастании содераания нитратов в питательной среде.

5.В семенах гороха и некоторых других бобовых культур обнаружен (1о-со, содержание которого является генотигшчески обусловленным

признаком сорта, и находится в обратной зависимости с продуктивностью генотипа и крупностью семян и в прямой -с содержанием сырого протеина в ник. Преобладающая часть Мо-со в покоящихся семенах находится в безмолибденовой форме.

6.Высокопродуктивные сорта современной селекции имеют более высокое соотношение содержания Но к содержанию Мо-со в семенах чем кизкопродуктивные генотипы и отличаются большей активностью нитратредуктазы, нитрогеказы и фотосинтеза.

7 преобладающая часть активного Мо-со в семенах гороха связана с белком молекулярной массы S7 кДа и отличается по флюоресценции от известных типов кофактора.

8.Модифицированы методы определения Мо-со и HP активности, позволяющие обнаружить в 5-13 и 3-19, соответственно, раз большую активность этих показателей, чем при стандартном их определении.

Список работ, опубликованных по тепе диссертации:

1.Швецов A.A., Бурсаков С.А., Кирнос С.В;, Чернова E.H., Герцуский Д.Ф., Павлов А.Н., Львов Н.П. Метаболизм нитратов у растений ячменя и пшеницы в зависимости от уровня азотного питания // Тез. докл. Второго Съезда Всесоюзного Общества физиологов растений Минск, 1990, С.98.

2.Швецов A.A., Бурсаков С.А., Кирнос C.B., Чернова E.H., Павлов А.Н., Львов Н.П. Влияние молибдена на нитратредуктвзнув активность и содержание нитратов в листьях яровой пшеницы при возрастающих дозах азотрого .питания // Тез. докл. II Всесоюзной конференции "Биологическая роль микроэлементов к их применение в сельском хозяйстве и медицине", Самарканд 1990, С. 335-336.

З'.Швецов A.A., Бурськов С.А., Львов Н.П. Определение нитратредуктазной активности з растениях по убыли нитратов и накоплению нитритов // Тез. докл.Всесоюзного совещания "Проблема азоте

б интенсивном земледелии", Новосибирск 1990, С. 270-271

4.Швецов A.A., Амелин A.B., Новикова Н.Е., Львов Н.П. Содержание свободного и связанного молибдокофактора в семенах различных генотипов гороха // Тез. докл. Всесоюзной конференции "Физиолого-генетические механизмы регуляции азотного питания растений", Киев 1991, C.G3-G4.

5.Бурсаков С.А., Швецов A.A. Индуцируемый нитратом биосинтез молибдоферментов в листьях пшеницы, ячменя и гороха // Тез. докл., там se, С.7-8.

6.Швецов A.A., Амелин A.B., Новикова Н.Е., Львов Н.П. Нолибдокофактор в семенах гороха // Физиология растений, 1992, Т.39, в.Г, С.93-Г03.

7.Швецов A.A., Бурсаков С.А., Кирнос C.B., Чернова E.H., Герцуский Д.Ф., Павлов А.Н., Львов Н.П. Индуцируемый нитратом биосинтез молибдокофактора в листьях, пшеницы и ячменя при возрастающих уровнях азотного питания // Физиология растений, 1992, Т.39, в. 2, С.

8.Швецов A.A., Бурсаков С.А., Калакуцкий К.Л., Кильдибеков H.A., Львов Н.П. Белок, содержащий мо.табдокофактор в листьях пшеницы, ячменя и гороха // Биохимия, 1992, Т.57, в.2, С.292-299.

Э.Швецов A.A., Бурсаков С.А., Львов Н.П. Сравнительная оценка двух методов определения нитратредуктвзной активности. In uttro // Прикладная биохимия и микробиология, 1992, Т.28, С. 156-160.

Ю.Калакуцкий К.Л., Швецов A.A., Бурсаков С.А., Лвтаров A.B., Заболотный, А.Й., Львов Н.П. Высокочувствительный метод обнаружения молибденсодвржавдх белков // Биохимия 1992, в печати.

II.Швецов A.A., Амелин A.B., Львов Н.П. Сырье для получения молибдокофактора // Решение о выдаче авторского свидетельства на изобретение Но 4923160/13.