Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белок, содержащий молибдокофактор из семян гороха (PISUM SATIVUM L. )

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Белок, содержащий молибдокофактор из семян гороха (PISUM SATIVUM L. )"

РГЗ ОД'

, >ла ,0ДУССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

1 "Г) ^ \) |ЦиСУиТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА

. , ИОН ЮЯ5 „

•' - • ' На правах рукописи

ОМАРОВ Рустем Тукенович

УДК 557.151.33

БЕЛОК, СОДЕРЖАЩИЙ МОЛИБДОКОФАКТОР ИЗ СЕМЯН ГОРОХА (PISUM SATIVUM L.)

03.00.04 — биологическая химия

. Автореферат

диссертации на соискание ученой степенн кандидата биологических наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена в лаборатории биохимии ассимиляции нитратов Института биохимии им. А. Н. Баха Российской академии наук. - . .

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Н. П. Львов, кандидат биологических наук Н. А. Киль-дибеков.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук М. С. Крицкий, доктор биологических наук, профессор Э. А. Муравин.

Ведущее учреждение — Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук.

Защита диссертации состоится

ЯГ. . ноября 1995 г.

в ..... часов на заседании специализированного совета

(К 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А. Н. Баха (1170^71, Москва) Ленинский проспект, 33, корп. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп: 1). ,

Автореферат разослан /^Г^.у^/ .... 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета — доктор биологических наук

I

М. И. Молчанов

0Г,1ИЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акгуальноеть темы. Молибдокофактор (Moco» - каталшическнй центр всех, за исключением нитрогеназьт, молибден-содержащих ферментов, играющих существенную роль в жизнедеятельности бактерий, водорослей, грибов, растений и животных. Список этих ферментов включает в себя гидроксилазы, оксидоредуктазы и дегидрогеназы, которые катализируют биохимические превращения азота, углерода и серы. Мо-ферменты участвуют в метаболизме пуринов и других N-гетероциклических соединений, а также в генерации биологических антиоксидантов у высших организмов. Нарушения п биосинтезе молибдокофактора у человека приводят к ряду тяжелых заболеваний, потому исследование Moco имеет большую медицинскую значимость.

Молиблокофаюор растений в «¡лично от Moco бактериального к животного происхождения изучен недостаточно и представлен, главным образом, в составе двух Мо-ферментов: нмтратредукгазы и ксантиндегидрогеназы. Исследование Мосо-содержащих белков, не обладающих активностями Мо-ферментов в тканях растений, и в частности, их запасание в семенах, имеет большое значение в понимании функций кофактора, его биохимической и физиологической роли. Много неясности в изучении путей биосинтеза Moco в растениях, отсюда поиск и изучение возможных предшественников кофактора представляют несомненный интерес.

Аккумуляция молибдокофактора в семенах гороха имеет генотипическую обусловленность. Накопление "семенного" Moco связано с физиолого-биохимическими показателями растения. Следовательно, подробное изучение свойств, форм и механизмов запасания кофактора в семенах важно для понимания физиологического смысла его накопления и может иметь методическое значение в селекционно-генетических исследованиях.

Цель и задачи исследования. Главной целью исследования было изучение молибдокофактора, аккумулирующегося в покоящихся семенах гороха. В задачу исследования входили следующие вопросы: I. Исследование форм запасания кофактора в семенах гороха. 2. Разработка метода очистки Мосо-содержащего белка и . характеристика его свойств. 3. Изучение свойств и структуры кофактора. 4. Поиск возможных предшественников Moco в семенах.

Научная новизна работы. 1. Обнаружено, что преобладающая часть молибдокофактора в семенах гороха аккумулируется в составе белка молекулярной массы 300 кДа. 2. Разработан метод выделения и очистки до гомогенного состояния Мосо-содержащего белка. 3. Впервые показано, что молибдокофактор в растениях структурно идентичен Moco, выделенному из источников животного происхождения. 4. Установлены оптимальные условия определения активности кофактора Мосо-содержащего белка, позволяющие существенно повысить чувствительность метода определения содержания кофактора. 5. Впервые обнаружена стабилизирующая роль ЭДТА при выделении Moco прогреванием. 6. В семенах гороха обнаружен и выделен птерин-содержащий белок, возможно участвующий в синтезе молибдокофактора.

Практическая ценность работы. Полученные результаты дополняют имеющиеся данные о структуре, свойствах и формах молибдокофактора в растениях. Разработанный способ очистки до гомогенного состояния Мосо-содержащего белка может быть использован для дальнейшего изучения Moco, а также применяться в медицинских целях, в качестве препарата при лечении различных заболеваний, связанных с недостатком или нарушениями в биосинтезе Moco в организме (Подана заявка на изобретение № 95114012 от 14.08.95). Модификация метода определения активности Moco в семенах гороха может быть применена на других объектах для определения содержания активного Moco.

Апробация.

Материалы диссертации докладывались на ГУ Международном симпозиуме "Ассимиляция неорганического азота" (Дармштадт, 'Германия 1995) и на семинаре лаборатории биохимии ассимиляции нитратов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы и одна сдана в печать.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, экспериментальной части, заключения и выводов. Работа содержит 25 рисунков и 3. таблицы. Список цитируемой литературы включает 123 публикации.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследований. В работе использовали горох сорта "Малиновка", полученный in коллекции ВНИИ зернобобовых и крупяных культур (г. Орел), ¡¡моющий по данным (Швецов, 1992) высокое содержание молибдокофактора.

Определение активности молибдокофактора (Moco). Определение активности Мое о основано на реакции комплементации кофактора с дефектной по молибдокофактору нитратредуктазой мутанта гриба Neumspora crassa nit-J (Nason et al., 1970). Для количественного определения кофактора применялась методика комплементации на холоду в течение 20 ч (Hawkes, Bray, 1984). За единицу активности Moco принимали количество нмолей нитритов, образовавшихся в 1 мин в ходе реакции комплементации с дефектной нитратредуктазой мутанта гриба Neurospora crassa nit-1, в расчете на 1 мг внесенного Мосо-содержащего белка.

Определение активности ксантиндегвдрогеиазы. Ксантиндегидро-геназную активность определяли методом окрашивания в ПААГ после электрофореза согласно (Mendel, Muller, 1976).

Определение активности NADH - зависимой нитратредуктазы. Нитратредуктазную активность in vitro определяли по методике описанной в работе (Львов, Сафаралиев, 1988).

Определение активности метилвиологен - зависимой нитратредуктазы. Для определения нитратредуктазной активности, донором которой является восстановленный дитионитом метилвиологен, готовили следующую реакционную смесь в мк молях: натрий-фосфатный буфер - 0,1 М pH 6,5 - 50,0, метилвиологен - 0,7, NaN03 - 2,5, дитионит - 5,8, исследуемый препарат 0,2 мл.

Запись спектров флюоресценции. Флюоресценцию птеринов регистрировали на спектрофлюориметре "Hitachi"- MPF-4. Спектры флюоресценции снимали в диапозоне 400-460 нм, при длине волны возбуждения -360 - 370 нм.

Запись спектров поглощения. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония) в ультрафиолетовой и видимой областях.

Определение изоэлектрической точки Мосо-содержащего белка. Изоэлектрическое фокусирование Мосо-содержащего белка проводили на колонке LKB 8101-110 по ранее предложенной методике (Ригетти, 1976) с применением амфолинов в диапазоне 3,59,5.

Определение молекулярной массы Мосо-содержащих белков. Молекулярную массу Мосо-содержащих белков в семенах гороха оценивали методом гельхроматографни на колонке .72 х 2,5 см с Sephacryl S-200 и HW-55 Toyopearí, уравновешенных 50 мМ калий-фосфатным буфером, содержащим 1 мМ Na ЭДТА и 3 мМ востановленного глутатиона. Использовали следующие стандартные белки-метчики: ферритам (480 кДа), каталазу ( 240 кДа), альдолазу ( 147 кДа), альбумин (67 кДа), миоглобнн (17,8 кДа) фирмы "Serva" (Германия).

Определение субъединичного состава Мосо-содержащего белка.

Субъединичный состав белков определяли методом денатурирующего электрофореза по методу (Laemmlí, 1970) в ПААГ в присутствии ионного детергента додецил-сульфата натрия. Концентрация разделяющего геля 10%. Белковые полосы окрашивали красителем Кумасси бриллиантовым синим R-250 производства фирмы "Reanal" (Венгрия).

В качестве метчиков использовались следующие белки: миозин (200 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), каталаза (60 кДа), яичный альбумин (45 кДа), лактатдегидрогеназа (36 кДа) фирмы "Serva" (Германия).

Получение стабильных продуктов модификации и окисления Moco.

Получение йодацетамид-замещенного модифицированного производного кофактора Мосо-содержащего белка дикарбоксиамидо-метгошолибдоптерина проводилось по методике описанной в работе (Kramer et al., 1987).

Йод-окисленное производное кофактора - форму А из препарата Мосо-содержащего белка получали по методике указанной 5! работе (Johnson et al., 1984).

В качестве стандарта для получения дикарбоксиамидо-метилмолибдоптерина и формы А использовался коммерческий гомогенный препарат ксантиноксидазы молока фирмы "Serva".

Для получения птерин-6-карбоновой кислоты из препарата Moco, использовалась методика окисления кофактора йодом (I2/KI) с дальнейшей обработкой щелочным перманганатом калия (Johnson and Rajagopaían, 1982).

■ Мдезшификащш продуктов окнслешиз и' модификации Moco. Идентификацию продуктов окисления Moco и его модификации йодацетамвдом проводили на колонке с гидрофобной матрицей С-18

(150 х 3 мм Separan С-18 SGX ) жидкостной хроматографии высокого давления.

Определение содержания негеминового железа. Негсшшовое железо определяли по методу Рамзея (Ramsay, 1953).

Другие методы, использованные в работе.

Белок определяли методом Брэдфорда (Bradford, 1976) с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина. Гомогенность белков контролировали методом нативного диск-электрофореза в ПААГ, при концентрации разделяющего геля 7,5% в пластине 11x11 см с использованием стандартного прибора. Белковые полосы окрашивали красителем Кумасси бриллиантовым голубым G-250 производства фирмы "Ferak" (Германия).

Гель-фильтрацию проводили на носителях: Sephadex G-25 "Reanal", Венгрия; Toyopearl HW-55 "Toyosoda", Япония; Sephacryl S-200 "Pharmacia", Швеция. Ионообменную хроматографию проводили на анионообменнике DEAE-Toyopearl 650М "Toyosoda", Япония. Для гидрофобной хроматографии использовался носитель Phenyl-Sepharose 4В "Pharmacia", Швеция. Копалентную хроматографию осуществляли на активированном носителе Thiol-Sepharose 4В, "Sigma", США. Жидкостную хроматографию высокого давления проводили . на приборе НРР 5001 фирмы "Laboratomi Pristroje Praha" с использованием в качестве носителя колонки с гидрофобной матрицей С-18, Чехия.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Очистка белка, содержащего молибдокофактор

Ранее в семенах гороха был обнаружен молибдокофактор, накопление которого является • генетически обусловленным признаком сорта. Использование в качестве объекта исследования сорта "Малиновка" было обусловлено высоким содержанием Moco в семенах растений данного генотипа. Преобладающая часть кофактора в семенах указанного сорта аккумулируется в связанной с белком форме (Швецов, 1992).

Очистку Мосо-содержащего белка из семян гороха проводили методами: высаливания сульфатом аммония (20-40%); ионообменной хроматография на DEAE Toyopearl 650 М (рис. 1); гельфильтрации на Sephacryl S-200 и ковалентной хроматографии на активированной Thiol-Sepharose 4В (рис. 2).

s

Активность

50

100 150

200 250 300

Фракции« ил

Рис. 1. Ионообменная хроматография Мосо-содержащего белка на колонке DEAE Toyopearl 650М после стадии высаливания сульфатом аммония. Заштрихована область активности Moco.

t а " i

Рнс.2. Ковалентная хроматография Мосо-содержащего белка На активированной матрице Thiol-Sepharose 4 В. I - белки не связавшиеся с матрицей; II - эл1оция ступенью 60 мМ ГлутатноНа; Ш - элюция ступенью 65 мМ дитнотреитола (Стрелками указаны места внесения). Заштрихованные столбики - активность Moco.

Препарат Мосо-содержащего белка, полученный указанным способом, был электрофоретически гомогенен и имел удельную активность ¡4,1 ед/мнн на 1 мг белка (таблица 1). Степень очистки по белку составляла 4160 раз, по активности кофактора 293,8 раза. Степень очистктт Мосо-содержащего белка выражалась активностью вновь реконструированной in vitro нитратредукгазы мутанта гриба Neurospora crassa nit-1 . Следует отметить, что для количественной оценки Moco использовалась методика определения кофактора при продолжительной (20 ч на холоду) комплементации кофактора с экстрактом мицелия мутанта гриба N. crassa nit-1 (Hawkes, Bray, 1984).

Характеристика свойств Мосо-содержащего белка.

Определение молекулярной массы нативного Мосо-содержащего белка, полученного двумя методами: электрофорезом в 7%-ном ПААГ и гель-хроматографией на Toyopearl HW-55 F, показало одинаковую величину - 300 кДа.

Денатурирующий электрофорез гомогенного препарата Мосо-содержащего белка в 10%-ном ПААГ в присутствии додецил-сульфата натрия выявил одну полосу с молекулярной массой 150 кДа (рис. 3), что указывает на наличие двух гомологичных субъединиц.

Методом изоэлектрофокусирования показано, что pi Мосо-содержащего белка 5,0.

Нативный Мосо-содержащий белок не имеет специфической флюоресценции с максимумом при 450 нм и длине волны возбуждения 370 нм, характерной для окисленных форм Moco. Это позволяет считать, что птериновый компонент молибдокофактора исследуемого белка находится в восстановленной форме в виде тетрагудро- или дигидроптерина. В то же время, спектр флюоресценции окисленного кислородом воздуха (кипячение на водяной бане), но не отделенного от белка молибдокофактора, имеет максимум флюоресценции при 440 нм и длине волны возбуждения 360-370 нм, что соответствует спектру флюоресценции окисленного молибдоптерина (рис. 4). Анализ спектров флюоресценции Мосо-содержащего белка не выявил флюоресценции характерной для флавинов - хромофорных групп Мр-ферментов растений нитратредукгазы и ксантнндепшрогекэзы- Спектры поглощения гомогенных препаратов Моео-содержашего бедка (рис. 5), также указывают на отсутствие какда-яибо хромофорных групп Э РОРТЗве

Таблица 1. Очистка Мосо-содержащего белка из семян гороха

Стадия очистки Обшнй объем, мп Общий белок, мг Общая активность, ед. Удельная активность, нМ КОз" ед. на мг Выход,% Степень очистки

Исходный экстракт 100 3120 149,8 0,048 100 . 1

20-40% сульфат аммония 50 380 41,0 0,108 27 2,3

РЕАЕ- Тоуореаг1 650М 10 18,6 25,5 1,37 17 28,5

8ерЬасту1 Э-200 2S 2,95 13,8 4,67 9 97,3 .

ТЫо1- ЭерНагобС 4В 5 0,75 10,6 14,1 7 293.8

12 3 4 5 кЗ)а

— 200 --—150

"Ч Рис.3. Денатурирующий электрофорез Мосо-содержащего белка: 1 •

4 I исходный гомогенат; 2 - осаждение сульфатом аммония; 3 •

! ионообменная хроматография на ОЕЛЕ Тоуореаг! 630 М; 4 •

' геяьхроматографня на БерЬасгу! 8-200; 5 - хроматография на

I активированной ТЫоЬБерЬагояе 4В. Справа указаны молекулярные

' массы белков-метчиков в кДа.

320 360 400 ни 420 440 460 480 ни

Рис. 4. Спектр флюоресценции Мосо-содержащего беяка, окисленного кислородом воздуха при рН 7,2: А ■■ спектр возбуждения флюоресценции, В - спектр флюоресценции.

360 -Х.1Ш

Рис. 5. Спектры поглощения препаратов Мосо-еодержгщего белка: 200 (V) и 100 мкг/мл(2); 3- бычин, сывороточным альбумин.

субъединиц. В составе Мосо-содержащего белка не обнаружено негеминового железа, присутствие которого (в форме Fe/S-кластеров) характерно для Мо-ферментов растений.

Отсутствие ферментативной активности у Мосо-содержащего белка и его предполагаемые функции. Исследуемый белок не обладает ни одной из ферментативных активностей, свойственных растительным молибдоферментам, поскольку не обнаружено ни ксантиндегидрогеназной, ни нитратредуктазной активностей. Как будет ниже отмечено, Moco в составе выделенного белка находится в безмолибденовой форме, однако при экзогенном внесении молибдата активностей вышеперечисленных ферментов в покоящихся семенах не обнаружено. Можно предположить, что Мосо-содержащий белок является предшественником какого-либо Мо-фермента, например ксантиндегидрогеназы. Так, нами обнаружена

ксантиндегидрогеназная активность в процессе прорастания семян гороха (на второй день после начала проращивания). Следует отметить, что все изученные к настоящему моменту растительные молибден-содержащие ферменты имеют в своем составе, кроме Moco, другие простетические группы. Если данный белок является предшественником какого-либо Мо-фермента, то, вероятно, его модификация заключается во включении окислительно-восстановительных компонентов (флавины, Fe/S-кластеры, цитохромы и т.д.), а так же во встраивании молибдена (Мо-процессинг) в кофактор. Не исключена также возможность постгрансляционной модификации самой белковой молекулы. Вторым вероятным предположением, касающимся роли Мосо-содержащего белка, является его функционирование в качестве " донора активного кофактора в процессе биосинтеза Мо-ферментов.

Оценка количества молекул молибдоптерина в составе Мосо-содержащего белка с использованием в качестве стандарта препарата ксантиноксидазы. При сравнении активностей кофактора Мосо-содержащего белка и гомогенного препарата ксантиноксидазы (мол. масса 300 кДа), было обнаружено, что при использовании стандартной процедуры определения активности Moco, количество активного кофактора в исследуемых образцах сопоставимо. Так, пересчет активности Moco на количество белка в образцах указывает наличие в составе Мосо-содержащего белка 1,96 молекул кофактора. Известно, что в состав фермента ксантиноксидазы, входит две

молекулы молибдоптерина, и поэтому можно предположить, что Мосо-содержапши белок имеет такое же количество кофактора. Попытка оценки количества молекул Moco с использованием в качестве стандарта птерии-6-карйоновой кислоты (продукта окисления Moco щелочным перманганатом) указывает на меньшее содержание кофактора в составе выделенного белка (<1). Данное несоответствеие, может быть объяснено потерей исследуемого материала в процессе получения стабильного продукта окисления кофактора щелочным перманганатом (см. ниже).

Структура и свойства кофактора выделенного из Мосо-содержащего белка. Для идентификации структуры Moco, ввиду его чрезвычайной лабильности, обычно используется методика получения стабильных продуктов модификации и окисления кофактора (RajagopaUm, 1992). При отделении Moco от бедка при помощи температурной обработки в присутствии додецнл-сульфата натрия и окислителей Ь /К I с последующим окислением щелочным перманганатом калия, происходило образование окисленного производного идентичного по времени удержания на колонке С-18 HPLC птерин-6-карбоновой кислоте. Следовательно, структурной основой активного кофактора является птерин с боковой цепью в 6-положении. При обработке диссоциированного кофактора Мосо-содержашего белка йодом (Ь/KI) происходило образование производного идентичного форме А, получаемой при окислении препарата Moco из ксантиноксидазы молока. Обработка кофактора йодапетамидом проводила к замещению SH-групп кофактора с образованием дпкарбоксиамидо-метилмолибдоптерина, идентичного аналогичному модифицированному производному, получаемому из молпбдокофактора препарата ксантиноксидазы (рис. 6). Присутствие сульфгпдрильных групп в составе Moco из семян гороха подтверждается сорбцией активного Moco на активированной матрице тиолсефарозы, а также стабилизирующим действием тиольного реагента (восстановленной формой глутатиона) (см.ниже). Получение формы А и дикарбоксиамццометил-молибдоптерина указывает на наличие в составе Мосо-содержащего белка 6 -замещенного молибдоптерина, структурно идентичного кофактору ксантиноксидазы.

Таким образом, образование полученных стабильных производных Moco указывает на мононуклеотидную структуру

V

х в о

0) в о ч и о в

20 -

15 -

10 -

30

20

10

60

а ад

I

5

I 20

0 •

200 300 400 500 Длина волны, нм

н

И*

С=с—снон-э э

сн, СИ, «,N0 СНН|

о о

-СНгОРС^

10

15

20

25

Время удержания, мин

Рис. 6. Профиль элюции с колонки С-18 (НР1.С) дикарбок-сиамидометилмолибдоптерина (сатМРТ) полученного при обработке йодацетамидом препаратов: кофактора Мосо-содержащего белка (А), кофактора ксантиноксидазы (В). Спектр поглощения сагаМРТ (С).

5

хофактора в ссмс»:>\ юро\ t i е. ч к :u>' шлейном Moco отсутствует какои-дибо дополнительный нуклеотидный остаток, характерный для г.екотопыу тчг^" ойплиужгнчн-*

з прскарио!ичс«-кич unnininvny ''лслозатс-^iio. М»/сч> ь растениях структурно сходен с кофактором, выделенным из источников животного происхождения. На основании этого можно заключить, что присутствие динуклеотидных форм молиодохофактора, вероятно, свойственно только для лрокариотических организмов.

Условия выделения кофактора из Мосо-содержащего белка. Активность Moco обнаруживалась только при прогревании фрнкчий очищенного белка, что указывает на его прочную связь с кофактором. Молибдокофактор, аккумулирующийся на л ом белке, после прогревания не восстанавливал актишшеп. ai юни ¡pa треду ктазы экстракта мутанта триба N. emssa nit-l через диллшную мембрану. Это вероятно связано с тем, что после температуркою воздействия Moco остается связанным с белком, в форме способной встраиваться в активный центр апонитратредуктазы мутанта N. emssa nit-l

По литературным данным известно, что ввиду высокой окислясмости Moco в аэробных условиях, поддержание коф актора в активном состоянии возможно только в присутствии протекторов, в частности, восстановленной формы (лутатиона, аскорбата натрия, дитионита и т. д. (Alikulov, Schiemann, 1985; Аликулов и др., 1987; Львов, 1989; Hinton, Dean, 1990). Защиттшя функция протекторов обусловлена присутствием лабильных функциональных SH-групп в структуре Moco, участвующих в координации H07ia молибдена в активном центре. В нашем случае было обнаружено, что восстановленная форма глутатиона является эффективным протектором в кс центрациях 1-3 мМ. Использование в качестве восстановителя аскорбата натрия (1-3 мМ) менее эффективно предохраняло кофактор от инактивации (рис. 7). Для поддержания кофактора в активном состоянии необходимо внесение восстановленного глутатиона в реакционную среду непосредственно перед прогреванием Мосо-содержащего белка. Глутатион предохраняет кофактор от инактивации только в период температурного воздействия, необходимого для денатурации белка и последующего выделения кофактора.

При прогревании Мосо-содержащего белка одновременно с присутствием глутатиона необходимо добавление ЭДТА (0,1-1мМ). В

литературе имеются данные, что хслатирующие лигавды, в частности ЭДТА, образующие устойчивые комплексы с металлами (Си, Со, Fe, Мп) препятствуют окислению птериновых соединений молекулярным кислородом (Миронов, Вольпин, 1980). Очевидно, ЭДТА выполняет стабилизирующую роль при температурном воздействии, т.к. ее добавление сразу после прогревания Мосо-содержащего белка не приводило к сборке функционально активной нитратредуктазы мутанта гриба N. crassa nit-1. По-видимому, при температурном воздействии происходит окисление птеринового кольца Moco, и ЭДТА участвует в замедлении этого процесса. Возможно также, что механизм протекторного действия ЭДТА связан с хелированием ионов меди, способных к образованию комплекса с тетрагидроптерином (Burgmayer, 1993), препятствуя включению Мо в кофактор. Если принять во внимание такой механизм стабилизации • Moco при помощи ЭДТА, вероятно, следует считать, что выделенный нами кофактор находится в полностью восстановленной тетрагидроформе, т.к дигидроформы птерина не способны к взаимодействию с двухвалентными ионами меди. Интересно отметить обнаружение высокой активности Moco в исходном экстракте без добавления ЭДТА и гдутатиона, что может свидетельствовать о наличии протекторов или других механизмов стабилизации кофактора в семенах гороха.

Активность Moco, выявляемая в реакции комплементации, лимитируется количеством кофактора, способного встраиваться в дефектную нитратредуктазу мутанта N. crassa nit-1. Следовательно, при использовании прогревания, как метода выделения Moco, необходима оптимизация температурных условий для максимального выделения кофактора, сохраняющего каталитическую активность. Было установлено, что оптимальная температура прогревания Мосо-содержащего белка, после которой происходит максимальная реконструкция апонитратредуктазы мутанта N. crassa nit-1, составляет 95 °С в течение 90 сек . Это позволяет на порядок усилить чувствительность метода определения активного Moco по сравнению с ранее предложенной температурной обработкой при 70 °С (90 сек) (Швецов и др., 1992).

Изучение термостабильности Moco показало,что в течение 5 мин в присутствии протекторов происходит полное окисление, и как следствие, инактивация кофактора под воздействием температуры 95 °С . По всей видимости, это связано с окислением восстановленного

I 2 3 4 5 6

Рис. 7.Влияние протекторов на активность кофактора при прогревании (95°С) Мосо-содержащнго белка. I - аскорбат натрия (1-3 мМ); 2 -восстановленный глутатион (1-3 мМ); 3 - ЭДТА (0,1-1 мМ); 4 -восстановленный глутатион (1-3 мМ) и ЭДТА (0,1-1 ыМ, 5 -аскорбат натрия (1-3 мМ) и ЭДТА (0,1-1 мМ); б - аскорбат натрия(1-3 мМ), восстаноиленный глутатион (1-3 мМ) и ЭДТА (0,1-1 мМ).

?нс. 8. Влияние экзогенного вольфрама на активность кофактора

Мосо-содержащего белка т у и го: 1 - Ыа2Мо04 (2х10"2м); 2 - ЫагМоО,* (2х10'2М) и Na2W04 (2х10-2м>; 3 - Ыа2\У04 (2х10"2м).

глутатиона, выполняющего протекторную функцию, т.к. предварительное прогревание данного восстановителя при той же температуре приводило к утрате его стабилизирующей способности.

Отсутствие молибдена в кофакторе покоящихся семян гороха.

Молибдокофактор аккумулируется на белке и семенах гороха в виде безмолибденового предшественника, т.к только при экзогенном добавлении молибдата натрия (10'2 М) происходит реконструкция (в ходе реакции комплементации апобелка и источника Moco) функционально активной нитратредуктазы мутанта N. crassa nit-i. Необходимость внесения молибдена обнаружена также на уровне грубого экстракта, т. е., без добавления молибдата активность Moco не обнаруживалась п семенах гороха. Экзогенный молибден был необходимым условием при определении активного Moco, как при термообработке, так и без ее применения. Известно, что в биосинтез Moco вовлечены продукты экспрессии генов ответственных за поступление Мо в клетку и его включение в кофактор (Hinton, Dean, 1990). При увеличении концентрации молибдена в среде- большая часть Moco синтезируется в виде активного кофактора, а при низких концентрациях значительная часть Moco находится в виде безмолибденового предшественника (Amy, Miller, 1983). С другой стороны, имеются данные, свидетельствующие о том, что семена бобокых растений аккумулируют большое количество молибдена (Львов, 1989; Калакуцкий, 1992), и вероятно, отсутствие Мо в структуре Moco в покоящихся семенах не является следствием его недостатка. Нами обнаружено появление активности кофактора без добавления экзогенного молибдата при прорастании семян гороха. Можно предположить, что в семенах гороха молибдокофактор накапливается в безмолибденолой форме и включение молибдена в Moco осуществляется в процессе прорастания семени. Отсутствие молибдена в кофакторе покоящихся семян гороха и его дальнейшее включение при прорастании могут играть определенную роль, как механлзм регулируемой активации Moco in vivo.

Отсутствие Мо позволяет использовать кофактор для изучения возможности включения в его структуру других металлов, способных к образованию координационных связей с птерином. При внесении эквимолярных количеств вольфрамата (Na2W04) и молибдата (NajMoWO,}), активность Moco снижается вдвое, что свидетельствует

0 конкурентном встраивании вольфрама в активный центр кофактора (рис. 8).

Свойства Мосо-содержащего белка и кофактора из семян гороха суммировании в таблице 2.

Две формы накопления молибдокофактора в семенах гороха.

Наряду с кофактором, прочно связанным с белком, для определения которого необходима температурная обработка препарата, в семенах гороха аккумулируется Moco, способный восстанавливать активность апонитратредуктазы мутанта N. crassa nit-

1 без предварительной термообработки (Швецов, 1992). Возникает вопрос, является ли Moco, для комплементации которого не требуется предварительная обработка экстракта - "свободным", т.е низкомолекулярным или же он ассоциирован с белком. Нами обнаружено, что в семенах присутствует кофактор, непрочно ассоциированный с белком, так как гельфильтрация экстракта из муки гороха на колонке с Sephadex G-25 уравновешенной буфером содержащим восстановленный глутатион и ЭДТА, показала наличие активности Moco в белковых фракциях как при прогреве, так и без него. Это указывает на присутствие в семенах горох Мосо-содержащего белка, свободно отдающего кофактор без тепловой обработки. Количество Moco, определяемое без прогревания, было значительно меньше, чем в варианте с тепловой обработкой фракций элюата (рис. 9). Низкомолекулярный активный Moco не обнаруживается во фракциях после гельфильтрации. Попытки оценить молекулярную массу Мосо-содержащего белка, активность кофактора которого определяется без прогревания препарата методом гель-хроматографии на колонке с Sephacryl S-200, не увенчались успехом, вероятно, виду высокой лабильности кофактора в аэробных условиях.

Известно, что структурная функция молибдокофактора заключается в ассоциации субъединиц Mo-фермента (Nason et al., 1970; Аликулов и др., 1980). На наш взгляд, необходимость прогревания фракций Мосо-содержащих белков для отделения кофактора, по всей видимости, основана на изменении четвертичной структуры белка, в результате которой кофактор способен встраиваться в апонитратредуктазу. Таким образом, можно предположить, что понятие прочности связи кофактора с белком носит условный характер. По-видимому, существование различий

Таблица 2. Свойства Мосо-содержащего белка и молибдокофактора из семян гороха

Молекулярная масса 300 кДа

Субъединичный состав гомоднмер 150 кДа

Изоэлектрическая точка, pl 5,0

Простетнческие группы Moco

Содержание Moco на моль белка 1,96

Спектр флуоресценции (посте окисления) 440 нм (эмиссия) 360 нм (экстинкция)

Активности «олн бдоферментов растений (нитратредуктаза и ксантиндегидрогеназа) не обнаружены

Выделение активного Moco прогревание (95 °С), 90 сек

Стабилизация Moco в течение прогревания Восстановленный глутатион, •ЭДТА

Содержание молибдена Мо отсутствует ("empty Moco")

Номера фракция

Рис. 9.Гельхроматография экстракта из муки гороха на колонке Sephadex G-25: 1 - поглощение при 206 нм; 2 • активность Moco после прогревания; 3 - активность Moco без применения процедуры прогревания.

оптимальных условий выделения кофактора из Мосо-содержащих белков зависит от "прочности" связи между субъединицами олпгомсра. Нами обнаружено, что денатурированный Мосо-содсржащий беЛок способен к обратимой димеризации. Так, после гельфильтрации прогретого препарата Мосо-содержащего белка для определения активности кофактора« требуется его повторная температурная обработка. Наличие активности у Мосо-содержащих белков без применения денатурирующих условий скорее всего обусловлено их мономерным составом. В пользу данного предположения свидетельствуют также относительно небольшие молекулярные массы (30-60 кДа) обнаруженных Мосо-сояержащих белков бактерий, водорослей и растений, восстанавливающих активность нитратредуктазы мутанта N. crassa nit-1 без создания денатурирующих условий (Amy, Rajagopalan, 1979; Бурнханов, 1981; Alikuiov, Schicmaníi, 1985; Bagchi et al., 1987; Aguilar et al., 1991).

Присутствие в семенах гороха птерин-содержащего белка, не обладающего активностью Moco.

При гельфильтрации экстракта муки из семян гороха на колонке HW-55 foyopearl во фракциях, элюируемых с .¡елками молекулярной массы около 300 кДа, обнаруживается ярко-голубая флюоресценция с максимумом при 418 им и длинной волны возбуждения 360 нм. Поскольку максимальная флюоресценция регистрировалась во фракциях Мосо-содержащего белка, Первоначально она служила тестом на выявление фракций содержащих активный кофактор (рис. 10). Следует отметить, что характерная дня окисленного Moco флюоресцеиия с максимумом при 445 нм обнаруживалась во фракциях, не содержащих активный кофактор. Известно, что молибдокофактор не обладает в Восстановленном состоянии флюоресценцией, поэтому исследование флюоресцирующего вещества представляло определенный интерес. На основе характеристик спектров флюоресценции было выдвинуто предположение о ее птериновой природе. Интересно отметить, что флюоресценция с максимумом при 418 нм обнаруживается на уровне исходного экстракта из семян гороха и может использоваться в качестве теста на определение присутствия птерин-содержащего белка в различных образцах.

При ионообменной хроматографии экстракта из семян ЮрОЧй на колонке DEAE Toyopearl 650 М с использованием градиента

<0 43 56 Номера фрышха

Рис. 10. Гельхроматография экстракта из муки гороха на колонке HW-55 Toyopearl: 1 - поглощение при 206 нм; 2 - флюоресценция 418 нм; 3 - активность Moco.

50 100 150 200 250 300

®ракции, ил

Рис. 11. Ионообменная хроматография экстракта из семян гороха на колонке DEAE Toyopearl 650М. 1-поглощение при 206 нм, 2-активностъ Moco, 3 - флюоресценция 418 нм.

хлористого калия было обнаружено, чго флюоресцирующий белок элюируегся при концентрациях соли 0,2 М. б то время как, Мосо-содержаший белок элюнровался при меньших кпниентраннтх КС! (0,15 М"). Таким обратом, удавалось разделить укатанные белки, имеющие в своем составе птериноный компонент, (рис. 11). Тем самым было показано, что флюоресценция в белковых фракциях не является следствием окисления молиблокофактора, входящего в состав Мосо-содержашего белка.

Для дальнейшей очистки белка с флюоресценцией 418 нм были применены гельфильтрация на колонке HW-55 Toyopearl и гидрофобная хроматография на Phenyl-Sepharose 4В. В некоторых случаях применялась методика инкубации с активированной тиолсефарозой Птерин-солержащий белок не сорбируется на тиолсефарозе, в vo время как Мосо-содержаший белок удерживается на этом носи геле (см. выше). Белок после указанны ч стадии очистки не содержал активного молибдокофактора, выявляемого но реакции комплементации с дефектной по Moco шпратредукг.иой мутанга N. crassa nit-l, сохраняя при эхом интенсивную флюоресцентно

Изменение спектра флюоресценции итерин-еодеужашего елка под действием температуры. Отделение птерина и исследование продукта его окисления. При попытках отделения птерина от белка при помощи температурной денатурации 90-100 °С было обнаружено изменение спектра и интенсивности его флюоресценции. Температурное воздействие на белок в кювете флюориметра при 70 °С приводит к постепенному смещению флюоресценции от 418 нм до 445 нм и одновременному уменьшению ее интенсивности (рис. 12,А) Следует отметить, что флюоресценция с максимумом 440-450 нм характерна для пгеринов (Joimson et al, !984). Измс нение длины .волны флюоресценции, возможно, объясняется окислительными процессами, происходящими при температурном воздействии. Это подтверждается тем, что при добавлении восстановленного глутатиона к препарату выделенного белка, при прогревании в тех же условиях на начальном этапе наблюдается замедление смещения флюоресценции в длинноволновую область (рис. 12,В). Следовательно, глутатион может участвовать в поддержании восстановленное™ птерина при окислении кислородом воздуха. рероятно стабилизация" птеринового кольца восстаиоалвнным глутатионом имеет также место при стандартной процедуре

Мй 418

Рис. 12. Динамика изменения флюоресценции белка под действием температуры ' (70 С). А ' - без добавления восстановленного глутатиона; при добавлении 3 мМ восстановленного глутатиона. 1- 5 мин: 2-10 мин: 3-15 мин; 4 - 20 мин: 5 - 25 мин: 6 - 30 мин: 7 - 35 мин: 8 * 40 мин: 9 • 45 мин.

определения активности кофактора в Мосо-содержаших белках при температурной обработке исследуемых препаратов.

С целью выделения и дальнейшего исследования птерина, прогретый препарат белка подвергался гельфильтрации на колонке с Sephadex G-25. Было обнаружено, что птерин ассоциирован с белком достаточно прочно, так как основная флюоресценция после гельфильтрации регистрировалась в белковых фракциях, и лишь, незначительный пик птеринов элюировался в низкомолекулярных фракциях. При прогревании препарата в присутствии детергента додецил-сульфата натрия в концентрации 2% происходит более полное отделение птерина от белка. Можно предположить, что механизм взаимодействия птерина аналогичен связи молибдокофактора с белком и носит характер гидрофобного взаимодействия (Львов, 1989). Как указавалось ранее, необходимость создания денатурирующих условий для выделения молибдоптерина, вероятно, обусловлена олигомерным составом белков. По-видимому, выделенный птерин также локализован между субъединицами белка и его отделение требует достаточно "жесткой" денатурации белкового препарата. Высокая молекулярная масса (около 300 кДа) также указывает на то, что выделенный птерин-содержащий бел^к имеет олигомерную структуру.'

Как указывалость ранее, для изучения структуры молибдоптерина, применяется методика получения • стабильных продуктов окисления Moco (Rajagopalan, 1993). Отделенный от белка птерин при окислении йодом (1г /К1) и дальнейшей обработке щелочным перманганатом калия, частично окисляется в птерин-б-карбоновую кислоту. Это свидетельствует о наличии в исследуемом птерине боковой цепи в 6 положении. Известно, что структурной основой молибдокофактора также является 6 замещенный птерин (Johnson et al., 1993). Следовательно, можно предположить возможность существования метаболической связи между выделенным птерином и активным Moco в семенах гороха. Детальное изучение структуры обнаруженного птерина, что является целью наших дальнейших исследований, вероятно позволит выяснить биохимическую роль его накопления в семенах гороха.

ВЫВОДЫ

1. Преобладающая часть молибдокофактора в семенах гороха обнаруживается в составе белка - гомодимера с молекулярной массой 300 кДа. Выделенный белок содержит две молекулы молибдокофактора, он не обладает активностями Мо-ферментов растений (нитратредуктазы и ксантиндепшрогеназы) и не имеет в своем составе флавинов и Fe/S кластеров. с

2. Молибдокофактор в составе Moco-содержал (его белка обнаруживается в виде безмолибденового предшественника (молибдоптерина). В металлсвязывающий участок кофактора может конкурентно встраиваться вольфрам не приводя к сборке функционально активного Moco.

3. На основе изучения продуктов модификации и окисления Moco из семян гороха показано, что молибдокофактор растений структурно идентичен мононуклеотидному кофактору выделенному из источников животного происхождения.

4. Наряду с протекторной функцией восстановленной формы глутатиона, впервые показана необходимость стабилизации кофактора при помощи ЭДТА при прогревании препарата Мосо-содержащего белка.

5. Обнаружено присутствие в семенах гороха птерин-содержащего белка молекулярной массы 300 кДа не обладающего активностью молибдокофактора. На основе изучения свойств окисленного производного выделенного птерина, предполагается возможность его метаболической связи с молибдокофактором.

О М

Список работ, опубликованных по теме диссертации

--- 1. Кильди беков. Н. А.,___Омаров Р. Т., Швецов А. А.,

Львов Н. П. Белок, содержащий молибдокофактор из семян гороха Pisum sativum L.: выделение п очистка. — Биохимия, 1995, т. 60, вып. 9f с. 1411 — 1418.

2.' О м а р о в Р. Т., К и л ь д и б е к о в Н. А., Швецов А. А., Львов Н. П. Свойства молибденового кофактора из семян гороха.— Прикладная биохимия и микробиологии, 1995, т. 31, № б, с. 604—608.

3. Kildibekov N. A., Omarov R. Т., Antipov A. N., Shvetsov A. A., L'vov N. P. A molybdocofactor-containing protein from pea (Pisum sativum L.), seeds: purification and properties.—Abstr. of Fourth International Symposium on Inorganic Nitrogen Assimilation, Seeheim, Darmstadt, Germany, 1995, p. 65.

4. Shvetsov A. A., Kildibekov N. A., Omarov R. Т., Kalakoutskii K. L-, L'vov. N. P. Genetically determined molybdenum cofactor level in legume seeds, physiological'and biochemical signi-" iicance. — Abstr. of Fourth International Symposium on Inorganic Nitrogen Assimilation, Seeheim, Darmstadt, Germany, 1995, p. 117.

5. Кильди беков H. А., Омаров P. Т., M и р о и о в Е. А., Львов Н. П. Структура молибдокофактора из семян гороха Pisum sativum L. — Биохимия, 1996 (в печати).

Объем 1 '/г' п. л.

Тираж 100

Заказ 988

Типография издательства Московской с.-х. академии им. К- А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44