Клонирование симбиотических генов гороха посевного (Pisum sativum L.) с использованием синтении геномов бобовых растений

Жуков, Владимир Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клонирование симбиотических генов гороха посевного (Pisum sativum L.) с использованием синтении геномов бобовых растений
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование симбиотических генов гороха посевного (Pisum sativum L.) с использованием синтении геномов бобовых растений"

На правах рукописи

ЖУКОВ Владимир Александрович

КЛОНИРОВАНИЕ СИМБИОТИЧЕ СКИХ ГЕНОВ ГОРОХА ПОСЕВНОГО (Pisum sativum L.) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕНИИ ГЕНОМОВ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ

специальность: 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологаческих наук

з о О'.-.Т 2"°

Санкт-Петербург 2008

003451395

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии РАСХН, Санкт-Петербург-Пушкин.

Научный руководитель:

профессор, доктор биологических наук Тихонович Игорь Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Миронова Людмила Николаевна

кандидат биологических наук Андронов Евгений Евгеньевич

Ведущее учреждение:

Московский Государственный Университет, Биологический факультет

Защита состоится (6с\г2008 г. в часов на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

/Г

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан

ск-

2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Формирование симбиотических взаимоотношений между организмами является одной из закономерностей эволюционного развития биологических систем и основой качественных изменений в живом мире, обеспечивающих успешную эволюцию различных групп организмов. Так, широкое аспространение по земному шару высших растений в значительной мере обусловлено их способностью к образованию взаимовыгодных симбиозов с микроорганизмами, которые улучшают минеральное питание растений, а также обеспечивают адаптации к различным стрессам и защиту от патогенов и фитофагов.

Среди растительно-микробных симбиозов одним из наиболее экологически значимых является симбиоз между бобовыми растениями (сем. Fabaceae) и клубеньковыми бактериями, или ризобиями (сем. Rhizobiaceae) (Provorov et al., 002; Oldroyd, Downie, 2008). Благодаря биологической фиксации азота, существляемой в специализированных органах растения - симбиотических губеньках, колонизированных ризобиями, - атмосферный азот переводится в орму, доступную в дальнейшем для всех живых организмов. Важность бобовых астений как сельскохозяйственных культур, выращиваемых в различных шматических поясах, определяет научно-практическое значение бобово-изобиального симбиоза (Crews, Peoples, 2004).

Бобовые растения, ввиду своей высокой и разносторонней симбиотической ктивности, в наибольшей степени отвечают требованиям современной концепции [аптивного земледелия (Celik et al., 2004). В связи с этим ведется научная работа, аправленная на разработку методов создания наиболее эффективных растительно-икробных систем бобовых, при функционировании которых максимально еализуется потенциал продуктивности растения (Штарк и др. 2006; Борисов и др., 007). Особую актуальность поэтому приобретает изучение систем узнавания артнерами друг друга. Уникальной особенностью каждого конкретного штамма изобий является спектр выделяемых им сигнальных молекул, называемых Nod-акгорами (Geurts et al., 1997). Специфичность взаимодействия растения с пределенными штаммами ризобий определяется наличием у растения ысокоспецифичных рецепторов, распознающих структуру Nod-факторов (Limpens t al., 2003; Radutoiu et al., 2003, 2007; Oldroyd, Downie, 2008). Исследования >ироды этих рецепторов, и, в более общем смысле, генетического контроля пецифичности взаимодействия с микроорганизмами со стороны растения, позволят ести научно-обоснованную селекцию наиболее эффективных пар микро- и акросимбионта. Кроме того, изучение последующих стадий развития бобово-изобиального симбиоза (проникновения бактерий в ткани корня и формирование ового органа растения - азотфиксирующего клубенька) позволяет выявить сновные механизмы, лежащие в основе развития и функционирования астительно-микробных систем, что также обогащает фундаментальные основы иологии и генетики развития высших растений.

Изучение генетического контроля развития симбиоза со стороны растения 1утем мутационного анализа позволило выявить у 10 видов бобовых растений более

100 генов, ответственных за протекание различных стадий становления симбиоза. К настоящему времени более десятка таких симбиотических генов клонировано и охарактеризовано в отношении их детальной роли в симбиозе (см. обзоры Борисов и др., 2007; Oldroyd, Downee, 2008). Данные исследования проводятся в основном на модельных бобовых растениях лядвенце японском (Lotus japonicus (Regel.) К. Larsen) и диплоидной люцерне (Medicago truncatula Gaertn.), однако сходная организация (синтения) геномов бобовых растений позволяет использовать накопленные знания и для клонирования симбиотических генов сельскохозяйственно-ценных бобовых, в частности, гороха посевного (Pisum sativum L.) (Kalo et al., 2004; Zhu et al., 2005). Клонирование симбиотических генов гороха необходимо для изучения особенностей его симбиотической системы и понимания механизмов координированного генетического контроля развития симбиоза путем взаимодействия геномов макро- и микросимбионта. Изучение генетического полиморфизма симбиотических генов гороха также облегчит селекцию сортов гороха с высокой симбиотической эффективностью, в полной мере соответствующих концепции адаптивного земледелия, и потому востребованных в России и на мировом рынке.

Таким образом, диссертационная работа соответствует самым современным направлениям мировых научных исследований в области биологии развития и генетики симбиозов, и поставленные цели и задачи представляют передний край мировой биологической науки.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось продолжение анализа генетической системы гороха посевного (Р. sativum), обеспечивающей специфичность взаимодействия с клубеньковыми бактериями и контролирующей процесс образования азотфиксирующих клубеньков. В связи с этим, конкретными задачами работы являлись:

1. клонирование генов гороха (Pisum sativum L.), гомологичных симбиотическому гену LjNJrl лядвенца японского (Lotus japonicus (Regel.) Larsen), и изучение их роли в формировании бобово-ризобиального симбиоза.

2. изучение полиморфизма генов гороха, кодирующих компоненты рецепторного комплекса, воспринимающего сигнальные молекулы ризобий.

3. отработка методики создания ген-специфичных молекулярных маркеров для генетической локализации симбиотических генов гороха.

4. генетическая локализация симбиотических генов гороха PsCoch, PsCrt и PsSym27 на генетической карте гороха с целью их последующего клонирования.

5. поиск генов диплоидной люцерны (Medicago truncatula Gaertn.), гомологичных PsCoch, PsCrt и PsSym27, на основании результатов локализации этих генов в геноме гороха.

Здесь и далее первые буквы в названии генов и их белковых продуктов обозначают название вида растения: Lj - Lotus japonicus (Regel.) Larsen; Mt - Medicago truncatula Gaertn.; Ps - Pisum sativum L.

Научная новизна работы. Впервые с использованием синтении геномов ладвенца японского (Lotus japonicus (Regel.) Larsen) и гороха посевного (Pisum ativum L.) были клонированы два симбиотических гена гороха PsSym37 и PsKl, кодирующие рецепторные киназы, содержащие LysM-домены и предположительно связывающие бактериальный Nod-фактор - важнейшую сигнальную молекулу, синтезируемую ризобиями. Анализ экспрессии этих генов в различных тканях астения методом «ПЦР в реальном времени» подтвердил симбиотическую роль генов PsSym37 и PsKl. Впервые была продемонстрирована роль гена PsSym37 в определении специфичности взаимодействия растения с ризобиями: была показана важность аминокислотной замены в последовательности PsSym37 для восприятия структуры Nod-факторов. Впервые была изучена изменчивость генов PsSym37 и sKl у серии линий гороха с различным проявлением специфичности к структуре Nod-факторов, и на основании результатов впервые было выдвинуто предположение том, что продукт гена PsKl способен выступать в качестве рецептора, овышающего точность определения структуры Nod-факшра.

Также были разработаны уникальные ген-специфичные молекулярные маркеры ш сопоставления генетических карт гороха и диплоидной люцерны с спользованием генотипов коллекции гороха лаборатории генетики растительно-икробных взаимодействий ГНУ ВНИИСХМ. С применением этих маркеров первые было осуществлено точное генетическое картирование генов гороха PsCrt, sCoch и PsSym27, ответственных за регуляцию бобово-ризобиального симбиоза. На сновании данных картирования впервые был клонирован ген PsCoch, емонстрирующий высокую гомологию с генами ВОР1 и ВОР2 Arabidopsis thaliana L.) Heynh., кодирующими регуляторные белки, контролирующие активность еристем растения.

Практическая ценность.. Полученные в диссертационной работе данные, видетельствующие о вовлечении в сигнальные взаимодействия между бактериями растениями нескольких рецепторных киназ, повышающих специфичность заимного узнавания партнеров, а также об участии белковых регуляторов истемных реакций растения в формировании клубеньковых меристем, будут спользованы для построения моделей взаимодействия генов (в том числе генов икроорганизмов и растения) в ходе развития симбиозов. Обнаруженные механизмы щтроля специфичности взаимодействия макро- и микросимбионта могут ^пользоваться в работе по научно-обоснованному созданию высокоэффективных астительно-микробных систем в сельском хозяйстве для максимального спользования потенциала продуктивности сельскохозяйственных растений, гработанная методика клонирования ключевых генов гороха на основе сходства номов гороха и модельных бобовых может быть использована для эффективного юнирования генов сельскохозяйственно-значимых видов бобовых растений, тветственных за сельскохозяйственно-ценные признаки, например, архитектонику тебля или старение симбиотических органов растения. Результаты работы спользуются в материалах курса лекций "Симбиогенетика", читаемого на биолого-

почвенном факультете СПбГУ, и в реализации селекционной программы «Симбиоз», осуществляемой в ГНУ ВНИИЗБК (Орел, Россия) под руководством проф. Т.С. Наумкиной.

Выполнение работы поддержано грантами CRDF (ST-012-0), РФФИ (04-0448457, 06-04-01856, 07-04-13566, 07-04-01171, 07-04-01558), NWO 047.018.001, грантом ЕС FOOD-CT-2004-506223, Госконтрактами Миннауки (02.445.11.7492, 02.434.11.7122, 02.512.11.2143, 02.512.11.2149, 02.512.11.2182, НШ-1103.2003.04, НШ-9644.2006.4, НШ-5399.2008) и персональным грантом Travelling Fellowship (The Company of Biologists).

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 9-ой, 10-ой и 11-ой Международных школах-конференциях молодых ученых «БИОЛОГИЯ -НАУКА XXI ВЕКА» (Пущино, Россия, 2005, 2006, 2007 гг.); четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007 г.); I Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз-Россия 2008» и Школе - конференции «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, Россия, 2008); Symposium and postgraduate course «Agro-biotechnology focused on root-microbe systems» (Kaunas, Lithuania, 2005; St.Petersburg, Russia, 2007); 7th. European Nitrogen Fixation Conference (Aarhus, Denmark, 2006); 15th. International Congress on Nitrogen Fixation (Cape Town, South Africa, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и более 10 тезисов докладов на российских и международных научных конференциях.

Объем и структура диссертации.. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 266 источников. Работа изложена на 180 страницах и содержит 40 рисунков и 16 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал.. В работе использованы различные формы и линии гороха посевного Pisum sativum L. из коллекций Всероссийского Научно-Исследовательского Института Сельскохозяйственной Микробиологии (СПб), Всероссийского Института Растениеводства им. Н.И.Вавилова (СПб), Т. ЛяРю (Воусе Thompson Institute, USA), К. Ингвилда (RISO National Laboratory, Denmark) и И. Якобсена (Wageningen Agricultural University, The Netherlands).

Штаммы клубеньковых бактерий. Для инокуляции гороха были использованы штаммы ШигоЫит к^иттоаагит Ы'. уШае из коллекции ГНУ

ВНИИСХМ: СIAMl026 (Safronova, Novikova, 1996); Al (Четкова, Тихонович, 1986); VF39gusAconst. (любезно предоставлен проф. У. Прифер, Oeklologie des Bodens, Aachen, Germany) (Voroshilova et al., 2001).

Условия вегетации растений. Растения были выращены в вермикулите или песке (в зависимости от целей экспериментов) в вегетационных домиках, где освещенность и температура определялись погодными условиями на широте Санкт-Петербурга; в условиях теплицы с освещенностью 15-20 тыс. люкс, день/ночь - 16/8

4 и температурой воздуха 20-25°С днем и 15-20°С ночью или в фитотронах Heraeus Voetch (Германия) в заданных климатических условиях: день/ночь - 16/8 ч, температура 21°С днем, 19°С ночью, относительная влажность воздуха 75%, освещенность 490 цмоль/м2с (38 тыс. люкс).

Световая микроскопия. В экспериментах по изучению ответа растения на присутствие ризобий в ризосфере материал собирали на 28 день после инокуляции. Анализировали 5 растений на вариант, по 2 см отрезков пяти боковых корней от каждого растения. Корни растений, инокулированных штаммами CIAM1026 или Al окрашивали 0,01% метиленовым синим в течение 3-4 минут и анализировали скручивания и деформации корневых волосков и образование инфекционных нитей (не менее 20 полей зрения на отрезок корня при увеличении 300Х, приблизительно 500 полей зрения на генотип). Корни растений, инокулированных штаммом VF39gusA, выдерживали в течение ночи в окрашивающем растворе на ß-глюкуронидазу (50 мМ натрий-фосфатный буфер, pH 7.0, содержащий 0.1% тритон,

5 мМ K3[Fe(CN)6], 5 мМ K4[Fe(CN)¿] и 0.02% 5-бромо-4-хлоро-3-индол ил-ß-D-глюкуроновую кислоту) (Voroshilova et al., 2001), и затем анализировали.

Молекуляпно-биологические процедуры^ Выделение ДНК из растительного материала осуществляли с использованием буфера СТАВ по модифицированному протоколу Rogers, Bendich, 1985; выделение РНК из различных тканей растения осуществляли с использованием буфера TRIZOL по протоколу производителя реагента TRIZOL (Life Technologies). ПЦР проводили в термоциклерах iCycler™ (Bio-Rad, США) и Personal Cycler (Biometra, Германия); ПЦР в реальном времени - в термоциклере Light Cycler (Roche Molecular Biochemicals). Секвенирование проводили на автоматических приборах ABI PRISM 310 Genetic Analyzer и CEQ™ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, США) по протоколу производителей.

Компьютерная обработка полученных результатов.. Для обработки полученных данных были использованы следующие компьютерные программы:

• для обработки статистических данных при анализе количества формируемых клубеньков и эффективности клубенькообразования у различных линий гороха применяли программу SigmaStat 2.0.

• генетическое картирование и построение генетических карт проводили с помощью программы MapL98 (Prof. Yasuo Ukai, Biometrics Laboratory, Graduate School of Agricultural Life Science, the University of Tokyo).

• данные по секвенированию нуклеотидных последовательностей обрабатывали с помощью программного обеспечения автоматического секвенатора CEQ™ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, США). В программе Multalin (-http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/multalin.html.)npoBOJiMH множественное выравнивание пуклеотидных последовательностей.

• трансляцию нуклеотидных последовательностей в предполагаемые белковые осуществляли в программе EMBOSStranseq (Mp://\vww.ebi.ac.uk/emboss/transeq/-). Выравнивание и сравнение белковых последовательностей проводили в программе ClustalW f.www.ebi.ac.uk/clu.stalw/_~).

• праймеры, необходимые для секвенирования и косегрегационного анализа, были сконструированы при помощи компьютерной программы Oligonucleotyde Properties Calculator ("_httpi/Avww.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html).

• подбор необходимых рестриктаз для детекции полиморфизма фрагментов осуществляли в программе dCAPS Finder 2.0 (.http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps. html.).

• нормализацию уровня экспрессии генов по трем независимым генам сравнения проводили с использованием программы QBASE v. 1.3.5 fj)ttp://medgen.ugent.be/qbase/.).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Клонирование генов гороха, ответственных за рецепцию бактериального Nod-фактора, и изучение их роли в бобово-ризобиальном симбиозе

Клонирование генов гороха, гомологичных гену LjNfrl лядвенца японского

С использованием в качестве зонда первичной последовательности гена лядвенца японского LjNfrl, кодирующего рецептор-подобную киназу, предположительно связывающую бактериальный Nod-фактор, в библиотеке кДНК P.sativum были выявлены 2 гена гороха посевного, гомологичные LjNfrl. На основании результатов генетического картирования гена гороха PsSym37 в регионе, синтенном региону локализации LjNfrl, было предположено, что один из клонированных гомологов LjNfrl является геном PsSym37. Для проверки этого предположения было проведено секвенирование геномных копий обоих генов-кандидатов у двух мутантных линий по гену Pssym37 (RisNod4 и К24) и исходных линий «дикого типа» Finale и Rondo. В последовательности одного из генов-кандидатов у мутантных линий были найдены точковые замены, приводящие к замене аминокислоты в 1-ом LysM-домене у линии RisNod4 и к формированию укороченного киназного домена вследствие появления преждевременного стоп-кодона у линии К24 (см. рис. 1).

PsSym37

PsK1

634 34 5 1 53 203 00 54 1 52 82 142 2S1

Рисунок 1. Экзон-интронная структура генов PsSym37 и PsKl.

Размер экзонов (прямоугольники) и интронов (пунктирная линия) представлены для линий Finale и Rondo. Серыми прямоугольниками выделены LysM-домены. Показаны точковые мутации в гене PsSym3 7 для линий RisNod4 и К24.

Дополнительным доказательством тому, что указанный ген, несущий мутации, является геном PsSym37, стал результат анализа наследования молекулярных маркеров, созданных на основе генов-кандидатов. В пределах выборки из 235 растений F2 была продемонстрирована косегрегация обоих маркеров и мутантного фенотипа sym37. Таким образом, было доказано, что ген PsSym37 гомологичен LjNfrl. Ген, паралогичный PsSym37 и локализующийся от него на расстоянии, по нашим оценкам, не превышающем 200 т.п.н., был назван PsKl.

Предполагаемые белковые продукты PsSym37 и PsKl представляют собой рецептор-подобные Ser/Thr киназы, гомологичные друг другу на уровне 86% для сорта Finale. Киназные домены белков PsSym37 и PsKl демонстрируют 95% гомологию, в то время как предсказанные экстраклеточные домены характеризуются лишь 75% сходством. Оба предсказанных белка также гомологичны белковым продуктам генов LjNfrl лядвенца японского (78% для PsKl и 76% для PsSym37) и MtLyk3 диплоидной люцерны (84% для обоих), также кодирующих рецептор-подобные киназы, предположительно, связывающие молекулы Nod-фактора. Консерватизм последовательности и структуры генов PsSym37 и PsKl позволяет считать их наиболее вероятными кандидатами на роль ортологов LjNfrl \\MtLyk3.

Анализ экспрессии генов PsSymS7 и PsKJ.

Для подтверждения сим биотической роли PsSvm37, а также выяснения вршожноЙ роли PsKl, была проанализирована экспресса'Л генов P.sXvjh57 и PsKl в различных тканях растений гороха сорта Finale. Было показано, что экспрессия PsSym37 и PsKl достоверно выше в зрелых клубеньках по сравнению с уровнем их экспрессии в корнях ней но ку лиров энных растений (рис. 2Л). Этот факт свидетельствует о важности повышения уровня экспрессии этих генов в азотфиксирутощих клубеньках для нормального функционирования симбиоза, и позволяет отнести нее эти гены к группе симбиотических генов. Повышенный уровень экспрессии гена PsKl. отмеченный в стеблях, может свидетельствовать о некоторой иной роли PsKl, помимо симбиотичесхой, в развитии растения.

\ Kl R 1 Syru.î? Syfti/Û ■ Sjrfn П A 16 12 i » Ï btmiï ■ il', в

с ? 4 1 J 1 [ 1

- ° 2 (tu* ■

roots uodttlc* 1 cuves «tenu Itowcfi JKHIS DHICIlliHCl!

Рисунок 2. Экспрессия генов Рз8ут37 и РхЮ в различных тканях растения (А) и зависимость их экспрессии от инокуляции ризобиями (В).

Также было проведено исследование динамики экспрессии генов ¡\sSym37 и РзК1 в корнях растений гороха в течение первой недели после инокуляции. Было выяснено, что инокуляция ризобиями вызывает быструю индукцию транскрипции гена Рэ$утЗ% а также других симбиотических г енов гороха РзвутЮ и Рз8ут35. в то время как уровень экспрессии гена РхК1 в течение недели после инокуляции оставался неизменным (рис.2В) Этот факт свидетельствует о необходимости наличия высокого уровня 'фанскриптов генов РзЗут 10, РэЭутЗЗ, РьЗутЗ 7 при нормальном развитии симбиоза, а также о незначительном вкладе уровня экспрессии Р.чК1 на ранних стадиях развития Симбиоза, подразумевающем возможную рель гена РяК1 на более поздних стадиях.

Сравнительный анализ мутантов по гену РззутЗ 7 и «афганских к разновидностей гороха посевного.

11екоторые разновидности гороха, в частности, происходящие из Афганистана, способны образовывать клубеньки лишь со штаммами ризобиЙ, экскретиру ющими

молекулы Кос!-фактора с дополнительной ацетильной группировкой на нереду цирующем конце диИОхито-олигосахаридиой цепочки (ОешТ* С1 а1., 1997) (рис.З). Таким образом, ^ти разновидности (т.н. «афганские горохи») демонстрируют более высокую специфичность но отношению к ми крое им он опту, чел г европейские сорта и разновидности гороха, способные к симбиозу с« штаммами рнзобий, продуцирующими N0(1-факторы как сложной, так и упрошенной структуры* Локус, отвечающий за проявление специфичности по отношению к структуре Ькх1-фЕпп'ора. получил у гороха название РйЗутЗ (Клшк е1 а!-, 1995). Предположительно, ген Р$$ут2 кодирует рецептор ну к> молекулу, распознающую структуру Ыоё-фактора.

Рисунок Л, Структура одного из Ыоё-факторов, проецируемых штаммами НИЬоЫит к^итто.чап1ш Ь\. 1 Чаае. способными образовыва й, симбиоз с афганскими линиями гороха посевного (из А1Ьгсс1н е1 а!.. 1999). Выделена ацетильная группа на переду пирующем конце липохнтоолигосахаридного остова, необходимая для распознавания данного 1 ипа Мой-фактора «афганскими горохами».

Позиция PsSym2 на генетической карте гороха соответствует локализации гена PsSym37 и синтенна локализации LjNfrl и M/LYK3 у лядвенца и люцерны. Тем не менее, результаты теста на аллелизм демонстрируют, что PsSynû и PsSym37 не являются аллелями одного локуса. Для сравнения роли генов PsSym2 ti PsSym37 и определении специфичности взаимодействия макро- и микросимбионта- был проведен детальный фенотипический анализ мутантов но гену PssytnWI и «афганских» разновидностей гороха посевного при инокуляции ризобиями. продуцирующими Nod-факторы различной структуры.

При взаимодействии со штаммом CIA.M 1026. экскретирующим Nod-фактор упрощенной структуру линии RisNod4 {зутЗТ), К24 (,%уш37), а также 2150 (symZ* -аллель, характерная для «афганских Горохов»), 6559 Çsym2A), 1887 (symJ ') н 31/6 (sym2A} блокировали проникновение ризобий в корневой волосок (фенотип представлен на рис. 413, С), в отличие от линий «дикого типа» Finale и Rondo (фенотип представлен на рис. 4А). При взаимодействии со штаммом AI, продуцирующим Nod-фактор с ацетильным «декором», линия К24 (Р.чнушЗТ). несущая преждевременный етоп-кодон в рамке считывания PsSym37, была неспособна к формированию клубеньков (рис. 4D); все линии, несущие

«афганскую» аллель Р$8ут2'1. демонстрировали нормальное клубенькообразовзшщ линия К1зГчЫ4, несущая аминокислотную замену в рецепторной части предполагаемого белка Рз8ут37, также формировала клубеньки, нормальные по внешнему виду, котя и в меньшем количестве. Таким образом, симбштическая роль Р$8ут37 - распознавание структуры сигнальной молекулы ризобий - сходна с предполагаемой ролью Рх$ут2.

Рисунок 4. Проникновение риЗОбий в корневой волосок растений гороха сорта Finale (Л) и блок развития инфекции у линий К24 (JPssym37)(B) и RrsNod4 (Pssym37){Q) (масштабная линейка 0,1 мм): D - число клубеньков, образуемое растениями линий Finale, Rondo (обе - «дикий тип»), К24, RisNod.4 (обе - Pssy/пЗ7) и 2! 50 (PsSym2 ) при инокуляции штаммами С1АМ1026 (белые столбики) и Л1 (серые столбики). Показана стандартная ошибка, указано число растений на вариант.

Супрессия мутантного фенотипа макросимбионта за счет изменения структуры Nod-фактора доказывает, что продукт гена PsSym37 принимает участие в распознавании бактериальной сигнальной молекулы и таким образом взаимодействует с ризобиальным геном nocCt, определяющим ацетидирование Nod-фактора. Данный факт является одним из первых примеров системы «ген-на-ген» в муту а лист и чес ком симбиозе с известными первичными последовательностями обоих взаимодействующих генов.

Анализ полиморфизма генов PsSym37 и PsKl у серии европейских сортов и линий гороха и «афганских » разновидностей гороха посевного.

Исходя из результатов теста на аллелизм и фенотишгческото сходства, ген PsSym37 является функциональным аналогом PsSym2. Для проверки предположения о том, к« определяет пи первичная последовательность гомологичного гена Ps К ! характерный фенотип «афганских Горохов», было осуществлено секвенирование

вариабельной части генов PsSym37 и PsKl (соответствующей рецепторным доменам предполагаемых белковых продуктов данных генов) с последующей трансляцией in silico у серии европейских генотипов гороха и «афганских» разновидностей гороха.

Согласно ожиданиям, анализ аминокислотной последовательности предполагаемого белка, соответствующего гену PsSym37, не выявил замен в рецепторной части, специфических только для «афганских Горохов». В свою очередь, аминокислотная последовательность рецепторной части белка, соответствующего гену PsKl, является уникальной для «афганских» линий гороха, в то время как все остальные аллели, описанные в данной работе для 8 европейских генотипов гороха, несут на уровне белка аминокислотные замены. Таким образом, ген PsKl является наиболее вероятным кандидатом на роль гена PsSym2, однако для проверки этой гипотезы необходимы эксперименты по воссозданию системы рецепции «декорированного» Nod-фактора в других видах бобовых посредством генетической трансформации.

Регион генома М. truncatula, синтенный региону локализации PsSym37 и PsKl, содержит кластер из нескольких гомологичных генов, кодирующих рецепторные киназы (Limpens et al., 2003). Предполагается, что в данном регионе происходят процессы формирования новых вариантов рецепторных молекул, например, вследствие незаконной рекомбинации (Michelmore, Meyers, 1998). Исходя из высокого сходства организации геномов гороха и люцерны, помимо PsSym37u PsKl в соответствующем регионе, вероятно, находится серия рецепторных киназ, которые, благодаря сходству последовательностей, могут быть способны замещать друг друга в рецепторном комплексе, воспринимающем структуру Nod-фактора. Адаптивная роль функционирования LysM-содержащих киназ в качестве сменных субъединиц рецепторного комплекса при восприятии сигнальной молекулы микросимбионта может быть объяснена необходимостью взаимодействия со штаммами ризобий, для которых характерна высокая вариабельность, в том числе по структуре продуцируемых Nod-факторов.

Генетическое картирование симбиотических генов гороха посевного с целью их последующего клонирования

Создание ген-специфичных ДНК-маркеров для генетического картирования симбиотических генов гороха

Секвенирование геномов модельных бобовых Medicago truncatula и Lotus japonicus близко к завершению (avvvw.medicago. org /genome. и .www.kazusa.or. jp/lotus/.. соответственно). Для секвенирования и клонирования генов гороха посевного на основании известных последовательностей генов модельных бобовых можно использовать следующий путь: 1. точное картирование гена, несущего мутацию, относительно ген-специфичных маркеров; 2. определение позиций генов, гомологичных ген-специфичным маркерами, на физической карте генома модельного бобового; 3. сопоставление построенной генетической карты с физической картой генома модельного бобового; 4. выбор генов-кандидатов в регионе генома модельного бобового, синтенном региону локализации мутации в

геноме гороха; 5. анализ совместного наследования мутантного фенотипа и генов-кандидатов; 6. выявление гена, не демонстрирующего рекомбинационных событий с мутантным фенотипом; 7. секвенирование геномной копии данного гена у мутантных линий и соответствующих линий «дикого типа». Таким образом, для использования этого подхода необходимо точное картирование мутации в геноме гороха относительно ген-специфичных ДНК-маркеров. Наибольшее количество симбиотических генов гороха локализовано в V группе сцепления, поэтому в работе была создана серия ген-специфичных маркеров для V группы сцепления гороха.

За основу для маркеров были взяты последовательности генов гороха с подтвержденной локализацией в V группе сцепления, а также последовательности генов диплоидной люцерны, локализованных в 7 хромосоме, синтенной V группе сцепления гороха. Были подобраны праймеры к консервативным участкам экзонов выбранных генов, осуществлена ПЦР на ДНК родительских линий с последующим секвенированием продуктов, найдены сайты полиморфизма и подобраны эндонуклеазы рестрикции, позволяющие различать аллели продуктов ПЦР за счет наличия или отсутствия сайта узнавания данной эндонуклеазы в точке полиморфизма (методика CAPS - от англ. Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (Konieczny, Ausubel, 1993)). Праймеры для амплификации ген-специфичных маркеров были созданы к последовательностям 18 генов, из которых 16 оказалось возможно амплифицировать, и 10 показали полиморфизм, пригодный для детектирования на родительских линиях, использованных в работе. Таким образом, в ходе работы была отработана методика создания маркеров для локализации генов гороха посевного с целью их последующего клонирования на основании синтении геномов бобовых растений.

Генетическая локализация симбиотических генов Vгруппы сцепления

С использованием созданных ген-специфичных ДНК-маркеров было осуществлено генетическое картирование симбиотических генов гороха PsCrt, PsCoch и PsSym27 в V группе сцепления гороха. Анализ был проведен на картирующих популяциях поколения F2 и F3 от скрещивания мутантных линий с генетическими линиями, нормальными по клубенькообразованию. Генетические карты были построены для каждого скрещивания, и затем объединены в одну карту V группы сцепления гороха (рис.5). Для каждого маркера в геноме диплоидной люцерны были найдены гомологичные гены (сервис http:/Avww.medicago.org/genome/cvit blast.php.), и тем самым было проведено сопоставление полученной карты V группы сцепления гороха с физической картой синтенной 7 хромосомы люцерны, а также участка 1 хромосомы (рис. 5). Также были определены позиции генов, гомологичных «генам интереса» PsCrt, PsCoch и PsSym27, в геноме M.truncaula.

Клонирование симбиотического гена гороха PsCoch

В регионе вероятной локализации гомолога PsCoch в геноме M.truncatula была картирована вставка транспозона 7л/7, использованного для создания коллекции симбиотических мутантов диплоидной люцерны (Tadege et al., 2008). Фенотип

линии noot, несущей вставку, аналогичен таковому у мутантов Pscoch (рост корня на кончике клубенька) (Dr. P.Ratet, личное сообщение). Секвенирование гена, нарушенного вставкой, у люцерны, показало его гомологию с генами Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. BOP1 и BOP2. Секвенирование гомологичного гена у линий гороха, мутантных по гену Pscoch, выявило точковые замены, приводящие к появлению преждевременных стоп-кодонов в рамке считывания. Этот результат, в совокупности с данными о косегрегации мутантного фенотипа и молекулярного маркера, представляющего участок гена PsCoch, доказывает, что, клонированный ген, гомологичный ВОР1 и ВОР2, является симбиотическим геном гороха PsCoch. По предварительным данным, продукт гена PsCoch является белковым регулятором активности клубеньковых меристем растения.

Рисунок 5. Генетическая карта V группы сцепления гороха (оригинальные данные) и соответствующих частей геномаМ. 1гипсаш1а (лууу\у.medicago.org/genome.) А, В, С - генетические карты, построенные при локализации генов РлО/, РзСосИ и на соответствующих выборках; Б - участок 1 хромосомы Млптса1и1а\ Е -объединенная карта V группы сцепления гороха; Р - участок 7 хромосомы МЛгипсаш1а.

Черными овалами обозначены позиции предполагаемых ортологов генов гороха РзСп, Р.чСоск и РвБут27 в геноме диплоидной люцерны.

ВЫВОДЫ;

1. Гомология последовательностей генов культурных и модельных бобовых позволяет проводить клонирование симбиотических генов гороха посевного на основе их сходства с известными генами лядвенца японского и диплоидной люцерны.

2. Гены гороха Р$8ут37 и РзК1, клонированные на основе их гомологии с геном лядвенца японского, являются симбиотическими генами. Они кодируют Т-уэМ-содержащие рецепторные киназы, при этом Рв8ут37 участвует в распознавании бактериального №>с1-фактора.

3. На основании анализа полиморфизма генов рецепторных киназ РяБутЮ, РзБут37 и РяК1 показано, что первичная последовательность РвБутЮ и Ря8ут37 не определяет фенотип «афганских» генетических линий гороха, а аллель РзК1 «афганских» линий имеет уникальную нуклеотидную последовательность.

4. Для картирования симбиотических генов гороха можно использовать ген-специфичные молекулярные маркеры, созданные на основе последовательностей генов диплоидной люцерны. Генетическая карта V группы сцепления гороха, построенная с использованием таких ген-специфичных маркеров, включает в себя 10 маркеров и 3 гена, контролирующих развитие симбиотических признаков гороха: РхСгГ, ЛСосА \iPsSym27.

5. Сходство построенной генетической карты V группы сцепления с физической картой синтенной 7 хромосомы диплоидной люцерны позволило определить позиции предполагаемых ортологов генов РьСп, РяСосИ и Рз8ут27 в геноме люцерны.

6. На основании результатов точного картирования симбиотического гена гороха РбСосИ в геноме диплоидной люцерны был выявлен гомологичный ему ген МШосЛ. Клонирование гена гороха РяСосЬ показало, что он кодирует транскрипционный фактор, предположительно регулирующий развитие симбиотических систем.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации

Статьи:

1. Zhukov V.A., Kuznetsova E.V., Ovchinnikova E.S., Rychagova T.S., Titov V.S., Pinaev A.G., Borisov A. Y., Moffet M., Domoney C„ Ellis T.H.N., Ratet P., Weeden N.. and Tikhonovich I. (2007) Gene-based markers of pea linkage group V for mapping genes related to symbioses//Pisum Genetics'. 39: 19-25.

2. Борисов А.Ю., Васильчиков А.Г., Ворошилова В.А., Данилова Т.Н., Жернаков А.И., Жуков В.А., Королева Т.А., Кузнецова Е.В., Мадсен JL, Мофетт М., Неманкин Т.А., Павлова З.Б., Петрова Н.Э., Пинаев А.Г., Радутоиу С., Розов С.М., Соловов И.И., Топунов А.Ф., Уиден Н.Ф., Цыганов В.Е., Штарк О.Ю., Стоугаард Й., Наумкина Т.С., Тихонович И.А. (2007) Регуляторные гены гороха посевного (Pisum sativum L.), контролирующие развитие азотфиксирующих клубеньков и арбускулярной микоризы: фундаментальные и прикладные аспекты. // Прикладная биохимия и микробиология. 43(3): 265-271.

Тезисы конференций:

1. Жуков В.А., Борисов А.Ю., Кузнецова Е.В., и др. Клонирование симбиотических генов гороха посевного: научные подходы, результаты и перспективы // БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 11-я Бущинская международная школа-конференция молодых ученых (Россия, Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 года). Сборник тезисов. С. 81-82.

2. Rychagova T.S., Zhukov V.A., Borisov A.Yu., Tikhonovich I.A. The role of pea (Pisum sativum L.) symbiotic genes in Nod-factor perception И Abstract book of Postgraduate Course "Agro-Biotechnology focused on Root-Microbe Systems (AB-RMS)", St.Petersburg, Russia, June 25 - July 02,2007. P. 32.

3. Жуков B.A., Борисов А.Ю., Ворошилова B.A., и др. Клонирование симбиотических генов у хозяйственно значимых бобовых с использованием синтении геномов //Тезисы докладов на четвертом Московском международном конгрессе «Биотехно-логия: состояние и перспективы развития»,12-16 марта 2007 г., Москва, Россия.С.192.

4. Zhukov V.A., Borisov A.Y., Kuznetsova E.V., et al. Genome synteny of pea and model legumes: from mutations through genetic mapping to the genes // Abstract book of 15й1. International Congress on Nitrogen Fixation,21-26 Jan.2007,Cape Town,South Africa.P.62.

5. Zhukov V.A., Borisov A.Y., Madsen L.H., et al. Genome synteny of pea and model legumes is the key approach for sequencing of symbiotic genes of pea (Pisum sativum L.) // Abstract book of 7. . European Nitrogen Fixation Conference, 22-26 July 2006, Aarhus, Denmark. P. 24.

6. Borisov A. Y., Voroshilova V.A., Shtark O.Y., Zhukov V.A., et al. Genetic system of pea (Pisum sativum. L.) controlling development of symbiotic compartments of nitrogen-fixing nodules and arbuscular mycorrhiza: fundamentals and applications // Abstract book of 3rd international conference on Legume genomics and genetics, 9-13 April 2006, Brisbane, Australia. P. 55.

7. Zhukov V.A., Tsyganov V.E., Pinaev A.G., et al. Genetic mapping of pea (Pisum sativum L.) symbiotic genes involved in the development of the N-Fixing symbiotic system. // Abstract book of Symposium and postgraduate course agro-biotechnology focused on root-microbe systems. Kaunas, May 20-27, 2005, Lithuania. P. 103.

Подписано в печать 03.102008г.. Формат 60x84/16. Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии РПФ «ЛАРС-принт» Печать ризографическая. Заказ №274. Усл. печ. л. 1,0. тираж 100 экз.

РПФ «ЛАРС-принт» Адрес: 198095, Санкт-Петербург, ул. Розенштейна, д.21. Тел.: (812) 363 12 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жуков, Владимир Александрович

Введение.

Глава 1. Генетический контроль развития бобово-ризобиального симбиоза со стороны растения (обзор литературы).

1.1. Основные стадии развития бобово-ризобиальпого симбиоза.

1.1.1. Взаимовыгодные симбиозы, образуемые бобовыми растениями.

1.1.2. Специфичность азотфиксирующего симбиоза бобовых растений.

1.1.3. Инициация взаимодействия при АФС.

1.1.3.1. «Молекулярный диалог» между макро- и микросимбионтом.

1.1.3.2. Nod-фактор, важнейшая сигнальная молекула АФС.

1.1.3.3. Комплексность сигнальных систем АФС.'

1.1.4. Ранние этапы взаимодействия при АФС.

1.1.4.1. Физиологические изменения в растении.

1.1.4.2. Рост инфекционной нити - эпидермальная программа развития.

1.1.4.3. Развитие клубенькового примордия - кортикальная программа развития.

1.1.5. Поздние стадии развития АФС.

1.1.5.1. Эпдоцитоз бактерий из ИН.

1.1.5.2. Образование симбиосом.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование симбиотических генов гороха посевного (Pisum sativum L.) с использованием синтении геномов бобовых растений"

Формирование симбиотических взаимоотношений между организмами является одной из закономерностей эволюционного развития биологических систем. Образование взаимовыгодных, или мутуалистических, симбиозов часто является основой качественных изменений в живом мире и причиной успешной эволюции тех или иных групп организмов, при этом симбиозы могут быть образованы представителями различных падцарств живого мира — Eukaryota и Prokaiyota. В частности, выход растений на сушу в значительной степени был обусловлен их приобретенной способностью формировать симбиозы с микроорганизмами, в первую очередь, с грибами арбускулярной микоризы.

Полезные симбиотические микроорганизмы играют важную роль в жизни растений, обеспечивая их минеральное питание, защиту от патогенов и фитофагов, а также адаптации к различным стрессам. Наибольшее экологическое значение для растений имеют эндосимбионты - как азотфиксаторы (эубактерии, актиномицеты, цианобактерии), позволяющие хозяевам выживать при дефиците связанного азота, так и грибы арбускулярной микоризы, обеспечивающие ассимиляцию питательных (в основном фосфор- и азотсодержащих) веществ из почвы (Проворов и др., 2002). По той же причине эти симбиозы имеют важное сельскохозяйственное, а также научно-практическое значение.

Арбускулярную микоризу образуют более 90% наземных растений, в то время как способностью к формированию азотфиксирующих симбиозов обладают лишь немногие растения. В настоящее время наиболее интенсивно изучается процесс биологической азотфиксации, осуществляемый в ходе симбиотических взаимоотношений между бобовыми растениями (сем. Fabaceae) и клубеньковыми бактериями, или ризобиями (сем. Rhizobiaceae). Актуальность исследований и ценность получаемых результатов в области изучения данного типа азотфиксирующего симбиоза, объясняется рядом причин.

Во-первых, необходимость исследования бобово-ризобиального симбиоза определяется важностью бобовых растений как сельскохозяйственных культур, выращиваемых в различных климатических поясах (htlp://www.grainlegumes.com\ Современная концепция сельского хозяйства претерпевает изменение от «интенсивного» (от англ. «intensive agriculture»), основанного на применении больших количеств дорогостоящих минеральных удобрений (в т.ч. азотных), к «адаптивному» (англ. «sustainable agriculture»), с максимальным использованием биологического потенциала почв, с сохранением и даже повышением их плодородия (Celik et al., 2004). В наибольшей степени требованиям концепции адаптивного земледелия отвечают бобовые растения, способные к максимальному использованию потенциала полезной почвенной микрофлоры ввиду своей высокой и разносторонней симбиотической активности. В связи с этим ведутся активные исследования процесса формирования взаимовыгодных симбиозов бобовыми растениями, направленные на создание комплементарных пар симбионтов, при взаимодействии которых наиболее эффективно осуществляется биологическая азотфиксация (Тихонович н др., 2005). Следует огметить, что при подборе пар симбионтов необходимо учитывать и способность растения с наибольшей выгодой для себя взаимодействовать также с грибами арбускулярной микоризы (отдел Glomeromycota) и рост-стимулирующими ризосферными бактериями, так как только в этом случае будут обеспечиваться оптимальные условия для растений и достигаться наивысшая урожайность (Борисов и др., 2007).

Во-вторых, бобово-ризобиальный симбиоз, развившийся в эволюции на основе более древнего арбускулярно-микоризного симбиоза, является уникальной моделью для изучения взаимодействия между растениями и микроорганизмами. В результате координированной экспрессии генов обоих симбионтов в ходе этого взаимодействия инициируется программа развития нового органа растения - азотфиксирующего клубенька. В ходе длительной совместной эволюции бобовых растений и клубеньковых бактерий возникла система сигнального взаимодействия между симбионтами, обеспечивающая^ строго специфическое узнавание партнеров и ведущая к их генетической интеграции и формированию «надорганизма», в котором интегрируются биохимические процессы симбионтов, определяются специализированные варианты дифференцировки органов, тканей, клеток растения, а также самих бактерий. Кроме того, модифицируются защитные реакции растения, в результате чего становится возможным их более тесное взаимодействие с бактериями, при сохранении контроля над микросимбионтом со стороны растения (Тихонович, Проворов, 1998). Все эти эволюционные изменения позволяют симбиотической системе функционировать подобно единому организму. Таким образом, исследование бобово-ризобиального симбиоза позволяет выявить основные механизмы, лежащие в основе развития и функционирования растительно-микробных систем, а также дает возможность изучить фундаментальные основы биологии и генетики развития высших растений.

Одним из основных направлений исследования симбиотических взаимоотношений является изучение генетического контроля этого процесса со стороны обоих партнеров, призванное раскрыть молекулярно-гснетические механизмы взаимодействия бобовых растений с клубеньковыми бактериями, а также облегчить селекцию симбиотически эффективных сортов бобовых растений и комплементарных штаммов ризобий. До недавнего времени наибольшие успехи были достигнуты в идентификации симбиотических генов клубеньковых бактерий (Fisher, Long, 1992; Fisher, 1994; Denarie, Debelle, 1996). Более 20-ти лет назад были инициированы исследования с применением методов экспериментального мутагенеза бобовых растений, и в результате этих исследований было идентифицировано около 100 генов у более чем 10-ти видов бобовых растений (см. обзор Borisov et al., 2007). К настоящему времени более десятка симбиотических генов бобовых растений клонировано и охарактеризовано, в основном на модельных бобовых растениях лядвенце японском (Lotus japonicus (Regel.) К. Larsen) и диплоидной люцерне (Medicago truncatula Gaertn.).

Среди сельскохозяйственно-ценных бобовых наиболее изученным генетически является горох посевной (Pisum sativum L.). Известно более сорока симбиотических генов гороха, по которым получено более ста независимых мутантов (Borisov et al., 2007) с нарушениями процесса развития симбиоза на различных стадиях. Для ряда мутантов был проведен детальный фепотипический анализ, и некоторые симбиотические гены гороха были клонированы на основании их гомологии с генами модельных бобовых, имеющих сходный мутаптиый фенотип. Клонирование симбиотических генов гороха необходимо для изучения различных стадий симбиотических взаимоотношений, в том числе для исследований взаимодействий между геномами макро- и микросимбионтов, которые позволят расширить наше понимание механизмов координированного генетического контроля данного процесса со стороны каждого партнера. Изучение генов гороха, являющегося сельскохозяйственно-ценной культурой, облегчит также селекцию сортов гороха с высокой симбиотической эффективностью, в полной мере соответствующих концепции адаптивного земледелия и потому востребованных в России и на мировом рынке.

Таким образом, целью диссертационного исследования являлось продолжение анализа генетической системы гороха посевного (P. sativum), обеспечивающей специфичность взаимодействия с клубеньковыми бактериями и контролирующей процесс образования азотфиксирующих клубеньков, а также отработка методики клонирования симбиотических генов гороха на основании сходства (синтении) геномов бобовых растений.

Конкретными задачами работы являлись:

1. клонирование генов гороха, гомологичных симбиотическому гену Ljhfrl лядвенца японского (L. japonicus), и изучение их роли в формировании бобово-ризобиального симбиоза.

5. поиск генов диплоидной люцерны, гомологичных PsCoch, PsCrt и PsSym27, на основании результатов локализации этих генов в геноме гороха.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Жуков, Владимир Александрович

Выводы

2. Гены гороха PsSym37 и PsKl, клонированные на основе их гомологии с геном Ljhfrl лядвенца японского, являются симбиотическими генами. Они кодируют LysM-содержащие рецеиторные киназы, при этом PsSym37 участвует в распознавании бактериального Nod-фактора.

3. На основании анализа полиморфизма генов рецепторных киназ PsSymLO, PsSym37 и PsKl показано, что первичная последовательность PsSymlO и PsSym37 не определяет фенотип «афганских» генетических линий гороха, а аллель PsKl «афганских» линий имеет уникальную нуклеотидную последовательность.

5. Сходство построенной генетической карты V группы сцепления с физической картой синтенной 7 хромосомы диплоидной люцерны позволило определить позиции предполагаемых ортологов генов PsCrt, PsCoch и PsSym27 в геноме люцерны.

6. На основании результатов точного картирования симбиотического гена гороха PsCoch в геноме диплоидной люцерны был выявлен гомологичный ему ген MtNoot. Клонирование гена гороха PsCoch показало, что он кодирует транскрипционный фактор, предположительно регулирующий развитие симбиотических систем.

Заключение.

Одним из основных подходов, используемых при изучении генетического контроля развития взаимовыгодных симбиозов со стороны растения, является мутационный анализ. Применение данной методологии за последние два десятка лет позволило выявить у 10 видов бобовых растений более 100 генов, ответственных за протекание различных стадий становления симбиоза. К настоящему времени более десятка таких симбиотических генов клонировано и охарактеризовано в отношении их молекулярной функции в сложном каскаде передачи сигналов, управляющих развитием мутуалистических симбиозов (Борисов и др., 2007; Oldroyd, Downee, 2008). Наибольшие успехи в данном направлении исследований достигнуты с использованием модельных бобовых растений: лядвенца японского (Lotus japonicus (Regel.) К. Larsen) и диплоидной люцерны (Medicago truncatula Gaertn.), наиболее удобных для использования всего спектра молекулярно-генетических подходов, направленных на многоуровневую характеристику симбиотических генов. Тем не менее, в исследованиях, ведущихся на модельных бобовых, широкомасштабно используются научные данные и биологический материал, полученные в ходе многолетних исследований на сельскохозяйственно-значимых бобовых культурах (Tr,folium spp., Pisum sativum L. , Medicago sativa L., Glycine max (L.) Merr., Cicer arietinum L., Vigna radiata (L.) R. Wilcz.; Phaseolus vulgaris L. и др.) с целью создания сравнительной симбиогенетики бобовых растений.

Одной из целей изучения симбиотических систем бобовых растений является создание новых сортов сельскохозяйственно-значимых культур, способных к наиболее эффективному использованию потенциала полезной почвенной микрофлоры, а также приемов создания высокоэффективных растительно-микробных систем в полевых условиях современного сельского хозяйства. Таким образом, очевидна необходимость работы не только с модельными бобовыми, но и с культурными бобовыми растениями.

Одной из важнейших культур среди бобовых растений России является горох посевной (Pisum sativum L.), однако молекулярно-генетические исследования на данном объекте представляются весьма трудоемкими. Методы молекулярной генетики, такие как генетическая трансформация и позиционное клонирование (необходимые для изучения функции генов на биохимическом и субклеточном молекулярном уровне), очень сложны для применения на горохе ввиду его низкой способности к трансформации и большому размеру генома (4300 МЬ/1С, или 4.3* 109 п.н., согласно http://data.kew.org/cvaluesA. т.е. наличия большого количества гетерохроматина. Тем не менее, из-за своей сельскохозяйственной значимости горох остается важным объектом для исследования различных аспектов повышения его урожайности и энергетической и питательной ценности семян. Наличие генетически детерминированных признаков устойчивости к патогенам, архитектоники стебля и симбиотической эффективности вызывает необходимость изучения генетических основ, определяющих фенотип ценных сортов и перспективных для дальнейшей селекции линий с учетом потенциала мутуалистических симбиозов.

Ключом» к изучению генетических механизмов, лежащих в основе сельскохозяйственно-значимых признаков гороха, является эксплуатация сходной организации (синтении) геномов бобовых растений. Данный подход, называемый также «сравнительной генетикой», позволяет использовать знания, накопленные при работе с модельными бобовыми, для изучения симбиотических генов сельскохозяйственно-ценных бобовых, в частности, гороха посевного (.Pisum sativum L.) (Kalo et al., 2004; Zhu et al., 2005). Клонирование симбиотических генов гороха необходимо для изучения особенностей его симбиотической системы и понимания механизмов координированного генетического контроля развития симбиоза путем взаимодействия геномов макро- и микросимбионта. Изучение генетического полиморфизма симбиотических генов гороха также способно облегчить селекцию сортов гороха с высокой симбиотической эффективностью, в полной мере соответствующих концепции адаптивного земледелия, и потому востребованных в России и на мировом рынке. Таким образом, изучение генетического контроля развития взаимовыгодных симбиозов, являющееся целью диссертационной работы, находится в одном ряду с исследованиями, представляющими передний край мировой биологической науки, и задачи работы соответствуют самым современным направлениям мировых научных исследований в области биологии развития и генетики симбиозов.

В ходе данной работы было проведено исследование генетических механизмов, управляющих развитием азотфиксирующего симбиоза между бобовыми растениями и клубеньковыми бактериями, в частности, была изучена система рецепции центральной сигнальной молекулы — Nod-фактора, определяющего исключительную специфичность данного типа симбиоза. Сигнальные взаимодействия между макро- и микросимбионтом являются ключевой стадией развития симбиоза, так как благодаря ним только симбиотические штаммы ризобий способны проникнуть в ткани корня растения. В случае симбиоза, образуемого горохом посевным, рецепция Nod-фактора протекает в два этапа. Вначале пикомолярные концентрации Nod-фактора, выделяемого бактериями, индуцируют скручивания корневых волосков и локализацию бактериальных клеток в углублении, образуемом скручиванием. После этого более высокие концентрации Nod-фактора, выделяемого локально этими клетками, приводят к активации роста инфекционной нити и полному проникновению бактерий в клетки корня. Адаптивное значение такого двойного контроля, возможно, заключается в противодействии высокой изменчивости микроорганизмов, в том числе патогенных, потенциально способных мимикрировать под симбиотические формы.

Молекулы Nod-фактора воспринимаются растительными рецепторами, вероятно, объединенными в сложный рецепторный комплекс. В ходе настоящей работы на основании гомологии с геном Ljhfrl лядвенца японского были клонированы два гена гороха, кодирующие рецепторные киназы - PsSym37 и PsKl. Симбиоз-специфичная экспрессия этих генов, а также высокая гомология с генами рецепторов к Nod-фактору Ljhfrl лядвенца японского и MtLYK3 диплоидной люцерны, свидетельствуют о потенциальной способности продуктов этих генов к рецепции липохитоолигосахаридов. Анализ взаимодействия мутантов гороха по гену Pssym37 с различными штаммами клубеньковых бактерий показал, что проявление мутации в Pssym37, приводящей к аминокислотной замене в рецепторном домене PsSym37, может быть супрессироваио штаммом ризобий А1, продуцирующим модифицированный Nod-фактор более сложной структуры. Этот результат подтверждает роль PsSym37 в рецепции Nod-фактора и указывает на важность аминокислотной структуры рецепторной части белка для корректного распознавания бактериальной сигнальной молекулы. Высокая гомология генов PsSym37 и PsKl, а также повышенный уровень их экспрессии в клубеньках, позволяет предположить, что ген PsKl, возможно, также участвует в восприятии Nod-фактора в качестве сменной субъединицы рецепторного комплекса. Общее число генов, кодирующих компоненты этого комплекса у гороха, не установлено, однако настоящее исследование демонстрирует возможность включения в комплекс не менее трех рецепторных кииаз, из которых две могут быть взаимозаменяемы.

Результаты анализа полиморфизма генов PsSym37 и PsKl у серии линий гороха позволяют предположи ть, что последовательность гена PsKl может быть ответственна за проявление фенотипа «афганских» генетических линий гороха, образующими симбиоз лишь со штаммами ризобий, продуцирующими Nod-фактор с дополнительной ацетильной группировкой на нередуцирующем конце олигосахаридного остова. Сравнительный анализ последовательностей генов PsSym37 и PsKl у «европейских» и «афганских» форм гороха позволяет спекулировать, что разнообразие рецепторных киназ, воспринимающих структуру сигнальных молекул микроорганизмов, должно компенсировать высокую вариабельность и изменчивость патогенных микроорганизмов, способных мимикрировать под симбиотические формы. Аминокислотная последовательность белкового продукта гена PsKl несет замены, отличающие «европейские» линии от «афганских», что является отражением эволюции генотипов данных линий. В центре происхождения вида P. sativum L. (Ближний восток, в частности, Афганистан), в связи с разнообразием микроорганизмов, генотипы гороха характеризуются повышенными требованиями к структуре Nod-фактора (определяемыми, согласно предположению, уникальной последовательностью PsKl). По мере распространения в Европу, требования к структуре Nod-фактора снизились в связи с невысоким разнообразием клубеньковых бактерий (и в последовательности PsKl появились мутации, не нарушающие, однако, структуру рамки считывания). Следует отметить также, что регион локализации генов PsSym37 и PsKl, очевидно, содержит другие гомологичные гены, продукты которых также потенциально способны к связыванию липохито-олигосахаридных молекул и определению структуры Nod-фактора. Поэтому возможным продолжением работы должно стать клонирование остальных генов данного региона, кодирующих рецепторные киназы, внесение этих генов в геном модельных объектов (M.truncatula или L.japonicus) посредством генетической трансформации и эксперименты по изучению восприятия Nod-факторов гороха различной структуры трансгенными растениями.

Распознавание микросимбионта является ключевым этапом развития симбиотических взаимоотношений, однако эффективность симбиоза, безусловно, определяется влиянием большого числа других генетических факторов. Для изучения этого влияния в настоящем исследовании было проведено генетическое картирование и клонирование симбиотических генов гороха посевного с использованием ген-специфичных молекулярных маркеров. Использование ген-специфичных маркеров позволяет сопоставлять генетические карты гороха и физические карты модельных бобовых с целью применения достижений их генетики и геномики для клонирования симбиотических генов гороха. Поэтому в рамках исследования был разработан набор таких маркеров для сопоставления генетических карт гороха и диплоидной люцерны, и с их помощью были картированы гены гороха PsCrt, PsCoch и PsSym27, ответственные за регуляцию симбиоза. На основании данных картирования для гена PsCoch в геноме люцерны был найден наиболее вероятный кандидат-гомолог MtNoot, и по гомологии с этим геном был клонирован геп PsCoch. Анализ его первичной последовательности выявил гомологию с генами ВОР1 и ВОР2 A.thaliana, которые являются белковыми регуляторами активности меристем растения. Мутантный фенотип — рост корня на кончике клубенька у мутантов по гену Pscoch ~ соответствует предполагаемой роли PsCoch в регуляции активности меристем клубенька. Результаты работы демонстрируют возможность клонирования генов гороха на основании синтении геномов бобовых и открывают перспективы изучения специфичности симбиозов на популяционном уровне, а также исследования роли регуляторных генов в развития симбиозов.

Полученные в диссертационной работе данные, свидетельствующие о вовлечении в сигнальные взаимодействия между бактериями и растениями нескольких рецепторных киназ, повышающих специфичность взаимного узнавания, а также об участии белковых регуляторов растения при формировании клубеньковых меристем, могут быть использованы для построения моделей взаимодействия генов (в том числе взаимодействия генов микроорганизмов и растения) в ходе развития симбиозов. Обнаруженные механизмы контроля специфичности взаимодействия макро- и микросимбионта могут использоваться в работе по научно-обоснованному созданию высокоэффективных растительно-микробных систем в сельском хозяйстве для максимального использования потенциала продуктивности сельскохозяйственных растений. Отработанная методика клонирования ключевых генов гороха на основе сходства геномов гороха и модельных бобовых может быть использована при работе с сельскохозяйственно-значимыми видами бобовых растений для эффективного клонирования пх генов, ответственных за сельскохозяйственно-ценные признаки, например, архитектонику стебля или старение симбиотических органов растения. В дальнейшем, обнаруженные механизмы контроля специфичности взаимодействия макро- и микросимбионта могут использоваться для научно-обоснованного создания высокоэффективных растительно-микробных систем в сельском хозяйстве. Результаты работы уже сейчас используются в материалах курса лекций "Симбиогсиетика", читаемого на биолого-почвенном факультете СПбГУ, а также в реализации селекционной программы «Симбиогенетика», осуществляемой в ГНУ ВНИЗБК (Орел, Россия) под руководством д.б.н. Т.С. Наумкиной, что подчеркивает несомненную практическую значимость результатов, полученных в диссертационном исследовании.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жуков, Владимир Александрович, Санкт-Петербург

1. Бердников В.А., Розов С.М,, Богданова B.C. Создание серии лабораторных линий гороха // Тезисы докладов конференции, 23-23 мая 1989 года. Частная генетика растений. Киев, 1989 Т. 2, С. 47-51.

2. Борисов А.Ю., Розов С.М., Цыганов В.Е., Куликова О.А., Колычева А.Н., Якоби

3. Л.М., Овцына А.О., Тихонович И.А. Выявление симбиотических генов горохаt

4. Pisum sativum L.) с использованием экспериментального мутагенеза // Генетика. 1994. V. 30. № 11. С. 1484-1494.

5. Воронин А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений// Соросовский Образовательный Журнал. 1998. № 10. С. 25-31.

6. Вавилов Н.И. Закон гомологических рядов в наследственной изменчивости. В сб.: Н. И. Вавилов. Избранные произведения. JL, 1967. № 1, С. 8-61.

7. Ворошилова В.А. Генетический анализ процесса развития симбиотических клубеньков у гороха посевного (Pisum sativum L.) Диссертация на соискание ученой степени канд.биол.наук. СПб, СПбГУ, 2002. 160 с.

8. Ежова Т.А., Лебедева О.В., Огаркова О.А., Пенин А.А., Солдатова О.П., Шестаков С.В. Arabidcpsis thaliana модельный объект генетики растений: учебно-методическое пособие по генетике растений // М., МАКС Пресс, 2003. 220 с.

9. Каратыгин И.В. Коэволюция грибов и растений // Труды Ботан. ин-та РАН. 1993. Вып. 9. С. 8-62.

10. Малышев С.В., Картель Н.А. Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений // Молекулярная биология. 1997. Т. 31. №62. С. 197-208.

11. Мендель Г. Опыты над растительными гибридами. М.: Наука, 1965. 159 с.

12. Проворов Н.А., Тихонович И.А. Мутуалистические симбиозы (генетическая интеграция растений и микроорганизмов) // В Кн. Генетика развития растений / Под ред. чл.-кор. РАН С.Г. Инге-Вечтомова. СПб.: Наука, 2000. 539 с.

13. Разумовская 3. Г. Образование клубеньков у различных сортов гороха // Микробиология. 1937. Т. 6. № 3. С. 321-328.

14. Серебровский А.С. Генетический анализ // Москва: Наука, 1970. 145 с.

15. Сидорова К.К., Шумный В.К. Новый ген гороха (Pisum sativum L.) Nod5-nod5, контролирующий нодулядию // Докл. АН. 1997. Т. 353. № 5. С. 703-704.

16. Сидорова К.К., Шумный В.К. Создание и генетическое изучение коллекции симбиотических мутантов гороха (Pisum sativum L.) // Генетика. 2003. Т. 39. № 4. С. 501-509.

17. Четкова С.А., Тихонович И.А. Выделение и исследование штаммов Rhizobium legwninosarum, эффективных на горохах афганского происхождения П Микробиология. 1986. Т. 55. С. 143 147.

18. Albrecht С., Geurts R., Bisseling Т. Legume nodulation and mycorrhizal formation; two extremes in host specificity meet // The EMBO Journal. 1999. V. 18. N. 2. P. 281-288.

19. Albrecht C., Geurts R., Lapeyrie F., Bisseling T. Endomycorrhizae and rhizobial Nod factors both require SYM8 to induce the expression of the early nodulin genes PsENOD5 andPsENOD12A. //Plant J. 1998. V. 15. P. 605-614.

20. Ane J.M., Kiss G.B., Riely B.K., Penmetsa R.V., Oldroyd G.E., Ayax C., Levy J., Debelle F., Baek J.M., Kalo P., Rosenberg C., Roe B.A., Long S.R., Denarie J., Cook

21. D.R. Medicago truncatula DMI1 required for bacterial and fungal symbioses in legumes // Science. 2004. V. 303. N. 5662. P. 1364-1367.

22. Baumbusch L.O., Sundal I.K., Hughes D.W., Galau G.A., Jakobsen K.S. Efficient protocols for CAPS-based mapping in Arabidopsis II Plant Mol. Biol. Rep, 2001. V. 19. P. 137-149.

23. Benabcn V., Due G., Lefcbre V., Huguet Т. TE7, an inefficient symbiotic mutant of Medicago truncatula Gaertn. cv. Jemalong 11 Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 53-62.

24. Bennett M.D., Leitch I.J. Plant genome size research: a field in focus // Ann. Bot. (Lond). 2005. V. 95.N. l.P. 1-6.

25. Bergman K., Gulash-Hoffee M., Hovestadt R.E., Larosiliere R.C., Rongo P.G., Su L. Physiology of behavorial mutants of Rhizobium meliloti: evidence for a dual chemotaxis pathway//J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 3249-3254.

26. Blauenfeldt J., Joshi P.A., Gresshoff P.M., Caetano-Anolles G. Nodulation of white clover {Tr,folium repens) in the absence of Rhizobium И Protoplasma 1994. V. 179. P. 106-110.

27. Borisov A.Y., Morzhina E.V., Kulikova O.A., Tchetkova S.A., Lebsky V.K., Tikchonovich I.A. New symbiotic mutants of pea (Pisum sativum L.) affecting either nodule initiation or symbiosome development// Symbiosis. 1992. V. 14. P. 297-313.

28. Brauner S., Murphy R.L., Walling J.G., Przyborowski J., Weeden, N.F. STS markers for comparative mapping in legumes // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 2002. V. 127. N. 4. P. 616622.

29. Brewin N.J. Development of the legume root nodules // Ann. Rev. Cell Biol. 1991. V. 7. P. 191-226.

30. Caetano-Anolles G., Crist-Estes D.K., Bauer W.D. Chemotaxis of Rhizobium meliloti to the plant flavonc luteolin requires functional nodulation genes // J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 3164-3169.

31. Caetano-Anolles G., Gresshoff P.M. Plant genetic control of nodulation // Annu. Rev. Microbiol. 1991. V. 45. P. 345-382.

32. Cartwright D.A., Troggio M., Velasco R., Gutin A. Genetic mapping in the presence of genotyping errors // Genetics. 2007. V. 176. N. 4. P. 2521-2527.

33. Catoira R., Timmers A.C.J, Maillet F., Galera C., Penmetsa R.V., Cook D., Denarie J., Gough C. The LICL gene of Medicago truncatula controls Rhizobium-induced root hair curling // Development. 2001. Y. 128. P. 1507-1518.

34. Cermola M., Fedorova E., Tate R., Riccio A., Favre R., Patriarca E.J. Nodule invasion and symbiosome differentiation during Rhizobium elti Phaseolus vulgaris symbiosis // Mol. Plant-Microbe Interact. 2000. V. 13. P. 733-741.

35. Cheng H.-P., Walker G. Succinoglycan is required for initiation and elongation of infection threads during nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1998. V. 180. P.5183-5191.

36. Cikos S, Bukovska A, Koppcl J. Relative quantification of mRNA: comparison of methods currently used for real-time PCR data analysis // BMC Mol. Biol. 2007. V.8. N. 113. P. 1-14.

37. Cohn J., Day R.B., Stacey G. Legume nodule organogenesis // Elsevier Science Ltd. 1998. Vol. 3, No. 3. P. 105-110.

38. Cook D.R. Medicago truncatula a model in the making! // Curr. Opin. Plant Biol. 1999. V.2.N.4. P. 301-304.

39. Corley S.B., Carpenter R., Copsey L., Coen E. Floral asymmetry involves an interplay between TCP and MYB transcription factors in Antirrhinum И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. N. 14. P. 5068-5073.

40. Crespi M., Galves S. Molecular mechanisms in root nodule development // J. Plant Growth Regul. 2000. Vol. 19. P. 155-166.

41. Davis E.O., Evans I.J., Johnston A.W.' Identification of nodX, a gene that allows Rhizobium leguminosarum bv. viciae strain TOM to nodulate Afghanistan peas // Mol. Gen. Genet. 1988. V. 212. N.3. P.531-535.

42. Demont N., Debelle F., Aurelle H., Denarie J., Prome J.C. Role of the Rhizobium meliloti nodF and nodE genes in the biosintesis of lipo-oligosaccharidic nodulation factors // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. No. 27. P. 20134-20142.

43. Denarie J., Debellc F., Prome J.C. Rhizobium Lipo-cliitooligosaccaride nodulation factors: signaling molecules mediating recognition and morphogenesis // Annu. Rev. Biochem. 1996. V. 65. P. 503-535.

44. Downie J.A. Infectious Heresy// Science. 2007. V. 316. N. 5829. P. 1296-1297.

45. Doyle J.J., Luckow M.A. The rest of the iceberg. Legume diversity and evolution in a phylogenetic context // Plant Physiol. 2003. V. 131. N. 3. P. 900-910.

46. Due G., Messager A. Mutagenesis of pea (Pisum sativum L.) and the isolation of mutants for nodulation and nitrogen fixation // Plant Sci. 1989. V. 60. P. 207-213.

47. Edwards A., Hcckmann A.B., Yousafzai F., Due G., Downie J.A. Structural implications of mutations in the pea SYM8 symbiosis gene, the DMI1 ortholog, encoding a predicted ion channel //Mol. Plant Microbe Interact. 2007. V. 20. N. 10. P. 1183-1191.

48. Ehrhardt D.W., Atkinson E.M., Long S.R. Depolarization of alfalfa root hair membrane potential by Rhizobium meliloti Nod factors // Science. 1992. V. 256. P. 998-1000.

49. Ellis Т.Н., Turner L., Hellens R.P., Lee D., Harker C.L., Enard C., Domoney C., Davies D.R. Linkage maps in pea // Genetics. 1992. V. 130. N. 3. P. 649-663.

50. Endre G., Kereszt A., Kevei Z., Mihacea S., Kalo P., Kiss G.B. A receptor kinase gene regulating symbiotic nodule development //Nature. 2002. Vol. 417. P. 962-966.

51. Engvild K.J. Nodulation and nitrogen fixation mutants of pea (Pisum sativum) // Theor. ^ Appl. Genet. 1987. Vol. 74. P. 711-713.

52. Esseling J.J., Lhuisser F.G., Emons A.M. Nod-factor induced root hair curling: continuous polar growth towards the point of Nod-factor application // Plant Physiol. 2003. V. 132. P. 1982-1988.

53. Felle H.H., Kondorosi E., Kondorosi A., Schultze M. The role of ion fluxes in Nod factor signalling inMedicago sativa // Plant J. 1998. V. 13. P. 455-463.

54. Ferguson B.J., Mathesius U. Signaling interactions during nodule development // J.Plant Growth Regul. 2003. V. 22. P. 47-72.

55. Fitch W. M. Distinguishing Homologous from Analogous Proteins // Systematic Zoology. 1970. V. 19. N. 2. P. 99-113.

56. Flavell A.J., Knox M.R., Pearce S.R., Ellis Т.Н. Rctrotransposon-based insertion polymorphisms (RBIP) for high throughput marker analysis // Plant J. 1998. V. 16. N. 5. P. 643-650.

57. Flor H.H. Inheritance of reaction to rust in flax // J. Agric. Res. 1947. V. 74. P. 241-262.

58. Gage D.J., Margolin W. Hanging by a thread: invasion of legume plants by rhizobia // Curr. Opin. Microbiol. 2000. V. 3. P. 613-617.

59. Gage D.J. Infection and invasion of roots by symbiotic, nitrogen-fixing rhizobia during nodulation of temperate legumes // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. Vol. 68. N. 2. P. 280-300.

60. Gelin O., Blixt S. Root nodulation in peas // Agri. Hort. Genet. 1964. V. 22. P. 149-159.

61. Geurts R., Bisseling T. Rhizobium Nod factor perception and signalling // The Plant Cell. 2002. V. 14. P. 239-249.

62. Gianinazzi-Pearson V. Plant cell responses to arbuscular mycorrhizal fungi: getting to the roots of the symbiosis // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1871-1883.

63. Gilpin В .J., McCallum J.A., Frew T.J., Timmerman-Vaughan G.M. A linkage map of the pea (Pisum sativum L.) genome containing cloned sequences of known function and expressed sequence tags (ESTs) // Theor. Appl. Genet. 1997. V. 95. P. 1289-1299.

64. Gleason C., Chaudhuri S., Yang Т., Munoz A., Poovaiah B.W., Oldroyd G.E. Nodulation independent of rhizobia induced by a calcium-activated kinase lacking autoinhibition // Nature. 2006. V. 441. N. 7097. P. 1149-1152.

65. Goetz R., Evans I. J., Downie J.A., Johnston A.W.B. Identification of the host-range DNA which allows Rhizobium leguminosarum strain TOM to nodulate cv. Afghanistan peas // Mol. Gen. Genet. 1985. V. 201. N. 2. P. 296-300.

66. Gonzalez-Rizzo S., Crespi M., Frugier F. The Medicago truncatula CRE1 cytokinin receptor regulates lateral root development and early symbiotic interaction with Sinorhizobium meliloti // Plant Cell. 2006. V. 18. N. 10. P. 2680-2693.

67. Grant D., Cregan P., Shoemaker R.C. Genome organization in dicots: genome duplication in Arabidcpsis and syntcny between soybean and Arabidopsis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000 V. 97. P. 4168-4173.

68. Gresshoff P.M. Positional Cloning of Plant Developmental Genes. // The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping / Eds.: Meksem K., Kahl G. Wiley-VCH, Weinheim, 2005.

69. Gualtieri G., Kulikova O., Limpens E., Kim D.J., Cook D.R., Bisseling Т., Geurts R. Microsynteny between pea and Medicago truncatula in the SYM2 region // Plant Mol. Biol. 2002. V. 50. N. 2. P. 225-235.

70. Guinel F.C., Geil R.D. A model for the development of the rhizobial and arbuscular mycorrhizal symbioses in legumes and its use to understand the roles of ethylene in the establishment of these two symbioses // Can. J. Bot. 2002. V. 80. P. 695-720

71. Handberg K., Stougaard J. Lotus japonicus, an autogamous, diploid legume species for classical and molecular genetics II Plant J. 1992. V. 2. P. 487-496.

72. Harrison M.J. The arbuscular mycorrhizal symbiosis // Plant-Microbe Interactions / Eds Stacey G., KeenN.T.; New York: Chapman and Hall. 1997. P. 1-34.

73. Hartwig H.A., Joseph C.M., Phillips D.A. Flavonoids released naturally from alfalfa seeds enhance growth rate of Rhizobium meliloti II Plant Physiol. 1991. V. 95. P. 797803.

74. Hass-Jacobus В., Jackson S.A. Physical Mapping of Plant Chromosomes // The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping / Eds.: Meksem K., Kahl G. Wiley-VCH, Weinheim, 2005

75. Hecht V., Foucher F., Ferrandiz C., Macknight R., Navarro C., Morin J., Vardy M.E., Ellis N., Beltran J.P., Rameau C., Weller J.L. Conservation of Arabidcpsis flowering genes in model legumes // Plant Physiol. 2005. V. 137. N. 4. P. 1420-1434.

76. Heidstra R., Geurts R., Franssen H., Spaink H.P., van Kammen A., Bisseling T. Root hair deformation activity of nodulation factors and their fate on Vicia sativa I I Plant Physiol. 1994. V. 105. P. 787-797.

77. Hellemans J., Mortier G., De Pacpe A., Speleman F., Vandesompele J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of realtime quantitative PCRdata// Genome Biol. 2007. V. 8. N.2. R 19 (epub).

78. Hepworth S.R., Zhang Y., McKim S., Li X., Haughn G.W. BLADE-ON-PETIOLE-dependent signaling controls leaf and floral patterning in Arabidcpsis II Plant Cell. 2005. V. 17. N. 5. P. 1434-1448.

79. Hirsch A.M. Developmental biology of legume nodulation // New Phytol. 1992. V. 122. P. 211-237.

80. Hirsch A.M. What makes the Rhizobia-legume symbiosis so special? // Plant Physiol. 2001. V. 127. P. 1484-1492.

81. Hirsch A.M., LaRue T.A. Is the legume nodule a modified root or stem or an Organ sui generis? // 1997. V. 16. N.4. P. 361-392.

82. Holl F.B. Host-plant control of the inheritance of dinitrogen fixation in the Pisum-Rhizobium symbiosis // Euphytica. 1975. V. 24. P. 767-770

83. Hungria M., Joseph C.M., Phillips D.A. Rhizobium nod gene inducers exuded naturally from roots of common bean (Phaseolus vulgaris L.) // Plant Physiol. 1991. V. 97. P. 759764.

84. Irzikowska L., Wolko В., Swi?cicki W.K. The genetic linkage map of pea (Pisum sativum L.) based on molecular, biochemical and morphological markers // Pisum Genetics. 2001. V. 33. P. 13-18.

85. Jacobsen E., Feenstra W.J. A new pea mutant with efficient nodulation in the presence of nitrate // Plant Sci. Letters. 1984. V. 33. P. 337-344

86. Kalo P., Seres A., Taylor S.A., Jakab J., Kevei Z., Kereszt A., Endre G., Ellis Т.Н., Kiss G.B. Comparative mapping between Medicago sativa and Pisum sativum 11 Mol. Genet. Genomics. 2004. V. 272. N. 3. P. 235-246.

87. Kijne J.M. The Rhizobium infection process // Biological Nitrogen Fixation / New York; London, 1992. P. 349-398.

88. Kiss G.B., Kereszt A., Kiss P., Endre G. Colormapping: a nonmathematical procedure for genetic mapping // Acta Biol. Hun. 1998. V. 49. P. 125-142.

89. Kneen B.E., LaRue T.A. Nodulation resistant mutant of Pisum sativum L. // J. Hered. 1984a. V. 75. P. 238-240.

90. Kneen B.E., LaRue T.A. Peas (Pisum sativum L.) with strain specificity for Rhizobium leguminosarum // Heredity. 1984b. V. 52. P. 383-389.

91. Kneen B.E., LaRue T.A. Induced symbiosis mutants of pea (Pisum sativum) and sweetclover (Melilotus alba annua) // Plant Sci. 1988. V. 58. P. 177-182.

92. Kneen B.E., LaRue T.A., Hirsch A.M., Smith C.A., Weeden N.F. sym-13 A gene conditioning ineffective nodulation in Pisum sativum. II Plant Physiol. 1990. V. 94. P. 899-905.

93. Kneen B.E., Weeden N.F., LaRue T.A. Non-nodulating mutants of Pisum sativum (L.) cv. Sparkle //J. Hered. 1994. V. 85. P. 129-133.

94. Konieczny A., Ausubel F.M. A procedure for mapping Arabidcpsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers // Plant J. 1993. V. 4. N. 2. P. 403-410.

95. Konovalov F., Toshchakova E., Gostimsky S. A CAPS marker set for mapping in linkage group III of pea (Pisum sativum L.) // Cell. Mol. Biol. Lett. 2005. V. 10. N. 1. P. 163171.

96. Koroleva T.A., Voroshilova V.A., Tsyganov V.E., Borisov A.Y., Tikhonovich I.A. Symbiotic locus Sym38 is localized in linkage group V // Pisum Genet. 2001. V. 33. P. 30-31.

97. Kosterin O.E., Rozov S.M. Mapping of the new mutation bib and the problem of integrity of linkage group I // Pisum Genet. 1993. V. 25. P. 27-31.

98. Kropf D.L., Bisgrove S.R., Hable W. Cytoskeletal control of polar growth in plant cells // Curr. Op. Cell Biol. 1998. V. 10. P. 117-122.

99. Krusell L., Krause K., Ott Т., Desbrosses G., Kramer U., Sato S., Nakamura Y., Tabata S., James E.K., Sandal N., Stougaard J., Kawaguchi M., Miyamoto A., Suganuma N.,

100. Udvardi M.K. The sulfate transporter SST1 is crucial for symbiotic nitrogen fixation in Lotus japonicus root nodules // Plant Cell. 2005. V. 17. N. 5. P. 1625-1636.

101. Kulikova 0., Gualtieri G., Geurts R., Kim D.J., Cook D., Huguet Т., de Jong J.H., Fransz P.F., Bisseling T. Integration of the FISH pachytene and genetic maps of Medicago truncatula // Plant J. 2001. V. 27. N.l. P. 49-58.

102. Kumagai H., Kinoshita E., Ridge R.W., Kouchi H. RNAi knock-down of ENOD40s leads to significant suppression of nodule formation in Lotus japonicus II Plant Cell Physiol. 2006. V. 47. N. 8. P. 1102-1111.

103. Kumar A., Bennetzen J.L. Plant retrotransposons // Annu Rev Genet. 1999. V. 33. P. 479-532.

104. Kuster H., Vieweg M.F., Manthey K., Baier M.C., Hohnjec N., Perlick A.M. Identification and expression regulation of symbiotically activated legume genes // Phytochemistry. 2007. V. 68. N. 1. P. 8-18.

105. LaRue T.A., Weeden N.F. The symbiosis genes of pea// Pisum Genetics. 1992. V. 24. P. 5-12.

106. LaRue T.A., Temnykh S., Weeden N.F. Syml8 a novel gene conditioning altered strain specificity in Pisum sativum cv. Sparkle // Plant Soil. 1996. V. 180. P. 191-195.

107. Laucou V., Haurogne K., Ellis N., Rameau C. RAPD-based genetic linkage map of Pisum sativum II Theor. Appl. Genet. 1998. V. 97. P. 905-915.

108. Libbenga K.R., Harkes P.A.A. Initial proliferation of cortical cell the formation of root nodules in Pisum sativum L. II Planta. 1973. V. 114. P. 17-28.

109. Lie T.A. Temperature-dependent root-nodule formation in pea cv. Iran // Plant Soil. 1971. V. 34. P. 751-752.

110. Lie T.A. Symbiotic specialization in pea plants: the requirement of specific Rhizobium strains for peas from Afghanistan // Ann. Appl. Biol. 1978. V. 88. P. 462-465.

111. Lie T.A., Timmermans P.C.J.M. Host genetic control of nitrogen fixation in the legume-Rhizobium symbiosis: complication in the genetic analysis due to maternal effects // Plant Soil. 1983. V. 75. P. 449-453.

112. Lie T.A. Host genes in Pisum sativum L. conferring resistance to European Rhizobium leguminosarum strains // Plant Soil. 1984. V. 82. P. 415-425.

113. Lie T.A., Goktan D., Engin M., Pijncnborg J., Anlarsal E. Co-evolution of the legume-Rhizobium association // Plant Soil. 1987. V. 100. P. 171-181.

114. Limpens E., Franken C., Smit P., Willemse J., Bisseling Т., Geurts R. LysM domain receptor kinases regulating rhizobial Nod factor-induced infection // Science. 2003. V. 302. N. 5645. P. 630-633.

115. Limpens E., Mirabella R., Fedorova E., Franken C., Franssen H., Bisseling Т., Geurts R. Formation of organelle-like N2-fixing symbiosomes in legume root nodules is controlled by DM12II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. N. 29. P. 10375-10380.

116. Lum M.R., Hirsch A.M. Roots and their symbiotic microbes: strategies to obtain nitrogen and phosphorus in a nutrient-limiting environment // J. Plant Growth Regul. 2003. Vol.21. P. 368-382.

117. Lysak M.A., Fransz P.F., АН H.B., Schubert I. Chromosome painting in Arabidcpsis thaliana II Plant J. 2001. V. 28. N. 6. P. 689-697.

118. Markwei C.P., LaRue T.A. Phenotypic characterization of sym21, a gene conditioning shoot-controlled inhibition of nodulation in Pisum sativum cv. Sparkle // Physiol. Plantarum. 1997. V. 100. P. 927-932.

119. Maxwell С., Phillips D.A. A ehaleon and two related flavonoids release from alfalfa roots induce nod gene of Rhizobium meliloti II Plant Physiol. 1989. V. 91. P. 842-847.

120. Meksem K., Ishihara H., Jesse T. Integration of Physical and Genetic Maps / The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping // Eds.: Meksem K., Kahl G. Wiley-VCH, Weinheim, 2005

121. Miller R.K., Matheos D., Rose M.D. The cortical localization of the microtubule orientation protein, Kar9p, is dependent upon actin and proteins required for polarization // J. Cell Biol. 1999. V. 144. P. 963-975.

122. Murray J.D., Karas B.J., Sato S., Tabata S., Amyot L., Szczyglowski K. A cytokinin perception mutant colonized by Rhizobium in the absence of nodule organogenesis // Science. 2007. Y. 315. N. 5808. P. 101-104.

123. Neff M.M., Turk E., Kalishman M. Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis // Trends Genet. 2002. Y. 18. N. 12. P. 613-615.

124. Newcomb W.E. Nodule morphogenesis // International Rewiew of Cytology, suppliment 13 / Eds. Bourne G.H., Danielli, J.F., Academic Press, New York, USA, 1981. P. 246298.

125. Nguyen H.T., Wu X. Molecular Marker Systems for Genetic Mapping / The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping // Meksem K., Kahl G. Wiley-VCH, Weinheim, 2005.

126. Nishimura R., Ohmori M., Fujita H., Kawaguchi M. A Lotus basic leucine zipper protein with a RING-finger motif negatively regulates the developmental program of nodulation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002b. V. 99. N. 23. P. 15206-15210.

127. Norberg M., Holmlund M., Nilsson O. The BLADE ON PETIOLE genes act redundantly to control the growth and development of lateral organs // Development. 2005. V. 132. N. 9. P. 2203-2213.

128. Nutman P.S. Genetic factors concerned in the symbiosis of clover and nodule bacteria // Nature, London. 1946. V. 151. P. 463-465.

129. Oldroyd G.E., Downie J.A. Calcium, kinases and nodulation signalling in legumes // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. V. 5. N. 7. P. 566-576.

130. Oldroyd G.E., Downie J.A. Coordinating nodule morphogenesis with rhizobial infection in legumes // Annu. Rev. Plant Biol. 2008. V. 59. P. 519-546.

131. Pawlowski K., Bisseling T. Rhizobial and Actinorhizal Symbioses: What Are the Shared Features? // The Plant Cell. 1996. V. 8. P.l899-1913.

132. Penmetsa R.V., Cook D.R. A legume ethylene-insensitive mutant hyperinfected by its rhizobial symbiont// Science. 1997. V. 275. P. 527-530.

133. Postma J.G., Jacobsen E., Feenstra W.J. Experiments with mutants of pea (Pisum sativum L.) // Nitrogen Fixation: Hundred Years After / Eds. Bothe H., de Bruijn F.J., Newton W.E.; Stuttgart: Gustav Fisher Verlag, 1988a. P. 629-633.

134. Postma J.G., Jacobsen E., Feenstra W.J. Three pea mutants with an altered nodulation studied by genetic analysis and grafting// J. Plant Physiol. 1988b. V. 132. P. 424-430.

135. Postma J.G., Jager D., Jacobsen E., Feenstra W.J. Studies on a non-fixing mutant of pea (Pisum sativum L.). 1. Phenotypical description and bacteroid activity // Plant Sci. 1990. V. 68. P. 151-161.

136. Provorov N.A., Borisov A.Y., Tikhonovich I.A. Developmental genetics and evolution of symbiotic structures in nitrogen-fixing nodules and arbuscular mycorrhiza // J. Theor. Biol. 2002. V. 214. P. 215-232.

137. Radutoiu S., Madsen L.H., Madsen E.B., Felle H.H., Umehara Y., Gronlund M., Sato S., Nakamura Y., Tabata S., Sandal N., Stougaard J. Plant recognition of symbiotic bacteria requires two LysM receptor-like kinases //Nature. 2003. V. 425. P. 585-592.

138. Rae A.L., Bonfante-Fasolo P., Brewin N.J. Structure and growth of infection threads in the legume symbiosis with Rhizobium leguminosarum II Plant J. 1992. V. 2. P. 385-395.

139. Ren C., Xu Z., Sun S., Lee M.-K., Wu C., Scheuring C., Zhang H.-B. Genomic DNA Libraries and Physical Mapping / The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping// MeksemK., Kahl G. Wiley-VCH, Weinheim, 2005.

140. Riely B.K., Lougnon G., Anc J.M., Cook D.R. The symbiotic ion channel homolog DM11 is localized in the nuclcar membrane of Medicago truncatula roots // Plant J. 2007. V. 49. N. 2. P. 208-216.

141. Rogers S.O., Bendich, A.J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Mol. Biol. 1985. V. 5. P. 69-76.

142. Roth L.E., Stacey G. Bacterium release into host cells of nitrogen-fixing soybean nodules: the symbiosome membrane comes from three sourses // Europ. J. Cell Biol. 1989. V. 49. P. 13-23.

143. Rozov S.M., Temnykh S.V., Gorel F.L., Berdnikov V.A. A new version of pea linkage group 5 // Pisum Genet. 1993. V. 25. P. 46-51.

144. Rozov S.M., Borisov A.Y., Tsyganov V.E. Further evidence that the mutant Fix gene in line Sprint-2Fix is in pea linkage group III.// Pisum Genet. 1994. V. 26. P. 24-25.

145. Rozov S.M,, Kosterin O.E., Borisov A.Y., Tsyganov V.E. The history of the pea gene map: last revolutions and the new symbiotic genes // Pisum Genet. 1999. V. 31. P. 55-57.

146. Safronova V.I., Novikova N.I. Comparison of two methods for root nodule bacteria preservation: lyophilization and liquid nitrogen freezing // J. Microbiol. Methods 1996. V. 24. P. 231-237.

147. Sagan M., Huguet Т., Barker D., Due G. Characterization of two classes of non-fixing mutants of pea {Pisum sativum L.) // Plant Sci. 1993. V. 95. P. 55-66.

148. Sagan M., Huguet Т., Due G. Phenotypic characterization and classification of nodulation mutants of pea {Pisum sativum L.) // Plant Sci. 1994. V. 100. P. 59-70.

149. Sagan M., Due G. Sym28 and Sym29, two new genes involved in regulation of nodulation in pea {Pisum sativum L.) // Symbiosis. 1996. V. 20. P. 229-245.

150. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. P. B.23.

151. Schauser L., Roussis A., Stiller J., Stougaard J. A plant regulator controlling development of symbiotic root nodules //Nature. 1999. V. 402. N. 6758. P. 191-195.

152. Schefc J.H., Lehmann K.E., Buschmann I.R., Unger Т., Funke-Kaiser H. Quantitative real-time RT-PCR data analysis: current concepts and the novel "gene expression's CT difference" formula// J. Mol. Med. 2006. V. 84. N. 11. P. 901-910.

153. Schnabel E.L., Frugoli J. The PIN and LAX families of auxin transport genes in Medicago truncatula II Mol. Genet. Genomics. 2004. V. 272. N. 4. P. 420-432.

154. Schultze M., Kondorosi A. Regulation of symbiotic root nodule development 11 Annu. Rev. Genet. 1998. Vol. 32. P. 33-57.

155. Shimizu S., Mori H. Analysis of cycles of dormancy and growth in pea axillary buds based on mRNA accumulation patterns of cell cycle-related genes // Plant Cell Physiol. 1998. V. 39.N.3. P. 255-262.

156. Sidorova K.K., Uzhintseva L.P. Mapping of nod-4, a new hypernodulating mutant in pea // Pisum Genet. 1995. V. 27. P. 21.

157. Sinjushin A.A., Konovalov F.A., Gostimskii, S.A. A gene for stem fasciation is localized on linkage group III 11 Pisum Genet. 2006. V. 38. P. 19-20.

158. Smit G., Kijne J.W., Lugtenberg В.J. Involvement of both cellulose fibrils and a Ca2+-dependent adhesin in the attachment of Rhizobium leguminosarum to pea root hair tips I I J. Bacteriol. 1987. V. 169. N. 9. P. 4294-4301.

159. Smit P., Raedts J., Portyanko V., Debelle F., Gough C., Bisseling Т., Geurts R. NSP1 of the GRAS protein family is essential for rhizobial Nod factor-induced transcription // Science. 2005. V. 308. N. 5729. P. 1789-1791.

160. Smit P., Limpens E., Geurts R., Fedorova E., Dolgikh E., Gough C., Bisseling T. Medicago LYK3, an entry receptor in rhizobial nodulation factor signaling 11 Plant Physiol. 2007. V. 145. N. l.P. 183-191.

161. Smith S.E., Read D.J. Mycorrhizal symbiosis // United Kingdom. London: Academic Press. 1997. 2nd ed.

162. Stacey G., Libault M., Brechenmacher L., Wan J., May G.D. Genetics and functional genomics of legume nodulation II Curr. Opin. Plant Biol. 2006. V. 9. N. 2. P. 110-121.

163. Stougaard J. Genetics and genomics of root symbiosis // Curr. Opin. Plant Biol. 2001. Vol. 4. P. 328-335.

164. Szczyglowski K., Shaw R.S., Wopereis J., Copeland S., Hamburger D., Kasiborski В., Dazzo F.B., de Brujin F.J. Nodule organogenesis and symbiotic mutants of the model Legume Lotus japonicus II Mol. Plant-Microbe Interact. 1998. V. 11. P. 684-697.

165. Tan Y.D., Fu Y.X. A novel method for estimating linkage maps // Genetics. 2006. V. 173. N. 4. P. 2383-2390.

166. Tan Y.D., Fu Y.X. A new strategy for estimating recombination fractions between dominant markers from an F2 population // Genetics. 2007. V. 175. N. 2. P. 923-931.

167. Tanksley S.D., Ganal M.W., Martin G.B. Chromosome landing: a paradigm for map-based gene cloning in plants with large genomes // Trends Biotechnol. 1995. V. 11. N. 2. P. 63-68.

168. Temnykh S.V., Kneen B.E., Weeden N.F., LaRue T.A. Localization of nod-3, a gene conditioning hypernodulation, and identification of a novel translocation in Pisum sativum L. cv. Rondo // J. Heredity 1995. V. 86. P. 303-305.

169. Thykjaer Т., Finnemann J., Schauser L., Christensen L., Poulsen C., Stougaard J. Gene targeting approaches using positive-negative selection and large flanking regions. Plant Mol Biol. 1997. V. 35. N. 4. P. 523-530.

170. Timmers A.C.J., Auriac M-C., Truchet G. Refined analysis of early symbiotic steps of the Rhizobium-Medicago interaction in relationship with microtubular cytoskeleton rearrangements//Development. 1999. V. 126. P. 3617-3628.

171. Truchet G., Barker D.G., Camut S., de Billy F., Vasse J., Huguet T. Alfalfa nodulation in the absence of Rhizobium // Mol. Gen. Genet. 1989. V. 219. P. 65-68.

172. Tsyganov V.E., Borisov A.Y., Rozov S.M., Tikhonovich I.A. New symbiotic mutants of pea obtained after mutagenesis of line SGE // Pisum Genet. 1994. V. 26, P. 36-37.

173. Tsyganov V.E., Morzhina E.V., Stefanov S.Y., Borisov A.Y., Lebsky V.K., Tikhonovich I.A. New pea (Pisum sativum L.) genes sym33 and sym40 control infection thread formation and root nodule function// Mol. Gen. Genet. 1998. V. 256. P. 491-503.

174. Tsyganov V.E., Pavlova Z.B., Kravchenko L.V., Rozov S.M., Borisov A.Y., Lutova L.A., Tikhonovich I.A. New gene Crt (curly roots) controlling pea (Pisum sativum L.) root development. // Annals of Botany. 2000. V. 86. N. 6. P. 975-981.

175. Tsyganov Y.E., Borisov A.Y., Tikhonovich I.A. Fix- mutants RisFixA and RisFixV carry mutations in newly identified pea genes sym4l and sym42, respectively // Pisum Genet.2001. V. 33. P. 36.

176. Wagner E., Lykke-Andersen J. mRNA surveillance: the perfect persist // J. Cell Sci.2002. V. 115. P. 3033-3038.

177. Wais R.J., Galera C., Oldroyd G., Catoira R., Penmetsa R.V., Cook D., Gough C., Denarie J., Long S.R. Genetic analysis of calcium spiking responses in nodulationmutants of medicago truncatula И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 1340713412.

178. Walker S.A., Viprey V., Downie J.A. Dissection of nodulation signaling using pea mutants defective for calcium spiking induced by Nod factors and chitin oligomers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97, No. 24. P. 13413-13418.

179. Wan J., Zhang X.C., Neece D., Ramonell K.M., Clough S., Kim S.Y., Stacey M.G., Staccy G. A LysM receptor-like kinase plays a critical role in chitin signaling and fungal resistance in Arabidcpsis II Plant Cell. 2008. V. 20. N. 2. P. 471-481.

180. Wang H., Qi M., Cutler A. J. A simple method of preparing plant samples for PCR // Nucleic Acids Reserch. 1993. Vol. 21. N. 17. P. 4153-4154.

181. Weeden N.F., Kneen B.E., LaRue T.A. Genetic analysis of sym genes and other nodule-related genes in Pisum sativum II Nitrogen Fixation: Achievements and Objectives. / Eds. P.M. Gresshoff et al. N.Y., L.: Chapman and Hall. 1990. P. 323-330.

182. Weeden N.F., Swiecicki W.K., Ambrose M., Timmerman G.M. Linkage groups of pea // Pisum Genet. 1993. V. 25. P. 4.

183. Weeden N.F., Swiecicki W.K., Timmerman-Vaughan G.M., Ellis T.H.N., Ambrose M. The current pea linkage map // Pisum Genet. 1996. V. 28. P. 1-4.

184. Weeden N.F., Ellis T.H.N., Timmerman-Vaughan G.M., Swiecicki W.K., Rozov S.M., Berdnikov V.A. A consensus linkage map for Pisum sativum II Pisum Genet. 1998. V. 30. P. 1-4.

185. Weeden N.F., Tongue M., Boone W.F. Mapping coding sequences in pea by PCR // Pisum Genet. 1999. V. 31. P. 30-32.

186. Weeden N.F., Moffet M. Identification of genes affecting root mass and root/ shoot ratio in a JI1794 x 'Slow' R1L population // Pisum Genet. 2002. V. 34. P. 28-31.

187. Weeden N.F. Fs and U appear to be alleles of a locus near the end of linkage group V // Pisum Genet. 2006. V. 38. P. 23-28.

188. Wessler S.R. Transposable elements and the evolution of eukaryotic genomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. N. 47. P. 17600-17601.

189. Wu C., Sun S., Nimmakayala P., Santos F.A., Meksem K., Springman R., Ding K., Lightfoot D.A., Zhang H.B. А ВАС- and BIBAC-based physical map of the soybean genome // Genome Res. 2004. V. 14. N. 2. P. 319-326.

190. Young, J.P.W. Linkage of sym-2, the symbiotic specificity locus of Pisum sativum II J. Hered. 1985. V. 76. P. 207-208.

191. Young N.D., Cannon S.B., Sato S., Kim D., Cook D.R., Town C.D., Roe B.A., Tabata S. Sequencing the genespaces of Medicago truncatula and Lotus japonicus II Plant Physiol. 2005. V. 137. N. 4. P. 1174-1181.

192. Young N.D., Shoemaker R.C. Genome studies and molecular genetics. Part 1: Model legumes. Exploring the structure, function and evolution of legume genomes // Curr. Opin. Plant Biol. 2006. V. 9. N. 2. P. 95-98.

193. Zhu H., Choi H.K., Cook D.R., Shoemaker R.C. Bridging model and crop legumes-through comparative genomics // Plant Physiol. 2005. V. 137. N. 4. P. 1189-1196.

194. Zhukov V.A., Borisov A.Y., Tikhonovich I.A. Pea mutant line Sprint-2Nod-3 represents a new mutant allele of pea symbiotic gene syml9 II Pisum Genet. 2007b. V. 39. P. 27.

195. Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории Генной экспрессии Университета Орхуса (Дания) Симоне Радутоиу (Simona Radutoiu), Лине Мадсен (Lene Н.

196. Madsen) и Иенсу Стоугаарду (Jens Stougaard) за теплый прием вдали от родного дома, чуткое руководство и бесценный опыт научной работы на мировом уровне.

Информация о работе

Жуков, Владимир Александрович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2008
ВАК 03.00.15

Диссертация

Клонирование симбиотических генов гороха посевного (Pisum sativum L.) с использованием синтении геномов бобовых растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы