Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ генетической системы гороха (Pisum sativum L.), контролирующей развитие арбускулярной микоризы и азотфиксирующего симбиоза

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ генетической системы гороха (Pisum sativum L.), контролирующей развитие арбускулярной микоризы и азотфиксирующего симбиоза"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

НЕМАНКИН Тимофей Александрович

4859466

АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ГОРОХА (Pisum sativum L.), КОНТРОЛИРУЮЩЕЙ РАЗВИТИЕ АРБУСКУЛЯРНОЙ МИКОРИЗЫ И АЗОТФИКСИРУЮЩЕГО СИМБИОЗА

03.02.03 - Микробиология 03.02.07-Генетика

1 О НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2011

4859466

Работа выполнена в лаборатории генетики растительно-микробных взаимодействий Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии (Санкт-Петербург, Пушкин).

Научный руководитель: доктор биологических наук

Борисов Алексей Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Лутова Людмила Алексеевна, (Санкт-Петербургский Государственный Университет)

кандидат биологических наук Андронов Евгений Евгеньевич, (Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии)

Ведущая организация: Ботанический институт им. В.Л. Комарова

Российской академии наук

Защита состоится ".г?^.."1 г. в ч на заседании

объединенного совета ДМ212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Биолого-почвенный факультет, аудитория ш

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Факс для отзывов: +7 (812) 470 43 62.

Автореферат разослан 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Е.И. Шарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В связи с активным заселением суши растениям необходимо было развивать новые способы адаптации к разнообразным изменениям условий окружающей среды, как абиотическим, так и биотическим. Появление способности к установлению взаимовыгодных (мутуалистических) симбиотических взаимоотношений с микроорганизмами обусловило стратегию наземного образа жизни растений (Gianinazzi-Pearson, 1996).

Бобовые растения (семейство Fabaceae) способны к образованию, по крайней мере, двух типов мутуалистических эндосимбиозов: арбускулярной микоризы с грибами отдела Glomeromycota и азотфиксирущего симбиоза с клубеньковыми бактериями семейства Rhizobiaceae, объединяемых под названием ризобии. Взаимодействия с грибами арбускулярной микоризы улучшают водный статус и минеральное питание растений (прежде всего фосфорное), повышают устойчивость растений к патогенам и абиотическим стрессам (Smith, Read, 2008). Благодаря биологической фиксации азота, осуществляемой ризобиями в специализированных органах растений - симбиотических клубеньках - атмосферный азот переводится в аммонийную форму, доступную для большинства живых организмов, и растения получают возможность заселения субстратов, не содержащих связанного азота (Vance, 2001). Важность бобовых растений как сельскохозяйственных культур, выращиваемых в различных климатических поясах, определяет научно-практическое значение данных эндосимбиозов (Crews, Peoples, 2004).

Бобовые растения обладают разносторонней симбиотической активностью, и, таким образом, в наибольшей степени отвечают современной концепции адаптивного земледелия (Celik et al., 2004). В связи с этим ведется разработка методов создания наиболее эффективных растительно-микробных систем бобовых, при функционировании которых максимально реализуется потенциал продуктивности растения (Борисов и др., 2007, Shtark et al., 2010). Поэтому, изучение генетических систем растения, определяющих специфичность, основные этапы развития и итоговую эффективность взаимодействий с партнерами по симбиозу приобретает особую актуальность. Кроме того, выявление базовых механизмов развития эндосимбиозов бобовых, приводящих в случае бобово-ризобиального симбиоза к симбиотическому органогенезу клубенька, позволяет выявить основные механизмы, лежащие в основе взаимодействия симбионтов, развития и функционирования взаимовыгодных растительно-микробных систем, что также расширяет знания о биологии микроорганизмов и генетике развития высших растений.

Изучение генетического контроля эндосимбиозов со стороны растения путем мутационного анализа позволило выявить у 10 видов бобовых растений более 100 генов, необходимых для развития эндосимбиозов. Наибольшие успехи были достигнуты в идентификации симбиотических генов гороха посевного {Pisum sativum L.). Более десяти таких симбиотических генов клонировано и охарактеризовано в отношении их роли в симбиозе (Oldroyd, Downie, 2008; Shtark et al., 2010). В настоящее время данные исследования наиболее интенсивно ведутся на модельных бобовых растениях: люцерне слабоусеченной (Medicago truncatula Gaertn.) и лядвенце японском (Lotus japonicus (Regel.) Larsen). Сходная организация

о

(синтения) геномов бобовых растений позволяет использовать накопленные знания и для клонирования симбиотических генов сельскохозяйственно-ценных бобовых, в частности, гороха посевного (Жуков и др., 2009). Продолжение разносторонней характеристики масштабной коллекции линий гороха посевного, мутантных по симбиотическим генам, и клонирование данных генов необходимы для изучения особенностей его симбиотической системы и понимания механизмов координированного генетического контроля развития симбиозов путем взаимодействия геномов макро- и микросимбионта.

Цель и задачи исследования. Главной целью диссертационной работы являлся анализ роли компонентов генетической системы гороха (Pisum sativum L.) в контроле развития и функционирования симбиозов с эндомикоризными грибами (<Glomus sp.) и клубеньковыми бактериями (Rhizobium leguminosarum bv. viciae).

Конкретными задачами работы являлись:

1. Фенотипическая характеристика проявления новой независимо полученной мутантной аллели гена Pssym40 (линия SGEFix"-6) в отношении развития арбускулярной микоризы;

2. Характеристика взаимодействия симбиотических генов гороха Pssym40 и Pssym33 в ходе развития арбускулярной микоризы;

3. Изучение влияния мутаций в генах Pssym40 и Pssym42 на экспрессию других генов гороха, вовлеченных во взаимодействие с микроорганизмами, в азотфиксирующих клубеньках;

4. Создание системы межвидовых молекулярных маркеров для генетического картирования и последующего клонирования симбиотических генов гороха;

5. Локализация симбиотических генов Pssym40 и Pssym42 на генетической карте гороха для их последующего позиционного клонирования.

Здесь и далее первые буквы в названии генов и их белковых продуктов обозначают название вида растения: Ps - Pisum sativum L.; Mt - Medicago truncatula Gaertn; Lj - Lotus japonicus (Regel.) Larsen.

Научная новизна работы. В ходе данной работы впервые для сравнительного анализа развития арбускулярной микоризы у мутантных линий гороха был использован признак, отражающий активность колонизации грибом поверхности корня растений, - "количество апрессориев". Вовлечение в анализ двойной мутантной линий гороха посевного по генам Pssym40 и Pssym33 позволило впервые показать, что данные гены участвуют в различных механизмах генетического контроля формирования апрессориев и проникновения гриба в корень в ходе развития арбускулярной микоризы. Кроме того, показано, что гены Pssym33 и Pssym40 оказывают влияние на динамику численности функциональных единиц AM симбиоза - арбускул.

С целью генетического картирования симбиотических генов создана система из 75 межвидовых молекулярных EST-маркеров, покрывающих большую часть генетической карты гороха посевного. Использование созданной системы молекулярных маркеров позволило впервые локализовать на генетической карте гороха ген Pssym40, а для гена Pssym42 - определить место его наиболее вероятной локализации. Сходная локализация симбиотических генов гороха посевного Pssym40 и люцерны слабоусеченной MtEFD на генетических картах позволила

выдвинуть предположение о гомологичное™ данных генов, которое было поддержано обнаружением нонсенс-мутации в нуклеотидной последовательности гена гороха PsEFD у мутанта гороха SGEFix"-l (Pssym40).

Впервые охарактеризовано влияние мутаций в генах Pssym40 и Pssym42 на экспрессию других генов гороха, вовлеченных во взаимодействие с микроорганизмами, в азотфиксирующих клубеньках.

Практическая ценность. Полученные в диссертационной работе данные расширяют представления о функциях изученных симбиотических генов гороха и будут использованы при построении моделей регуляторных систем бобовых растений, контролирующих развитие и функционирование эндосимбиозов. Созданные в ходе работы молекулярные маркеры могут быть использованы для картирования генов гороха посевного, мутации по которым получены на линиях SGE и Finale, на поколениях F2 и F3 от скрещивания с линией NGB1238. Отработанные методики картирования и клонирования симбиотических генов гороха посевного могут быть использованы для эффективного клонирования генов культивируемых видов бобовых растений, ответственных за сельскохозяйственно-ценные признаки, например, архитектонику стебля или старение симбиотических органов растения. Результаты данной работы могут быть использованы в материалах курса лекций «Симбиогенетика», читаемого на кафедре генетики и селекции СПбГУ.

Выполнение работы поддержано грантами: NWO 047.018.001, Госконтракты с Минобрнауки № 16.512.11.2155, № 16.552.11.7047, № 02.740.11.0276.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 10-ой, 11-ой и 14-ой Международных школах-конференциях молодых ученых «БИОЛОГИЯ -НАУКА XXI ВЕКА» (Пущино, Россия, 2006, 2007, 2010 гг.); Всероссийской молодежной школе "Горизонты нанобиотехнологии" (Звенигород, Россия, 2009); 2nd Joint Retreat of PhD Students in Plant Sciences (Cologne, Germany, 2010); 9th European Nitrogen Fixation Conference (Geneva, Switzerland, 2010), The joint 5th Postgraduate Course and Minisymposium of ABRMS, 16th Biotechnology Summer School of University of Gdansk, and 2nd Workshop of PAS and RAAS on Plant Molecular Biotechnology (Mikkeli, Finland, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 6 тезисов докладов на российских и международных научных конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 170 источников. Работа изложена на 134 страницах и содержит 23 рисунка и 13 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Биологический материал.

В работе были использованы следующие линии гороха посевного (Pisum sativum L.) из коллекции "Симбиотический потенциал гороха" ГНУ ВНИИСХМ: Finale (wt), SGE (wt), RisFixV {Pssym42) SGEFix'-l (Pssym40), SGEFix"-6 (Pssym40), SGEFix"-2 (Pssym33), RBT3 (Pssym33, Pssym40). Для создания системы межвидовых молекулярных EST-маркеров для картирования генов гороха были использованы

также линии Frisson, Sparkle, Rondo, Finale, NGB1238, RT9, JI15, NGB851 и NGB2715.

Для инокуляции растений клубеньковыми бактериями был использован производственный штамм Rhizobium leguminosarum bv. viciae CIAM1026 (Safronova, Novikova, 1996) из коллекции ГНУ ВНИИСХМ. Для инокуляции эндомикоризными грибами Glomus intraradices Schenck and Smith - изолят CIAM8 из коллекции ВНИИСХМ (зарегистрированный в Европейском Банке Гломусовых как изолят BEG 144) - была использована инокуляционная система с растением-"няней" (СРН). В качестве растения-"няни" был использован лук-шнитт (Allium schoenoprasum L.).

Условия вегетадии растений. Растения были выращены в песке, песке с керамзитом или агро-перлите (в зависимости от целей экспериментов) в вегетационных домиках, где освещенность и температура определялись погодными условиями на широте Санкт-Петербурга (июнь - июль - август), в фитотроне (Vötsch, Germany) или в климатической камере (Radix Klima, Wageningen, The Netherlands) в заданных климатических условиях: температура 21 °С/19°С, день/ночь 16/8 ч. при относительной влажности воздуха 75% и освещении 35000 лк.

Методы исследований. В экспериментах по сравнительному анализу динамики развития арбускулярной микоризы корни растений окрашивали по Vierheilig et al., 1998. Оценка развития данного эндосимбиоза проводилась по Trouvelot et al., 1986 с использованием светового микроскопа (Axiostar plus, Carl Zeiss, Germany) в проходящем свете при 100-кратном и 200-кратном увеличении.

Растения всех мутантных линий, использованных в экспериментах, развивались медленнее на несколько дней, чем растения линии дикого типа. Предполагается, что измененный гормональный баланс мутантов по генам Pssym33 и Pssym40, меняющийся в зависимости от физиологического состояния растения, может влиять на взаимоотношения с микросимбионтом (Tsyganov et al., 1999; Jacobi et al. 2003a,b). Поэтому, в качестве двух последних контрольных сроков анализа были использованы физиологические стадии жизненного цикла растений. Выращиваемые в СРН растения анализировали на 6, 8 и 11 день и на физиологических стадиях раннего цветения (27 - 32) и первого почти зрелого, но не сухого боба (молочно-восковой спелости семян) (42 - 49 дней). Учитывали 3 показателя: 1) количество апрессориев на 1 см корня (включен в анализ впервые); 2) интенсивность микоризации корня и 3) обилие арбускул в микоризованной части корня. Для статистической обработки данных применяли программу SigmaStat 2.0.

Манипуляции с нуклеиновыми кислотами проводили по протоколам производителей оборудования, соответствующего программного обеспечения и наборов реактивов: выделение ДНК - по модифицированному протоколу Rogers, Bendich, 1985, ПЦР - в термоциклерах iCycler™ (Bio-Rad, США) и Personal Cycler (Biometra, Германия), выделение РНК - "E.Z.N.A. Plant RNA Mini kit" (Omega Bio-tek, Inc, USA), синтез кДНК - "¡Script cDNA Synthesis Kit" (Bio-Rad, USA), количественную ПЦР в реальном времени - "¡Q SYBR Green Supermix" (Biorad, USA) - на оптическом термоциклере "MylQ optical cycler" (Biorad, Hercules, USA), секвенирование - CEQ™ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, США). Обработку данных по генетическому картированию и построение генетических карт проводили с помощью программы MapL98. Часть молекулярных маркеров для

генетического картирования была создана в рамках совместной работы с Овчинниковой Е.С. и Кузнецовой Е.В. (ГНУ ВНИИСХМ, Санкт-Петербург, Пушкин).

В экспериментах по сравнительному анализу уровней экспрессии генов гистологическая структура клубеньков растений анализируемых линий была определена с помощью световой микроскопии полутонких срезов по Limpens et al., 2005 с использованием микроскопа Leica DM5000B (Leica, Germany).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Роль гена Pssym40 в регуляции развития арбускулярной микоризы и его взаимодействие с другими регуляторными генами гороха посевного.

Ранее было показано, что мутанты гороха по генам Pssym33 и Pssym40 имели нарушения образования азотфиксирующих клубеньков (Tsyganov et al., 1998, Ворошилова, 2002), а растения линий SGEFix"-2 (Pssym33) и SGEFix"-l (Pssym40), кроме того, характеризовались нарушениями развития, но не функционирования арбускулярной микоризы (AM) (Jacobi et al., 2003a,b). Было выяснено, что гены гороха Pssym33 и Pssym40 контролируют две последовательные стадии образования бобово-ризобиального симбиоза, причем мутация в гене Pssym33 блокирует этот процесс на более ранней стадии (Tsyganov et al., 2003, Цыганов и др., 2010). В данной работе взаимодействие симбиотических генов гороха Pssym33 и Pssym40 в ходе развития AM симбиоза было охарактеризовано с использованием двойного симбиотического мутанта RBT3 (Pssym33, Pssym40).

Характеристика новой независимо полученной мутантной аллели гена Pssym40 (линия SGEFix'-б) в отношении развития AM.

Анализ развития AM у линии SGEFix"-6 (Pssym40) был проведен в сравнении с линией дикого типа SGE и ранее охарактеризованной мутантной линией SGEFix"-l (Pssym40). Показано, что мутантные линии SGEFix'-l (Pssym40) и SGEFix'-6 (Pssym40) отличались от дикого типа по признаку "количество апрессориев"- на корнях обоих мутантов на ранних сроках формировалось большее количество апрессориев, чем у линии дикого типа. Кроме того, по данному признаку мутантные линии различались и между собой (Рис. 1, а). При этом апрессории, формирующиеся на корнях растений обеих мутантных линий и линии дикого типа, были сходны по размеру и форме. По-видимому, увеличение их количества при мутациях в гене Pssym40 может быть связано не с нарушением процесса проникновения гриба AM в корень - в этом случае апрессории гипертрофированы (Harrison et al., 1999) - а с изменением гормонального статуса растения и/или состава корневых экссудатов (Tawaraya et al., 1998). Таким образом, показано, что ген Pssym40 контролирует формирование апрессориев в ходе развития арбускулярной микоризы, причем различные мутации в данном гене вызывают различные проявления данного признака.

По интенсивности микоризации мутантные растения линий SGEFix"-l (Pssym40) и SGEFix"-6 (Pssym40) были близки к растениям дикого типа. Различия между линиями на ранних сроках могут быть связаны с различиями в количестве апрессориев (Рис. 1, а, б). Результаты данной работы подтверждают, что ген гороха Pssym40 не участвует в контроле процесса распространения гиф гриба в коре корня при развитии AM (Jacobi et al., 2003a).

Рисунок 1. Сравнительная динамика развития арбускулярной микоризы у линии дикого типа БОЕ и мутантных линий 8СЕР1х~-1 (Р,иут40) и 80ЕПх~-6 (Рззут40) (Кетапкт е1 а1., 2007). На графиках обозначена стандартная ошибка.

а) Среднее количество апрессориев на 1 см корня; а, Ь -различия в пределах одного срока между линиями, обозначенными разными буквами, достоверны при Р<0.01.

б) Интенсивность микоризации корня (М, %).

в) Обилие арбускул в микоризованной части корня (а,%). Значения, обозначенные на б) и в) разным цветом (белый, серый) статистически достоверно отличаются в пределах одного срока при Р<0.01.

По динамике проявления признака "обилие арбускул в микоризованной части корня", растения линии SGEFix'-6 (Pssym40) отличались не только от линии дикого типа SGE, но и от линии SGEFix'-l (Pssym40). Как было показано и ранее, мутация в гене Pssym40 у линии SGEFix'-l (Pssym40) вызывает ускоренное образование арбускул (Jacobi et al., 2003b). В ходе работы выяснено, что мутация у линии SGEFix"-6 (Pssyrn40) не нарушает динамику процесса образования арбускул, тогда как, обе мутантные аллели линий SGEFix'-l (Pssym40) и SGEFix"-6 (Pssym40) приводят к ускоренной деградации арбускул (Рис. 1, в).

Взаимодействие симбионтческих генов гороха Pssym33 и Pssym40 в ходе развития AM симбиоза.

Анализ развития AM у двойной мутантной линии RBT3 (Pssym33, Pssym40) был проведен в сравнении с линией дикого типа SGE и одиночными мутантными линиями SGEFix'-2 (Pssym33) и SGEFix'-l (Pssym40). По признаку "количество апрессориев" растения линии RBT3 (Pssym33, Pssym40) отличались от всех других изученных линий, хотя у всех мутантных линий количество апрессориев было увеличено (Рис. 2, а). Кроме того, апрессории, формируемые грибом AM на корнях растений двойной мутантной линии, были гипертрофированы, сходно с одиночной мутантной линией по гену Pssym33. Подобные видоизменения апрессориев наряду с увеличением их количества были показаны и у ряда мутантов бобовых и небобовых растений, имеющих нарушения процесса проникновения гриба AM в корень хозяина (Harrison, 1999). Таким образом, изменение формы и количества апрессориев у линии RBT3 (Pssym33, Pssym40), по всей видимости, являются следствием проявления мутации в гене Pssym33, снижающей вероятность проникновения гриба AM внутрь корня после образования апрессория. Кроме того, увеличение количества апрессориев у одиночного мутанта SGEFix'-l (Pssym40) и двойного мутанта RBT3 \Pssym33, Pssym40) может быть связано с изменением гормонального баланса растения и состава корневых экссудатов вследствие мутации в гене Pssym40. По всей видимости, гены Pssym33 и Pssym40 участвуют в различных механизмах генетического контроля формирования апрессориев в ходе развития арбускулярной микоризы.

Фенотип двойной мутантной линии RBT3 (Pssym33, Pssym40) по признаку "интенсивность микоризации корня" был сходным с мутантной линией SGEFix"-2 (Pssym33), но отличался от линии дикого типа SGE и мутантной линии SGEFix'-l (Pssym40). То есть, мутации в гене Pssym33 подавляют проявление признака "интенсивность микоризации корня" как доминантных, так и рецессивных аллелей гена Pssym40 в гомозиготном состоянии (рецессивный эпистаз).

По параметру "обилие арбускул в микоризованной части корня" статистически достоверных отличий между двойной мутантной линией RBT3 (Pssym33,Pssym40) и одиночными мутантными линиями SGEFix'-2 (Pssym33) и SGEFix'-l (Pssym40) показано не было. Однако, у всех мутантных линий значения этого параметра были выше, чем у линии дикого типа на ранних сроках анализа и ниже на поздних сроках анализа. Ускоренное образование и деградация арбускул у линии SGEFix'-l (Pssym40) и изменения динамики данного процесса у линии SGEFix"-2 (Pssym33) были также показаны ранее (Jacobi et al., 2003b). Таким образом, гены гороха Pssym33 и Pssym40 оказывают влияние на динамику численности арбускул.

■ 5СЕ (<М)

Я ввЕРкМ {РЁьутЩ

■ 50ЕНх--2 (РмутЗЭ)

■ ВВП (РкутЗЗ. РК)<№Х))

-О- ЗвЕ (»1)

чжвтз (Риушлз. Рззуячщ -о ЗОЕР1х"-1 (РззупНО) ЭОЕР^х'-г (РзьутЗЗГ)

25 30 35

дпи

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

дпи

Рисунок 2. Сравнительная динамика развития арбускулярной микоризы у линии дикого типа БОЕ, одиночных мутантных линий 80ЕР1х~-1 (Рввут40) и 80ЕР)х"-2 Ц'.ч.чутЗЗ) и двойной мутантной линии ШЗТЗ (РвяутЗЗ, Р.мут40). На графиках обозначена стандартная ошибка.

а) Среднее количество апрессориев на 1 см корня; а, Ь, с, с! -различия в пределах одного срока между линиями, обозначенными разными буквами, достоверны при Р<0.01.

б) Интенсивность микоризации корня (М, %). Различия между парами линий 8ОЕ(\у0, 8СЕР1х"-1 \Pssym40) и 5СЕРьч'-2 (Р.<;хутЗЗ), КВТЗ (Р.ч.чутЗЗ, Р$зут40) статистически достоверны на всех сроках фиксации результатов (Р<0.01).

в) Обилие арбускул в микоризованнои части корня (а,%). 55Мутантная линия 80ЕР1х"-1 (Ря$ут40) достоверно (Р<0.01)

отличалась от линии БОЕ (и1.) на сроке 8 дней и последнем сроке фиксации результатов.

Роль генов гороха Pssym40 и Pssvm42 в регуляции экспрессии других генов, вовлеченных во взаимодействие с микроорганизмами.

Определение молекулярных основ мутантного фенотипа идентифицированных симбиотических генов - комплексная задача. Гены могут быть напрямую или опосредованно задействованы в различных этапах развития симбиозов. Симбиотический ген может быть необходим на определенной стадии развития симбиоза, а, кроме того, влиять на предыдущие и/или последующие этапы развития по механизму прямой или обратной положительной и отрицательной связей. У генов, кодирующих транскрипционные факторы или регуляторы транскрипции, фенотип мутантов может быть связан с изменением экспрессии ряда генов, регулируемых мутантным геном. Таким образом, изучение закономерностей экспрессии генов, вовлеченных во взаимодействие с микроорганизмами, у мутантов по симбиотическим генам позволит расширить существующие представления о функции изучаемых генов в ходе развития симбиозов.

В ходе работы был проведен сравнительный анализ динамики экспрессии генов гороха посевного, вовлеченных во взаимодействие с микроорганизмами, в клубеньках мутантных линий по генам Pssym40 и Pssym42 и линий дикого типа SGE и Finale. Для анализа были выбраны: 1) симбиотические гены гороха: PssymlO, Pssym37, PssymlÇ, Pssym8, PssymÇ, Pssym7, Pssym35, Pssym33, PsEFD, PsIGNl, PsSSTl, Pssym29; 2) гены нодулинов: PsENOD2, PsENOD!4, PsLb; 3) ген защитных реакций PsPRl; 4) ген, кодирующий цистеиновую протеазу PsCatI; 5) ген, кодирующий фенилаланинаммонийлиазу PsPal.

Экспрессия генов гороха, вовлеченных во взаимодействие с микроорганизмами, в клубеньках растений, мутантных по гену Pssym40.

Наличие у растений линий SGEFix*-l (Pssym40) и SGEFix'-6 (Pssym40) мутаций в гене Pssym40 вызывало в клубеньках разнонаправленные изменения уровней экспрессии различных симбиотических генов (Рис. 3, а). Наиболее значимым по отношению к линии дикого типа было повышение уровня экспрессии регулятора транскрипции Pssyml, которое, по-видимому, влекло за собой усиление экспрессии одного из генов ранних нодулинов - PsENOD2. Повышение экспрессии гена Pssym29, участвующего в системной регуляции растением количества клубеньков, при мутации в гене Pssym40, может быть связано с активацией системы авторегуляции количества клубеньков у мутантных растений.

Экспрессия генов гороха, вовлеченных во взаимодействие с микроорганизмами, в клубеньках растений, мутантных по гену Pssym42. Наличие мутантных аллелей гена Pssym42 в гомозиготном состоянии у растений линии RisFixV (Pssym42) вызывало в клубеньках изменение уровней экспрессии целого ряда генов, причем экспрессия большинства симбиотических генов и нодулинов была снижена, тогда как экспрессия генов защитных реакций растения была повышена (Рис. 3, б). На сроке 35 дней после инокуляции паттерны экспрессии анализируемых генов в клубеньках растений линии RisFixV (Pssym42) обоих типов (по-видимому, являющихся результатами фенотипической изменчивости) были, в целом, сходными. Таким образом, в клубеньке ген Pssym42, возможно, играет значительно более важную роль в обеспечении нормального функционирования всей системы генетического контроля развития бобово-ризобиального симбиоза растением, чем можно было предположить по морфологической характеристике клубеньков мутанта.

а)

Относительная экспрессия генов (Мутант / Дикий тип)

20 ДЛИ 28 дпи 35 ДПИ

ЭСЕРЫ-! ЗСЕР(х-6 БОБРЫ БСЕРк-б 36ЕРк-1 ЭСЕПх-б

РгЭутЮ 5,92 *

Рв3^37 5,17 * 2.26 2,76 * 1,12 0,70 2,07

Ревут 19 4,23* 3,61 * 1,96 * 1,57 * 1,97* 1,30

Рзвутв 2,54* 1,49 1,07 1,00 1.15 0.75*

РаБутЭ 1,85* 1,08 1,09 0,38 * 0.59 * 0,44 * 1

Р53ут7 11.21** 4,22* 4,76* 9,62** 19,74 * 20,15* 1

РзЗутЗб 1,14 1,21 1,03 0.33 * 0,86 0,98 (

РвЗутЗЗ 0,77 0.74 0,52* 0,36** 032 *

РэЕРО 1,62 1,88 * 1,16 0.22 * .оЩ 0,58 *

Ра1(ЗМ1 2,61 * 2,10 * 2.12 * 1,70 * 2,75 * 2,21 *

РаЭЙТ! * £ 0,34 * о -аэ , *

РвЗут29 4,33** 2,49* 2,32 * 3,86** 1,07 1.08

РаЕЫООг 19,03** 8,39 * 4,23** 2,27 * 0.24 * 3,66* 5,32**

РзЕЫООи 0.59 0,78 0,65 .. Шк

РЫ. ь шват . Ш * 0,64 * 0.16**

РзСаИ 2,29* 2,01* 1,39 * 1,69 * 2,32 * 1,45

РзРаа) 6,21 ** 2,66* 2,60** 1,54 * 230 6,05*

Р5РЯ1Ь 1,01 0,62* 0.72 * 1,11 2,73** 2,31 *

0,05 0,066 0.1 0.2 1

V* - отличие от дикого типа достоверно при Р50.05

** - отличив от второй мутантной линии достоверно при Р20.0

Структурная организация клубеньков (схема)

2йдней после инокуляции У!Л Зут40"

Бут40"

¿¿дней после инокуляции

вутЛСГ

б)

Относительная экспрессия генов

Мдпи 28 дпи 35 дпи

Гены ЯвРЬЛ' ЯвПхУ Я«$РсхУ_Р

РзЗутЮ 0,33 * 0,42 * 0,47 * |

Рв3ут37 0,38 * 0,47 * С

РвЗупНЭ о.за * 0,61 1.37 1 п

Р53утв ■ ■ 0,38 * 0.75 * 0,89 +

РзЗутЭ 0.43 * 0,75 0,20 + 0,80

РзЗут7 0,91 0,56 0.76 0,50

Рз5угп35 0,52 * 0,06 0,36 * 0,94

РзЭутЗЗ ; 0Л'£ к 0.43 * й,?2 * 0,34

РзЕРО 0,32 * 0,60 * '■■■■ЬЩ** Э.24

РвЮЮ 13 1.19 1,35 1.39

РавЭП О,Сю Лс Щм 1

Р53ут29 0,60 0.61 1,51 1,08

Р5ЕЫ002 0;280,65 ».еэ * 1,19

РэЕМООМ 0,30 * I 0,58 * 1,12

Р81.Ь ИМИ 1.50 * 2,18 *

Р5С011 2,39 1.19 6,12 * 1,32

РзРаа) 1,99 * 3,99 72,72* 96,94**

рярть 1,63 2,13 1,95 * 0,88

0,05 0,066 0.1 0.2 1

Структурная организация клубеньков (схема)

<—Рисунок 3. Динамика экспрессии генов, вовлеченных во взаимодействие с микроорганизмами в клубеньках растений, мутантных по генам a) Pssym40 и б) Pssym42. Показана относительная экспрессия генов в клубеньках мутантных линий по отношению к линиям дикого типа. RisFixV - мелкие белые клубеньки линии RisFixV, RisFixV_P - редко встречающиеся удлиненные белые клубеньки линии RisFixV. Цветовая шкала отображает численные значения отношения уровней экспрессии. Структурная организация клубеньков исследуемых линий обозначена схематически (красным - меристема (зона I), желтым - зона инфекции (зона II), зеленым - зона фиксации азота (зона III), коричневым - зона старения (зона IV)).

Генетическое картирование симбиотических генов гороха с целью их последующего клонирования.

Генетическое картирование с использованием морфологических и молекулярных маркеров является начальным этапом позиционного клонирования генов. Наиболее перспективным является использование молекулярных CAPS-маркеров, основанных на последовательностях экспрессирующихся генов, поскольку использование таких маркеров позволяет проводить сравнение полученных генетических карт гороха посевного с картами модельных бобовых (Medicago truncatula Gaertn. и Lotus japonicus (Regel.) Larsen) благодаря высокому уровню синтении их геномов. В связи с этим, одной из задач данного исследования являлась разработка системы межвидовых молекулярных маркеров для генетического картирования генов гороха.

Создание системы межвидовых молекулярных маркеров для генетического картирования генов гороха.

Для создания молекулярных маркеров на их основе было выбрано более 300 EST гороха посевного, значительная часть из которых локализована на основании опубликованных данных в различных группах сцепления его генетической карты. Вероятная позиция остальных EST предсказана на основании гомологии с синтенными регионами генома М. truncatula. По полученным в базе данных NCBI нуклеотидным последовательностям выбранных EST были подобраны олигонуклеотидные праймеры для проведения ПЦР и амплификации целевых фрагментов ДНК у различных генетических линий гороха. Для всех выбранных фрагментов проведена оптимизация ПЦР, для 83 из них удалось достичь стабильной амплификации у различных генетических линий гороха посевного и отсутствия неспецифичных продуктов реакции.

С целью предварительной оценки степени полиморфизма между различными генетическими линиями гороха нуклеотидные последовательности ДНК были определены для 21 фрагмента у 5 линий гороха, на которых получено основное количество симбиотических мутантов, а также у 5 генетически отдаленных линий, потенциальных партнеров для скрещивания. Уровень полиморфизма между выбранными линиями был признан достаточным для продолжения работ по созданию системы молекулярных маркеров. На основании полученных нуклеотидных последовательностей было разработано 16 молекулярных CAPS-маркеров.

Поскольку наиболее интенсивно в настоящее время исследования симбиотических генов гороха в лабораториях мира ведутся с использованием мутантов, полученных на линиях Finale и SGE, дальнейшая работа по созданию

молекулярных маркеров проводилась на данных генетических линиях и линии NGB1238, активно используемой для создания популяций F2 и F3 для картирования. В ходе работы был создан 61 молекулярный маркер. Данные маркеры локализуются во всех семи группах сцепления и покрывают большую часть генетической карты гороха посевного.

Генетическое картирование гена Pssym40.

Расщепления по симбиотическому признаку и аллельным состояниям молекулярных маркеров были проанализированы на выборке растений поколения F2 (SGEFix'-l х NGB1238), состоящей из 61 растения, 37 из которых демонстрировали мутантный фенотип клубеньков. В анализе был использован 41 молекулярный маркер, большая часть которых в результате сегрегационного анализа была распределена по всем семи группам сцепления, показав достоверное сцепление с "якорными" маркерами, позиция которых на генетической карте была известна из литературных данных.

На основании анализа данных было выявлено 8 кластеров, маркеры внутри которых показали достоверное сцепление между собой. Внутри одного из кластеров маркеры JH4.3, EFD, N41, JH4.2 и JH4.8 показали сцепление с геном Pssym40. Данный кластер расположен в VII группе сцепления на основании сцепления маркера JH4.8 с маркерами VII группы сцепления Pip2 и Clpser при анализе выборки F2 (RisFixV х NGB1238) (см. далее). Кроме того, ген MtEFD, на основе ортолога которого PsEFD был создан маркер EFD, локализуется в регионе хромосомы 4 M truncatula, по литературным данным синтенном нижней части VII группы сцепления P. sativum (Vernie et al., 2008) (Рис. 4, a).

Генетическое картирование гена Pssym42.

Расщепления по симбиотическому признаку и аллельным состояниям молекулярных и морфологического маркеров были проанализированы на выборке растений поколения F2(RisFixV х NGB1238), состоящей из 96 растений, 15 из которых демонстрировали мутантный фенотип клубеньков. В анализе было использовано 44 молекулярных маркера, большая часть которых в результате сегрегационного анализа была распределена по всем семи группам сцепления гороха, показав достоверное сцепление с "якорными" маркерами с известной локализацией. Кроме того, в ходе работы было проанализировано расщепление по морфологическому маркеру на основе гена гороха tl, локализующегося в V группе сцепления, рецессивная аллель которого определяет проявление признака "акациевидные листья".

Ген Pssym42 показал сцепление с молекулярными маркерами SS, Роге и Sbel и морфологическим маркером tl V группы сцепления гороха, которое, однако, не может быть признано статистически достоверным (Рис 4, б). Таким образом, использование созданной в работе системы молекулярных маркеров, позволило предположить локализацию гена Pssym42 в V группе сцепления гороха.

Рисунок 4. Локализация молекулярных маркеров, использованных для картирования генов a) Pssym40 и б) Pssym42 на генетической карте гороха посевного. Цветом обозначены кластеры, маркеры внутри которых попарно показали статистически достоверное сцепление. ГС - группа сцепления. —*

а) гс1

■ — Мв .

□I М

15

ГС1У

ГСУ ГСУ1

ГШ

Е5Т№1

б) ГС1 ГСП

дайкё /^ТИкЛР

до

ГС1У

■м

■ ни

■ ФИ

.ш

впв

-—МЦМ2М

и

РЙ2 МКС

1(ВС

. сОМТ

V/"

У

Клонирование и секвенирование симбиотического гена гороха РвЗут40.

Сходство фенотипов линий, несущих мутации в генах Р$яут40 и М/ЕГО, а также локализация этих генов в гомологичных областях генома гороха и люцерны позволили сформулировать гипотезу о гомологии этих генов. Для проверки данной гипотезы кДНК гена гороха РвЕРЪ, гомологичного гену люцерны .\4tEFD, была секвенирована у мутантных линий гороха 8СНЗР!х-1 (Р$5ут40) и 80ЕР1х~-6 (Рз$ут40) и исходной линии дикого типа БОЕ. На основе последовательности гена М£И) были созданы праймеры, позволяющие амплифицировать кДНК гомологичного гена РвЕРЭ. С использованием этих праймеров был амплифицирован фрагмент гена Р$ЕРЭ размером 603 нуклеотида. Фрагменты РвЕРБ, амплифицированные на кДНК мутантных линий 80ЕР|х"-1 (Р.Ч5ут40) и 50ЕПх"-6 (Р.^упИО) и исходной линии БОЕ были клонированы в плазмиды р.)ЕТЕ2 и рЕМТЯ. Секвенирование и выравнивание последовательностей фрагментов позволило выявить нуклеотидную замену, приводящую к появлению стоп-кодона в рамке считывания линии 80ЕР1х'-1 (Р$аут4()). Вместе с тем, у линии БСЕМх'-б {Рввут40) проанализированная последовательность оказалась идентична таковой у

исходной линии SGE. По всей видимости, мутация в гене PsEFD у линии SGEFix'-6 (Pssym40) может находиться в пределах начальных 20 нуклеотидов в 5'- и 3'-последовательностях транслируемой области гена (комплементарных праймерам), либо в нетранслируемой области данного гена. Наличие мутации в последовательности гена PsEFD у мутанта SGEFix"-l (Pssym40), локализация генов Pssym40 и MtEFD в синтенных районах генома и сходство мутантных фенотипов поддерживают предположение о том, что ген гороха Pssym40 является гомологом гена люцерны MtEFD. Для окончательного подтверждения этого необходимо завершить секвенирование гена PsEFD у мутантных линий и исходной линии SGE.

ВЫВОДЫ:

1. Впервые показано, что гены гороха Pssym40 и Pssym33 участвуют в различных механизмах генетического контроля формирования апрессориев в ходе развития арбускулярной микоризы.

2. Гены Pssym40 и Pssym33 оказывают влияние на динамику численности функциональных единиц арбускулярно-микоризного симбиоза - арбускул.

3. Впервые охарактеризовано влияние мутаций в генах Pssym40 и Pssym42 на экспрессию других генов, вовлеченных во взаимодействие с микроорганизмами, в азотфиксирующих клубеньках. Продемонстрирована регуляторная функция данных генов.

4. Создан набор из 75 межвидовых молекулярных маркеров для генетического картирования генов гороха посевного.

5. Симбиотический ген гороха Pssym40 впервые локализован в VII группе сцепления, для гена Pssym42 определена область вероятной локализации - в V группе сцепления генетической карты.

6. Обнаружение нонсенс-мутации в последовательности гена PsEFD у мутанта гороха SGEFix'-I (Pssym40) и сходная локализация генов PsEFD и Pssym40 позволили выдвинуть предположение о том, что гены Pssym40 и MtEFD являются гомологами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в изданиях, рекомендованных БАК:

1. Штарк О.Ю., Борисов А.Ю., Жуков В.А., Неманкин Т.А., Тихонович И.А. Многокомпонентный симбиоз бобовых с полезными почвенными микроорганизмами: генетическое и эволюционное обоснование использования в адаптивном растениеводстве // Экологическая генетика. 2011. Т. IX. №. 2. С. 80-94.

2. Борисов А.Ю., Штарк О.Ю., Жуков В.А., Неманкин Т.А., Наумкина Т.С., Пинаев А.Г., Ахтемова Г.А., Ворошилова В.А., Овчинникова Е.С., Рычагова Т.С., Цыганов В.Е., Жернаков А.И., Кузнецова Е.В., Гришина O.A., Сулима A.C., Федорина Я.В., Чеботарь В.К., Бисселинг Т., Лемансо Ф., Джианиназзи-Пирсон В., Ратэ П., Санхуан X., Соугаард Й., Берг Г., Макфи К., Эллис Н., Тихонович И.А. Взаимодействие бобовых с полезными почвенными микроорганизмами: от генов к сортам // Сельскохозяйственная биология. 2011. №3. С. 41-47.

3. Борисов А.Ю., Васильчиков А.Г., Ворошилова В.А., Данилова Т.Н., Жернаков А.И., Жуков В.А., Королева Т.А., Кузнецова Е.В., Мадсен Л., Мофетт М., Наумкина Т.С., Неманкин Т.А., Павлова З.Б., Петрова Н.Э., Пинаев А.Г., Радутоиу С., Розов

С.М., Соловов И.И., Стоугаард Й., Топунов А.Ф., Уиден Н.Ф., Цыганов В.Е., Штарк О.Ю., Тихонович И.А. Регуляторные гены гороха посевного (Pisum sativum L.), контролирующие развитие азотфиксирующих клубеньков и арбускулярной микоризы: фундаментальные и прикладные аспекты // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т. 43. №3. С.265-271.

Публикации в других изданиях: Статьи:

4. Жуков В.А., Неманкин Т.А., Овчинникова Е.С., Кузнецова Е.В., Жернаков А.И., Титов B.C., Гришина О.А., Сулима А.С., Борисов Я.Г., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Создание серии ген-специфичных молекулярных маркеров для сравнительного картирования геномов гороха посевного (Pisum sativum L.) и диплоидной люцерны (Medicago truncatula Gaertn.) // Фактори експериментально'1 еволюцп оргашзм!в: зб. наук. пр. / НАН УкраТни, АМН УкраУни, Укр. т-во генетигав i селекционерш ¡м. МЛ. Вавилова; редкол.: В.А. Кунах (голов ред.) [та ш.]. - К.: Логос, 2003-2010. Т. 9: Присвяч. 110-р1ччю вщ дня народж. Теодоая Григоровича Добржаньского. 2010. С. 30-34.

5. Nemankin Т.А., Shtark O.Y., Zhernakov АЛ., Borisov A.Y., Tikhonovich I.A. New mutant allele of the symbiotic gene sym40 of pea (Pisum sativum L.): dynamics of arbuscular mycorrhiza development // Pisum Genetics. 2007. V 39. P 32-35.

Тезисы конференций:

6. Жуков B.A., T.A. Неманкин, Е.С. Овчинникова, А.И. Жернаков, B.C. Титов, О.А. Гришина, А.С. Сулима, Т.С. Рычагова, Е.В. Кузнецова, А.Ю. Борисов, И.А. Тихонович (2010) Генетическое картирование симбиотических генов гороха посевного (Pisum sativum L.) с использованием ген-специфичных молекулярных маркеров. // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой. Материалы V Всероссийской конференции молодых ученых, 28 сентября -1 октября 2010 г., Саратов. С. 114.

7. Nemankin Т., Ovchinnikova Е., Zhukov V., Borisov A., Limpens Е., Geurts R., Tikhonovich I. Cloning of symbiotic genes of Pisum sativum L. Sym40 and Sym42, involved in symbiosome formation and maintenance // Abstract book of the 9th European Nitrogen Fixation Conference, 6-10 Sept. 2010, Geneva, Switzerland. P. 134.

8. Nemankin Т., E. Ovchinnikova, V. Zhukov, A. Borisov, E. Limpens, R. Geurts, I. Tikhonovich. The set of gene-based CAPS markers for mapping symbiotic genes of Pisum sativum L. //2nd Joint Retreat of PhD Students in Plant Sciences, Max-Planck-Institute for Plant Breeding Research, Cologne, Germany, 15.04.2010 - 17.04.2010. P.211.

9. Неманкин T.A., Жуков B.A., Кузнецова E.B., Титов B.C., Овчинникова Е.С., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Генетический контроль растений гороха посевного над развитием и функционированием мутуалистических эндосимбиозов // БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых (Россия, Пущино, 19-23 апреля 2010 года). Сборник тезисов. Т. 2. С. 162.

10. Nemankin Т.А., Shtark O.Y., Borisov A.Y., and Tikhonovich I.A. using of modified "nurse-pot" inoculation method for analysis of pea symbiotic mutants during arbuscular mycorrhiza development. // Book of abstracts of Postgraduate Course "Applied

and fundamental aspects of responses, signaling and developmental processes in the root-microbe systems" and Meeting of the Research Consortium on Evolution of Plant-Microbe Interactions. St.-Petersburg, Russia, June 25-July 2,2007. P.31.

11. Неманкин T.A., Штарк О.Ю., Цыганов B.E., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Развитие арбускулярной микоризы у двойного симбиотического мутанта гороха (Pisum sativum L.) RBT3 (sym33, sym40). // Тезисы 10-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века". 16-21 апреля 2006 г. Россия, Пущино. С. 45.

Подписано в печать 21.10.2011г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 120 экз. Заказ №2271.

Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. 24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Неманкин, Тимофей Александрович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Генетический контроль развития арбускулярной микоризы и бобово-ризобиального симбиоза у гороха посевного (обзор литературы).

1.1. Мутуалистические эндосимбиозы, образуемые бобовыми растениями.

1.2. Основные этапы развития арбускулярной микоризы и бобово-ризобиального симбиоза у гороха посевного.

1.2.1. Пресимбиотические взаимодействия партнеров.

1.2.2. Проникновение и распространение микросимбионтов в корне растения.

1.2.3. Формирование внутриклеточных симбиотических компартментов.

1.2.4. Завершение симбиотических взаимодействий, размножение эндосимбионтов и их выход в окружающую среду.

1.3. Генетическая программа гороха посевного, контролирующая развитие арбускулярной микоризы и бобово-ризобиального симбиоза.

1.3.1. Симбиотические гены гороха посевного.

1.3.1.1. Пресимбиотические взаимодействия симбионтов.

1.3.1.1.1. Сигнальные молекулы растения и активация ответа микросимбионтов

1.3.1.1.2. Восприятие сигнальных молекул микросимбионтов растением.

1.3.1.1.3. Передача сигнала от сигнальных молекул микросимбионтов.

1.3.1.2. Проникновение и распространение микросимбионтов в корне растения

1.3.1.3. Органогенез клубенька - кортикальная программа развития БРС.

1.3.1.4. Поздние стадии развития симбиозов.

1.3.2. Клонирование симбиотических генов гороха посевного.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ генетической системы гороха (Pisum sativum L.), контролирующей развитие арбускулярной микоризы и азотфиксирующего симбиоза"

В связи с активным заселением суши растениям необходимо было развивать новые способы адаптации к разнообразным изменениям условий окружающей среды, как абиотическими, так и биотическими. Появление способности корневой системы к установлению обоюдно полезных (мутуалистических) симбиотических взаимоотношений с микроорганизмами обусловило стратегию наземного образа жизни растений (Gianinazzi-Pearson, 1996). Наиболее распространенными типами таких растительно-микробных взаимодействий являются эндосимбиозы - арбускулярная микориза и бобово-ризобиальный симбиоз.

Арбускулярная микориза (AM) - мутуалистический эндосимбиоз, формируемый большинством наземных растений (80-90% видов) с грибами отдела Glomeromycota. Он играет важную роль в минеральном питании и защитных реакциях растений и может влиять на структуру растительного сообщества. Симбиотические взаимодействия с грибами AM улучшают водный статус и минеральное питание растений необходимыми элементами, прежде всего фосфором, повышают устойчивость растений к патогенам и » абиотическим стрессам (Smith, Read, 2008; Koltai, Kapulnik, 2010). Бобово-ризобиальный симбиоз (БРС) является более специфичным и образуется растениями семейства Fabaceae (Бобовые) при взаимодействии с клубеньковыми бактериями родов Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium, объединяемых под общим названием ризобии. При этом на корнях растений развиваются специализированные структуры - клубеньки, предоставляющие бактериям условия для фиксации атмосферного азота (Sprent, 2001; Dilworth et al., 2008). Образующие клубеньки растения получают возможность заселения субстратов, не содержащих связанного азота, а осуществление процесса фиксации определяет значительную роль БРС в круговороте азота в природе (Vance, 2001). Таким образом, мутуалистические симбиозы с грибами AM и ризобиями предоставляют растениям дополнительные возможности для выживания в различных условиях, а микросимбионтам - продукты фотосинтеза и экологические ниши (White et al, 2007; Dilworth et al., 2008; Smith, Read, 2008; Koltai, Kapulnik, 2010).

Интерес исследователей, направленный на изучение данных типов растительно-микробных взаимодействий, объясняется рядом причин. Во-первых, растительно-микробные системы "растение - грибы AM - клубеньковые бактерии" способствуют поддержанию естественного плодородия почв и биологического разнообразия экосистем, а применение микробных препаратов (микробиологических удобрений) на основе этих микроорганизмов позволяет снизить затраты на агрохимикаты и уменьшить хемогенную нагрузку на окружающую среду, что соответствует принципам адаптивного земледелия (Brockwell et al., 1995; Vance, 2001; Sessitsch et al., 2002; Кожемяков, Чеботарь, 2005; Sandhu et al., 2010). Во-вторых, эндосимбиозы бобовых - удобная модель для изучения процессов эволюции наземных растений и микроорганизмов, а также ряда ключевых функций растения: сигнальных процессов и экспрессии генов, клеточной дифференцировки и органогенеза, азотного, фосфорного и углеродного обмена.

Одним из основных направлений исследования эндосимбиотических' ' ( 1 '

1 itвзаимоотношений является изучение молекулярно-генетического контроля этих ' процессов. Детальное изучение генетической системы растений, определяющей развитие эндосимбиозов, позволит понять молекулярно-генетические механизмы взаимодействий бобовых растений с грибами AM и клубеньковыми бактериями, а также разработать научные подходы к управлению их эффективностью.

В ходе многолетних исследований было выяснено, что в процесс генетической регуляции развития и функционирования AM и БРС со стороны растения вовлечено несколько общих компонентов. Поскольку БРС является гораздо более специфичным, чем AM, и формируется только у растений семейства Fabaceae, основными объектами для изучения генетического контроля развития и функционирования данных типов растительно-микробных взаимодействий были выбраны некоторые представители именно этого семейства: виды Pisum sativum L., Lotus japonicus (Regel.) Larsen и Medicago truncatula Gaertn. Основным подходом в изучении данного процесса является использование экспериментального мутагенеза. Наибольшие успехи были достигнуты при идентификации симбиотических генов гороха посевного (Pisum sativum L.). В настоящее время известно более 40 симбиотических генов гороха, получено более 100 независимых мутантов (Борисов и др., 2007). Однако, нуклеотидная последовательность большинства симбиотических генов гороха все еще неизвестна. Одним из перспективных способов установления нуклеотидной последовательности генов, идентифицированных с помощью мутагенеза, является их точная локализация на генетической карте и последующее позиционное или функциональное клонирование.

Главной целью диссертационной работы являлся анализ роли компонентов генетической системы гороха (Pisum sativum L.) в контроле развития и функционирования симбиозов с эндомикоризными грибами {Glomus sp.) и клубеньковыми бактериями (Rhizobium leguminosarum bv. viciae).

Конкретными задачами работы являлись:

1. Фенотипическая характеристика проявления новой независимо полученной мутантной аллели гена Pssym40 (линия SGEFix"-6) в отношении развития арбускулярной микоризы;

2. Характеристика взаимодействия симбиотических генов гороха Pssym40 и Pssym33 в ходе развития арбускулярной микоризы;

3. Изучение влияния мутаций в генах Pssym40 и Pssym42 на экспрессию других генов гороха, вовлеченных во взаимодействие с микроорганизмами, в азотфиксирующих клубеньках;

4. Создание системы межвидовых молекулярных маркеров для генетического картирования и последующего клонирования симбиотических генов гороха;

5. Локализация симбиотических генов Рззут40 и Рззут42 на генетической карте гороха для их последующего позиционного клонирования.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Неманкин, Тимофей Александрович

выводы.

1. Впервые показано, что гены гороха Р5$ут40 и РйзутЗЗ участвуют в различных механизмах генетического контроля формирования апрессориев в ходе развития арбускулярной микоризы.

2. Гены Ря5ут40 и РяяутЗЗ оказывают влияние на динамику численности функциональных единиц арбускулярно-микоризного симбиоза - арбускул.

3. Впервые охарактеризовано влияние мутаций в генах Р$$ут40 и Р$$ут42 на экспрессию других генов, вовлеченных во взаимодействие с микроорганизмами, в азотфиксирующих клубеньках. Продемонстрирована регуляторная функция данных генов.

4. Создан набор из 75 межвидовых молекулярных маркеров для генетического картирования генов гороха посевного.

5. Симбиотический ген гороха Р$яут40 впервые локализован в VII группе сцепления, для гена Р$$ут42 определена область вероятной локализации - в V группе сцепления генетической карты.

6. Обнаружение нонсенс-мутации в последовательности гена РйЕГО у мутанта гороха 80ЕР1х"-1 (Рззут40) и сходная локализация генов РзЕГИ и Рз$ут40 позволили выдвинуть предположение о том, что гены Р5$ут40 и М1ЕРО являются гомологами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Одним из основных подходов, используемых при изучении генетического контроля развития биологических систем, является мутационный анализ. Применение данной методологии на модели развития эндосимбиозов бобовых позволило выявить у 10 видов бобовых растений более 100 генов, необходимых для успешной реализации этапов программы развития азотфиксирующего симбиоза и арбускулярной микоризы. К настоящему времени разносторонняя фенотипическая характеристика мутантов и последующее клонирование более десятка симбиотических генов привели к построению модели сложной системы регуляции развития мутуалистических эндосимбиозов со стороны бобовых растений (Борисов и др., 2007; Oldroyd, Downie, 2008). Данная система включает распознавание структур сигнальных молекул микросимбионтов, передачу сигнала от рецепторов и индукцию программ развития эндосимбиозов.

В исследования молекулярно-генетических механизмов развития эндосимбиозов вовлечен широкий круг модельных и сельскохозяйственно-ценных видов растений: бобовые - Lotus japonicus (Regel.) Larsen, Medicago truncatula Gaertn., Trifolium spp., Pisum sativum L., Medicago sativa L., Glycine max (L.) Merr., Cicer arietinum L., Vigna radiata (L.) R. Wilcz.; Phaseolus vulgaris L. и др., небобовые - Oryza spp., Solanum lycopersicum и др. Исследования широкого круга объектов создали основу для появления сравнительной симбиогенетики и позволяют использовать знания, накопленные при работе с модельными растениями, для изучения симбиотических генов сельскохозяйственно-ценных бобовых, в частности, гороха посевного (Pisum sativum L.) (Kalo et al., 2004; Zhu et al., 2005).

В данной работе проведено исследование компонентов генетической системы гороха посевного (Pisum sativum L.), контролирующей развитие бобово-ризобиального симбиоза и арбускулярной микоризы.

С использованием данных по секвенированию генома М. &ипсаШ1а и феномена сходной организации (синтении) геномов бобовых в ходе работы создан набор межвидовых молекулярных маркеров для картирования генов гороха с целью их последующего позиционного клонирования. Применение данного набора молекулярных маркеров позволило локализовать симбиотический ген гороха Ря5ут40 на генетической карте, а для гена Рззут42 определить вероятное место его локализации.

Полученные при фенотипической характеристике нового мутанта гороха по гену Рз$ут40 данные показали, что различные мутации в гене Рззут40 приводят к проявлению различных фенотипов при развитии АМ симбиоза. Кроме того, показано, что гены гороха Р$$ут40 и Рму/иЗЗ участвуют в различных механизмах генетического контроля формирования апрессориев в ходе развития арбускулярной микоризы, а также совместно оказывают влияние на динамику численности функциональных единиц данного симбиоза - арбускул.

Анализ экспрессии генов гороха посевного, вовлеченных во взаимодействие с микроорганизмами, в клубеньках растений, мутантных по генам Рй5ут40 и Рззут42 показал, что ген Рззут40 оказывает влияние на экспрессию целого ряда генов, контролирующих развитие различных стадий бобово-ризобиального симбиоза, а ген Рз$ут42, по-видимому, необходим для нормального функционирования всей системы генетического контроля развития бобово-ризобиального симбиоза растением.

Кроме того, проведение анализа сходств и различий в развитии бобово-ризобиального симбиоза у мутантов гороха по гену Р$зут40 и слабоусеченной люцерны по гену МЯ^О и картирование гена Р$зут40, позволили выдвинуть предположение о том, что гены МЕ/ГО и Р$$ут40 являются гомологами. Данное предположение было поддержано обнаружением нонсенс-мутации в последовательности гена РяБЕИ у мутанта гороха 80ЕР1х"-1 {Рз$ут40).

Полученные в диссертационной работе данные расширяют представления о функциях изученных симбиотических генов гороха и будут использованы при построении моделей регуляторных систем бобовых растений, контролирующих развитие и функционирование эндосимбиозов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Неманкин, Тимофей Александрович, Санкт-Петербург

1. Борисов А.Ю., Васильчиков А.Г., Ворошилова В.А., Данилова Т.Н., Жернаков

2. Ворошилова В.А. Генетический анализ процесса развития симбиотических клубеньков у гороха посевного (Pisum sativum L.) Диссертация на соискание ученой степени канд.биол.наук // СПб, СПбГУ. 2002.

3. Ежова Т.А., Солдатова О.П., Пенин A.A., Шестаков C.B. Молекулярно-генетическое картирование генома растений // М.: МАКС Пресс. 2002.

4. Жуков В.А., Штарк О.Ю., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Молекулярно-генетические механизмы контроля растением ранних стадий развития взаимовыгодных (мутуалистических) симбиозов бобовых // Генетика. 2009. Т. 45. №.11. Р. 1449-1460.

5. Игнатов В.В. Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями // М.: Наука. 2005.

6. Каратыгин И.В. Коэволюция грибов и растений // Труды Ботан. ин-та РАН. 1993.1. B. 9. С. 8-62.

7. Кожемяков А.П., Чеботарь В.К. Биопрепараты для земледелия // Биопрепараты в сельском хозяйстве / Под ред. Тихоновича И.А., Круглова Ю.В. / М. 2005. С. 18-54.

8. Проворов H.A. Растительно-микробные симбиозы как эволюционный континуум // Журнал общей биологии. 2009. Т. 70. №.1. Р. 10-34.

9. Проворов Н.А., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Сравнительная генетика и эволюционная морфология симбиозов растений с микробами-азотфиксаторами и эндомикоризными грибами // Журнал общей биологии. 2002. Т. 63. №.6. С. 451-472.

10. Серебровский А.С. Генетический анализ // М.: Наука. 1970.

11. Akiyama К., Matsuzaki К., Hayashi H. Plant sesquiterpenes induce hyphal branching in arbuscular mycorrhizal fungi //Nature. 2005. V. 435. P. 824-827.

12. Barker S.J., Tagu D., Delp G. Regulation of Root and Fungal Morphogenesis in Mycorrhizal Symbioses // Plant Physiology. 1998. V. 116. N. 4. P. 1201-1207.

13. Baron C., Zambryski P.C. The Plant Response in Pathogenesis, Symbiosis, and wounding: variations on a Common Theme? // Annu. Rev. Genetics. 1995. V. 29. P. 107-129

14. Baumbusch L.O., Sundal I.K., Hughes D.W., Galau G.A. & Jakobsen K.S. Efficient protocols for CAPS-based mapping in Arabidopsis // Plant Mol. Biol. Rep. 2001. V. 19. P. 137149.

15. Bentivenga S.P., Morton J.B. Systematics of Glomalean endomycorrhizal fungi: current views and future direction // Mycorrhizae and Plant Health / Eds. F.L. Pfleger, R.G. Linderman / MN. St. Paul: APS Press. 1994. P. 283-308.

16. Bergman K., Gulash-Hoffee M., Hovestadt R.E., Larosiliere R.C., Ronco P.G., Su L. Physiology of Behavioral Mutants of Rhizobium meliloti: Evidence for a Dual Chemotaxis Pathway // J. of Bacteriology. 1988. V. 170. N. 7. P. 3249-3254.

17. Besserer A., Puech-Pages V., Kiefer P., Gomes-Roldan V., Jauneau A., Roy S., Portais J.-C., Roux C., Becard G., Sejalon-Delmas N. Strigolactones Stimulate Arbuscular Mycorrhizal Fungi by Activating Mitochondria // PLOS Biol. 2006. V. 4. P. 1239-1247.

18. Bolle C. The role of GRAS proteins in plant signal transduction and development // Planta. 2004. V. 218. P. 683-692.

19. Brauner S., Murphy R.L., Walling J.G., Przyborowski J., Weeden N.F. STS Markers for Comparative Mapping in Legumes // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 2002. V. 127. N. 4. P. 616-622

20. Brewin N.J. Development of the legume root nodule // Annu. Rev. Cell Biol. 1991. V. 7. P. 191-226.

21. Brewin N.J. Plant Cell Wall Remodelling in the Rhizobium-Legume Symbiosis // Critical Reviews in Plant Sciences. 2004. V. 23. P. 293-316.

22. Brockwell J., Bottomley P.J., Thies J.I. Manipulation of rhizobia microflora for improving legume productivity and soil fertility: A critical assessment // Plant and Soil. 1995. V. 174. P. 143-180.

23. Caetano-Anollés G., Crist-Estes D.K., Bauer W.D. Chemotaxis of Rhizobium meliloti to the plant flavone luteolin requires functional nodulation genes // J. of Bacteriology. 1988. V. 170. N. 7. P. 3164-3169.

24. Charon C., Johansson C., Kondorosi E., Kondorosi A., Crespi M. Enod40 induces dedifferentiation and division of root cortical cells in legumes // PNAS. 1997. V. 94. P. 89018906.

25. Charon C., Sousa C., Crespi M., Kondorosi A. Alteration oienod40 Expression Modifies Medicago truncatula Root Nodule Development Induced by Sinorhizobium meliloti II The Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1953-1965.

26. Charpentier M., Bredmeier R., Wanner G., Takeda N., Schleiff E., Parniske M. Lotus japonicus CASTOR and POLLUX Are Ion Channels Essential for Perinuclear Calcium Spiking in Legume Root Endosymbiosis // The Plant Cell. 2008. V. 20. P. 3467-3479.

27. Cheghamirza K., Koveza O., Konovalov F. and Gostimsky S. Identification of RAPD markers and their use for molecular mapping in pea (Pisum sativum L.) // Cell. Mol. Biol. Lett. 2002. V. 7. N. 2B. P. 649-655.

28. Cohen M.F., Sakihama Y., Yamasaki H. Roles of Plant Flavonoids in Interactions with Microbes: from protection against pathogens to the mediation of mutualism // Recent Res. Devel. Plant Physiol. 2001. V. 2. P. 157-173.

29. Davis T.M. Two Genes That Confer Ineffective Nodulation in Chickpea (Cicer arietinum L.) // Journal of Heredity. 1988. V. 79. P. 476-478.

30. Demchenko K., Winzer T., Stougaard J., Parniske M., Pawlowski K. Distinct roles of Lotus japonicus SYMRK and SYM15 in root colonization and arbuscule formation // New Phytologist. 2004. V. 163. P. 381-392.

31. Demont N., Debellé F., Aurelle H., Dénarié J., Promé J.C. Role of the Rhizobium meliloti nodF and nodE genes in the biosynthesis of lipo-oligosaccharidic nodulation factors // Journal of Biological Chemistry. 1993. V. 268. P. 20134-20142.

32. Denarie J., Debelle F Rhizobium lipo-chitooligosaccharide nodulation factors: Signaling Molecules Mediating Recognition and Morphogenesis // Annu. Rev. Biochem. 1996. V. 65. P. 503-535.

33. D'Haeze W., Holsters M. Nod factor structures, responses, and perception during initiation of nodule development // Glycobiology. 2002. V. 12. N. 6. P. 79-105.

34. Dilworth M.J., James E.K., Sprent J.I., Newton W.I. Nitrogen-fixing leguminous symbioses // Springer Science+Business Media B.V. 2008.

35. Downie J.A. Infectious Heresy // Science. 2007. V. 316. P. 1296-1297.

36. Downie J.A. The roles of extracellular proteins, polysaccharides and signals in the interactions of rhizobia with legume roots // FEMS Microbiol Rev. 2010. V. 34. P. 150-170.

37. Edwards A., Heckmann A.B., Yousafzai F., Due G., Downie J.A. Structural Implications of Mutations in the Pea SYM8 Symbiosis Gene, the DMI1 Ortholog, Encoding a Predicted Ion Channel // MPMI. 2007. V. 20. N. 10. P. 1183-1191.

38. Endre G., Kereszt A., Kevei Z., Mihacea S., Kalo P., Kiss G. A receptor kinase gene regulating symbiotic nodule development //Nature. 2002. V. 417. P. 962-966.

39. Engvild J. Nodulation and nitrogen fixation mutants of pea (Pisum sativum) II Theor. Appl. Genet. 1987. V. 74. P. 711-713.

40. Esseling J., Lhuissier F., Emons A.M. Nod Factor-Induced Root Hair Curling: Continuous Polar Growth towards the Point of Nod Factor Application // Plant Physiology. 2003. V. 132. P. 1982-1988.

41. Estabrook E.M., Sengupta-Gopalan C. Differential Expression of Phenylalanine Ammonia-Lyase and Chalcone Synthase during Soybean Nodule Development // The Plant Cell. 1991. V. 3. P. 299-308.

42. Fahraeus G. The Infection of Clover Root Hairs by Nodule Bacteria Studied by a Simple Glass Slide Technique // J. Gen. Microbiol. 1957. V. 16. P. 374-381.

43. Ferguson B.J., Indrasumunar A., Hayashi S., Lin M.-H., Lin Y.-H., Reid D.E., Gresshoff P.M. Molecular Analysis of Legume Nodule Development and Autoregulation // Journal of Integrative Plant Biology. 2010. V. 52. P. 61-76.

44. Ferrol N., Barea J.M., Azcon-Aguilar C. Mechanisms of nutrient transport across interfaces in arbuscular mycorrhizas // Plant and Soil. 2002. V. 244. P. 231-237.

45. Foucher F., Kondorosi E. Cell cycle regulation in the course of nodule organogenesis in Medicago II Plant Molecular Biology. 2000. V. 43. P. 773-786.

46. Gleason С., Chaudhuri S., Yang Т., Munoz A., Poovaiah B.W., Oldroyd G.E.D. Nodulation independent of rhizobia induced by a calcium-activated kinase lacking autoinhibition //Nature. 2006. V. 441. P. 1149-1152.

47. Goedhart J., Hink M.A., Visser A.J.W.G., Bisseling Т., Gadella T.W.J. In vivo fluorescence correlation microscopy (FCM) reveals accumulation and immobilization of Nod factors in root hair cell walls // The Plant Journal. 2000. V. 21. P. 109-119.

48. Gonzalez-Rizzo S., Crespi M., Frugier F. The Medicago truncatula CRE1 Cytokinin Receptor Regulates Lateral Root Development and Early Symbiotic Interaction with Sinorhizobium meliloti // The Plant Cell. 2006. V. 18. P. 2680-2693.

49. Harrison M., Dixon R. Spatial patterns of expression of flavonoid/isoflavonoid pathway genes during interactions between roots of Medicago truncatula and the mycorrhizal fungus Glomus versiforme II The Plant Journal. 1994. V. 6. P. 9-20.

50. Harrison M.J. The arbuscular mycorrhizal symbiosis // Plant-Microbe Interactions / Eds. Stacey G., Keen N.T. / New York: Chapman and Hall. 1997. P. 1-34.

51. Harrison M.J. Molecular and cellular aspects of the arbuscular mycorrhizal symbiosis // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. V. 50. P. 361-389.

52. Hause В., Fester T. Molecular and cell biology of arbuscular mycorrhizal symbiosis // Planta. 2005. V. 221. P. 184-196.

53. Hayashi Т., Banba M., Shimoda Y., Kouchi H., Hayashi M., Imaizumi-Anraku H. A dominant function of CCaMK in intracellular accommodation of bacterial and fungal endosymbionts // The Plant Journal. 2010. V. 63. P. 141-154.

54. Hirsch A.M. Developmental biology of legume nodulation // New Phytologist. 1992. V. 122. P. 211-237.

55. Hoagland D.R., Arnon D.T. The water-culture method for growing plants without soil // Berkeley. USA: University of California California. Agriculture Experiment Station Circular. 1938. P. 347. (uht. no: Demchenko et al., 2004).

56. Irzikowska L., Wolko B. and Swi^cicki W.K. Interval Mapping of QTLs Controlling Some Morphological Traits In Pea // Cell. Mol. Biol. Lett. 2002. V. 7. N. 2A. P. 417-422.

57. Irzykowska L., Wolko B., Swiecicki W.K. The genetic linkage map of pea (Pisum sativum L.) based on molecular, biochemical and morphological markers // Pisum Genetics. 2001. V. 33. P. 13-18.

58. Ivanov S., Fedorova E., Bisseling T. Intracellular plant microbe associations: secretory pathways and the formation of perimicrobial compartments // Current Opinion in Plant Biology. 2010. V. 13. P. 372-377.

59. Jacobi L.M., Petrova O.S., Tsyganov V.E., Borisov A.Y., Tikhonovich I.A. Effect of mutations in the pea genes Sym33 and Sym40.1. Arbuscular mycorrhiza formation and function // Mycorrhiza. 2003a. V. 13. P. 3-7.

60. Jacobi L.M., Zubkova L.A., Barmicheva E.M., Tsyganov V.E., Borisov A.Y., Tikhonovich I.A. Effect of mutations in the pea genes Sym33 and Sym40. II. Dynamics of arbuscule development and turnover // Mycorrhiza. 2003b. V. 13. P. 9-16.

61. Jing R., Johnson R, Seres A., Kiss G., Ambrose M.J., Knox M.R., Ellis T.H.N., Flavell A.J. Gene-Based Sequence Diversity Analysis of Field Pea (Pisum) // Genetics. 2007. V. 177. P. 2263-2275.

62. Jones K.M., Kobayashi H., Davies B.W., Taga M.E., Walker G.C. How rhizobial symbionts invade plants: the Sinorhizobium-Medicago model // Nature. 2007. V. 5. P. 619-633.

63. Kalo P., Seres A., Taylor S.A., Jakab J., Kevei Z., Kereszt A., Endre G., Ellis T.H., Kiss G.B. Comparative mapping between Medicago sativa and Pisum sativum II Mol. Genet. Genomics. 2004. V. 272. N. 3. P. 235-246.

64. Kijne J.W. The Rhizobium Infection Process // Biological nitrogen fixation / Eds. Stacey G., Burris R.H., Evans H.J. / New York: Chapman and Hall. 1992. P. 349-398.

65. Koltai H., Kapulnik Y. Arbuscular Mycorrhizas: Physiology and Function // Springer Science + Business Media B.V. 2010.

66. Konieczny A., Ausubel F.M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers // The Plant Journal. 1993. V. 4. P. 403-410.

67. Konovalov F., Toshchakova E., Gostimsky S. A CAPS marker set for mapping in linkage group III of pea (Pisum sativum L.) // Cell. Mol. Biol. Lett. 2005. V. 10. N. 1. P. 163-171.

68. Koske R.E. Gigaspora gigantea: Observations on Spore Germination of a VA-Mycorrhizal Fungus // Mycologia. 1981. V. 73. N. 2. P. 288-300.

69. Limpens E., Franken C., Smit P., Willemse J., Bisseling T., Geurts R. LysM Domain Receptor Kinases Regulating Rhizobial Nod Factor-Induced Infection // Science. 2003. V. 302. N. 5645. P. 630-633.

70. Limpens E., Mirabella R., Fedorova E., Franken C., Franssen H., Bisseling T., Geurts R. Formation of organelle-like N2-fixing symbiosomes in legume root nodules is controlled by DMI2 // PNAS. 2005. V. 102. N. 29. P. 10375-10380.

71. Lopez-Raez J.A., Bouwmeester H. Fine-tuning regulation of strigolactone biosynthesis under phosphate starvation // Plant Signaling & Behavior. 2008. V. 3. N. 11. P. 963-965.

72. Marsh J.F., Schultze M. Analysis of arbuscular mycorrhizas using symbiosis-defective plant mutants // New Phytologist. 2001. V. 150. P. 525-532.

73. Morton N.E. Sequential Tests for the Detection of Linkage // American Journal of Human Genetics. 1955. V. 7. P. 277-318.

74. Morzhina E.V., Tsyganov V.E., Borisov A.Y., Lebsky V.K., Tikhonovich I.A. Four developmental stages identified by genetic dissection of pea (Pisum sativum L.) root nodule morphogenesis // Plant Science. 2000. V. 155. P. 75-83.

75. Muromtsev G.S., Marshunova G.A., Jacobi L.M. USSR Inventor's Certificate no. 1501509. 1989.

76. Murray J.D., Karas B.J., Sato S., Tabata S., Amyot L., Szczyglowski K. A Cytokinin Perception Mutant Colonized by Rhizobium in the Absence of Nodule Organogenesis // Science. 2007. V. 315. P. 101-104.

77. Nagahashi G., Douds J.D.D. Appressorium formation by AM fungi on isolated cell walls of carrot roots //New Phytologist. 1997. V. 136. P. 299-304.

78. Nemankin T., Shtark O., Zhernakov A., Borisov A., Tikhonovich I. A new mutant allele of symbiotic gene sym40 of pea (Pisum sativum L.): dynamics of arbuscular mycorrhiza development // Pisum Genetics. 2007. V. 39. P. 13-15.

79. Nguyen H.T., Wu X. Molecular Marker Systems for Genetic Mapping // The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping / Eds. Meksem K., Kahl G. / Weinheim. Wiley-VCH. 2005.

80. Novak K., Pesina K., Nebasarova J., Skrdleta V., Lisa L., Nasinec V. Symbiotic Tissue Degradation Pattern in the Ineffective Nodules of Three Nodulation Mutants of Pea (Pisum sativum L.) //Annals of Botany. 1995. V. 76. P. 303-313.

81. Novak K., Skrdleta V., Kropacova M., Lisa L., Nemcova M. Interaction of two genes controlling symbiotic nodule number in pea {Pisum sativum L.) // Symbiosis. 1997. V. 23. N. 1. P. 43-62.

82. Oldroyd G.E., Downie J.A. Nuclear calcium changes at the core of symbiosis signalling // Current Opinion in Plant Biology. 2006. V. 9. P. 351-357.

83. Oldroyd G.E., Downie J.A. Coordinating nodule morphogenesis with rhizobial infection in legumes // Annu. Rev. Plant Biol. 2008. V. 59. P. 519-546.

84. Parniske M. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses // Nature Rev Microbiol. 2008. V. 6. P. 763-775.

85. Radutoiu S., Madsen L.H., Madsen E.B., Felle H.H., Umehara Y., Gronlund M., Sato S., Nakamura Y., Tabata S., Sandal N., Stougaard J. Plant recognition of symbiotic bacteria requires two LysM receptor-like kinases //Nature. 2003. V. 425. P. 585-592.

86. Rae A.L., Bonfante-Fasolo P., Brewin N.J. Structure and growth of infection threads in the legume symbiosis with Rhizobium leguminosarum II The Plant Journal. 1992. V. 2. N. 3. P. 385-395.

87. Robledo M., Jimenez-Zurdo J.I., Velazquez E., Trujillo M.E., Zurdo-Pineiro J.L., Ramirez-Bahena M.H., Ramos B., Diaz-Minguez J.M., Dazzo F., Martinez-Molina E., Mateos

88. P.F. Rhizobium cellulase CelC2 is essential for primary symbiotic infection of legume host roots // PN AS. 2008. V. 105. N. 19. P. 7064-7069.

89. Rogers S.O., Bendich, A.J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Mol. Biol. 1985. V. 5. P. 69-76.

90. Roth L.E., Stacey G. Bacterium release into host cells of nitrogen-fixing soybean nodules: the symbiosome membrane comes from three sources // Eur. J. Cell. Biol. 1989. V. 49. P. 13-23.

91. Safronova V.l., Novikova N.I. Comparison of two methods for root nodule bacteria preservation: lyophilization and liquid nitrogen freezing // J. Microbiol. Methods. 1996. V. 24. P. 231-237.

92. Sandhu H., Wratten S.D., Cullen R. Organic agriculture and ecosystem services // Environmental science & policy. 2010. V. 13. P. 1-7.

93. Scheres B., van Engelen F., van der Knaap E., van de Wiel C., van Kämmen A., Bisseling T. Sequential Induction of Nodulin Gene Expression in the Developing Pea Nodule // The Plant Cell. 1990. V. 2. P. 687-700.

94. Sessitsch A., Howieson J.G., Perret X., Antoun H., Martinez-Romero E. Advances in Rhizobium research // Crit. Rev. Plant Sei. 2002. V. 21. P. 323-378.

95. Siciliano V., Genre A., Balestrini R., Cappellazzo G., deWit P., Bonfante P. Transcriptome Analysis of Arbuscular Mycorrhizal Roots during Development of the Prepenetration Apparatus // Plant Physiology. 2007. V. 144. P. 1455-1466.

96. Smit P., Raedts J., Portyanko V., Debelle F., Gough C., Bisseling T., Geurts R. NSP1 of the GRAS Protein Family Is Essential for Rhizobial Nod Factor-Induced Transcription // Science. 2005. V. 308. N. 5729. P. 1789-1791.

97. Smith F.A., Smith S.E. Structural diversity in (vesicular)-arbuscular mycorrhizal symbioses //New Phitol. 1997. V. 137. P. 373-388.

98. Smith S.E., Read D.J. Mycorrhizal Symbiosis // 3nd ed. Acad Press, San Diego, London, New York, Boston, Sydney, Tokyo, Toronto. 2008.

99. Sprent J.I. Nodulation in Legumes // Cromwell Press Ltd, Kew, Royal Botanical Gardens. 2001.

100. Sprent J.I. Which steps are essential for the formation of functional legume nodules? // NewPhytologist. 1989. V. 111. P. 129-153.

101. Steinkellner S., Lendzemo V., Langer I., Schweiger P., Khaosaad T., Toussaint J.-P., Vierheilig H. Flavonoids and Strigolactones in Root Exudates as Signals in Symbiotic and Pathogenic Plant-Fungus Interactions // Molecules. 2007. V. 12. P. 1290-1306.

102. Stracke S., Kistner C., Yoshida S., Mulder L., Sato S., Kaneko T., Tabata S., Sandal N„ Stougaard J., Szczyglowski K., Parniske M. A plant receptor-like kinase required for both bacterial and fungal symbiosis //Nature. 2002. V. 417. P. 959-962.

103. Tawaraya K., Hashimoto K., Wagatsuma T. Effect of root exudate fractions from P-deficient and P-sufficient onion plants on root colonisation by the arbuscular mycorrhizal fungus Gigaspora margarita II Mycorrhiza. 1998. V. 8. N. 2. P. 67-70.

104. Timmers A.C., Auriac M.C., Truchet G. Refined analysis of early symbiotic steps of the Rhizobium-Medicago interaction in relationship with microtubular cytoskeleton rearrangements //Development. 1999. V. 126. P. 3617-3628.

105. Timmers A.C.J., Soupene E., Auriac M.-C., de Billy F., Vasse J., Boistard P., Trouchet G. Saprophytic Intracellular Rhizobia in Alfalfa Nodules // MPMI. 2000. V. 13. N. 11. P. 12041213.

106. Tirichine L., James E.K., Sandal N., Stougaard J. Spontaneous Root-Nodule Formation in the Model Legume Lotus japonicus: A Novel Class of Mutants Nodulates in the Absence of Rhizobia // MPMI. 2006. V. 19. N. 4. P. 373-382.

107. Tirichine L., Sandal N., Madsen L., Radutoiu S., Albrektsen A.S., Sato S., Asamizu E., Tabata S., Stougaard J. A Gain-of-Function Mutation in a Cytokinin Receptor Triggers Spontaneous Root Nodule Organogenesis // Science. 2007. V. 315. P. 104-107.

108. Tsyganov V.E., Morzhina E.V., Stefanov S.Y., Borisov A.Y., Lebsky V.K., Tikhonovich I.A. The pea (Pisum sativum L.) genes sym33 and sym40 control infection thread formation and root nodule function// Mol. Gen. Genet. 1998. V. 259. P. 491-503.

109. Vance C.P. Symbiotic nitrogen fixation and phosphorous acquisition. Plant nutrition in the world of declining renewable resources // Plant Physiology. 2001. V. 127. P. 390-397.

110. Vasse J., De Billy F., Camut S., Trouchet G. Correlation between ultrastructural differentiation of bacteroids and nitrogen in fixation alfalfa nodules // J. of Bacteriology. 1990. V. 172. N. 8. P. 4295-4306.

111. Vierheilig, H., Coughlan, A. P., Wyss, U., Piche, Y. Ink and Vinegar, a Simple Staining Technique for Arbuscular-Mycorrhizal Fungi // Applied and Environmental Microbiology. 1998. V. 64. P. 5004-5007.

112. Vincent J.L., Dahiya P., Brewin N.J. Localized Expression of Cathepsin B-like Sequences from Root Nodules of Pea (.Visum sativum) II MPMI. 2000. V. 13. N. 7. P. 778-780.

113. Voroshilova V.A., Demchenko K.N., Brewin N.J., Borisov A.Y., Tikhonovich I.A. Initiation of a legume nodule with an indeterminate meristem involves proliferating host cells that harbour infection threads//New Phytologist. 2009. V. 181. P. 913-923.

114. Wasson A.P., Pellerone F.I., Mathesius U. Silencing the Flavonoid Pathway in Medicago truncatula Inhibits Root Nodule Formation and Prevents Auxin Transport Regulation by Rhizobia // The Plant Cell. 2006. V. 18. P. 1617-1629.

115. Weeden N.F., Moffet M. Identification of genes affecting root mass and root/shoot ratio in a JI1794 x 'Slow' RIL population // Pisum Genetics. 2002. V. 34. P. 28-31.

116. Weeden N.F., Tongue M. and Boone W.F. Mapping coding sequences in pea by PCR // Pisum Genetics. 1999. V. 31. P. 30-32.

117. White J., Prell J., James E.K., Poole P. Nutrient Sharing between Symbionts // Plant Physiology. 2007. V. 144. P. 604-614.

118. Winkel-Shirley B. Flavonoid Biosynthesis. A Colorful Model for Genetics, Biochemistry, Cell Biology, and Biotechnology // Plant Physiology. 2001. V. 126. P. 485-493.

119. Yang W.-C., Cremerz H.C., Hogendijk P., Katinakis P., Wijffelman C.A., Franssen H., Van Kämmen A., Bisseling T. ln-situ localization of chalcone synthase mRNA in pea root nodule development// The Plant Journal. 1992. V. 2. P. 143-151.

120. Yokota K., Hayashi M. Function and evolution of nodulation genes in legumes // Cell. Mol. Life Sci. 2011. V. 68. P. 1341-1351.

121. Zhu H., Choi H.K., Cook D.R., Shoemaker R.C. Bridging model and crop legumes through comparative genomics // Plant Physiology. 2005. V. 137. N. 4. P. 1189-1196.

122. Zhukov V., Radutoiu S., Madsen L., Rychagova T., Ovchinnikova E., Borisov A., Tikhonovich I., Stougaard J. The Pea Sym37 Receptor Kinase Gene Controls Infection-Thread Initiation and Nodule Development // MPMI. 2008. V. 21. N. 12. P. 1600-1608.

123. Слова особой благодарности автор считает своим приятным долгом выразить Е.В. Коженковой и К.В. Квитко наставникам и учителям, оказавшим значительное влияние на формирование личности автора не только как научного сотрудника, но и как человека.