Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика генов гороха (Pisum sativum L.), вовлечённых в формирование арбускулярной микоризы

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика генов гороха (Pisum sativum L.), вовлечённых в формирование арбускулярной микоризы"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА Елена Владиславовна

ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОВ ГОРОХА (PISUMSATIVUM L.), ВОВЛЕЧЁННЫХ В ФОРМИРОВАНИЕ АРБУСКУЛЯРНОЙ МИКОРИЗЫ

03.02.07 Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 ОКТ 2010

Санкт-Петербург

2010

004610792

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ) РАСХН, лаборатории генетики растительно-микробных взаимодействий, Санкт-Петербург, Пушкин

и в Национальном институте сельскохозяйственных исследований Франции (Institut National de la Recherche Agronomique - INRA), Дижон

Научные руководители: доктор биологических наук

Борисов Алексей Юрьевич

лаб. генетики растительно-микробных взаимодействий ВНИИСХМ РАСХН, Санкт-Петербург, Пушкин

профессор, доктор Джианиназзи-Пирсон Вивиен (Gianinazzi-Pearson Vivienne) институт INRA, Дижон, Франция

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук

Миронова Людмила Николаевна Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург

кандидат биологических наук Андронов Евгений Евгеньевич лаб. микробиологического мониторинга и биоремедиации почв ВНИИСХМ РАСХН, Санкт-Петербург, Пушкин

Ведущее учреждение: Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН,

Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится "■?/2010 г. в /4 часов на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан " 13 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.212.232.12

кандидат биологических наук Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Симбиоз между растениями и грибами арбускулярной микоризы (AM) является одним из наиболее древних и широко распространённых взаимовыгодных растительно-микробных взаимодействий. Его возникновение около 450 миллионов лет назад, вероятно, явилось ключевым фактором, способствовавшим колонизации растениями суши (Remy et al., 1994). Более 80% видов наземных растений формируют AM, что способствует улучшению их минерального питания (преимущественно фосфатного) и дополнительному поступлению воды в растение (Harrison et al., 2005). Была доказана роль AM симбиоза в повышении устойчивости растений к биотическим (патогены корней) и абиотическим (наличие тяжёлых металлов, засоленность почв, засуха) стрессовым факторам (Dumas-Gaudot et al., 2000; Gianinazzi et al., 2005). В свою очередь растение предоставляет грибу ассимилированный при фотосинтезе углерод, который он самостоятельно получает сапротрофным путём в недостаточном для нормальной жизнедеятельности количестве. Было подсчитано, что все растеши земли передают AM грибам около 5 миллиардов тонн углерода в год (Pamiske et al., 2004). Таким образом, научная, агрономическая и экологическая значимость данных взаимовыгодных растительно-грибных взаимодействий огромна.

Большую роль в процессе определения генетических детерминант симбиоза играет' получение и изучение симбиотических (SYM) мутантов растений с нарушениями развития AM, что даёт возможность исследовать симбиоз на конкретных этапах его формирования. Клонирование SYM генов позволяет определить молекулярные основы мутаций и предположить функцию молекулярных продуктов изучаемых генов.

Другим приоритетным направлением генетики симбиоза является идентификация генов растений и AM грибов, экспрессия которых существенно изменяется в процессе формирования и функционирования AM симбиоза. Такие гены можно рассматривать в качестве молекулярных маркеров процессов (сигаалинга, защитных реакций, метаболизма), происходящих в растении и трибе при симбиозе. Использование в исследованиях такого рода симбиотических мутантов растений с блоком развития AM существенно увеличивает информативность подхода и позволяет связать происходящие изменения с конкретными стадиями развития симбиоза.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение роли поздних симбиотических генов гороха PsSym36, PsSym33 и PsSym40 в формировании функционального AM симбиоза. Были поставлены следующие задачи исследования:

1. изучение эффекта мутаций в генах PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на экспрессию генов Glomus intraradices при формировании AM симбиоза;

2. изучение экспрессии генов гороха (Pisum sativum L.), предположительно связанных с формированием AM симбиоза, при микоризации корней растений дикого типа и мутантов RisNod24 (Pssym36), SGEFix'-2 (feymii) ^SGF.F^'-l (Pssym40);

3. анализ экспрессии генов G.intraradices в растительных клетках, содержащих арбускулы;

4. разработка молекулярных маркеров и анализ сцепления генов PsSym36, PsSym40 и маркеров для локализации генов на генетической карте гороха с целью их последующего точного картирования и позиционного клонирования.

Научная новизна. Впервые проведено исследование влияния мутаций в симбиотических генах гороха посевного (Pisum sativum L.) PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на экспрессию восьми генов Р. sativum и десяти генов G. intraradices, предположительно вовлечённых в формирование функционального АМ симбиоза. Было показано, что блокирование развития арбускул в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36) приводит к существенному снижению экспрессии большей части анализированных грибных и растительных генов, в то время как более высокие темпы микоризации корней мутанта SGEFix"-l (Pssym40) коррелируют с более высоким, чем у растений дикого типа, уровнем экспрессии изученных грибных генов. Мутации в генах PsSym33 и PsSym40 имеют менее выраженный эффект на экспрессию анализированных генов гороха, чем мутация в гене PsSym36. Использование метода микродиссекции клеток лазером позволило осуществить выделение РНК из клеток, содержащих арбускулы, и впервые продемонстрировать преимущественную экспрессию генов G. intraradices, кодирующих супероксиддисмутазу (SOD), стеароил-СоА-десатуразу (DESAT) и пептидил-пролил-изомеразу (PEPISOM), в арбускулах.

Методическая и практическая значимость. Методология и молекулярные инструменты, разработанные в данном исследовании, могут быть использованы в дальнейшем при изучении растительных и грибных генов, контролирующих формирование и функционирование АМ. Полученный растительный материал (популяции растений поколений F1 и F2), разработанные молекулярные маркеры, а также данные картирования могут существенно облегчить дальнейшую работу по локализации генов гороха PsSym36 и PsSym40 на генетической карте для последующего точного картирования и позиционного клонирования данных генов. Полученные данные экспрессии растительных и грибных генов могут послужить базой для последующей работы по определению роли генов PsSym36, PsSym33 и PsSym40 в формировании симбиотических взаимоотношений растения с клубеньковыми бактериями и грибами арбускулярной микоризы. Результаты проведённых исследований могут быть использованы в курсах генетики развития и функционирования растительно-микробных систем профильных институтов и университетов.

Финансовая поддержка. Стипендия Департамента Науки, технологии и космоса Французского посольства в Москве, гранты РФФИ (07-04-01558, 07-04-01171).

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международном симпозиуме и школе молодых учёных «The thírd Baltic sea región symposium and postgraduate course on agro-biotechnology focused on root-microbe systems» (Saint-Petersburg, Russia, 2007), конференциях «Plant-Microbial Interactions 2008 Conference» (Krakow, Poland, 2008), «Forum des Jeunes Chercheurs» (Besancon, France, 2008), «International Conference on Mycorrhiza 2009 ICOM6» (Belo Horizonte, Brazil, 2009), 9-м конгрессе IPMB «Leading Biology through Plant Science» (St Louis, USA, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 6 тезисов докладов на международных научных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, четырёх глав, включающих обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводов, списка литературы (259 наименований) и приложения. Работа изложена на 191 странице, содержит 23 рисунка и 19 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. В работе были использованы формообразцы и линии гороха посевного Pisum sativum L. из коллекции Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (SGE, SGEFix'-l (Pssym40), SGEFix"-2 (Pssym33)), Всероссийского института растениеводства им. Н.И. Вавилова (К3034, К1693, К7128.К8274), Д.Дюка (cv Finale, RisNod24 (PssymS6); INRA, Дижон, Франция), Северного генного банка (NGB1238, NGB 851, NGB2715).

Изолят AM гриба. В работе был использован гриб Glomus intraradices Schenck & Smith (BEG 141), предоставленный Международным банком Glomeromycota INRA, Дижон, Франция.

Штамм клубеньковых бактерий. Для инокуляции гороха был использован штамм Rhizobium leguminozarum bv. vicea CIAM1026 из коллекции В1ШИСХМ, Пушкин, Санкт-Петербург, Россия (Safronova, Novikova, 1996).

Условия вегетации растений.

Для экспериментов по анализу экспрессии генов семена проращивали в темноте на чашках Петри на смоченной дистиллированной водой фильтровальной бумаге. На 3-й день проростки были пересажены в 200 мл сосуды, содержащие смесь почвы и инокулюма, либо только почву (в зависимости от варианта опыта), по одному растению на сосуд. Растения выращивали в условиях климатической камеры (24/19° - температура день/ночь, 16ч - длина светого дня, 420 цто1 m'V, 70% - относительная влажность воздуха). Минеральное питание обеспечивалось модифицированным раствором Long Ashton (Hewitt, 1966), не содержащим соединений фосфора.

Для экспериментов по генетическому картированию растения выращивали в почве (рНвд 5.5, Р2О5 18.5 мг/100г почвы, К20 4.3 мг/100г почвы) или стерильном песке (в зависимости от задач) в вегетационных домиках в климатических условиях Ленинградской области.

Методы исследования.

Анализ микоризации растений проводили на 21-е и 28-е сутки после инокуляции. Корни окрашивали с помощью чёрной туши (Sheaffer Manufacturing Co., USA) по методике Верхейлиг (Vierheilig et al., 1998). Активность щелочной фосфатазы в микоризованных корнях определяли по методике Тиссеран (Tisserant et al., 1993). Параметры микоризации определяли по методике Тровло (Trouvelot et al., 1986).

Анализ экспрессии генов в корнях растений гороха. РНК выделяли из корней растений на 21-е и 28-е сутки после инокуляции G. intraradices по методике Логеманн (Logemann et al., 1987) с учётом модификаций Франкен и Градинер (Franken, Gradinger, 1994). ДНК удаляли, используя набор реактивов SV Total RNA Isolation System (Promega). Синтез кДНК проводили согласно протоколу Вейдмшш (Weidmann et al., 2004). Уровень экспресс™ генов определяли методом абсолютного количественного ПЦР «в реальном времени», используя набор реактивов Absolute QPCR SYBR Green (ABgene, UK), в термоциклере ABI PRISM 7900 (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA). Определяли абсолютное количество транскршттов в трёх биологических и трёх технических повторностях. Полученные дашше

нормализовали относительно уровня экспрессии генов контроля G. intraradices TEF (фактор элонгации 1, а- субъединица) и P. sativum G APD}! (глицеральдегид-фосфатдегидрогепаза).

Для анализа были выбраны следующие гены:

G. intraradices, кодирующие Н*-АТФазу (bt-ATPase), щелочную фосфатазу (ALP), ингибитор диссоциации RHO/GDP (RHO), пептидил-пролил-изомеразу (PEPISOM), субъединицу 2 протеасомы 26S (26S), регуляторную субъединицу протеасомы 26S (26SREG), стеароил-СоА-десатуразу (DESAT), тиоредоксин пероксидазу (ТШО), супероксиддисмутазу (SOD) и белок неизвестной функции (VACU);

P. sativum, кодирующие Н^-АТФазу (Н*-ATPase), фосфатный транспортер (РТ4), «голубой» медь связывающий белок (ВСОР), белок устойчивости к болезням (DRP), ингибитор трипсина (77), глутатион-З-трзнсферазу (GST), MAP кнназу (МАРК) и серин-протеазу (SERPROT).

Анализ экспрессии генов в клетках, содержащих арбускулы. Экспрессию генов определяли в корнях мутанта SGEFix"-l (Pssym40) на 28-е сутки после инокуляции. Корни фиксировали раствором Farmer's fixative solution, окрашивали раствором эозина, заключали в парафин. Срезы толщиной Юцм делали на микротоме Jung RM 2065 (Leika). Депарафикизацию образцов осуществляли раствором Histoclear II непосредственно перед микродиссекцией. Вырезание клеток осуществляли на Arctuius™Microdissection instrument (ARCTURUS NIKON inverse XTIOO). Для выделения РНК использовали набор реактивов PicoPure RNA Isolation kit (Arcturus), выделение проводили согласно протоколу производителя. Синтез кД11К осуществляли с использованием набора реактивов TargetAmp™2-Round aRNA amplification kit (Epicenter Biotechnologies, Madison,WI) согласно протоколу производителя. Уровень экспрессии генов определяли методом абсолютного количественного ПЦР «в реальном времени», как было описано ранее.

Разработка молекулярных маркеров и генетическое картирование. ДНК выделяли, используя СТАВ буфер, согласно протоколу Роджерс и Бендич (Rogers, Bendich, 1985). Для картирования в качестве молекулярных маркеров были использованы гены известной локализации на генетической карте гороха. Амплификацию проводили методом ПЦР с использованием праймеров, нуклеотидные последовательности которых были ранее опубликованы, либо проводили конструирование праймеров на основе консервативных участков гомологичных генов у разных видов растений. Для определения нуклеотидного полиморфизма между родителями продукты амплификации секвенировали, используя набор реактивов GenomeLab™ DTCS Quick Start kit (Beckman Coulter) и секвенатор CEQ™8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter) согласно протоколу производителя.

Статистическая обработка данных. Для обработки данных микоризации использовали критерий Стьюдента. Достоверность различий в уровне экспрессии генов (количество транскриптов) определяли методом однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа. Генетическое картирование проводили с помощью программы MapL98 (Prof. Yasui Ukai, Biometrics Laboratory, Graduate School of Agricultural Life Science, the University of Tokyo).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние мутаций в генах РвЯутЗб, РйЗутЗЗ и Рв5ут40 на формирование арбускулярной микоризы. Для анализа влияния мутаций в 5УМ генах гороха на уровень транскрипции отобранных генов растения и АМ гриба была изучена колонизация корней растений грибом. Параметры микоризации определяли на 21-е и 28-е сутки после инокуляции О. ¡п1гага<Исез. Для визуализации АМ грибов использовали окрашивание чёрной тушью, а для анализа функциональной активности симбиоза определяли активность щелочной фосфатазы. Мутация в гене Л5>таЗй приводила к блокированию процесса формирования арбускул, а также к снижению колонизации корней в целом (табл. 1). В корнях мутанта по гену РяЗутЗЗ было показано снижение интенсивности АМ колонизации на 21-е сутки после инокуляции, в то время как достоверных различий в параметрах микоризации между мутантом и диким типом на сроке 28 дней после инокуляции отмечено не было, что свидетельствует о замедленном развитии АМ в корнях данного мутанта (табл. 2). В корнях мутанта 50Ер1Х-1 (Р$,5ут40) было показано увеличение интенсивности микоризации и формирования арбускул по сравнению с растениями дикого типа как на 21-е, так и на 28-е сутки после инокуляции (табл. 2). Показанные нарушения АМ фенотипа у мутантов по генам РьЗутЗб, Р$ЗутЗЗ и Рз5ут40 соответствуют данным более ранних исследований (С^ашпаи-Реагеоп й а1., 1992; .ГасоЫ е1 а1., 2003).

Таблица 1. Параметры микоризации растений дикого типа (wild type- wt) cv Finale и мутанта RisNod24 (Pssym3S) на 28 сутки после инокуляции G. intraradices

Линия гороха F, % M,% m, % a, % A, %

Окрашивание тушью

Finale (wt) 83.8 ±5.3 47.6 ± 7.0 55.6 ±5.4 19.9 ±3.1 9.8 ±2.1

RisNod24 (Pssym36) 61.2 ±6.8 11.6±3.0 18.4 ±3.6 4.6 ±0.7 0.6 ±0.2

Структуры гриба с активной щелочной фос( )атазой

Finale (wt) 78.5 ±3.7 9.1 ± 2.7 11.1 ±2.8 19.0 ±3.8 2.0 ±1.0

RisNod24 (Pssym36) 69.8 ±6.1 6.0 ±0.9 8.7 ± 1.1 13.8 ±2.0 0.8 ±0.1

И - частота микоризации корневой системы; М - интенсивность АМ колонизации корневой системы; т - интенсивность АМ колонизации михоризованных фрагментов корня; А -содержание арбускул в корневой системе; а - содержание арбускул в микоризованных фрагментах корня.

Таблица 2. Параметры микоризации растений дикого типа (wild type- wt) SGE и мутантов SGEFix"-2 (Pssym33), SGEFix'-l (Pssym40) на 28 сутки после инокуляции G. intraradices

Линия гороха F, % M,% m,% a, % A, %

Окрашивание тушью j :

SGE (wt) 99.1 ±0.9 36.3 ±5.6 36.5 ±5.5 21.5 ± 3.6 : 9:1 ±3.9

SGEFix"-2 (Pssym33) 99.1 ±0.9 27.7 ±3.0 27,9 ±3.0 24.8 ±1.9 7.0- 1.1

SGEFix'-l (Pssym40) 99.2 ±0.8 29.3 ± 1.9 29.6 ±2.1 25.1 : 3.5 ¡.7^5 ±1.4

Структуры гриба с активной щелочной фосс lara ioii ] j !'3 ; ■

SGE (wt) 93. ±3.71 15.0 ±3.2 15.9 ±3.0 22.5 : 4.8 1 ■■ 3.8 ± 1.3

SGEFix"-2 (Pssym33) 94.1 ±2.8 11.6± 1.5 11.8 ± 1.6 2з;;2±И ||.2^±0.8

SGEFix"-l (Pssym40) 95.7 ±2.3 29.5 ±4.2 30.5 ±3.9 24.^5 ±|.7 j:; ¡13 ±1.6

Обозначения как и к табл. 1.

Экспрессия генов Glomus intraradices при формировании AM у мутантов гороха RisNod24 (Pssym36), SGEFix*-2 (Pssym33) и SGEFix"-l (Pssym40). Исследования проводили на 21-е и 28-е сутки после инокуляции. Для анализа были выбраны гены G. intraradices, связь экспрессии которых с формированием функционального AM симбиоза была показана в более раннем исследовании (Seddas et al., 2009). Это гены G. intraradices, кодирующие белки, гипотетически вовлеченные в процессы транспорта, сигнапинга, транскрипции, синтеза белков, первичного и вторичного метаболизма (список генов в разделе «Материалы и методы«). Проведённый анализ транскрипции показал, что мутация в гене PsSym36, приводящая к блокированию формирования симбиоза на стадии арбускул, оказывает также существенное влияние на экспрессию генов G. intraradices. Количество транскриптов большинства вовлечённых в анализ генов, было существенно ниже в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36), чем у растений дикого типа (рис. 1). В свою очередь, мутация в гене PsSym40, результатом которой являются более высокие темпы микоризации и деградации арбускул, привела к существенному увеличению экспрессии части анализированных грибных генов (рис. 2). Мутация в гене PsSym33 оказала наименьший эффект на экспрессию грибных генов, что согласуется с менее выраженным отклонением параметров микоризации

корней мутанта от дикого типа (табл. 2). , ......^

Так, в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36), имеющего дефект ражшия арбускул, было показано существенное по сравнению с диким типом снижений экспрессии гена, кодирующего Н+-АТФазу, функция которой, как известно, заключается1 в; обеспечении активного транспорта веществ через мембрану. Отсутствие обмена метаболитами между симбионтами в корнях мутанта по гену PsSym36 также объясняет низкий уровень экспрессии гена DESAT, который играет роль в модификации метаболизма липидов в грибной клетке, а именно, в биосинтезе жирных кислот. В корнях же мутанта по гену PsSym40 было отмечено существенное по сравнению с растениями дикого типа увеличение количества транскриптов генов if-ATPase и DESAT, что отражает более высокую метаболическую активность AM в корнях этого мутанта.

ff ATPase

lUt

1 a 1

26SREG

IL

THIO

a t Ц a

: 11 JLt

VACU

ILa

28 21 28 Сутки после инокуляции G. irUroradices

Рисунок 1. Экспрессия генов G. intraradices в микоризованных корнях растений дикого типа Finale (■) и мутанта RisNod24 (Pssym36) (□) на 21 и 28 сутки после инокуляции. Буквами обозначены достоверные различия в уровне экспрессии генов (Р<0.05). I - стандартная ошибка, nd - экспрессия не определяется.

кi

RHO

•Él

b

л

Ul

ti

SOD

Л

21

-JLL

26SREG

Ш Ií¿_

7H/0

b

U£

21

28

28

Сутки после инокуляции G. intraradices

Рисунок 2. Экспрессия генов G. intraradices в микоризованных корнях растений дикого типа SGE (■ и мутанта SGEFix"-l (Pssym40) (ЕЗ) на 21 и 28 сутки после инокуляции. Буквами обозначены достоверные различия в уровне экспрессии генов (Р<0.05). I -стандартная ошибка.

В корнях мутантов RisNod24 (Pssym36) и SGEFix"-l (Pssym40) было показано изменение экспрессии генов PEPISOM и 26SREG, кодирующих шаперон и белок, участвующий в выборочной деградации аномальных и нормальных короткоживущих белков, а также генов антиоксидативного метаболизма, ТНЮ и SOD, являющихся частью защитной системы гриба, активируемой при колонизации корней растения. Неожиданным стало увеличение экспрессии гена ALP в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36), имеющего дефект развития арбускул, а также в корнях мутанта SGEFix"-2 (Pssym33) на 21 сутки после инокуляции, когда микоризация корней мутанта ещё сильно отставала от растений дикого типа. Как предполагают, щелочная фосфатаза гриба может играть роль в транспорте фосфата от гриба к растению. Увеличение экспрессии гена ALP в условиях не полностью сформированного симбиоза, установленное в данном исследовании, может свидетельствовать как об аккумуляции транскриптов гена до полного формирования симбиоза, так и о функции фермента, несколько отличной от предполагаемой.

В целом уровень транскрипции генов, кодирующих белки различных функциональных групп, в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36) был ниже, чем в корнях растений дикого типа, что, вероятно, является результатом создания неоптимальных условий развития и активности гриба внутри корня мутанта. Увеличение экспрессии части исследованных генов в корнях мутанта SGEFix"-l (Pssym40) может быть связано с более высокими темпами развития AM симбиоза в его корнях.

Дифференциальная экспрессия генов Pisum sativum L., предположительно связанных с формировнием AM, в корнях мутантов гороха RisNod24 (Pssym36), SGEFix"-2 (Pssym33) и SGEFix'-l (Pssym40). Co стороны растения в качестве молекулярных маркеров AM симбиоза было отобрано 8 известных генов, предположительно вовлечённых в процессы формирования и/или функционирования AM симбиоза (Krajinski et al., 2002; Wulf et al., 2003; Liu et al., 2003; Brechenmacher et al., 2004; Granwald et al., 2004; Massoumou et al., 2007). Список генов представлен в разделе «Материалы и методы». Нуклеотидные последовательности генов гороха ft-ATPase, РТ4, GST и SERPROT были не известны. По этой причине первоначально была проведена работа по конструированию ген-специфичных праймеров и амплификации фрагментов данных генов у гороха.

Проведённый анализ экспрессии показал, что все гены активны как в микоризованных, так и в нсинокулированных корнях растений дикого типа и мутантов. Наибольший эффект на экспрессию генов имела мутация в гене PsSym36 (рис. 3), в то время как изменения экспрессии генов в корнях мутантов SGEFix"-2 (Pssym33) и SGEFix"-l (Pssym40) были менее выражены. Зависимость экспрессии от процессов формирования и функционирования AM симбиоза была показана для всех генов гороха за исключением гена, кодирующего ЬГ-АТФазу. Особо следует отметить гены РТ4, TI и GST, экспрессия которых существенно увеличивалась при инокуляции растений дикого типа и мутантов по генам PsSym33, PsSym40 и не изменялась (по сравнению с неинокулированным диким типом) при микоризации мутанта по гену Pssym36, что свидетельствует о связи функции генов с формированием функциональных арбускул. Ген PsPT4 имеет высокую степень гомологии с AM специфичным фосфатным транспортером люцерны и, вероятно, его функция в арбускулах связана с транспортом фосфата в растение. Глутатион-5-трансфераза (GST) играет важную роль в защитных механизмах растений (Anderson and Davis, 2004). Ингибитор

трипсина (77), вероятно, вовлечён в контроль развития гриба внутри растительной клетки. Более точное определение функции изучаемых генов в АМ симбиозе требует дальнейших исседований.

H'ATPase

РТ4

ВСОР

DRP

МАРК

M

SERPROT

а

ш.

21 28 21 28

Сутки после инокуляции G. intraradices

Рисунок 3. Экспрессия генов гороха в микоризованных и неинокулированных корнях растений дикого типа cv Finale ( ■ , □) ив микоризованных и неинокулированных корнях мутанта RisNod24 (Pssym36) ( S,S ) на 21 и 28 сутки. Буквами обозначены достоверные различия в уровне экспрессии генов (Р<0.05). I - стандартная ошибка.

Анализ гранскрннции генов G. intraradices в клетках, содержащих арбускулы.

Одной из задач исследования являлась идентификация генов G. intraradices, экспрессия которых связана с формированием и/или функционированием арбускул. Основываясь на полученных данных экспрессии грибных генов в корнях мутантов RisNod24 (Pssym36) и SGEFix'-I (Pssym40), для анализа, в качестве наиболее вероятных кандидатов, были отобраны гены SOD, DEASATи PEPISOM (рис. 1, рис. 2). Исследование проводили в корнях мутанта SGEFix'-l (Pssym40), для которого характерен более быстрый оборот арбускул. Количество транскриптов определяли в вырезанных лазером клетках, содержащих арбускулы, и в образцах (срезах), не подвергавшихся микродиссекции (рис. 4, рис. 5). Полученные данные нормализовали относительно количества транскриптов гена контроля TEF.

Рисунок 4. Вырезание лазером из микоризованных корней мутанта 5СЕЕ1х-1 (Рмуш^О) кортикальных клеток, содержащих арбускулы. А - отображение образца на мониторе компьютера; В - выделение клеток, содержащих арбускулы, используя графическое компьютерное обеспечение; С - ЬСМ Сар, содержащая вырезанные клетки; Р - клетки, вырезанные ПК лазером.

JH

SOD

Рисунок 5. Экспрессия генов й. ШгагасЧсеъ

в образцах, не подвергавшихся микродиссекции (контроль) (■), и в вырезанных лазером клетках, содержащих арбускулы (И).

DESAT PEPISOM

Проведённые исследования позволило подтвердить преимущественную экспрессию генов SOD, DESAT и PEPISOM в арбускулах мутанта SGEFix"-l (Pssym40). Было установлено, что количество транскриптов генов SOD, DESAT и PEPISOM в клетках, содержащих арбускулы, превышает количество транскриптов этих генов в образцах, не подвергавшихся микродиссекции, в 60, 6 и 2117 раз соответственно.

Показанная активация гена антиоксидативного метаболизма 50Д вероятно, является результатом ответной реакции гриба на генерацию растением реакций защиты и/или стресса, которые, как было показано ранее ^¡ашпает-Реагеоп й а1., 1996), имеют место в клетках, содержащих арбускулы. Значительное увеличение экспрессии гена ОЕЗЛТ, кодирующего стеароил-СоА-десатуразу, с одной стороны, может быть связано с получением грибом фотосинтетического углерода от растения при формировании арбускул, с другой - с его участием в модификации плазматической мембраны грибов в процессе формирования арбускул. Ген РЕР180М, кодирующий пептидил-пролил-изомеразу, являющуюся шапероном, наиболее вероятно играет роль в процессе формирования и деградации арбускул. Однако, несмотря на полученные данные, требуется дальнейшее детальное изучение роли генов 50Д йЕЗАТ и РЕР180М в процессах формирования и функционирования АМ симбиоза в целом и арбускул в частности.

Локализация генов Р-^утЗО и РзВут40 на генетической карте гороха. В

проведённом ранее картировании с использованием небольшой (50 растений) популяции И2 (В. Жуков, личное сообщение) было обнаружено сцепление гена РйЗутЗб с морфологическим маркером и>Ь. В данной работе была получена выборка ¥2 большего объёма (217 растений) и проверено сцепление данных генов. Было показано, что гены РэЗутЗб и не сцеплены. Для локализации гена Р&5гут¥0 было отобрано 34 гена известной локализации на генетической карге гороха в группах сцепления I, И, III и V. На основе обнаруженного нуклеотидного полиморфизма между родителями было сконструировано 18 молекулярных маркеров. Однако проведённое картирование не привело к локализации гена

Рэ8ут40 на генетической карте гороха. Поскольку

использованные молекулярные маркеры перекрывают большую часть генетической карты I, II, III и V групп сцепления гороха (рис. 6), локализация гена Р$5ут40 в изученных сегментах данных групп сцепления может быть исключена.

Рисунок 6.

Локализация молекулярных маркеров на генетической карте гороха

Штриховкой выделены области, в которых локализация гена может быть

исключена.

• ' АССох

К?'$>«110

1611

;Т1||оР

. 1 «Рдт

16111 1&Ч

• • |ЧДАТ1

МР

• ■ Нпо!

• - «N1

■ • Ив 2

ии>*|<1

ВЫВОДЫ

1. Мутация в гене PsSym36 приводит к нарушению формирования арбускул, в то время как мутации в генах PsSym33 и PsSym40 - к изменениям скорости и интенсивности микоризации растений, что подтверждает данные более ранних исследований.

2. Эффект мутаций в генах гороха PsSym36, PsSym33 и PsSym40 проявляется как в нарушении колонизации и морфологической дифференциации грибов Glomus intraradices в процессе формирования арбускулярной микоризы, так и в изменении активности генов Pisum sativum L. и Glomus intraradices Schenck & Smith, определенный уровень экспрессии которых необходим для функционирования данного симбиоза.

3. Мутация в гене PsSym36 приводит к существенным изменениям, большей частью к снижению, экспрессии генов G. intraradices и P. salimm, что, очевидно, отражает роль данного гена в развитии арбускул в клетках корня растеши.

4. Мутация в гене PsSym33 оказывает менее выраженный эффект на экспрессию генов G. intraradices и P. sativum, также как и на формирование и функционировать AM симбиоза, чем мутации в генах PsSym36 и PsSym40.

5. Мутация в гене PsSym40 приводит к увеличению уровня экспрессии большинства проанализированных генов G. intraradices, а также части генов P. sativum, что, вероятно, связано с более высокими темпами формирования AM симбиоза в корнях мутанта по гену Pssym40.

6. Увеличение уровня экспрессии генов G. intraradices, кодирующих супероксиддисмугазу (SOD), стеароил-СоА-десатуразу (DESA Т) и пептидил-пролил-изомеразу (PEPISOM), в клетках корня мутанта SGEFix"-l (Pssym40), содержащих арбускулы, является доказательством роли данных генов в формировании и функционировании арбускул.

7. Анализ сцепления гена PsSym40 с набором молекулярных маркеров позволил исключить локализацию данного гена в изученных районах групп сцепления гороха I, II, III и V.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Борисов, А.Ю. Регуляторные гены гороха посевного (Pisum sativum L.), контролирующие развитие азотфиксирующих клубеньков и арбускулярной микоризы: фундаментальные и прикладные аспекты / А.Ю. Борисов, А.Г. Васильчиков, В.А. Ворошилова ... Е.В. Кузнецова и др. // Прикладная биохимия и микробиология. -2007,- Vol. 43, N 3. - С. 265 - 271.

2. Zhukov, V.A. Gene-based markers of pea linkage group V for mapping genes related to symbioses / V.A. Zhukov, E.V. Kuznetsova. E.S. Ovchinnikova et al. // Pisum Genetics.-2007. -Vol. 39. - P. 19-25.

3. Seddas-Dozolme, P. Expression profiling of fungal genes during arbuscular mycorrhiza symbiosis establishment using direct fluorescent in situ RT-PCR. / P. Seddas-Dozolme, C.

Arnould, M. Tollot, E. Kuznetsova et al. // Molecular and Cell Biology Methods for Fungi. Berlin-Heidelberg, 2009. - P. 137-152.

4. Kuznetsova. E. Symbiosis-related pea genes modulate fungal and plant gene expression during the arbuscule stage of mycorrhiza with Glomus intraradices / E. Kuznetsova. P. Seddas-Dozolme, C. Arnould et al. П Mycorrhiza.- 2010. - Vol. 20, N6.-P. 427-43.

Тезисы конференций:

1. Kuznetsova. E. Effect of pea (Pisum sativum L.) gene PsSym36 on Glomus intraradices Schenck &Smith gene expression / E. Kuznetsova. P. Seddas-Dozolme, V. Gianinazzi-Pearson, A. Borisov // The third Baltic sea region symposium and postgraduate course on agro-biotechnology focused on root-microbe systems: Abstract book (St.Petersburg, Russia, 25 June- 2 July, 2007).- St. Petersburg, 2007,- p. 33.

2. Zhukov, V.A. Genome synteny of pea and model legumes: from mutations through genetic mapping to the genes / V.A. Zhukov, A.Y. Borisov, E.V. Kuaietsova et al. // 15ь International Congress on Nitrogen Fixation: Abstract book (Cape Town, Suth Africa, 21-26 January, 2007). - Cape Town, Suth Africa, 2007. - p. 62.

3. Gianinazzi-Pearson, V. Signposting compatibility events driving the mycorrhizal rout / V. Gianinazzi-Pearson, P. Seddas, M. Tollot, E. Kuznetsova et al. // Plant-Microbial Interactions 2008 Conference: Abstract book (Krakow, Poland, 2-5 July, 2008). - Krakow, Poland, 2008.-p. 37.

4. Kuznetsova. E. Effect of mutations in pea genes PsSym36, PsSym33 and PsSym40 on Glomus intraradices gene expression / E. Kuznetsova. Seddas P., V. Gianinazzi-Pearson et al. // Forum des Jeunes Chercheurs: Abstract book (Besancon, Francc, 12-13 June, 2008). -Besancon, France, 2008. - p. 51.

5. Kuznetsova. E. Pea genes modulate symbiosis-associated fungal and plant molecular responses during late stages of the arbuscular mycorrhizal symbiosis / E. Kuznetsova. P. Seddas-Dozolme, C. Arnould et al. // The International Conference on Mycorrhiza 2009 ICOM6: Abstract book (Belo Horizonte, Brazil, 9-14 August, 2009). - Belo Horizonte, Brazil, 2009.-p. 35.

6- Kuznetsova. E. Pea genes modulate symbiosis-associated fungal and plant molecular responses during late stages of the arbuscular mycorrhizal symbiosis / E. Kuznetsova. P. Seddas-Dozolme, C. Amould et al. // 9th IPMB Congress "Leading Biology through Plant Science": Abstract book (St. Louis, MO - USA, 25-30 October, 2009). - St. Louis, USA, 2009.-p. 27.

Подписано в печать 01.09.2010 Формат 60х84'Лб Офсетная печать Печ. л. 1.0 Уч.-изд.л. 1.0 Тираж 100 Заказ 02/09 бесплатно

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт»

(191015, г. Санкт-Петербург, ул. Шпалерная, дом 51, офис 345)

Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузнецова, Елена Владиславовна

Список сокращений

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1. Арбускулярная микориза (AM)- один из наиболее распространённых симбиозов в природе

1.2. Формирование AM симбиоза

1.2.1. Стадии формирования AM

1.2.2. Цитологическая реорганизация растительной клетки в процессе формирования AM

1.2.3. Микоризные мутанты растений

1.3. Молекулярные основы AM симбиоза

1.3.1. Ранние сигнальные взаимодействия

1.3.2. Гены растения, активируемые на ранних стадиях формирования AM симбиоза

1.3.3. AM специфичная экспрессия растительных и грибных генов

1.3.4. Широкомасштабные исследования симбиоз-зависимых изменений транскриптома растений и грибов

1.3.5. Влияние sym мутаций растений на активность генов симбиотических партнёров при образовании AM

1.3.6. Сходство AM симбиоза и симбиоза бобовых растений с клубеньковыми бактериями (Rhizobium)

1.4. Генетическое картирование симбиотических генов бобовых растений для последующего позиционного клонирования генов

1.4.1. Клонирование симбиотических генов гороха

1.4.2. Использование молекулярных EST (expressed sequence tag-based) маркеров для генетического картирования

I.4.3. Использование синтении между геномами бобовых растений для картирования генов

Глава II. Материалы и методы

IL1. Биологический материал

11.2. Условия вегетации растений и отбор образцов для анализа

11.3. Определение параметров микоризации корней

11.4. Вырезание лазером кортикальных клеток, содержащих арбускулы (метод Laser Capture Microdissection)

1Г.4.1. Подготовка тканей к микродиссекции

II.4.2. Микродиссекция клеток, содержащих арбускулы

11.5. Гибридологический анализ • 66

11.6. Выделение нуклеиновых кислот

11.6.1. Выделение РНК из корней растений

11.6.2. Выделение РНК из вырезанных лазером клеток, содержащих арбускулы

11.6.3. Выделение ДНК из листьев растений 69 И.6.4. Выделение плазмидной ДНК

11.7. Разделение нуклеиновых кислот электрофорезом в геле

11.7.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле

11.7.2. Разделение РНК в денатурирующем агарозном геле 71 II. 8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

П.8.1.ПЦР

11.8.2. Конструирование праймеров

11.8.3. Синтез кДНК

11.8.4. Абсолютный количественный ПЦР «в реальном времени» 78 II.9. Секвенирование фрагментов ДНК 79 II. 10. Клонирование продуктов ПЦР 80 П.11. Разрезание ДНК фрагментов эндонуклеазами рестрикции 81 11.12. Разработка молекулярных маркеров для генетического картирования

II.13. Статистическая обработка данных

Глава III. Результаты и обсуждение

III. 1. Влияние мутаций в генах PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на формирование арбускулярной микоризы

III. 1.1. Введение

111.1.2. Результаты

III. 1.2.1. Развитие арбускулярной микоризы

III. 1.2.2. Рост растений

III. 1.3. Обсуждение

111.2. Экспрессия генов Glomus intraradices при формировании AM у мутантов гороха RisNod24 (Pssym36), SGEFix~-2 (Pssym33) и SGEFix-1 (Pssym40)

111.2.1. Введение

111.2.2. Результаты

111.2.2.1. Мутант RisNod24 (Pssym36)

111.2.2.2. Мутант SGEFix"-2 (Pssym33)

111.2.2.3. Мутант SGEFix-1 (Pssym40)

111.2.3. Обсуждение

111.3. Дифференциальная экспрессия генов Pisum sativum L., предположительно связанных с формированием AM, в корнях мутантов гороха RisNod24 (Pssym36), SGEFix"-2 {Pssym33) и SGEFix"-l (Pssym40)

111.3.1. Введение

111.3.2. Результаты

111.3.2.1. Мутант RisNod24 (Pssym36)

111.3.2.2. Мутант SGEFix"-2 (Pssym33)

111.3.2.3. Мутант SGEFix"-1 (Pssym40)

111.3.3. Обсуждение

111.4. Анализ транскрипции генов G. intraradices в клетках, содержащих арбускулы

Ш.4.1. Введение

111.4.2. Результаты

111.4.3. Обсуждение 125 III.5. Локализация генов PsSymSö и PsSym40 на генетической карте гороха

111.5.1. Введение

111.5.2. Результаты

111.5.2.1. Получение и скрининг F2 популяций

111.5.2.2. Конструирование молекулярных EST маркеров

111.5.2.3. Картирование генов 132 III. 5.3. Обсуждение

Глава IV. Заключение

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика генов гороха (Pisum sativum L.), вовлечённых в формирование арбускулярной микоризы"

Арбускулярно-микоризный (AM) симбиоз является одним из древнейших и наиболее распространённых симбиозов на планете. Его роль, в природных экосистемах огромна, а возможности использования в сельском хозяйстве весьма заманчивы. Симбиоз между корнями растения и грибами отдела Glomeromycota возник около 450 миллионов лет назад. В настоящее время более 80% наземных растений-формируют AM; которая-играет огромную роль в улучшении минерального питания растений, увеличивает их устойчивость к биотическим и абиотическим стрессовым факторам.

Горох (Pisum sativum L.) является одним из наиболее изученных модельных объектов генетики AM. Проведённые ранее исследования позволили получить симбиотические (Sym) мутанты гороха с нарушениями формирования и функционирования арбускулярной микоризы. Эти мутанты являются ценными инструментами изучения генетики растительно-микробных симбиотических взаимоотношений, так как дают возможность исследовать симбиоз на конкретных этапах его формирования, а клонирование Sym генов позволяет определить молекулярные основы мутаций и предположить функцию молекулярных продуктов изучаемых генов.

Другим приоритетным направлением генетики симбиоза является идентификация генов растений и AM грибов, экспрессия которых существенно изменяется в процессе формирования и функционирования AM симбиоза. Такие гены можно рассматривать в качестве молекулярных маркеров процессов (сигналинга, защитных реакций, метаболизма), происходящих в растении и грибе при симбиозе. Использование в исследованиях такого рода симбиотических мутантов растений с блоком развития AM существенно увеличивает информативность подхода и позволяет связать происходящие изменения с конкретными стадиями развития симбиоза.

Данная работа посвящена изучению генетики формирования и функционирования арбускулярной микоризы, поскольку «молекулярногенетический диалог» между растением и AM грибом определяет успех симбиотических взаимоотношений.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение роли поздних симбиотических генов гороха PsSym36, PsSym33 и PsSym40 в формировании функционального AM симбиоза. Были поставлены следующие задачи исследования:

1. изучение эффекта мутаций в генах PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на экспрессию генов Glomus intraradices при формировании AM симбиоза;

2. изучение экспрессии генов гороха (Pisum sativum L.), предположительно связанных с формированием AM симбиоза, при микоризации корней растений дикого типа и мутантов RisNod24 (.Pssym36), SGEFix"-2

Pssym33) и SGEFix"-l (.Pssym40);

3. анализ экспрессии генов G .intraradices в растительных клетках, содержащих арбускулы;

4. разработка молекулярных маркеров и анализ сцепления генов PsSym36, PsSym40 и маркеров для локализации генов на генетической карте гороха с целью их последующего точного картирования и позиционного клонирования.

Работа осуществлялась в рамках программы кооперации лаборатории генетики растительно-микробных взаимодействий (ВНИИСХМ РАСХН, Санкт-Петербург, Россия) и научно-исследовательского подразделения Plant-Microbe-Environment (UMR INRA 1088/CNRS 5184/Université de Bourgogne PME, Дижон, Франция). Изучение эффекта мутаций в генах PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на экспрессию грибных и растительных генов в процессе формирования и функционирования AM симбиоза проводилось в подразделении Plant-Microbe-Environment института INRA во Франции (Дижон), а разработка условий для локализации симбиотических генов гороха PsSym36 и PsSym40 на генетической карте - в лаборатории генетики растительно-микробных взаимодействий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии в России (Санкт-Петербург).

Научная новизна. Впервые проведено исследование влияния мутаций в симбиотических генах гороха посевного (Pisum sativum L.) PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на экспрессию восьми генов P. sativum и десяти генов G. intraradices, предположительно вовлечённых в формирование функционального AM симбиоза. Было показано, что блокирование развития арбу скул, в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36) приводит к существенному снижению экспрессии большей части анализированных грибных и растительных генов, в то время-как более высокие темпы микоризации корней мутанта SGEFix"-l (Pssym40) коррелируют с более высоким, чем у растений дикого типа, уровнем экспрессии изученных грибных генов. Мутации в генах PsSym33" и PsSym40 имеют менее выраженный эффект на экспрессию анализированных генов гороха, чем мутация в гене PsSym36. Использование метода микродиссекции клеток лазером позволило осуществить выделение РНК из клеток, содержащих арбускулы, и впервые продемонстрировать преимущественную экспрессию генов G. intraradices, кодирующих супероксиддисмутазу (SOD), стеароил-СоА-десатуразу (DESAT) и пептидил-пролил-изомеразу (PEPISOM), в арбу скулах.

Методическая и практическая значимость. Методология и молекулярные инструменты, разработанные в данном исследовании, могут быть использованы в дальнейшем при изучении растительных и грибных генов, контролирующих формирование и функционирование AM. Полученный растительный материал (популяции растений поколений F1 и F2), разработанные молекулярные маркеры, а также данные картирования могут существенно облегчить дальнейшую работу по локализации генов гороха PsSym36 и PsSym40 на генетической карте для последующего точного картирования и позиционного клонирования данных генов. Полученные данные экспрессии растительных и грибных генов могут послужить базой для последующей работы по определению роли генов PsSym36} PsSym33 и PsSym40 в формировании симбиотических взаимоотношений растения с клубеньковыми бактериями и грибами арбускуляриой микоризы. Результаты проведённых исследований могут быть использованы в курсах генетики развития и функционирования растительно-микробных систем профильных институтов и университетов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международном симпозиуме и школе молодых учёных «The third Baltic sea region symposium and postgraduate course on agro-biotechnology focused on root-microbe systems» (Saint-Petersburg, Russia, 2007), конференциях «Plant-Microbial Interactions 2008 Conference» (Krakow, Poland, 2008), «Forum des Jeunes Chercheurs» (Besancon, France, 2008), «International Conference on Mycorrhiza 2009 ICOM6» (Belo Horizonte, Brazil, 2009), 9-м конгрессе IPMB «Leading Biology through Plant Science» (St. Louis, USA, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 6 тезисов докладов на международных научных конференциях.