Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молибденовый кофактор: структура, свойства, разнообразие форм в клетке

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молибденовый кофактор: структура, свойства, разнообразие форм в клетке"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК г г ^И^^ИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА_

2 2 АПР 1996

На правах рукописи КИЛЬДНБЕКОВ Нурлан Абдулнасырович

УДК 557.151.33

МОЛИБДЕНОВЫЙ КОФАКТОР: СТРУКТУРА, СВОЙСТВА, РАЗНООБРАЗИЕ ФОРМ В КЛЕТКЕ

03.00.04 — биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1996

Работа Еыполнена в лаборатории биохимии ассимиляции нитратов Института биохимии им. А. Н. Баха Российской академии наук.

Официальные оппопенты:

доктор биологических наук, профессор 3. Г. ЕВСТИГНЕЕВА,

доктор биологических наук, .профессор

И. н. гоготов,

доктор биологических нагк, профессор Э. А. МУРАВЙН.

Ведущее учреждение: Институт физиологии растении им. К. А. Тимирязева Российской академии наук.

Защита диссертации состоится « » 1996 г.

в . . . часов на заседании специализированного совета Д 002.96.01 по присуждению ¡ученой степени доктора биологических наук в Институте биохимии им. А. И. Баха РАН по адресу: М7071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1).

Автореферат разослан « /Р. » . 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук Т. А. Валуега.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Молибдокофастор (Moco) - каталитический центр всех, за исключением китрогеназы, молибден-содержащих ферментов, играющих существенную роль в жизнедеятельности бактерий, водорослей, грибов, растений и животных. Список этих ферментов включает в себя гидроксилазы, оксидоредуктазы и дегидрогеназы, которые катализируют биохимические превращения азота, углерода и серы. Молибден-содержащие ферменты участвуют в ассимиляции нитратного азота, окислении альдегидов и сульфитов, в метаболизме пуринов и других N-гетероциклических соединений.

Необходимость изучения молибдокофактора диктуется той ролью, которую играют молибдоферменты в биосфере. Например, с помощью нитратной ассимиляции, по данным Гуерреро (Guerrero et al., 1981), усваивается по приблизительным оценкам более чем 2x1o4 мегатонн органического азота в год, что на два порядка выше, чем усвоение атмосферного азота в процессе азотфиксации. Благодаря нитратной ассимиляции удовлетворяются потребности в азоте всех форм жизни на земле. Ключевым звеном в цепи реакций, осуществляющих этот процесс, яаляется первая лимитирующая реакция, катализируемая одним из важнейших молибдоферментов - нитратредуктазой.

Исследование Moco является фундаментальной проблемой, решение которой позволит понять механизмы функционирования каталитических центров молибдоферментов. Отсутствие Moco или дефекты в структуре кофактора в результате мутаций или нарушения регуляции биосинтеза приводят к потере ферментативной активности молибдоферментов и, как следствие, к серьезным нарушениям обмена веществ. Так, например, нарушения в биосинтезе молибдокофактора у человека приводят к ряду тяжелых урологических и неврологических заболеваний, поэтому исследование Moco имеет также большую медицинскую значимость.

Молибдокофактор растений в отличие от Moco бактериального и животного происхождения изучен в наименьшей степени и представлен главным образом, в составе двух Мо-ферментов (нитратредуктазы и ксантиндегидрогеназы), а также белков растений, не обладающих активностями Мо-ферментов.

Аккумуляция молибдокофактора в семенах гороха имеет генотипическую обуслоатенность. Накопление "семенного" Moco связано с физиолого-биохимическимн показателями растения. Следовательно,

подробное." изучение свойств, форм и механизмов запасания кофактора в семенах важно для понимания физиологического смысла его накопления и может иметь методическое значение в селекционно-генетических исследованиях. Неизвестны, также пути биосинтеза Moco, поэтому поиск и шучение возможных предшественников кофактора представляет несомненный интерес.

Цель н задачи исследования. Для выделения и исследования структуры Mocó наша работа строилась на использовании в качестве материала двух совершенно разных молибдоферментов с контрастными свойствами: а) по филогенетическому (эукариот и прокариот) происхождению, б) по величине и сложности организации его белковой структуры. Были выбраны ксаитиноксидаза молока с . молекулярной массой 300 кДа и нитратредуктаза бактероидов клубеньков люпина с молекулярной массой 67 кДа. В то же время эти ферменты, благодаря содержанию Moco, обладали способностью осуществлять одну и ту же реакцию восстановления нитратов с участием исскуственного донора электронов (метилвиологена).

В нашей лаборатории было обнаружено присутствие Мосо-содержащих белков, не обладающих активностями Мо-ферментов в семенах бобовых растений, в частности у гороха (Швецов и др., 1992). Обнаружение связанной с неферментативным белком формы Moco, позволило начать сравнительное изучение и идентификацию этой формы кофактора у высших растений.

Таким образом ,в можно суммировать задачи, которые решались в настоящей работе:

1. Расшифровка структуры и изучение свойств молибденового кофактора молибдоферментов из организмов прокариотического и эукариотического происхождения.

2. Исследование форм молибдокофактора не связанных с молибдоферментами.

Научная новизна работы. 1. Сравнительное изучение продуктов окисления Moco из источников бактериального (нитратредуктаза бактероидов клубеньков люпина), животного (ксаитиноксидаза молока) и растительного (Мосо-содержащий белок семян гороха) происхождения позволило расшифровать химическую структуру молибдокофактора и показать единство основы кофактора, представляющего собой уникальный серусодержащий птерин с боковой цепью в 6-положении, конечным продуктом окисления которого является

птерин-6-карбоновая кислота. В.На основе изучения продуктов окисления Мое о выдвинута теоретическая модель координационной структуры молибденового центра кофактора, существеной особенностью которой является участие птеринового кольца кофактора в координации молибдена наряду с одной из двух тиольных групп боковой цепи. S. Впервые выделен и охарактеризован не -являющнея молибдоферментом растительный Moco-содержащий белок гомодимер с молекулярной массой 300 кДа, который аккумулирует преобладающую часть молибдокофактора в семенах гороха.

Впервые выделен и идентифицирован молибденовый кофактор высших растений, относящийся к мононуклеотидной форме (характерной также для Moco животного происхождения), входящий в состав Мосо-содержащего белка семян гороха.

Практическая ценность работы. Разработанный способ очистки до гомогенного состояния Мосо-содержащего белка может быть использован для дальнейшего изучения Moco, а также применяться в медицинских целях, в качестве препарата при лечении различных заболеваний, связанных с недостатком или нарушениями в биосинтезе Moco в организме (Подана заявка на' изобретение N 95114012 от 14.08.95). Модификация метода определения активности Moco в растительном материале может быть применена для определения содержания активного Moco из других источников растительного происхождения.

Апробация. Основные положения диссертационной работы докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Механизмы усвоения азота и биосинтеза белка в растениях" (Алма-Ата, 1981), . IX Всесоюзной конференции по проблемам микроэлементов в биологии (Кишинев, 1981), Всесоюзном совещании "Экологические последствия использования агрохимикатов /удобрения/" (Пущино, 1982), 5-ой конференции "Физиологические основы повышения продуктивности и устойчивости зерновых культур" (Целиноград,' 1984), V Всесоюзной биохимическом съезде (Киев, 1985), IV Конференции биохимиков респ. Средней Азии и Казахстана (Ашхабад, 1986), X Всесоюзной конференции по проблемам микроэлементов (Чебоксары, 1986), XIV Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988), Всесоюзном симпозиуме "Препаративная хроматография физиологически активных препаратов на полимерных сорбентах" (Ленинград, 1988), Международной конференции по проблемам современной физико-химической биологии и биотехнологии (Алма-Ата, 1989), IV Международном симпозиуме по ассимиляции неорганического азота (Зеехайм, Дармштадт, Германия, 1995).

Работа была дважды удостоена второй премии на конкурсе лучших научных работ Института биохимии им. А.Н.Баха РАН (в 1988 и 1995 годах).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ и две приняты к печати.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 230 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав, заключения и выводов. Работа содержит 52 рисунка и 12 таблиц. Список цитируемой литературы включает 259 публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования

В качестве объектов исследования в работе использовались:

1. Бактероиды клубеньков люпина. Семена люпина желтого (Lupinus luteus L.) сорт "Быстрорастущий-4", ииокулиро вались активным штаммом клубеньковых бактерий Rhizobium lupini 359а. По достижении люпином, выращенным в полевых условиях, фазы бутонизации - начала цветения, клубеньки отделяли от корней. Гомогенат получали разрушением клубеньков в соковыжималке. Осадок, отделенный от растворимой фракции, представлял собой бактероид! клубеньков люпина.

2. Семена гороха сорта "Малиновка", полученный ,из коллекции ВНИИ зернобобовых и крупяных культур, содержащий по данным (Швецов, 1992)' наибольшее количество связанного с белком молибдокофактора. ,

3. Дикий штамм и мутант гриба Neurospora crassa nit-l, синтезирующий дефектную по молибденовому кофактору нитратредуктазу. Штаммы были получены от проф. Кетчума (Оклендский университет, США). Мицелии мутанта nit-l выращивали на твердой среде Фриза.

Методы исследования

Для выделения и очистки молибдокофактора в его активной форме использовалась техника анаэробного выделения и определения активности разработанная нами и описанная в соответствующих разделах. Для объектов растительного происхождения была разработана стандартная методика определения Moco активности не требующая анаэробных условий в присутствии подобранных стабилизаторов. Для количественного определения кофактора применялась методика комплементации на холоду в течение 20 ч, что приводило к стехиометрическому связыванию реагирующих компонентов (Hawkes, Bray, 1984). За единицу активности

Moco принимали количество нмоль нитритов образовавшихся в 1 мин, в ходе реакции комплементации с дефектной нитратредуктазой мутанта i-риба <Y. crasse nit-1, в расчете на 1 мг внесенного Мосо-содержащего белка.

Активность ксактиноксидазы определяли в аэробных условиях по методу Мэсси (Massîy, 1969) спектрофотометрически при 295 нм по. образованию мочевой кислоты, катализирующим изменение оптической плотности при 295 нм на I ед. за I мин.

Ксантиндегидрогсназную активность определяли методом окрашивания в ПААГ после электрофореза согласно (Mendel, Muller, 1976).

Активность метилвиологен-зависимой нитратредуктазы определяли по модифицированному методу (Kennedy et al., 1975). Активность нитратредуктазы выражали в нмоль нитрита, образовавшегося за 1 мин, в расчете на 1 мг фермента.

Нитратредуктазнуго NADH - зависимую активность in vitro определяли по методихе описанной в работе (Львов, Сафаралиев, 1988).

Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония) в ультрафиолетовой и видимой областях.

Флуоресценцию Moco и птеринов регистрировали на спектрофлуориметре "Hitachi"- MPF-4. Перед измерением флуоресценции Moco фракции продували в течение 5 мин кислородом и выдерживали сутки на воздухе для окисления теринового компонента кофактора. Спектры флуоресценции Moco и птеринов снимали в диапазоне 400-460 нм, при длине волны возбуждения 360-370 нм.

Для тонкослойной хроматографии окисленных препаратов Moco использовали широкопористый силихагель "Silufol" в следующих системах растворителей (Johnson et al., I9S0): А, н-пропиловый спирт : \% NH4OH (2:1); В, н-бутиловый спирт : уксусная кислота : вода (4 : 1 : 1); С, 3% аммоний хлорид.

Аминокислотный состав определяли после 24-часового гидролиза препаратов Moco при П0°С в 6N HCl на аминокислотном анализаторе "Labotron" Liquimat-IÎI (Германия).

Для определения серы использовался нитропруссидный реактив в соответствии с методикой Коренмаиа (Коренман, 1975).

Изоэлектрическое фокусирование Мосо-содержашего белка проводили на колонке LKB 8101-110 объемом 110 so по ранее предложенной методике (Ригетти, 1976) с применением амфолинов в диапазоне 3,5-9,5 (LKB).

Субъединичный состав белков определяли методом денатурирующего электрофореза по методу (Laemmli, 1970) в ПААГ в присутствии ионного детергента додецил сульфата натрия. Концентрация разделяющего геля 10%. Белковые полосы окрашивали красителем Кумасси бриллиантовым синим R-250 производства фирмы "ЯеапаГ'(Венгрия). В качестве метчиков использовались следующие белки: миозин (200 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), каталаза (60 кДа), яичный альбумин (45 кДа), лактатдегидрогеназа (36 кДа).

Получение стабильных продуктов модификации и окисления Moco проводилось по методикам ряда авторов описанной в работах (Kramer et al., 1987; Rajagopalan, Johnson, 1992), модифицированных нами и приведенных в соответствующих разделах работы. Высокоочищенная хромато1рафически гомогенная птерин-6-карбоновая кислота, использованная в качестве стандарта, была синтезирована в Институте элементоорганических соединений РАН и любезно предоставлена Е.А.Мироновым.

Негеминовое железо определяли по методу (Ramsay, 1953). Количество железа определяли спектрофотометрически при длине волны 520 нм.

Другие методы, использованные в работе

Белок определяли методом Брэдфорда (Bradford, 1976) с использованием в качестве стандарта каталазу фирмы "Serva" (Германия). Гомогенность белков контролировали методом нативного диск-электрофореза в ПААГ, при концентрации разделяющего геля 7,5% в пластине 11x11 см с использованием стандартного прибора. Белковые полосы окрашивали красителем Кумасси бриллиантовым синим G-250 производства фирмы "Ferak" (Германия). Концентрацию белка определяли также по соотношению оптических плотностей при 205 и 280 нм по методу (Scopes, 1974).

Гель-фильтрацию проводили на носителях: Sephadex G-25, ("Reanal", Венгрии), Sephadex G-75, Sephadex G-150, Sephacryl S-200 ("Pharmacia",Швеция), Toyopearl HW-55 ("Toyosoda", Япония). Ионообменную хроматографию проводили на анионообменниках: DEAE целлюлоза DE-52 ("Reanal", Венгрия), DEAE -Toyopearl 650М ("Toyosoda", Япония), QAE-Sephadex А-50 ("Pharmacia",Швеция). Для гидрофобной хроматографии использовался носитель Phenyl-Sepharose 4В ("Pharmacia", Швеция). Ковалентную хроматографию осуществляли на активированном носителе Thiol-Sepharose 4 В ("Sigma", США). Жидкостную. хроматографию высокого давления проводили на приборе НРР 5001 фирмы "Laboratorni

Pristroje РгаЬа"(Чехия) с использованием в качестве носителя колонки С-18 фирмы "Tessek", Чехия (150 х 3 мм Separon С-18 SGX).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение гомогенных препаратов нитратредуктазы бактероидов Rhizobium lupini, обнаружение "деградации" нитратредуктазы

В нашей лаборатории была разработана методика выделения и очистки нитратредуктазы бактероидов Rhizobium lupini. Схема выделения включала в себя разрушение бактероидов ультразвуком, прогрев экстракта бактероидов при температуре 50°С, высаливание сульфатом аммония в диапазоне насыщения 40-60% и фракционирование на ионообменнике DEAE-Cellulose DE-52. Для получения гомогенного препарата нитратредуктазы был использован метод изоэлектрической фокусировки (Буриханов, 1981). В результате была выделена гомогенная метилвиологен-зависимая нитратредуктаза с молекулярной массой 67 кДа и не содержащая флавиков.

Так как для выделения молибденового кофактора требовалось препаративное количество высокоочищенного фермента методика выделения и очистки нитратредуктазы бактероидов была изменена. С целью увеличения выхода нитратредуктазы и получения ее в более нативном состоянии мы отказались от стадии прогревания бактероидного экстракта, а также использования изоэлектрического фокусирования (при котором происходит инактивация значительной части фермента вследствие диссоциации молибдена и необратимого окисления молибдокофактора). После фракционирования на DEAE-целлюлозе DE-52 полученные препараты нитратредуктазы далее очищали с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-150. Эффективной оказывалась также рехроматография на том же сефадексе.

В результате было обнаружено, что "короткая "(67 кДа) нитратредуктаза бактероидов клубеньков люпина (рис. 1) яатяется только частью "большой"(200 кДа) характерной для других организмов ассимиляторной, метил виологен-зазисимой флавинсодержашей нитратредуктазы (рис. 2). При этом все методы с использованием "жестких" процедур очистки (прогрев 50°С, многократное высаливание.

изофокусирование), приводят к образованию именно этой "короткой", метилвиологен-зависимой нитратредуктазы.

Благодаря знанию этих особенностей фермента мы получили возможность многократно увеличить выход высокоочищенной и, что очень существено, не содержащей никаких дополнительных простетических групп нитратредуктазы, необходимой для выделения Moco.

Получение гомогенной ксантиноксидазы из коровьего молока я исследование участия различных функциональных групп ксантиноксцдазы в питратредуктазной активности

Ксантиноксидазу очищали из коровьего молока по методу Харта (Hart, 1970) в модификации Л.Г.Наглер и Л.С.Вартанян (Наглер, Вартанян, 1973).

Для выяснения участия различных простетических групп ксантиноксидазы в нитратредуктазной активности мы использовали поочередное ингибирование этих групп, с одновременным определением нитратредуктазной и ксантиноксидазной активности фермента.

Нам удалось показать, что направленность реакций ксантиноксидазы меняется с изменением кислотности среды: при щелочных значениях pH (9,6) фермент проявляет оксидазкую активность, а при кислых pH (5,15) -нитратредуктазную.

Для того» чтобы выяснить "роль FAD в нитратредуктазной активности был применен метод получения дефлавоксантиноксидазы, который заключался в обработке фермента 2М хлористым кальцием с последующим диализом. Сравнительная легкость, с которой FAD диссоциирует от белка ксантиноксидазы, обусловлена тем, что флавин нековалентно связан с ферментом. Выход FAD из ксантиноксидазы хорошо регистрируется по увеличению флуоресценции его в диализате. По мере удаления FAD из ксантиноксидазы при обработке фермента 2М хлористым кальцием ксантиноксидазная активность фермента постепенно падала, исчезая полностью через 90 мин, в то время как нитратредуктазная активность сразу же после добавления хлористого кальция возрастала на 50% и оставалась на этом уровне до конца опыта. Быстрое повышение нитратредуктазной активности объясняется, по-видимому, конформационными изменениями фермента под действием высокой ионной силы. Таким образом, FAD не связан с

и

iOO 80 60 40 20

\ 60 —Т— 1--Т-" 1 1 1

■ \ ' / \

\ 40 \

\ 20 \ п . t N

\ 560 440 520 нн

1 . л . . . 1.1

2.2.0 гю £60 230 300 им

Рис. 1. Спектры поглощения и флуоресценции гомогенной нитратредуктазы (67 кДа) (Белок - 0,42 мг/мл)

Рис. 2. Спектр флуоресценции и возбуждения флуоресценции нитратредуктазы с молекулярной массой 200 кДа (НР-1)

11 и тратредуктаз ной активностью ксантиноксидазы, более того, его удаление из фермента приводит к стимуляции указанной активности, что можно объяснить увеличением потока электронов с Мо-содержащего центра на восстановление нитратов.

Для определения возможного участия железо-серных центров ксантиноксидазы в нитратредуктазной активности мы изучили влияние возрастающих концентраций комплексона а,а-дипиридила на обе изучаемые реакции ксантиноксидазы. Для этого фермент был диализован на колонке с сефадексом С-25, уравновешенным 0,01 М калий фосфатным буфером рН 7,5. Растворили а,а-дипиридил в 96% этаноле, разбавили 0,01 М калий-фосфатным буфером рН 7,5 до нужной концентрации и инкубировали с белком. Результаты показали, что нитратредуктазная активность практически не меняется в течение часа в пределах концентраций комплексона 0,005-0,15%, в то время как ксантиноксидазная активность падает в указанных условиях максимально на 50%. Эти результаты свидетельствуют о том, что железо-серные кластеры, доступные для действия ингибитора, также не принимают участия в нитратредуктазной активности ксантиноксидазы. В то же время, судя по величине ингибирования комплексоном ксантиноксидазной активности, его действие распространяется лишь на один из двух железо-серных мастеров, содержащихся в ферменте. По-видимому, ыиянию а,а-дипиридила подвержен расположенный ближе к модибдо кофактору железо-серный кластер, тогда как второй Ре/Б центр локализован внутри белковой глобулы и не атакуется хелатом.

Значение сульфгидрильных групп для проявления нитратредуктазной активности ксантиноксидазы изучали, используя в качестве ингибитора ЭН-групп п-хлормеркурибензоат. Растворяли- п-хлормеркурибензоат в глицин-№ОН буфере 0,003 М, рН 9,7 и инкубировали с ферментом в том же буфере в течение 30 мин. При этом обнаруживается, что обе изучаемые активности ксантиноксидазы подавляются возрастающими концентрациями этого реагента, причем ксантиноксидазная активность подавлялась сильнее, чем нитратредуктазная. Эти результаты указывают на то, что БН-группы важны для активности фермента, участвуя в обеих ферментативных реакциях, катализируемых ксантиноксидазой.

Известно, что молибден находится у ксантиноксидазы в субстратсвязываюшем центре (Вгау, 1980). Мы предположили, что, по аналогии с нитратредуктазами, именно молибденсодержаший, а не РАО или Ре/Б-содержащие центры ксантиноксидазы участвует в связывании и восстановлении нитратов. Для изучения этого вопроса мы использовали

. ингибитор ксантиноксидазы аллопуринол (4-оксипиразол [3, 4-d] пиримидин), присоединяющийся к молекуле фермента по молибденовому центру (Bray, 1975; Jezevska et al., 1974; Hille, Massey, 19S1). Выяснить роль Mo-центра в нитратредуктазной активности ксантиноксидазы было тем более важно, так как восстановление нитратов у ксантиноксидазы может идти и при использовании супероксидного радикала, генератором которого фермент является.

Изучив влияние аллопуринола, мы показали, что обе активности ксантиноксидазы полностью ингибируются при концентрации аллопуринола равной 20 мкМ. Это подтверждает наше предположение об участии Mo-центра в восстановлении нитратов ксантиноксидазой и находится в соответствии с ранее полученными данными Аликулова (Аликулов и др., 1980 б), свидетельствующими о том. что при концентрации аллопуринола 10 мкМ нитратредуктазная активность ксантиноксидазы ингибируется на 81% (донор электронов метилвиологен) и полностью в присутсвии НАДН.

Выделение и очистка ннзкомолекулярного Moco из нптратредуктазы и ксантиноксидазы

Схема очистки Moco включала: кислотную обработку Мо-фермента (pH 2,3), нейтрализацию натрий-фосфатным буфером с добавлением аскорбата натрия, анаэробное прогревание (80°С, 8 мин), удаление денатурированных белков анаэробным центрифугированием, концентрирование супернатанта упариванием, гельфильтрацию на сефадексе G-75, ступенчатую хроматографию иизкомолекулярного компонента Moco на ионсобменнике QAE-сефадексе А-50 (для обессоливапия и удаления FAD), упаривание а вакуумном испарителе, отмывка водой и концентрирование препарата Moco, тонкослойную хроматографию продуктов окисления кофактора (все этапы очистки проходили в строго анаэробных условиях).

Профиль элюции при гельфильтрации на сефадексе G-75 препарата Moco, выделенного прогреванием нитратредуктазы после кислотной обработки в атмосфере водорода со стабилизатором - аскорбатом натрия показал наличие двух пиков активности Moco, соответствующих Moco, связанному с белковым фрагментом и ннзкомолекуллрному кофактору. При этом белковый фрагмент содержал 15,6% от общей активности кофактора, содержащегося в исходном препарате нитратредуктазы, а низкомолекулярный Moco содержал 14,5%. При элюции препарата ксантиноксидазы вслед за нулевым объемом на сефадексе G-75 выхолит

фракция белкового фрагмента, несущего Moco, состаатяюшего до 2% от общего количества кофактора. Затем, начиная с середины элюируемого пика солей, начинается выход низкомолекулярного Moco, составляющего около 5% от исходной активности.

Фракции, элюированные с сефадекса G-75 и содержащие Moco, объединялись и разбавлялись с тем, чтобы конечная концентрация солей не превышала 0,01 М. При такой концентрации солей весь Moco задерживался ионообменным QAE-сефадексом в виде ярко-голубой флуоресцирующей полосы на верхней поверхности сефадекса шириной не более 0,5-1 см. Необходимо подчеркнуть, что флуоресценция обнаруживалась только после значительного окисления Moco. Активный низкомолекулярный Moco на поверхности сефадекса визуально не обнаруживался. Визуализация окисленного кофактора осуществлялась с помощью ультрафиолетовой лампы ОДД-41.

Отмытый от примесей низкомолекулярный кофактор для удаления следов солей, в частности натрий-фосфатного буфера, промывался большим объемом бидистиллированной воды. На этой стадии, в случае использования техники анаэробного выделения, мы получали активный низкомолекулярный иммобилизованный на колонке не содержащий молибдена кофактор, который был использован для обнаружения собственной нитратредуктазной активности

Для дальнейшего изучения Moco элюировали в аэробных условиях с QAE-сефадекса нанесением на колонку (ступенчатая элюция) последовательно следующих растворов: 0,01 М уксусной кислоты; 0,01 М HCl; 0,1 М HCl. Фракции, содержащие Moco, объединяли, выпаривали досуха, повторно промывали бидистиллированной водой и выпаривали на вакуумном испарителе для удаления следов уксусной и соляной кислот. Высушенный" кофактор растворяли в минимальном количестве бидистиллированной воды и использовали для анализа

Суммарные спектры продуктов окисления препаратов Moco из обоих источников после длительного хранения обнаруживают практически полное совпадение максимумов при 450, 480 нм в спектрах флуоресценции и при 320, 360 нм в спектре возбуждения флуоресценции (рис. 3).

При pH 9,5 все спектры фракций Moco из обоих источников обнаруживали сдвиг максимумов в длинноволновую сторону, что является характерным признаком птеринов.

Рис. 3. Спеетры возбуждения флуоресценции и флуоресценции препаратов Moco, полученных элюцией 0,1 М НС1 с QAE-сефадекса до (А, В) и после (А', В') полного окисления на воздухе.

A, А' - спектры возбуждения флуоресценции (Хрег. 450 нм),

B, В' - спектры флуоресценции (Хвозб. 370 нм),

1 - Moco из ксантиноксидазы,

2 - Moco из нитрагредухтазы

Другим аргументом, свидетельствующим о том, что ароматическим компонентом Moco яатяется птерин, послужило проведенное нами определение константы кислотной диссоциации (рКа) смеси продуктов окисления Moco, выделенного из ксантиноксидазы и нитратредуктазы. С этой целью в серии буферных растворов (ацетат аммония 0,02 М) с pH от 6 до 9 были сняты спектры возбуждения флуоресценции кофакторов. Наиболее выраженная зависимость интенсивности флуоресценции от pH наблюдалась в диапазоне 370-400 нм. В области около 340 нм в спектре проявлялась изобестическая точка, свидетельствующая о наличии в растворе двух равновесных форм. График зависимости (рис. 4) интенсивности флуоресценции от pH имеет характерную S-образную форму и небольшой наклон в интервале pH 8,0 ± 0,1 для обоих кофакторов. Это значение хорошо согласуется с известными значениями рКа 3,4 - амидной группировки птеринов (Albert, 1953).

Определение содержания аминокислот на высокочувствительном анализаторе "Liquimat-III" препаратов кофактора, элюированных 0,1 М HCl с QAE-сефадекса и подвергнутых 24 часовому гидролизу в 6 М HCl, дало одинаковое количество аминокислот для ксантиноксидазы и нитратредуктазы. Moco связан у обоих ферментов с пептидами, содержащими следующие доминирующие аминокислоты в соотношении: аспарагиновая кислота, серин, глутаминовая кислота, глицин, аланин, валин, лизин (1,7 : 1,8 : 1,4 : 2,6 : 2,5 : 1 : 1,4) для нитратредуктазы и (1,6 : 1,4 : 1,5 : 2,7 : 2,7 : 1 : 1,9) для ксантиноксидазы (содержание валина было принято за единицу как аминокислоты содержавшейся в минимальном количестве).

Мы изучили продукты окисления кофакторов ксантиноксидазы и нитратредуктазы молекулярным кислородом методами тонкослойной хроматографии. Moco, выделенный в присутствии аскорбата, в течение первых суток не обнаружил на хроматограмме флуоресцирующих продуктов.

Через несколько дней появились дза флуоресцирующих продукта с Rf 0,19; 0,39 (А); 0,52 (В), причем первый из них давал положительную реакцию на серу (Коренман, 1975). При окислении этого препарата Moco щелочным . перманганатом образуется продукт, сходный по хроматографическим свойствам с птерин-6-карбоновой кислотой (рис.5, форма VI). Установление последнего факта является еще одним аргументом в пользу птериновой природы ароматического компонента Moco (Johnson et al., 1980 b).

Рис. 4. Зависимость интенсивности флуоресценции от рН у окисленных форм Moco из нитратредукгазы (1) и ксантиноксидазы (2). Образцы кофактора окислялись на воздухе в течение месяца

Таким образом, на основании литературных и наших данных можно считать, что:

1. Moco представляет собой комплекс Mo(V) с 6-замешенным птерином, находящимся в тетрагидроформе. Учитывая известную склонность птеринов к комплексообразованиюс металлами (Albert, 1953) и большое сродство молибдена (V) к лигандам, содержащим тиольные группы, можно предположить следующую структуру такого комплекса (рис. 5, А, форма 1).

2. Медленное окисление активных препаратов Moco кислородом воздуха приводит к образованию ряда промежуточных окисленных продуктов. Причем в препаратах, подвергнутых длительному окислению, преобладают по крайней мере два флуоресцирующих продукта, суммарные спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции которых сходны у кофакторов, выделенных из ксантиноксидазы и нитратредуктазы.

3. В препаратах Moco из ксантиноксидазы и нитратредуктазы на начальной стадии окисления кофактора обнаружено содержание серы, подтверждающее данные полученные в лаборатории Раджагопалана (Rajagopalan et al., 1982) о том, что в боковой цепи птерина можно предполагать наличие одного или двух атомов серы, находящихся вероятно в тиольной форме (рис. 5, А, форма 1).

Рис. 5. Предполагаемая структура Moco и возможных продуктов его окисления. Римскими цифрами обозначены конечные продукты превращения Moco.

А - предполагаемая структура Moco (1), его превращение в уротион (4) и 6-карбокси-7-сульфокси1птерин (5); Б - возможная структура комплекса-Mo(V) с Moco; В - предполагаемый механизм стабилизации Moco аскорбатом; Г - схема аэробного окисления :Мосо: 1 - 5,6,7,8-тетрагидроформа; 2 - 7,8-дигидроформа; 3-7,8-дигидро-птерин-(дисульфид); I - полностью окисленный Moco; II - продукт циклизации Moco; Д - гидролиз фосфатного остатка продуктов окисления Moco: R - фрагмент структуры продуктов I или II; III и IV - продукты гидролиза; Е - гидролиз (V) или отщепление (Va) тиольной группы продукта II; Ж - окислительная деструкция боковой цепи продукта I в птерин-6-карбоновую кислоту (VI)

Обнаружение собственной нитратредуктазной активности низкомолекулярного молибденового кофактора

В имеющейся литературе до сих пор нет данных по собственной активности низкомолекулярного Moco, что безусловно связано с высокой лабильностью кофактора, прежде всего с его чувствительностью к окислению в аэробных условиях, а также радом методических трудностей. Вследствие весьма непрочной связи молибдена с кофактором, о чем уже упоминалось в литературном обзоре, получаемый в ходе описанной выше очистки Moco лишен молибдена. Практически весь молибден отделялся от белка на стадии его прогревания. Однако, как показали наши опыты, Moco, хранящийся под аргоном, сразу после отделения от белка обладает способностью координировать молибден, хотя в процессе хранения и, следовательно, окисления эта способность быстро теряется. Для получения активного Moco из его безмолибденовой формы, выделяемой в ходе очистки по нашей схеме мы использовали эту способность кофактора координировать молибден. Для этого:

1. Активный низкомолекулярный Moco, выделенный из ксантиноксидазы после стадии очистки на сефадексе G-75, преинкубировали с молибдатом натрия (10"^ М конечная концентрация) для включения молибдена в "пустой"кофакгор. Инкубация проводилась анаэробно в атмосфере аргона. Раствор молибдата натрия предварительно тщательно дегазировали и продували аргоном, а затем вводили шприцем в заполненную аргоном пробирку в соотношении 1:1 с аликвотой активного кофактора. Инкубация длилась от 30 мин до 1 часа при температуре +4°С.

2. Следующая стадия определения активности Moco - сорбция его на микроколонке (0,8x0,5 см) с QAE-сефадексом. На предварительно подготовленную, как было показано выше, и уравновешенную насыщенным аргоном 0,01 М натрий фосфатным буфером микроколонку наносили преинкубированный с молибдатом кофактор (нанесение производили строго анаэробно в токе аргона). Затем колонка тщательно промывалась от избытка молибдата (с контролем по денситометру при 220 нм) большим объемом 0,01 М натрий-фосфатного буфера до полного удаления следов молибдена. Это необходимо потому, что молибдат в кислой среде (она получается при добавлении сульфаниловой кислоты) может отрицательно влиять на определение нитритов.

3. В заранее приготовленную в пробирке реакционную смесь, содержащую следующие компоненты (мкмоль): натрий-фосфатный буфер, рН 6,5-7,5 - 100, натрий азотнокислый - 2,5, метилвиологен хлорид - 0,7, дитионит - 2,6, вносили аликвоту сорбированного на ионообменном

сефадексе кофакторе (шприцем под током аргона снимали количественно весь сефадекс с микроколонки и вместе с кофактором помещали в реакционную смесь), затем инкубировали в течение 30 мин при 30°С.

Для контроля аналогичную операцию производили с ионообменным QAE-сефадексом не содержащим Moco, но также отмытым от молибдлта.

Такие же аликвоты сорбированного кофактора вносили в реакционную смесь, содержащую nit-l, с добавлением и без лобаапения в реакционную смесь молибдена. Тем самым проверялась активность кофактора в реакции комплементации с дефектной нитратредуктазой мутанта nit-l.

Полученные результаты суммированы в табл. 1. Расчет собственной нитратредуктазной активности Moco в процентах от нитратредуктазной активности ксантиноксидазы проводился следующим образом:

1. Общую активность Moco в 1 мг белка ксантиноксидазы определяли по реакции комплементации с дефектной нитратредуктазой nit-l после кислотной обработки ксантиноксидазы.

2. По величине полученной активности выделенного препарата Moco в реакции комплементации с дефектной нитратредуктазой определяли, какая часть кофактора находится в исследуемой ал и квоте.

3. Зная нитратредуктазную активность нативной ксантиноксидазы в стандартной инкубационной смеси в расчете на мг белка, по величине собственной нитратредуктазной активности аликвоты Moco определяли сколько процентов она составляет к нитратредуктазной активности нативной ксантиноксидазы.

Результаты расчетов показали, что собственная нитратредуктазная активность Moco составляет 8,9% от нитратредуктазной активности нативной ксантиноксидазы.

Данные по стимуляции активности Moco молибдатом натрия в реакции комплементации с дефектной нитратредуктазой мутанта nit-l показывают, что лишь 40% молекул активного кофактора смогли включить молибден, сохранив в восстановленном состоянии функциональные группы, ответственные за координирование этого металла.

Таким образом, нами впервые обнаружено, что низкомолекулярный Moco из ксантиноксидазы обладает собственной нитратредуктазной активностью. Это свидетельствует о том,что выделенный Moco яатяется частью активного центра ксантиноксидазы.

Таблица 1

Собственная юггратредуктазшш якгишюсп ннзЕомолскулярлого Moco из ксантнноксноазы молоке*)

Варианты Активность Moco в нмоль N02"/мин Собственная НР-активность Moco в%к НР-активности ксантинокси- дазы

Собственная НР-актив-ность Moco Активность Moco по nit-1

Контроль без Moco 0,056 - 8,90

Moco 0,136 -

Добавление Moco к л/7-7 + Мо 0,168

Добавление Moco к nit-1 -Мо 0,067

*)Среднее из 3-х опытов; НР - нитратредуктаза

Выделение я отлепи белка, содержащего молнбдокофастор из семвв гороха

Ранее в семенах гороха был обнаружен молибдокофактор накопление которого, является генотипически обусловленным признаком сорта. Использование в качестве объекта исследования сорта "Малиновка" было обусловлено высоким содержанием Moco в семенах растений данного генотипа. П ре обладающая часть кофактора в семенах указанного сорта аккумулируется в связанной с белком форме (Швецов, 1992).

Очистку Мосо-содержащего белка из семян гороха проводили методами: высаливания сульфатом аммония (20-40%); ионообменной хроматографии на DEAE Toyopeart 650 М ; гельфильтрации на Sephacryl S-200 и ковалентной хроматографии на активированной Thiol-Sepharose 4В.

Препарат М осо-содержащего белка, полученный указанным способом, был электрофоретически гомогенен и имел удельную активность 14,1 ед/мин на 1 мг белка (таблица 2). Степень очистки по белку состаачяла 4160 раз, по активности кофактора 293.8 раза. Степень

очистки Мосо-содержащего белка выражалась активностью вновь реконструированной in vitro нитрзтредуктазы мутанта гриба Neuroapora crassa nit-1 . Следует отметить, что для количественной оценки Moco использовалась методика определения кофактора при продолжительной (20 ч на холоду) комплементации кофактора с экстрактом мицелия мутанта гриба N. crassa nit-1 (Hawkes, Bray, 1984).

Таблица 2.

Очистка Мосо-содержащего белка та семян гороха

Стадия очистит Обший объем, мл Общий белок, мг Общая активность, ед. Удельная акт-ность, ед. на мг белка Выход, % Степень очистки

Исходный экстракт 100 3120 149,8 0,048 100 1

20-40% сульфат аммония 50 380 41,0 0,108 27 2,3

DEAE- Toycpearl 650М 10 18,6 25,5 1,37 17 28,5

Seph- acryl S-200 25 2,95 13,8 4,67 9 97.3

Thiol- Sepharose 4B 5 0,75 10,6 14,1 7 293,8

Характеристика своЗстя Мосо-ссдержагаего белка.

Определение молекулярной массы нативного Мосо-содержашего белка, полученного двумя методами: электрофорезом в 7%-ном ПАЛ Г и гель-хроматографией на ТоуореаН Н\У-55 Р, показало одинаковую величину - 300 кДа.

12 3 4 5 кВа

, " —200 — —150

.. I

I

Рис. 6. Денатурирующий БОБ-электрофорез Мосо-содержащего белка: 1 - исходный гомогенат, 2 -осаждение сульфатом аммония; 3 - ионообменная хроматография на ОЕАЕ Тоуореаг1 650 М, 4 -гельхроматография на 5ерЬасгу1 5-200, 5 хроматография на активированной ТЫо1-8ерЬаго5е 4В. Справа указаны молекулярные массы белков-метчиков в кДа

Денатурирующий электрофорез гомогенного препарата Мосо-содержащего белка в 10%-ном ПААГ в присутствии додецил-сульфата натрия выявил одну полосу с молекулярной массой 150 кДа (рис. 6), что указывает на наличие двух гомологичных субъединиц.

Методом изоэлектрофокусирования показано, что pi Мосо-содержашего белка 5,0.

Нативный Мосо-содержащий белок не имеет специфической флуоресценции с максимумом при 450 нм и длине волны возбуждения 370 нм, характерной для окисленных форм Moco. Это позволяет считать, что птериновый компонент молибдокофактора исследуемого белка находится в восстановленной форме в виде тетрагидро- или дигидроптерина. В то же время, спектр флуоресценции окисленного кислородом воздуха (кипячение на водяной бане), но не отделенного от белка молибдокофактора, имеет максимум флуоресценции при 440 нм и длине волны возбуждения 360-370 нм, что соответствует спектру флуоресценции окисленного молибдоптернна (рис. 7). Анализ спектров флуоресценции Мосо-содержащего белка не выявил флуоресценции характерной для флавинов - хромофорных групп Мо-ферментов растений нитратредуктазы и ксантиндегидрогеназы. Спектры поглощения гомогенных препаратов Мосо-содержащего белка (рис. 8), также указывают на отсутствие каких-либо хромофорных групп в составе субъединиц. В составе Мосо-содержащего белка не обнаружено негеминового железа, присутствие которого (в форме Fe/S-кластеров) характерно для Мо-ферментов растений.

Отсутствие ферментативной активности у Мосо-содержащего белка и его предполагаемые функции. Исследуемый белок не обладает ни одной из ферментативных активностей, свойственных растительным молибдоферментам, поскольку не обнаружено ни ксантиндегидрогеназной, ни нитратредуктазной активностей. Как будет ниже отмечено, Moco в составе выделенного белка находится в безмолибденовой форме, однако при экзогенном внесении молибдата активностей вышеперечисленных ферментов в покоящихся семенах не обнаружено. Можно предположить, что Мосо-содержащий белок является предшественником какого-либо Mo-фермента, например ксантиндегидрогеназы. Так, нами обнаружена ксантиндегидрогеназная активность в процессе прорастания семян гороха (на второй день после начата проращивания). Следует отметить, что все изученные к настоящему моменту растительные молибден-содержащие ферменты

Рис. 7. Спектр флуоресценции Мосо-содержащего белка, окисленного кислородом воздуха при рН 7,2: А -спектр возбуждения флюоресценции, В - спектр флюоресценции

Рис. 8- Спектры поглощения препаратов Мосо-содержащего • белка: 200 (1) и 100 мкг/мл (2), 3- бычий сывороточный альбумин

имеют в своем составе, кроме Moco, другие простетические группы. Если данный белок является предшественником какого-либо Мо-фермента, то, вероятно, его модификация заключается во включении окислительно-восстановительных компонентов (флавины, Fe/S-кластеры, цитохромы и т.д.), а так же во встраивании молибдена (Мо-процессинг) в кофактор. Не исключена также возможность посттрансляционной модификации самой белковой молекулы. Вторым вероятным предположением, касающимся роли Мосо-содержащего белка, является его функционирование в качестве донора активного кофактора в процессе биосинтеза Мо-ферментов.

Оценка количества молекул молибдоптернна в составе Мосо-содержащего белка с использованием в качестве стандарта препарата ксантнноксндазы.

Нами обнаружено, что количество получаемого из гомогенного препарата белка молибдоптерина очень невелико, поэтому достаточно точная оценка количества птерина по величине молярного поглощения не предстаатялась возможной. Более подходящей могла оказаться оценка с помощью измерения интенсивности флуоресценции конечного продукта окисления МоСо щелочным перманганатом - птерин-6-карбоновой кислоты. Однако расчетные данные, полученные с помощью этой методики, показали наличие менее 1 молекулы кофактора на 1 молекулу белка. При сравнении активностей кофактора, полученных из равных количеств МоСо-содержащего белка и препарата ксантиноксидазы (молекулярная масса 275 кДа), было обнаружено, что при использовании стандартной процедуры определения активности МоСо количество активного кофактора в исследуемых образцах сопоставимо. Пересчет активности МоСо на количество белка в образцах указывает на наличие в составе МоСо-содержащего белка 1,96 молекул кофактора на 1 молекулу дймера, что, по-видимому, дает более правильные значения (табл. 3). Наблюдаемое несоответствие в оценке содержания МоСо, определенного разными методами, может быть объяснено потерей исследуемого материала в процессе получения стабильного продукта окисления кофактора щелочным перманганатом.

Таблица 3

Количественная оценка кофактора в МоСо-содержащем белке

Источник Moco Молекулярная масса, кДа Концентрация белка, мкг/мл Количество образца, мкл Удельная акт-ность Moco, ед/мг белка Количество моль Moco на моль белка

Ксантин-оксидаза 275 20 60 0,680 2,0

Мосо- содерж. белок 300 20 60 0,710 1,96

Примечание. Удельные активности приведены по средним значениям пяти повторностей (среднее квадратичное отклонение не превышает 0,1). За единицу активности молибдокофактора принимается количество нмоль нитритов, образовавшихся за 1 мин в ходе реакции новообразованной китрагредуктазы мутанта гриба А'.сгона л/7-1, в расчете н 1 мг внесенного белка - донора МоСо.

Структура и свойства (кофактора выделенного из Мосо-содержащего белка.

Спектр поглощения диссоциированного от белка молибдокофактора с последующим окислением щелочным перманганатом калия (для выявления окисленного птеринового производного) обнаруживает характерный для птеринов пик при 360 нм (рис. 9). Это указывает на птеридиновую природу кофактора Мосо-содержащего белка.

к

Рис. 9. Спектр поглощения отделенного от белка и окисленного

молибдокофактора

С целью идентификация структуры молибдокофактора МоСо-содержащего белка из семян гороха были использованы методики получения стабильных продуктов модификации и окисления кофактора (Johnson, Rajagopalan, 1982; Kramer et al., 1987; Johnson et al., 19S4). Для получения формы А 0,3 мл препарата белка, содержащего МоСо или стандартную ксантиноксидазу (не менее 2 мг белка), в 0,02 М калий-фосфатном буфере разбавляли в 10 раз дистиллированной водой, подкисляли до pH 2,5 раствором соляной кислоты, добавляли 3 г DS-Na, обрабатывали раствором 0,5%-ного иода с 1%-ным йодистым калием в 0,1 М НС1.до концентрации 0, 05 % ¡2, 0,1 % KI или до устойчивого избытка иода. Время обработки составляло 24 ч при комнатной температуре. Для проверки достижения устойчивого избытка иода периодически делали крахмальные пробы (до появления синей окраски). По окончании инкубации избыток иода удаляли добавлением нескольких капель 1%-ной аскорбиновой кислоты. Перед проведением ЖХВД-хроматографии проводили очистку препарата формы А от DS-Na, денатурированного белка и других окисленных продуктов, образовавшихся в результате йодного окисления. Для этого с помощью ячейки Amicon через мембрану РМ-30 осуществляли ультрафильтрацию предварительно

нейтрализованного до pH 7,0-7,5 препарата формы А. Затем полученный диализат объемом 30 мл наносили на колонку с сильным анионообменником QAE-сефадексом А-25 (размеры колонки 0,7x2,0 см). Предварительно колонка заряжалась пропусканием через нее нескольких объемов 1 М ацетата аммония (pH 6,8) с последующей промывкой пятью объемами дистиллированной воды. Форма А связывается с матрицей анионообменника, образуя тонкий слой в верхней части колонки, легко детектируемый с помощью флуоресцентной лампы по характерной ярко-голубой флуоресценции. Колонку промывали не менее чем пятью объемами дистиллированной воды. Форму А элюировали с колонки двумя объемами 0,1 Ni HCl, затем раствор упаривали на роторном испарителе. Осадок растворяли в дистиллированной воде с последующим упариванием на роторном испарителе для освобождения от следов соляной кислоты. Эту процедуру повторяли дважды. Полученный осадок растворяли в 0,4 мл элюента для ЖХВД-хроматографии: 0,3 М формиатный буфер, pH 3,8, содержащий 3%-ный метанол.

Обратнофазовую гидрофобную хроматографию высокого давления проводили на колонке Separon С-18 (0,3x15 см), без использования "предколонки". Образец (30 мкл) наносили на колонку,

- А

- В

1 , Ли-

-1---------1...... 1 ... 1

0 1 2 3 4 5

Время удержания, мин

Рис. 10. Профиль элюции с колонки С-18 (НРЬС) формы А полученной при окислении йодом (¡2/К1) препаратов: кофактора Мосо-содержащего белка (Л), кофактора ксантиноксидазы (В)

уравновешенную 0,3 М формиатным буфером, рН 3,8, содержащим 3%-ный метанол и проводили изократическую элюцию тем же буфером, регистрировали поглощение при 365 ни. Профиль элюции показан на рис. 10. Видно, что время удержания формы А, полученной из МоСо-содержащего белка, соответствует времени удержания формы А, полученной из ксантиноксидазы. Для получения птерин-6-кгрбоновой кислоты к 0,3 мл препарата формы А добавляли 6 мл насыщенного водного раствора перманганата калия и 0,6 мл 1 М раствора КОН, прогревали в течение 50-60 мин на кипящей водяной бане, а затем для разрушения перманганата добавляли 1 мл метанола. Образец охлаждали и центрифугировали 5 мин при 12000 g для удаления нерастворимого осадка двуокиси марганца. Перед проведением ЖХВД-хроматографии окисленный до птерин-6-карбоновой кислоты щелочным перманганатом препарат формы А подвергали дополнительной очистке.

Для этого пробу объемом 0,7 мл наносили на заряженную (как указано выше) колонку с анионообменником ОАЕ-сефадексом А-25 (0,7x2,0 см). Так же, как и в предыдущем случае, птерин-6-карбоновая кислота связывается с матрицей анионообменника, образуя тонкий слой в верхней части колонки, легко детектируемый по ярко-голубой флуоресценции. Колонку промывали несколькими объемами дистиллированной воды. Птерин-6-карбоновую кислоту элюировали с колонки двумя объемами 0,1 М НС1, затем раствор упаривали на роторном испарителе. Далее препарат готовился для ЖХВД-хроматографии в полном соответствии с ранее описанной процедурой. Как видно на рис. 11, профиль элюции окисленного продукта, полученного из МоСо содержащего белка, идентичен профилю элюции стандарта (птерин-6-карбоновой кислоты). Следовательно, структурной основой данного молибдокофактора является птерин с боковой цепью в шестом положении.

Для получения дикарбосиамидометилированного производного МоСо была использована техника обработки образца иодацетамидом в анаэробных условиях. Во флакон объемом 10 мл наливали 2 мл 0,02 М калий-фосфатного буфера рН 7,4. Флакон герметично закрывали резиновой пробкой и через введенную в пробку иглу производили дегазацию, последовательно трехкратно вакуумируя сосуд (10"3 мм рт.ст.) с введением аргона для замены воздуха в буфере инертным газом. Флакон открывали под током аргона, всыпали 8 мг иодацетамида, 25 мг и

вновь герметически закрывали. В отдельном герметичном флаконе готовили 0,1 М раствор дитионита натрия, растворяя в

в о

ч р

о с

15

10

0

30

20 10

И 1 А 1

1 и--'—-- В

Время удержания, мин

Рис. 11. Профиль элюции с колонки С-18 (НРЬС): А -препарат кофактора Мосо-содержашстп белка после обработки йодом (12/К1) с дальнейший окислением перманганатом калия, В - птерин-6-карбоновая кислота

5

О

дегазированном растворе 0,1 M бикарбоната натрия под аргоном (согласно описанной выше процедуре дегазации) навеску кристаллического днтионита. В первый флакон с раствором иодацетамида вводили последовательно через пробку шприцом 0,025 мл раствора днтионита из шорого флакона, 0,1 мл раствора образца, содержащего 2 мг исследуемого белка. Затем раствор оставляли на инкубацию при 37 0 в течение 2 ч с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение ночи (1S ч). После инкубации раствор разбавляли дистиллированной водой до 10 мл. Перед проведением ЖХВД-хроматографии препарат, содержащий дикарбоксиамидо'-метилированную форму кофактора и остатки денатурировавшего белка, подвергали дополнительной очистке по схеме, описанной выше для формы А. Для этого с помощью ячейки Amicoii через мембрану РМ-30 осуществляли ультрафильтрацию образцов; полученный диализат -объемом 10 мл наносили на колонку с анионообменником QAE-сефадексом А-25, элюировали 5 мл 1 M НС1, упаривали на роторном испарителе и переводили в буфер для дальнейшей чрочатографии.

Обработка кофактора иодацетамидом приводила к замещению SH-групп кофактора с образованием camMPT, идентичного (по времени удержания на колонке С-18) аналогичному модифицированному производному, получаемому из препарата кофактора ксантиноксидазы (рис. 12).

Присутствие сульфгидрильных групп в составе МоСо из семян гороха подтверждается сорбцией "активного" МоСо на активированной матрице тиолсефарозы. Нам удалось иммобилизовать гомогенный нативный молибдокофактор в опыте с прямым диализом экстракта белка, содержащего МоСо, против активированной тиолсефарозы. Дл я проведения опыта в стекляную трубочку (0,8 х 5,0 см), с одного конца герметично обтянутую диализной мембраной, наливали 0,5 мл суспензии активированной матрицы тиолсефарозы 4В, предварительно замоченной в 0,02 M калий-фосфатном буфере, рН 7,5,содержащем I мМ ЭДТА и аскорбат натрия (1 мг/мл). Трубочку (обтянутым концом вниз) опускали в стакан с 20 мл экстракта МоСо-содержащего белка в указанном выше буфере (концентрация белка не менее 2 мг/мл). Стакан ставили на магнитную мешалку и проводили диализ на холоду в течение 18-20 ч (при медленном помешивании). По окончании диализа суспензию тиолсефарозы. извлекали из трубочки, заполняли ею мнкроколонку (0,5x0,8 см), отмывали двумя объемами буфера для диализа и проводили элюирование молибдокофактора двумя объемами 0,02 M калий-

а

о ч й о с

5 10 15 20

Время удержания, шш

Рис. 12. Профиль элюиии с колонки С-18 (НР1-С) дикарбокси-амидометилмолибдоптеркна (сашМРТ) полученного при обработке йодацетамидом препаратов: А -кофактора Мосо-содержащего белка, В - кофактора ксантиноксидазы, С- спектр поглощения сашМРТ

фосфатного буфера, pH 7,5,содержащего 1 мМ ЭДТА и 5 мМ восстановленного глутатиона. Полученный МоСо сохранял высокую активность, определяемую в реакции комплементации с дефектной нитратредуктазой мутанта гриба Neurospora crassa nit-1. В данном опыте взаимодействие с тиолсефарозой происходило только благодаря наличию сульфгидрильных групп в молпбдокофактОре; последний вытеснялся более сильным тиоловым реагентом - восстановленным глутатионом с тиолсефарозной матрицы. На это указывает также стабилизирующее действие восстановленной формы глутатиона, используемое для сохранения активности МоСо при прогревании в стандартной процедуре выделения кофактора (Кильдибеков и др., 1995; Омаров, Кильдибеков и др., 1995).

Получение лтерин-6-карбоновой кислоты, формы А и camMPT доказывает наличие в составе МоСо-содержащего белка 6 - замощенного молибдоптерина, структурно идентичного кофактору ксантиноксидазы (Johnson. Rajagopalan, 19S2; Львов, Кильдибеков и др.. 19S3). Таким образом, образование подобных стабильных производных МоСо указывает на мононуклеотидную структуру кофактора в семенах гороха, т. е. в составе выделенного МоСо отсутствует какой-либо дополнительный нуклеотидный остаток, характерный для некоторых типов молибдокофактора, обнаруженных в бактериях (Rajagopalan, 1993). Следовательно, молибдокофактор в семенах гороха структурно сходен с кофактором, выделенным из Мо-ферментов животных организмов (рис. 5, А, форма 1). На основании этого можно заключить, что присутствие динуклеотидных форм молибдокофактора, вероятно, свойственно только для прокариотических организмов.

Условия выделения кофактора из Мосо-содержащего белка. Активность Moco обнаруживхтась только при прогревании фракций очищенного белка, что указывает на его прочную связь с кофактором. Молибдокофактор, аккумулирующийся на этом белке, после прогревания не восстанаачивал активность апонитратредуктазы экстракта мутанта гриба N. crassa nii-I через диализную мембрану. Это вероятно связано с тем, что после температурного воздействия Moco остается связанным с белком, в форме способной встраиваться в активный центр апонитратредуктазы мутанта N. crassa nit-1.

По литературным данным известно, что ввиду высокой о^исляемости Moco в аэробных условиях, поддержание кофактора в-активном состоянии возможно только в присутствии протекторов, в

частности, восстановленной формы глутатиона, аскорбата натрия, дитионита и т. д. (Alikulov, Schiernann, 1985; Алйкулов и др., 1987; Львов, 19S9; Hinton, Dean, 1990). Защитная функция протекторов обусловлена присутствием лабильных функциональных SH-груип в структуре Moco. ;чествующих в координации иона молибдена в активном центре. В нашем случае было обнаружено, что восстановленная форма глутатиона является эффективным протектором в концентрациях 1-3 мМ. Использование в качестве восстановителя аскорбата натрия (1-3 мМ) менее эффективно предохраняло кофактор от инактивации (рис. 7). Для поддержания кофактора в активном состоянии необходимо внесение восстановленного глутатиона с реакционную среду непосредственно перед прогреванием Мосо-содержащего белка. Глутатиок предохраняет кофактор от ина.чтивации только в период температурного воздействия, необходимого для денатурации белка и последующего выделения кофактора.

При прогревании Мосо-содержащего белка одновременно с присутствием глутатиона необходимо добавление ЭДТА (0,1-1мМ). В литературе имеются данные, что хелатирующие лиганды, в частности ЭДТА. образующие устойчивые комплексы с металлами (Си, Со, Fe, Мп) препятствуют окислению птериновых соединений молекулярным кислородом (Миронов, Вольпин, 1980). Очевидно, ЭДТА выполняет стабилизирующую роль при температурном воздействии, т.к. ее добавление сразу после прогревания Мосо-содержащего белка не приводило к сборке функционально активной нитратредуктазы мутанта гриба Л'. crassa nit-1. По-видимому, при температурном воздействии происходит окисление птеринового кольш Moco, и ЭДТА участвует в замедлении этого процесса. Возможно также, что механизм протекторного действия ЭДТА связан с хелированием ионов меди, способных к образованию комплекса с тетрагидроптерином (Burgmayer, 1993). препятствуя включению Мо в кофактор. Если принять во внимание такой механизм стабилизации Moco при помощи ЭДТА, вероятно, следует считать, что выделенный нами кофактор находится в полностью восстановленной тетрагидроформе, т.к дигидрофо,, .« птерина не способны к взаимодействию с двухвалентными ионами меди. Интересно отметить обнаружение высокой активности Moco в исходном экстракте без добавления ЭДТА и глутатиона, что может свидетельствовать о наличии протекторов или других механизмов стабилизации кофактора п семенах гороха.

Активность Moco, выявляемая в реакции комплементации, лимитируется количеством кофактора, способного встраиваться и

дефектную нитратредуктазу мутанта N. crassa nit-1. Следовательно, при использовании прогревания, как метода выделения Moco, необходима оптимизация температурных условий для максимального выделения кофактора, сохраняющего каталитическую активность. Было установлено, что оптимальная температура прогревания Мосо-содержащего белка, после которой происходит максимальная реконструкция апонитратредуктазы мутанта N. crassa nit-1, составляет 95 °С в течение 90 сек . Это позволяет на порядок усилить чувствительность метода определения активного Moco по сравнению с ранее предложенной температурной обработкой при 70 °С (90 сек) (Швецов и др., 1992).

Изучение термостабильности Moco показало,что в течение 5 мин в присутствии протекторов происходит полное окисление, и как следствие, инактивация кофактора под воздействием температуры 95°С. По всей видимости, это связано с окислением восстановленного гдутатиона, выполняющего протекторную функцию, т.к. предварительное прогревание данного восстановителя при той же температуре приводило к утрате его стабилизирующей способности.

Отсутствие молибдена в кофакторе покоящихся семян гороха.

Молибдокофактор аккумулируется на белке в семенах гороха в виде безмолибденового предшественника, т.к только при экзогенном добавлении молибдата натрия (10-2 М) происходит реконструкция (в ходе реакции комплементации апобелка и источника Moco) функционально активной нитратредуктазы мутанта ftl. crassa nit-1. Необходимость внесения молибдена обнаружена также на уровне грубого экстракта, т. е., без добавления молибдата активность Moco не обнаруживалась в семенах гороха. Экзогенный молибден был необходимым условием при определении активного Moco, как при термообработке, так и без ее применения. Известно, что в биосинтез Moco вовлечены продукты экспрессии генов ответственных за поступление Мо в клетку и его включение в кофактор (Hinton, Dean, 1990). При увеличении концентрации молибдена в среде большая часть Moco синтезируется в виде активного кофактора, а при низких котдам грациях значительная часть Moco находится в виде безмолибденового предшественника (Amy, Miller, 1983). С другой стороны, имеются данные, свидетельствующие о том, что семена бобовых растений аккумулируют большое количество молибдена (Львов, 1989; Калакуцкий, 1992), и вероятно, отсутствие Мо в структуре Moco в покоящихся семенах не является следствием его недостатка. Нами обнаружено появление активности кофактора без

добавления экзогенного молибдата при прорастании семян гороха. Можно предположить, что в семенах гороха молибдокофактор накапливается в безмолибденовой форме и включение молибдена в Moco осуществляется в процессе прорастания семени. Отсутствие молибдена в кофакторе покоящихся семян гороха и его дальнейшее включение при прорастании могут играть определенную роль, как механизм регулируемой активации Moco in vivo.

Отсутствие Мо позволяет использовать кофактор для изучения возможности включения в его структуру других металлов, способных к образованию координационных связей с птерином. При внесении эквимолярных количеств вольфрамата (Na2WÜ4) и молибдата (Na2MoW04), активность Moco снижается вдвое, что свидетельствует о конкурентном встраивании вольфрама в активный центр кофактора.

Дцс формы накопления молибдокофактора в семенах гороха.

Наряду с кофактором, прочно связанным с белком, для определения которого необходима температурная обработка препарата, в семенах гороха аккумулируется Moco, способный восстанавливать активность апонитратредуктазы мутанта N. crassa nit-1 без предварительной термообработки (Швецов, 1992). Возникает вопрос, является ли Moco, для комплементации которого не требуется предварительная обработка экстракта - "свободным", т.е низкомолекулярным или же он ассоциирован с белком. Нами обнаружено, что в семенах присутствует кофактор, непрочно ассоциированный с белком, так как гельфильтрация экстракта из муки гороха на колонке с Sephadex G-25, уравновешенной буфером содержащим восстановленный глутатион и ЭДТА, показала наличие активности Moco в белковых фракциях как при прогреве, так и без него. Это указывает на присутствие в семенах гороха Мосо-содержашего белка, свободно отдающего кофактор без тепловой обработки. Количество Moco, определяемое без прогревания, было значительно меньше, чем в варианте с тепловой обработкой фракций элюата. Низкомолекулярный активный Moco не обнаруживается во фракциях после гельфильтрации. Попытки оценить молекулярную массу Мосо-содержащего белка, активность кофактора которого определяется без прогревания .¡репарата методом гель-хроматографии на колонке с Sephacryl S-200, не увенчались успехом, вероятно, ввиду высокой лабильности кофактора в аэробных условиях.

Известно, что структурная функция молибдокофактора заключается в ассоциации субъединиц Мо-фермента (Nason et al., 1970; Аликулов и др., 1980). На наш взгляд, необходимость прогревания фракций Moco-

содержащих белкоз для отделения кофактора, по всей видимости, основана на изменении четвертичной структуры белка, в результате которой кофактор способен встраиваться в апонитратредуктазу. Таким образом, можно предположить, что понятие прочности связи кофактора с белком носит условный характер. По-видимому, существование различий оптимальных условий выделения кофактора из Мосо-содержащих белков зависит от "прочности" связи между субъединицами олигомера. Нами обнаружено, что денатурированный Мосо-содержащий белок способен к обратимой димеризации. Так, после гельфильтрации прогретого препарата Мосо-содержащего белка для определения активности кофактора требуется его повторная температурная обработка. Наличие активности у Мосо-содержащих белков без применения денатурирующих условий скорее всего обусловлено их мономерным составом. В пользу данного предположения свидетельствуют также относительно небольшие молекулярные массы (30-60 кДа) обнаруженных Мосо-содержаших белков бактерий, водорослей и растений, восстанавливающих активность нитратредуктазы мутанта N. сгааа пИ-1 без создания денатурирующих условий (Ату, 1Ъ]'а§ора1ап, 1979; Буриханов, 1981; А11ки1оу, БсЫешапп, 1985; ВавсЫ е1 а1„ 1987; Aguilaг ег а1„ 1991).

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Сравнительное изучение продуктов окисления Moco, выделенного из источников бактериального (нитратредуктаза бактероидов клубеньков люпина), животного (ксантиноксидаза молока) и растительного (Мосо-содержащнй белок семян гороха) происхождения, позволило расшифровать структуру кофактора, представляющего собой уникальный серусодержаший птерин с боковой цепью в б-положении и показать его идентичность во всех исследуемых белках.

2. На основе изучения продуктов окисления Moco выдвинута теоретическая модель координационного центра кофактора, сушественой особенностью которой является участие птеринового кольца кофактора в координации молибдена наряду с одной из двух тиольных групп боковой цепи.

3. Впервые выделен и идентифицирован молибденовый кофактор высших растений, входящий в состав Мосо-содержащего белка семян гороха. Показано, что структурной основой растительного кофактора является его мононуклеотидная форма, характерная также для Moco животного происхождения.

4. Впервые выделен и охарактеризован не являющися молибдофермснтом растительный Мосо-содержащий белок, который аккумулирует молибдокофактор в семенах гороха. Белок представляет собой гомодимер с молекулярной массой 300 кДа, содержит 1 молекулу Moco на 1 субъединицу белка и не имеет в своем составе флавиноз и Fe/S-кластсров.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Аликулов З.А., Кильдибеков H.A., Львов Н.П., Кретович В.Л. Молибдокофакторы молибденсодержащих ферментов - Изв.АН СССР, сер.биол., 1981, №2, с.219-236.

2. Кильдибеков Н.А, Львов Н.П., Кретович В.Л. Модификация метода выделения молибдокофактора из молибденсодержащих ферментов - В кн.:Материалы Всесоюзного симпозиума "Механизмы усвоения азота и биосинтеза белка в растениях", Алма-Ата, 1981, с.55.

3. Ананиади Л.И., Кильдибеков H.A., Сергеев Н.С., Львов Н.П., Кретович В.Л. Некоторые стороны механизма нитратредуктазной активности ксантиноксидазы молока - В кн.: Материалы Всесоюзного сим-позиума "Механизмы усвоения азота и биосинтеза белка в растениях", Алма-Ата, 1981, с.70.

4. Кильдибеков H.A., Аликулов З.А., Львов Н.П., Кретович В.Л. Молибденсодержащие ферменты: Сходство структуры и функций - В кн.: Сборник докладов IX Всесоюзной конференции по проблемам микроэлементов в биологии, Кишинев, Штиинца, 1981, с.168-172.

5. Кильдибеков H.A., Буриханов Ш.С., Львов Н.П., Кретович В.Л. Энзиматические механизмы питания бобовых растений связанных с атмосферным азотом - В.кн.: Сборник тезисов Всесоюзного совещания "Экологические последствия использования агрохимикатов /удобрения/", Пущино, 1982, с.27-28.

6. Ананиади Л.И., Кильдибеков H.A., Сергеев Н.С., Львов Н.П., Кретович ВЛ. Загрязнение нитратами и нитратредуктазная активность ксантиноксидазы молока - В.кн.: Сборник тезисов Всесоюзного совещания "Экологические последствия использования агрохимикатов /удобрения/", Пущино, 1982, с.152-153.

7. Ананиади Л.И., Кильдибеков H.A., Сергеев Н.С., Львов Н.П., Кретович В.Л. Исследование функциональных групп, участвующих в нитратредуктазной активности ксантиноксидазы молока - Биохимия, 1983, т.47, вып.6,с.14-17.

8. Львов Н.П., Кильдибеков H.A., Миронов Е.А., Москалева И..В., Вольпин М.Е.. Кретович ВЛ. Молибдокофакторы нитратредуктазы и ксантиноксидазы и возможные продукты их окисления - ДАН СССР, 1983, т.272, №5, с.1264-1267.

9. Кильдибеков H.A., Жабаева М.У., Аликулов З.А Изучение- нитратвос-станавливающей системы пшеницы - В кн.: Сборник тезисов 5-ой

конференции "Физиологические основы повышения продуктивности и устойчивости зерновых культур"Целиноград, 1984, с.132-133.

10. Кильдибеков H.A., Аликулов З.А. Изучение молибденового кофактора в зерне пшеницы. - В кн.:Сборник тезисов V Всесоюзного биохимического съезда, Киев, 1985, с.162-163.

11. Кильдибеков H.A., Скопин В.Ю. Оценка стабильности нитратредуктазы проростков пшеницы. - В кн.: Сборник тезисов IV Конференции биохимиков респ. Средней Азии и Казахстана, Ашхабад, 1986, с.267-268.

12. Кильдибеков H.A., Годовикова В.А., Скопин В.Ю. Нитратредуктазная активность и содержание молибдена у мутантов ячменя - В кн.¡Сборник тезисов X Всесоюзной конференции по проблемам микроэлементов, Чебоксары, 19S6, с.123-124.

13. Кильдибеков H.A., Бурсаков С.А., Гвоздев Р.И., Львов Н.П. Высокочувствительный кинетический микрометод определения молибдена в растительное материале - Прикладная биохимия и микробиология, 1987, т.23, вып.2, с.284-287.

14. Аликулов З.А., Кильдибеков H.A., Бесба;ва Б.М., Скопии В.Ю. Изучение свойств и регуляции молибденового кофактора и нитратредуктазы высших растений - В кн.: "Ферменты и качество зерна" ,Алма-Ата, 1987, с.125-153. >

!5 Кильдибеков H.A., Годовикова В.А. Шумный В.К. Биохимическая характеристика нитратредукгазных мутантов ячменя - ДАН СССР, 1987, т.293, №5, с. 1245-1248.

16. Топупов А.Ф., Кильдибеков H.A., Асеева К.Б., Львов Н.П. Деградация нитратредуктазы бактероидов клубеньков люпина при выделении и очистке - Иэз.АН СССР, сер.биол., 19S8, №1, с.150-154.

17. Кильдибеков H.A., Бурсаков С.А., Ггоздез Р.И., Львов Н.П. Высокочувствительный кинетический микрометоя определения молибдена в растительном материале - В кн.: "Новые методы практической биохимии", М, 1988, с. 109-111.

18. .Аликулов З.А., Кильдибеков H.A., Бесбаева Б.М., чЛ-:опин В.Ю., Идрисова А. Иммобилизация молибдокофактора на тиолсефарозе - В кн.: "Методы молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии растений" Алма-Ата, 1988, с.109-114.

19 Кильдибеков H.A., Скопин В.Ю. Кинетический метод определения молибдена в молибдоферментах - В кн.: "Методы молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии растений" Алма-Ата, 1988, с.118-119.

20. Kildibekov N.A., Godovikova V.A., Skopin VJu. Biochemical characterization of barley nitrate reductase mutants - Abstr. of XIV International Biochemical Congress, Praque, 1988, p.76.

21. Кильдибеков H.A., Скопил В.Ю., Аликулов З.А. Аффинная хроматография нитратредуктазы пшеницы на проционовых красителях с различными матрицами - В кн.: Материалы Всесоюзного симпозиума "Препаративная хроматография физиологически активных препаратов на полимерных сорбентах", Ленинград, 1988, с.98.

22. Kildibekov N.A., Alikuiov Z.A., Besbaeva В.М., Skopin V.Ju.

Nitrate reductase from wheat seeds - Modern problems of physico-chemical biology and biotechnology. Abstr. of scientific conference, Alma-Ata, 1989, p.87.

23. Kildibekov N.A., Omirbekova N.Zh., Boguspaev K.K., Skopin V.Ju. Nitrate reductase activity of barley androgenous callus culture regenerants -Modern problems of physico-chemical biology and biotechnology. Abstr. of scientific conference, Alma-Ata, 1989, p.88.

24. Швецов A.A., Бурсаков C.A., Калакуцкий К.Л., Кильдибеков Н.А., Львов Н.П. Белок, содержащий молибдокофактор в листьях пшеницы, ячменя и гороха - Биохимия, 1992, т.57, вып.2, с.292-299.

25. Кильдибеков Н.А., Омаров Р.Т., Швецов А.А., Львов Н.П. Белок, содержащий молибдокофактор из семян гороха Pisum sativum L.: выделение и очистка - Биохимия, 1995, т.60, вып.9, с. 1411-1418.

26. Омаров Р.Т., Кильдибеков Н.А., Швецов А.А., Львов Н.П. Свойства молибденового кофактора из семян гороха - Прикладная биохимия и микробиология, 1995, т.31, № 6, с.604-608.

27. Kildibekov N.A., Omarov R.T., Antipov A.N., Shvetsov A.A., L'vov N.P.

A molybdocofactor-containing protein from pea (Pisum sativum L.,) seeds: purification and properties - Abstr. of Fourth International Symposium on Inorganic Nitrogen Assimilation, Seeheim, Darmstadt, Germany, 1995, p.65.

28. Shvetsov AA., Omarov R.T., Kalakoutskii K.L., Kildibekov N.A.,

L'vov N.P. Genetically determined molybdenum cofactor level in legume seeds: physiological and biochemical significance - Abstr. of Fourth International Symposium on Inorganic Nitrogen Assimilation, Seeheim, Darmstadt, Germany, 1995, p.117.

29. Кильдибеков H.A., Омаров P.T., Львов Н.П. Молибденовый кофактор (обзор) - Успехи биологической химии, 1996, г.36, с. 136-186.

30. Кильдибеков Н.А., Омаров Р.Т., Антипов А.Н., Миронов Е.А.,

Львов Н.П. Структура молибдокофактора из семян гороха Pisum sativum L. - Биохимия, 1996, N5.

31. Kildibekov N.A., Omarov R.T., Antipov A.N., Mironov E.A., L'vov N.P. Purification of a molybdocofactor-containing protein from pea seeds and identification of molybdopterin - Plant Physio!. Biochem., 1996 (принято в печать).

32. Швецов А.А., Омаров Р.Т., Кильдибеков Н.А., Львов Н.П. Белок, содержащий молибдокофактор и способ его получения - Заявка на патент № 95114012 от 4.08.95.

МГГ.У

3c*«L -154-3 Т. <00