Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биохимические особенности представителей галоалкалофильных бактерий из содовых озер

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические особенности представителей галоалкалофильных бактерий из содовых озер"

На правах рукописи

БОЛТЯНСКАЯ Юлия Владимировна

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ГАЛОАЛКАЛОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ ИЗ

СОДОВЫХ ОЗЕР

Специальность 03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук М.А. Путева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Д.Ю. Сорокин

доктор биологических наук, профессор М.М. Умаров

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Бахе РАН

Защита диссертации состоится « 15 » мая 2006 г. в 14°° на заседании диссертационного совета Д.002 224.01 в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат разослан « / "» апреля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета у

кандидат биологических наук Л.Е. Никитин

2-00Q /V 7

Актуальность. Микробное сообщество содовых озер активно изучается с начала 1990-х годов В нашей стране интерес к ним в значительной степени обусловлен гипотезой Г.А. Заварзина о том, что эпиконтичентальные содовые водоемы могут являться центром формирования наземной биоты в прошлом (Заварзин, 1993) и рассматриваться, таким образом, как реликтовые Содовые озера представляют собой уникальную экосистему, в которой экстремально высокий pH часто сочетается с высокими концентрациями солей вплоть до насыщающих. Чтобы выжить в таких условиях, микроорганизмы должны располагать комплексом адаптационных механизмов В настоящее время существует большое количество работ, посвященных изучению этих механизмов у разнообразных галофильных бактерий (Sadler et al, 1980; Vreeland et al, 1984; Vreeland, 1987, Galinski and Trüper, 1994; Cänovas et al., 1996; Mojica et al, 1997; Ono et al., 1998; Valderrama et al, 1998; Roeßler and Müller, 2001). Однако галоалкалофильные представители содовых озер с этой точки зрения мало изучены. Активное исследование микробного сообщества содовых озер, начатое в лаборатории акад. Г.А. Заварзина (Zhilina and Zavarzin, 1994) и описание ряда новых микроорганизмов различных систематических групп (Заварзин и др., 1999) позволило провести сравнительное изучение механизмов адаптации этих бакгерий к экстремальным условиям.

В настоящее время известны представители основных групп микроорганизмов, осуществляющих круговороты элементов в содовых водоемах. Среди них новые представители групп первичных и вторичных анаэробов, совместное действие которых приводит к полной деструкции органического вещества (Zavarzin and Zhilina, 2000). С циклом углерода напрямую связан цикл азота, являющийся важнейшим звеном в функционировании любой экосистемы.

Диссимиляционное восстановление нитрата (денитрификация) является хорошо изученным процессом в микробиологическом плане, однако первые алкалофильные денитрификаторы были описаны относительно недавно. Новейшие исследования > показали, что к литотрофному восстановлению нитрата способны представители рода Thioalkalivibrio (Sorokin et al, 2002c; Sorokin et al., 2003b; Sorokin et al, 2004b), а в условиях органотрофного питания важнейшую роль играют представители рода Halomonas. Высокая численность галомонад в щелочных экосистемах подтверждается результатами молекулярно-биологических исследований (Duckworth et al, 1996), однако на данный момент идентифицировано лишь небольшое число облигатно алкалофильных представителей этого рода (Berendes et al, 1996, Mormile et al., 1999, Duckworth et al., 2000). Предполагается, что алкалофильные галомонады могут обладать уникальными свойствами, отличающими их от нейтрофильных представителей этого рода (Jones and Grant, 2000). Таким образом, их изучение представляет определенный интерес.

Ключевым ферментом ассимиляции нитрата у эукариот, а также ассимиляции и диссимиляции у прокариот является нитратредуктаза, катализирующая восстановление нитрата в нитрит. Несмотря на разнообразие форм, универсальность фермента для про- и эукариот определяется наличием общего молибденового кофактора у всех выделенных до сих пор нитратредуктаз. Зависимость нитратредуктаз от молибдена была установлена еще 50 лег назад (Wolfe, 1954) и многократно подтверждалась дальнейшими исследованиями (Львов, 1989; Кильдибеков и др., 1996). Однако в 1998 году в лаборатории проф. Н.П. Львова (ИНБИ им. А.Н. Баха РАН) из клеток ванадатредуцирующей бактерии Pseudomonas isachenkovii впервые были выделены две так называемые «альтернативные» нитратредуктазы, не содержащие молибден и молибденовый кофактор (Antipov et al, 1998). У ферментов был обнаружен ряд необычных свойств (Антипов и др., 1999). На основании результатов этого исследования была сформулирована гипотеза, согласно которой безмолибденовые нитратредуктазы, возможно, синтезируются у организмов, населяющих экстремальные местообитания. Были обозначены возможные пути поиска микроорганизмов с новым типом нитратредуктаз (Антипов, 1999). В числе экстремальных факторов рассматривается и высокий pH окружающей среды. К началу нашей работы исследований, касающихся структуры и свойств нитратредуктаз алкалофилов, не проводилось. По предложению проф. Н.П. Львова было предпринято исследование нитратредуктаз облигатно алкалофильных штаммов денитрификаторов, выделенных из содовых озер Т.Н. Жилиной и Д.Ю. Сорокиным, что потребовало описания этих организмов и изучения особенностей их физиологии.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение особенностей физиологии и биохимии новых алкалофильцых денитрифицирующих бактерий и исследование механизмов осмоадаптации у новых и описанных ранее галоалкалофияьных представителей содовых озер.

В рамках основной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Описание новых штаммов алкалофильных гетеротрофных денитрифицирующих бактерий, выделенных из содовых озер;

2. Поиск безмолибденовых нитратредуктаз у новых штаммов галоалкалофильных денитрификаторов. Исследование свойств безмолибденовой нитратредуктазы штамма 2-7398-2 как модельного объекта;

3. Изучение механизмов адаптации галоалкалофильных бактерий к осмотическому стрессу на примере новых штаммов денитрификаторов и описанных ранее микроорганизмов:

а) оценка внутриклеточных концентраций ионов натрия, калия и хлора;

б) идентификация внутриклеточных осмопротекторов;

в) анализ аминокислотного состава общего клеточного белка;

г) исследование способности ферментов метаболизма к функционированию в условиях высоких концентраций солей.

Научная новизна и практическая значимость. Определен таксономический статус 11 штаммов алкалофильных денитрифицирующих бактерий из содовых озер. Штамм 2-7009, а также штаммы АШ.-1 и АГО.-2 отнесены к роду На1отопаз в качестве новых видов с предложенными названиями Я. паггопоркйа и Я кепуепьи. 8 штаммов из озера Магади отнесены к ранее известному виду Нактопая сатр1за1и. У выбранного для изучения штамма Я. сатр 'паШ 2-7398-2 выделена и очищена до гомогенного состояния нитратредуктаза, не содержащая молибден и молибденовый кофактор в активном центре. Показана распространенность безмолибденовых нитратредуктаз у галоалкалофильных денитрифицирующих бактерий.

Исследованы стратегии осмоадаптации галоалкалофильных бактерий. Обнаружено, что внутриклеточные концентрации ионов К+ и СГ у Я. сатриаШ и Я. Леиуеяда недостаточны для уравновешивания внутреннего и внешнего осмотического давления, и баланс достигается благодаря накоплению органических осморегуляторов, как это характерно для нейтрофильных представителей этого рода. У галоалкалофильного представителя порядка На1апаегоЫа1сз ИшготеИа асеЧ§епа осмолиты не обнаружены, а осмоадаптация осуществляется за счет накопления в клетке экстремально высоких концентраций солей. В клетках ТтйаШа magadlensis обнаружен бетаин. Установлено, что белки изучаемых галоалкалофильных бактерий обогащены остатками кислых аминокислот, как это характерно для галофильных белков. Показано, что дополнительным способом приспособления изученных микроорганизмов к осмотическому стрессу является возможность функционирования их ферментов в широком интервале концентраций солей.

Полученные результаты расширяют представления о физиолого-биохимическом разнообразии галоалкалофильных денитрифицирующих бактерий и их месте в круговороте азота в содовых водоемах. Новые штаммы могут быть рекомендованы в качестве потенциальных агентов для очистки щелочных нитратсодержащих сточных вод. Галоалкалофильные микроорганизмы представляют интерес как источники новых солетолерантных ферментов.

Апробация работы. Отдельные материалы диссертации докладывались на следующих научных конференциях: III сьезд Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004 и 2005), «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004), «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Москва, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисов, 1 статья принята к печати.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста и включают 29 рисунков и 15 таблиц. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Выводы», «Заключение» и «Список литературы», включающий в себя 279 наименований.

Благодарность. Автор выражает глубокую признательность д.б.н Т.Н. Жилиной за предоставление культур и ценные советы по их описанию, д б.н. Д.Ю. Сорокину за предоставление штаммов AIR-1 и AIR-2, к б н. А.Н. Антштаву за руководство биохимической частью работы, к.б.н. В В. Кевбрину и к б.н. Е.Н. Детковой за советы и помощь в освоении методик, к.бн. А.М Лысенко, к.т.н. Т.В. Колгановой за помощь на отдельных этапах работы. Я особенно благодарна д.б.н М.А Пушевой за общее научное руководство и заведующему лабораторией реликтовых микробных сообществ ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН акад. Г А. Заварзину за помощь в интерпретации результатов.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ 01-04-48553, 01-04-48217, 0104-48018, грантов Президента РФ «Ведущие научные школы» НШ-И01.2003 4 и РИ-112/001/027, гранта Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования.

I. Новые галоалкалофильные денитрифицирующие бактерии

1. Штаммы Z-7198, Z-7198-2-1, Z-7398-2, Z-7398-2-3, Z-7498-1-1, Z-7498-2, Z-7498-2-1, Z-7498-5 выделены д б.н Т Н Жилиной анаэробно из проб донного осадка с отмершими пурпурными бактериями, отобранных проф Г.А. Заварзиным в сентябре 1998 г из лагуны к северу от насыпи через озеро Магади (Кения) с глубины 30см. На момент отбора проб вода в лагуне имела температуру 38°С и минерализацию 260 г/л, рН 10.5.

2 Штамм Z-7009 изолирован д б п. Т.Н Жилиной анаэробно из пробы, отобранной проф В.М. Горленко из придонного ила озера Дзун-Тухэм-Нур (Северо-восточная Монголия) в сентябре 1999 г (Sorokin et al, 2004а). На момент отбора пробы рН воды составлял 9.1, минерализация - 27 г/л

3 Штаммы AIR-1 и AIR-2 выделены аэробно из смешанной пробы илов пяти кенийских озер (Кратерное, Богория, Элментейта, Накуру, Магади) д.б н Д.Ю Сорокиным.

Необходимые для сравнения типовые штаммы Halomonas campisalis и Н. desiderata были любезно предоставлены Dr. В. Peyton и Dr В. Tindall, соответственно.

П Описанные ранее анаэробные бактерии Tindallia magadiensis (Kevbnr. et al, 1998), Natroniella acetigena (Zhilina et al, 1997), Halanaerobium saccharolyticum (Zhilina et al, 1992) и Acetobacterium paludosum (Kotsyurbenko et al, 1995), различающиеся по степени галофилии, получены из коллекции лаборатории реликтовых микробных сообществ ИНМИ РАН Некоторые свойства этих бактерий приведены в таблице 1

Таблица 1. Некоторые свойства используемых в работе микроорганизмов

Микроорганизм Порядок семейство Область рН/ оптимум Отношение к Na+ Na+,M Пределы роста/оптимум

Acetobacterium paludosum Clostndiales Eubacrenaceae 5.0-8 0/7.0 нейтрофил негалофил —

Halanaerobium saccharolyticum Halanaerobiales Haloanaerobiaceae 6.0-8.0/7.5 нейтрофил умеренный галофил 0.5-5.1/1.7

Tindallia magadiensis Clostndiales Clostndiaceae 7 5-10.5 / 8.5 алкал офил умеренный галофил 0.17-1.7/0.51-1.0

Natroniella acetigena Halanaerobiales Halobacteroidaceae 8.1-10 7/9.7-10.0 алкалофил экстремальный галофил 1.7-4.4/ 2.0-2.56

Условия культивирования. Минеральный фон сред для культивирования денитрификаторов до и после оптимизации представлен в таблице 2. Общими компонентами всех сред являлись (г/л)' КН2Р04 - 0 2, MgCl2*6H20 - 0.05; Ка>ГО3 - 1; дрожжевой экстракт - 0.1; раствор микроэлементов (Кевбрин и Заварзин, 1992) - 1 мл, ацетат натрия - 2. Среды для выделения содержали также №28*9Н20 (0.2 г/л). В аэробных условиях источником азота служил хлорид аммония (0.5 г/л), а КаМЭз не вносили. В опытах по изучению стратегий осмоадаптации использовали среду, минеральный фон которой включал 6.5 г/л Ка2СОз и 3.5 г/л ТчаНСОз, а необходимый уровень солености достигался варьированием концентрации №С1.

TmdaШa magadiensis 2-7934т культивировали на среде с пируватом как описано ранее (КсуЬгш е! а1, 1998). ШиотеПа асе^епа Z-7937т культивировали с лактатом (5 г/л) при рН 9.7 на

среде следующего состава (г/л): N82001 - 68.3; КаНСОз - 38.3; КН2РО4 - 0.2; МяС126Н20 - 0.1; КН4С1 -1.0; КС1 - 0.2; дрожжевой экстракт - 0.2; Ка^Б 9НгО - 1.0; раствор микроэлементов - 1 мл; 0 04% резазурин - 2 мл; раствор витаминов по Волину - 2 мл. Среда содержала 1 или 5% №С1. Галофильный ацетоген На1апаегоЫит яасскаго^Нсит Ъ-11%11 культивировали согласно работе (ЯиНпа ег а1, 1992), пресноводный Асе^ЪШепит раЫйозит 2-4092т в соответствии с (КойуигЬепко а а1„ 1995).

Таблица 2. Состав минерального фона сред для культивирования галоалкалофильных денитрифицирующих бактерий_ __

Штамм Среда для выделения, г/л Среда после оптимизация, г/л

Na2C03 NaHCOj NaCl Na2C03 NaHC03 NaCl

Z-7198; Z-7198-2-1; Z-7398-2; Z-7398-2-3 Z-7498-1-1; Z-7498-2 Z-7498-2-1; Z-7498-5 90 10 50 30 50 0

AIR-1; AIR-2 23 7 6 24 38 0

Z-7009 59 20 31 10 15 28

Примечание: состав сред после оптимизации указан для штаммов, выделенных в таблице жирным шрифтом.

Рост. В зависимости от целей работы рост оценивали по оптической плотности клеточной суспензии при 600 нм на спектрофотометре Spekol (Jena) в кюветах с длиной оптического пути 10 мм или непосредственно в пробирках Хангейта, прямым подсчетом клеток в световом микроскопе или по общему клеточному белку. Белок определяли методом Лоури (Lowry et al, 1951).

Ростовые характеристики. Для получения pH зависимостей нужные значения pH устанавливали подтитровкой среды 6М HCl и 12М NaOH. Зависимость от карбонатов изучали при замене их эквимолярным по натрию количеством NaCl, для поддержания pH 9 применяли 50 мМ TABS или сериновый буфер. Абсолютную потребность в хлориде выявляли заменой NaCl эквимолярным по Na+ количеством карбоната и бикарбоната в соотношении, поддерживающем оптимальное значение pH. Для выявления потребности в ионе Na+ все натриевые соли заменяли калиевыми. Для определения зависимости роста от концентрации NaCl общее содержание карбонатов в среде снижали в 10 раз, a NaCl в количестве от 0 до 30% (вес/объем) вносили отдельно в каждую пробирку. Влияние температуры на рост изучали при оптимальных значениях pH и минерализации. Термоустойчивость выявляли путем инкубации культур, взятых со стационарной стадии роста, в течение 10 и 50 мин при 70°С с последующим высевом на жидкие питательные среды оптимального состава. О термоустойчивости судили по наличию или отсутствию роста после 14 суток культивирования.

Аналитические определения. Ацетат определяли на хроматографе модели 3700 (Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Азот, кислород и водород определяли на газовом хроматографе J1XM-80 с катарометром на колонке, заполненной молекулярным ситом 5А (Serva) при комнатной температуре Нитрит определяли спектрофотометрически при 548 нм по образованию окрашенного азокомплекса с сульфаниловой кислотой и 1-N-нафтилэтилендиамином, сульфид - по реакции образования метиленовой сини (Trüper and Schlegel, 1964), аммоний - по реакции с реактивом Несслера после изотермической микровозгонки в виде свободного аммиака. Тесты на наличие каталазы и оксидазы проводили по стандартным методикам соответственно с 3% Н2О2 и N,N,N,'N,'- тетраметил-п-фенилендиамином 2НС1.

Получение суспензий клеток и бесклеточных экстрактов. Клетки осаждали центрифугированием при 16600G в течение 15 мин. и ресуспендировали в различных буферах в зависимости от целей работы. Для получения бесклеточных экстрактов суспензии подвергали аэробному разрушению на Х-прессе или ультразвуком в УЗДН-1 при 0.4 мА 3 раза по 0.5 мин. Клеточные фрагменты удаляли центрифугированием 15 мин при 8000 об./мин. Бесклеточные экстракты использовали как источник нитратредуктазы или для определения внутриклеточных концентраций ионов. С целью определения активностей СО-дегидрогеназ и гидрогеназ разрушение клеток проводили анаэробно.

Концентрацию неорганических ионов в бесклеточных экстрактах определяли совместно с к.б.н. JI.E. Дуловым методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Стайер (Аквилон. Россия) с кондуктометрическим детектором. Определение хлорид-иона проводили в 3 мМ карбонатном буфере на колонке ВТХ An (4.6 * 100 мм). Концентрации ионов натрия и калия определяли в 2 мМ растворе HNO3 на колонке С1Р (4 * 150 мм). Скорость потока элюента -1.5 мл/мин; объем вводимой пробы 20 мхл. Объем межклеточной воды учитывали с помощью голубого декстрана 2000Т, как описано ранее (Николаев и др., 1987). Внутриклеточный объем рассчитывали на основании геометрических размеров клеток (Fagerbakke et al., 1999).

Анализ общего аминокислотного состава белков. Клетки, находящиеся в конце экспоненциальной фазы роста, осаждали центрифугированием при 16600G в течение 15 мин. Белок осаждали 70% этанолом, отделяли от низкомолекулярных компонентов клетки центрифигированием и подвергали гидролизу в 6М НС1 (20-21 ч при 110°С). Гидролизат упаривали на вакуум-роторном испарителе, промывали деионизированной водой для удаления избытка НС1 и повторно упаривали. Анализ аминокислот в виде N-трифторацетил-О-изопропиловых эфиров проводили на хроматографе модели 3700 с пламенно-ионизационным детектором. Разделение проводили на кварцевой капиллярной колонке размером 25 м * 0.23 мм с диамидной фазой типа Chirasil-L-Val. Начальная температура анализа составляла 85"С (3 мин), затем температуру увеличивали до 200°С со скоростью Ю'С/мин. Процедура не позволяет определить триптофан и цистеин, так как они разлагаются при кислотном гидролизе. В процессе гидролиза глутамин дезаминируется в глутаминовую кислоту, а аспарапга - аспарагиновую, поэтому эти аминокислоты выходят в виде единого пика с соответствующими аминами. Анализ выполнен в совместной работе с к.х.н. Н С. Иконниковым.

Анализ осмолитов. Полученный после осаждения белка супернатант (спиртовой экстракт) упариваривали на вакуум-роторном испарителе до получения сухого остатка и растворяли в ДМСО. 'Н и !3С спектры регистрировали на ЯМР-спектрометре Bruker АСЗОО (Германия) с рабочими частотами 300.13 МГц по протонам и 75.64 МГц по углероду. Химические сдвиги были измерены по сигналам ДМСО при комнатной температуре (совместно с к.х.н. А.Н. Шумским).

Выделение и очистка нитратредуктазы. Гомогенный препарат нитратредуктазы получали методом препаративного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Элюируемые с ПААГ фракции, обладающие нитратредуктазной активностью, концентрировали на ячейке для ультрафильтрации «Amicon» (мембрана ХМ 50). При необходимости препарат повторно подвергали препаративному электрофорезу в тех же условиях с последующей ультрафильтрацией. Полученный препарат нитратредуктазы был электрофоретически гомогенен.

Препаративный электрофорез проводили в ПААГ, содержащем 7.5% акриламида, при комнатной температуре. В качестве электродного буфера использовали трис-боратный буфер (рН 8 9). Непрерывную элюшло белков осуществляли электродным буфером. Нитратредуктазную активность во фракциях определяли, как описано выше.

Аналитический электрофорез. Нативный диск-электрофорез проводили в градиентном ПААГ (5-15% акриламида) в пластине размером 11x11см и толщиной 1 мм (Ornstein, 1964) при комнатной температуре. Белковые поносы окрашивали серебром по методу Нестеренко (Nesterenko, 1994). В качестве стандарта при определении молекулярной массы белка использовали бычий сывороточный альбумин (67 кДа) и его олигомеры. Субъединичный состав белков определяли методом денатурирующего электрофореза в градиентном ПААГ с концентрацией геля 5-20% в присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия (SDS) (Laemmli, 1970) Процесс проводили в тех же условиях, что и нативный электрофорез. В качестве стандарта для определения молекулярных масс субъединиц использовали смесь р-галактозидазы (116 кДа), фосфорилазы b (97 кДа), бычьего сывороточного альбумина (67 кДа), яичного альбумина (45 кДа) и карбоангидразы (29 кДа).

Определение наличия молибденового кофактора (Moco) проводили с использованием мутанта nit-l гриба Neurospora crassa, содержащего дефектную по Moco нитратредуктазу (Nason et al, 1970). При комплементации молибденового кофактора с апонитратредуктазой мутанта nit-l происходит сборка функционально активного фермента.

Определение нитратредуктазной актнвпости. Для определения нитратредуктазной активности in vitro в качестве донора электронов использовали восстановленный дитионитом

метилвиологен (Bluetnle and Zumft, 1991). Применяли реакционную смесь следующего состава (мМ): 0.1 M калий-фосфатный буфер (рН 7) - 100; KNO3 - 10; дитионит натрия - 1.2; метилвиологен - 0.8 и исследуемый препарат нитратредуктазы. Реакцию инициировали внесением дитионита. Смесь инкубировали 15 мин при 70 "С, а затем измеряли количество образовавшегося нитрита. За относительную единицу активности нитратредуктазы принимали количество нмоль нитрита, образовавшееся за минуту ферментативной реакции Для определения нитратредуктазной активности в ПААГ использовали реакционную смесь следующего состава (мМ): 0.1 M натрий-фосфатный буфер (рН 7), KNOj - 20, метилвиологен - 1, дитионит - 5. Пластину геля инкубировали в смеси при 70°С до появления на синем фоне геля прозрачных полос, образующихся вследствие окисления металвиологена нитратредуктазой, а затем помещали в 0.05% трифенилтетразолийхлорид для фиксации окраски. Окончательную фиксацию проводили в 5% уксусной кислоте.

Активности СО-дегидрогеназы и гидрогеназы определяли спектрофотометрически при 600 нм по восстановлению бензилвиологена, соответственно, СО и водородом в регистрирующем спектрофотометре «Specord» UV-VIS (Пушева и др., 1989, Пушева и Соколова, 1995). Молярный коэффициент экстинкции для бензилвиологена составлял 8.65 мМ"1 см'1. Активности лактатдегидрогеназы и глутаматдегидрогевазы определяли спектрофотометрически при 340 нм по окислению NADH с пируватом и а-кетоглутаратом, соответственно (Bergmeyer, 1963). Определение активности фермента гликолиза глицеральдегид-3-фосфат-дегндрогеназы определяли спектрофотометрически при 340 нм по окислению NADH в присутствии 3-фосфоглицериновой кислоты. Молярный коэффициент экстинкции для NADH 6.22 мМ'1 см'1.

Анализ металлов в активном центре нитратредуктазы проводили методами плазменной атомно-эмиссионной спектрометрии и плазменной масс-спектрометрии на приборах Optima 2000 DV и Elan 9000 («Perkin Elmer», США), а также методом рентгеновского микроанализа на микроскопе JEM-100C XII со сканером EM-ASID4D и приставкой для рентгеновского микроанализа Link 860 с детектором Е 5123.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. СИСТЕМАТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ НОВЫХ ДЕНИТРИФИЦИРУЮЩИХ ГАЛОАЛКАЛОФИЛОВ

Группа штаммов, изолированных из содового озера Магади, несколько различались формой, цветом и размером колоний, морфологией клеток и степенью адгезии. В анаэробных условиях у большинства штаммов была обнаружена способность к образованию закиси азота как промежуточного продукта денитрификации. Несмотря на эти различия, организмы оказались очень близки по содержанию Г+Ц пар в составе ДНК (66.1 - 68.1 мол. %) и по степени ДНК-ДНК гомологии (75 - 92%), и являются, таким образом, морфотипами одного вида. Дальнейшие исследования показали их принадлежность к ранее монотипическому виду Halomonas campisalis (Mormile et al., 1999). Однако обнаружение y новых штаммов необычной нитратредуктазы, впервые выявленной у алкалофильных денитрификаторов, заставило предварить ее этимологическое исследование физиологическим. В качестве объекта изучения была выбран штамм Z-7398-2.

Штаммы Z-7009, AIR-1 и AIR-2 составили две отдельные ДНК-гомологичные группы, различающиеся на видовом уровне (Табл. 3).

Таблица 3. Нуклеотидный состав и гомология ДНК алкалофильных денитрификаторов Z-7009, AIR-1 и AIR-2.

Штаммы Г+Ц, мол % Гомология с AIR-2, %

Z-7009 67.9 50

AIR-1 651 90

AIR-2 65.5 100

Уровень гомологии этих бактерий со штаммами из озера Магади не превышал 35%.

На основании данных анализа 16S рРНК они также были отнесены к роду Halomonas. Положение новых штаммов в системе рода Halomonas показано на рисунке 1. Штамм AIR-2 оказался близок к двум из трех описанных ранее алкалофильных галомонад - Н. tampisalu (Mormile et al, 1999) и Я desiderata (Berendes et al., 1996). Штамм Z-7009 попал в один кластер с нейтрофильным Я alimentaria, выделенным из корейского национального блюда (Yoon et al, 2002) и галоалкалофильным Я ventosae, являющимся компонентом микробного сообщества засоленных почв юго-востока Испании (Martínez-Cánovas et al, 2004) Низкий уровень ДНК-ДНК гомологии новых штаммов с филогенетически близкими организмами, а также некоторые фенотипические различия, позволили описать их в качестве новых видов.

Halomonas eurihalina ATCC 49336T, X87218 Halomonas elongata ATCC 33173T, M93355

Halomonas halmophûa ATCC 197171, AJ306889 Halomonas salma F8-11T, AJ295145 Halomonas halophila DSM 4770T, M93353 Halomonas mawa S-31T. AJ271864 Halomonas pacifica DSM 4742T, L42616 _J Halomonas halodemtrificans ATCC 13511T, L04942

J*" Halomonas alimentaria YKJ-16T. AF21 ¡860 I*-" Halomonas ventosae AI12T. AY268080 | Halomonas cupida DSM 4740T, L42615

| Halomonas halocynthiae KMM 1376T, AJ417388

'-Z-7009

Halomonas anticariensis FP35T. AY489405 Halomonas campisalis ATCC 700597T, AF054286 Halomonas desiderata FB2T, X92417"

AIR-2

Halomonas pantelleriensis AAPT, X93493 — Halomonas muralis LMG 20969T, AJ320530

Рисунок 1. Филогенетическое дерево, показывающее положение штаммов Z-7009 и AIR-2 в системе рода Halomonas. Значения «Bootstrap» анализа указаны над точками ветвления. Значащими признаны значения более 95.

Ниже приведено описание штамма Z-7398-2 и диагнозы новых видов.

2. ОПИСАНИЕ ДЕНИТРИФИЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ ИЗ СОДОВЫХ ОЗЕР

2.1. Штамм Z-7398-2

Клетки имеют различную морфологию в зависимости от возраста культуры. В экспоненциальной фазе роста размер клеток составляет 0.8-1 х 1-3 мкм. На поздних стадиях развития возможно образование коротких цепочек из нескольких клеток или агрегатов клеток, а также длинных изогнутых нитей. Клетки окружены слизистой капсулой. Подвижность за счет двух боковых жгутиков, расположенных с одной стороны. Организм каталазо- и оксидазо положителен. Клеточная стенка имеет грам-отрицательный тип строения, что характерно для всех галомонад.

Штамм растет при содержании в среде от 0.16 до 3 1 М Na+ с выраженным оптимумом при 1 0 М (Рис За) и может быть охарактеризован как умеренный галофил. Организм развивается в щелочной области рН с пределами роста 7 5-10.4 и оптимумом 8.8-9.5 (Рис 36), что позволяет считать его истинным алкалофилом. При оптимальных значениях рН и концентрации Na+ культура растет в широком интервале температур от 10 до 55°С с оптимумом 36-40°С (Рис. Зв)

Организм является истинным денитрификатором, восстановливающим нитрат до газообразного азота Исследование динамики процесса денитрификации выявило четко выраженный двухстадийный характер. На первом этапе происходит полный количественный переход нитрата в нитрит, причем до исчерпания нитрата дальнейшее восстановление не

происходит На втором этапе образовавшийся ранее нитрит переходит в газообразные продукты денитрификации - азот и небольшое количество закиси азота. В конечной точке процесса нитрат и нитрит не обнаружены Таким образом, несмотря на то, что нам не удалось добиться анаэробного роста с нитритом в качестве акцептора электронов, организм обладает способностью к его восстановлению, поскольку при росте с нитратом образующийся на первой стадии денитрификации нитрит полностью исчерпывается в дальнейшем (Рис. 2).

Организм обладает окислительным типом метаболизма и не способен к брожению Используемые акцепторы электронов - кислород, нитрат и закись азота В анаэробных условиях с нитратом в качестве акцептора Н сатргзаШ 2-7398-2 окисляет следующие субстраты пептон, казаминовые кислоты, дрожжевой экстракт, ацетат, пропионат, бутират, пируват, лактат, фумарат, цитрат, этанол; глюкозу, сахарозу, мальтозу, рибозу, фруктозу, маннозу, (3-аланин, аспартат, глутамат, гистидин и Т\уееп 80. В аэробных условиях список дополняется гликолятом, бетаином, галактозой и пролином. Организм не использует: оксалат, формиат, метанол, глицерин, триметиламин; рамнозу, ксилозу, фукозу, сорбозу, инозит, дульцит. сорбит, маннит, М-ацетил-Э-глюкозамин; глицин. М.М-диметилглиции, серин, орнитин. валин, триптофан, метионин, изолейцин, фенилаланин, цистеин, холин-хлорид, целлюлозу и Тчуееп 60. Организм чувствителен к сульфиду: рост отсутствовал при 6 мМ.

Рисунок 2. Динамика роста и образования продуктов денитрификации.

-ацетат мМ

ОПбОО

Сравнительная характеристика нового штамма Н сатр1заИ$ и типового ипамма этого вида представлена в таблице 4.

Таблица 4 Дифференцирующие признаки штаммов НЫотопаз сатр1$аИ$ Т-139%-2 и 4А

Характеристика Штамм г-7398-2 Штамм 4А1

Зависимость от карбонатов + -

Ыа* (интервал/оптимум) 0 16-3 1/10 0 2-45/1 5

рН (интервал/оптимум) 7 5-10 418 8-9 5 6-11 /9.5

Температура (интервал/оптимум) 10-55/36-40 4-50 / 30

Рост с нитритом - +

Нв' + М03" - +*

Окисляемые субстраты

Р-рибоза + -

О-манноза +/- +

Ы-ацетил-О-глюкозамин - +

Аргинин +

Глицерин - +

Бетаин +**

Гликолят +

Г+Ц, мол.% 66.4 66

Место выделения Озеро Магади, Кения Озеро Алкали, США

Примечания- данные для Я сатриаЬз 4А приведены в соответствии со статьей (МогтПе е! а/, 1999), кроме отмеченных знаком * - результаты, полученные нами, ** - субстрат используется только аэробно

2.2. Halomonas natronophila sp. nov. и Halomonas kenyensis sp. nov.

2.2.1. Диагноз Halomonas natronophila sp. nov. na.tro.no.phi'la; N.Gr. n. natron, сода, карбонат натрия; Gr. adj. philos, любящий; N.L fern. adj. natronophila, организм, развивающийся в щелочном (содовом) водоеме.

Клетки - грамотрицательные прямые или изогнутые палочки размером 0.7-2 х 0.5-1 мкм. В стационарной фазе роста длина клетки может достигать 5 мкм. Спорообразование не отмечено Термочувствителен: рост отсутствует после прогревания при 70°С в течение 10 мин. Подвижность посредством одного субполярного жгутика выявляется только в молодой культуре.

Истинный алкалофил. Рост в пределах рН 8.0-10.5 с оптимумом при рН 8.5-9.6 (Рис. 36). Умеренный галофил. Рост в пределах 0.16-2.2 M Na+ с оптимумом при 0.7—1 7 M Na+ (Рис. За). Облигатно зависит от иона натрия, не нуждается в хлориде и карбонатах.

Мезофил Рост в пределах 15-50°С с оптимумом при 36-40°С (Рис.Зв).

Факультативный анаэроб, способен к восстановлению нитрата, закиси азота и, в меньшей степени, нитрита. Каталазо - и оксидазоположителен. Не способен к брожению. Хемоорганогетеротроф. При анаэробном росте с нитратом окисляет ацетат, пропионат, бутират, сукцинат, гликолят, фумарат, цитрат, пируват, лактат, этанол, рибозу, пептон, дрожжевой экстракт, Казаминовые кислоты, глутамат, аспартат, аланин, пролин. В аэробных условиях в дополнение окисляет ксилозу и в меньшей степени арабинозу, фруктозу и сорбозу. Гидролизует Tween 80. Не использует оксалат, формиат, метанол, глицерин, триметиламин, бетаин, глюкозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, маннозу, лактозу, галактозу, фукозу, рамнозу, сорбит, дульциг, N-ацетил-О-глюкозамин, аргинин и гистидин. Способен к окислению сульфида с закисью азота в качестве акцептора электронов и ацетатом в качестве единственного источника углерода.

Содержание Г+Ц пар в ДНК 67 9%. Изолирован из озера Дзун-Тухэм-Нур (Восточная Монголия). Типовой штамм Z-7009T (=DSM 17332, =ВКМ В2353).

2.2.2 Диагноз Halomonas kenyensis sp. nov. ke.ny.en'sis; N.L. fern. adj. Кенийский, относящийся к Кении.

Клетки - грамотрицательные тонкие короткие палочки длиной 1.5-2 5 мкм. Основной диаметр 0.5 мкм, однако, некоторые клетки достигают 0.7 мкм. Клетки активно подвижны за счет длинных перитрихиально расположенных жгутиков. В неблагоприятных условиях клетки образуют длинные изогнутые нити. Спорообразование не отмечено. Термочувствителен: рост отсутствует после прогревания при 70°С в течение 10 мин.

Истинный алкалофил. Рост в пределах рН 7.5-10.6 с оптимумом при рН 9.5 (Рис. 36). Облигатно зависит от иона натрия, не нуждается в хлоридах и карбонатах. Факультативный галофил. Рост в пределах 0.04-2.2 M Na+ с оптимумом при 0.5-1.2 M Na* (Рис. За)

Мезофил. Рост в пределах 10 до 55°С с оптимумом при 36-40°С (Рис. Зв).

Факультативный анаэроб, способен к восстановлению нитрата, закиси азота и, в меньшей степени, нитрита. Каталазо - и оксидазоположителен. Тип метаболизма окислительный. Хемоорганогетеротроф. С кислородом или нитратом в качестве акцептора электронов окисляет: ацетат, пропионат, бутират, сукцинат, гликолят, фумарат, цитрат, пируват, лактат, этанол, глюкозу, сахарозу, мальтозу, ксилозу, фруктозу, трегалозу, пептон, дрожжевой экстракт, Казаминовые кислоты, глутамат, аспартат, аланин, аргинин, пролин, гистидин, и в меньшей степени рибозу и маннозу. Гидролизуег Tween 80 Не окисляет оксалат, формиат, метанол, глицерин, триметиламин, бетаин, галактозу, арабинозу, фукозу, рамнозу, лактозу, сорбит, дульцит, Т\[-ацетил-В-глюкозамин. Способен к окислению сульфида с нитратом в качестве акцептора электронов и ацетатом в качестве единственного источника углерода. Сульфидотолерантен (до 28 мМ сульфида).

Содержание Г+Ц пар в ДНК 65 5%. Изолирован из смешанной пробы илов пяти кенийских озер (Кратерное, Богория, Элментейта, Накуру, Магади). Типовый штамм AIR-2T (=DSM 17331, =ВКМ В2354), референтный штамм AIR-1.

Таблица 5. Сравнительная характеристика Н пМгопорЫа и филогенетически близких представителей рода НЫотопая__

Характеристика Н. natronophila Z-7009 //. ventosae Н. alimentaria

Размер клеток, мкм 0.7-2.0x0.5-1.0 1.2-1.4x0 7-0.8 0.8-1 2 •< 0.8-1 2

Подвижность + + _

Тип жгутикования монотрих нд -

рН (интервал / оптимум) 8.0-10.5 / 8.5-9.6 6-10/НД НД / 6 5—7 5

КаС1 (интервал / оптимум) 0-12* / 3-9* 3-15/8 1-24/1-13

Окисляемые субстраты-

эганол + - нд

iлицерин - + НД

D-глкжоза - + +**

сахароза - НД +**

мальтоза - + НД

лактоза - + НД

D-трегапоза - + НД

D-галактоза - + НД

L-арабиноза + - НД

L-сорбит - + НД

L-аланин + - НД

Tween 80 + -

Г+Ц, мол. % 67.9 74.3 63.0

Примечание- * - на фоне 0.16 М Na+ за счет карбонатов. Данные приведены в соответствии со следующими работами Н ventosae (Martínez-Cánovas et al, 2004), Я alimentaria (Yoon et al, 2002); ** - данные по субстратам, полученные нами

Таблица 6. Сравнительная характеристика Н кепуепз1$ и филогенетически близких представителей рода НсЛотопав____

Характеристика Я. kenyensis AIR-2 Н. campisalis Н. desiderata

Размер клеток, мкм 1 5-2 5 х 0.5-0.7 3-5 х 1 1.0-2.6x0.4-0 6

Тип жгутикования перигрих НД перитрих

рН (интервал / оптимум) 7 5-10 6/9 5 6-11/95 7-11/9 5

\'аС1 (интервал / оптимум) 0-13*/3 7* 0 2-25 / НД 0-18/НД

Окисляемые субстраты

пропионат + +**

гликолят + +**

этанол 4- +

формиат - _**

бетаин - —**

глицерин _ + +

рибоза + - +

D-ксилоза + - +

D-манноза + - +

D-галактоза - - +

L-арабиноза - - +

И-ацетил-О-глюкозамин - + НД

L-аланин + -

api инин +

Tween 80 -t- ND -

Г+Ц, мол. % 65.5 66 0 66.0

Примечание: * - на фоне 0 04 М Na' за счет карбонатов Данные приведены в соответствии со следующими работами- Я campisalis (Mormile et al. 1999); Я desiderata (Berendes et al, 1996), ** - данные no субстратам, полученные нами Недостающие для сравнения данные, обозначенные знаком ***, взяты из статьи Mata et al, 2002

Как видно из списков используемых субстратов, приведенных в диагнозах, новые галоалкалофильные виды Halomonas способны к окислению большого количества различных

органических веществ Такая гибкость метаболизма характерна для представителей этого рода. Списки используемых субстратов близки, однако организмы проявили различное отношение к сахарам. Штамм АШ.-2 хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, ксилозе, фруктозе и трегалозе и несколько слабее на рибозе и маннозе как аэробно, так и анаэробно. Штамм 7-7009, напротив, использует только пятиуглеродные (рибоза, арабиноза, ксилоза) или шестиуглеродные сахара семейства кетоз (фруктоза и сорбоза), причем предпочтительными являются рибоза и ксилоза, а на других сахарах рост слабый и начинается после более продолжительной в сравнении с иными субстратами лаг-фазой. В анаэробных условиях рост возможен только на рибозе.

Интересным свойством новых организмов оказалась способность к использованию сульфида в качестве донора электронов в гетеротрофных условиях с ацетатом как источником углерода. Способность к окислению сульфида проявляется у штамма 2-7009 только с N20 в качестве акцептора электронов. Ранее это свойство было обнаружено у филогенетически далекого от галомонад хемолитоавтотрофа 1Ъюа1ка1тЬпо ¿епИпАсапв (БогоИп е? а/, 2001а) Однако это свойство не было выявлено у облигатно гетеротрофных бактерий, и в том числе - у галомонад. Штамм г-7009, по-видимому, является первым представителем рода На1отопа8, способным к осуществлению этой окислительно-восстановительной реакции. У штамма АШ.-2, напротив, реакция окисления сульфида осуществлялась только в паре с нитратом, как это было показано ранее для нескольких гетеротрофов, предположительно относящихся к роду На1отоп<и (Сорокин и др , 1996; Сорокин, 2003). Чувствительность к сульфиду была различна рост 7.-7009 угнетался при начальной концентрации 9 мМ, тогда как штамм АП1-2 рос в присутствии 28 мМ, что, возможно, позволяет ему существовать в зоне активного сульфидогенеза. Следует отметить, что способность к окислению сульфида не выявлена у морских денитрификаторов, в то время как у изолированных из содовых озер денитрифицирующих галомонад, она, по-видимому, распространена. Это особенно интересно, учитывая известное ингибирующее действие, оказываемое сульфидом на нитритредуктазу

Согласно полученным данным, органотрофные денитрификаторы содовых озер не представляют собой отдельных филогенетических ветвей, а являются представителями ранее известного рода НаЬтопач У новых организмов обнаружена приспособленность к изменению физико-химических условий содовых озер, проявляющаяся в возможности роста в широком интервале концентраций солей, рН, и температуры, переключении с аэробного дыхания на анаэробное, способности к окислению широкого спектра органических субстратов и к использованию сульфида Высокая численность галомонад в содовых водоемах и их вовлеченность в большое количество микробиологических процессов указывает на значимость данной группы в функционировании экосистемы и необходимость описания новых изолятов, несмотря на не упорядоченную на сегодняшний день систематику рода.

3 ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ НИТРАТРЕДУКАЗЫ ГАЛОАЛКАЛОФИЛЬНОЙ ДЕНИТРИФИЦИРУЮЩЕЙ БАКТЕРИИ НАЮМОЫАБ САМРКАШ Т-1Ш-2

До последнего времени участие молибдена в восстановлении нитрата считалось бесспорным Однако в последние годы было описано несколько китратредуктаз, не содержащих в своем составе молибден и молибденовый кофактор (Апйроу е1 а!, 1998, АгШроу а а!., 2003) Все они были выделены из экстремофильных микроорганизмов, что позволило сделать предположение о том, что синтез необычных ферментов есть отклик на стресс С этой точки зрения особый интерес представляют восемь штаммов галоалкалофильных денитрифицирующих бактерий из озера Магади, подвергающихся двойному стрессу - воздействию экстремально высоких значений рН и близкого к насыщению уровню минерализации.

Проведенные ранее исследования позволили разработать систему тестов, позволяющих отнести изучаемую нитратредуктазу к группе «альтернативных»: рост на среде, содержащей 1мМ вольфрамата; отрицательный тест с шЫ мутантом Neurospora сгазва, содержащим дефектную по молибденовому кофактору нитратредуктазу; повышенный температурный оптимум.

Вольфрам, являющийся структурным аналогом молибдена, способен встраиваться в активный центр молибденсодержащих ферментов, что приводит к синтезу их неактивных форм и, следовательно, к подавлению роста Однако при культивировании алкалофильных

денитрифицирующих бактерий на среде с 1 мМ вольфрамата подавления роста и денитрификации не наблюдалось, что объясняется либо устойчивостью нитратредуктаз к этому соединению, как это было обнаружено ранее у гипертермофильной архебактерии РугоЪасиЫт аегорЫит ^эЬаг е! а!, 1998; АГвЬаг е! а1, 2001), либо синтезом «альтернативных» безмолибденовых нитрагредуктаз. На Рис 4 приведены кривые роста и накопления N2 для штамма 2-7398-2.

вРем»> 4 время, ч

* ■ беэ вольфрамата —*—с 1мМ вольфрамата

а б

Рисунок 4. Влияние 1мМ вольфрамата натрия на рост (а) и образование азота (б) НаЬтопаз сатр1$аИз 7-7398-2.

Для проверки предположения о безмолибденовой нитратредуктазе нами был проведен тест с шМ мутантом Ыеигсирога сгама, являющийся стандартом на наличие молибденового кофактора. Принцип метода заключается в том, что при комплементации кофактора с дефектной по нему апонитратредуктазой мутанта происходит сборка функционально активного фермента, о чем свидетельствует образование нитрита При тестировании нитратредуктазы штамма '¿-1299,-2 был получен отрицательный результат, что свидетельствовало об отсутствии молибденового кофактора в составе ее активного центра. В дальнейшем те же результаты были получены для нитратредуктаз других штаммов исследуемой группы, а также для штаммов АГО.-2 и 2-7009

Нитратредуктаза выбранного штамма Я сатркаНя 2-7398-2 была выделена и очищена до электрофоретически гомогенного состояния Гомогенный препарат нитратредуктазы был получен методом препаративного электрофореза в ПААГ с 7 5% акриламида при непрерывной элюции трис-боратным буфером (рН 8 9). Элюируемые с ПААГ фракции, обладающие нитратредуктазной активностью, концентрировали на ячейке для ультрафильтрации При необходимости препарат повторно подвергали препаративному электрофорезу в тех же условиях с последующей ультрафильтрацией. Полученный таким методом препарат был электрофоретически гомогенен, о чем свидетельствовало совпадение по электрофоретической подвижности в ПААГ полос, окрашенных по нитратредуктазной активности и по белку и отсутствие посторонних белковых полос Все свойства фермента были изучены на гомогенном препарате

Поскольку при росте бактерии в анаэробных условиях нитрат является единственным акцептором электронов, можно предположить, что данная нитратредуктаза является диссимиляционной. Такие ферменты, как правило, состоят из трех субъединиц и являются мембрансвязанными По данным денатурирующего ЗБЭ электорофореза нитратредуктаза И сатргяаНз 2-7398-2 представляет собой мономер с молекулярной массой полипептидной цепи 134 кДа (Рис. 5) В настоящее время мономерная структура описана только для некоторых бактериальных ассимиляционных нитратредуктаз, но неизвестна для диссимиляционных, таким образом, структура фермента Я ся/я/ига/м является необычной При разрушении клеток нитратредуктазная активность была обнаружена в бесклеточном экстракте, что говорит либо о локализации в периплазме, либо о непрочной связи с мембраной и диссоциации фермента в раствор при разрушении Однако при фракционировании клеток большая часть нитратредуктазной активности была обнаружена в мембранной фракции В пользу

предположения о связи с мембраной свидетельствует также способность к восстановлению хлората, характерная именно для мембрансвязанных нитратредуктаз

Помимо структурных особенностей фермент имеет и другие необычные свойства Так, было обнаружено, что помимо способности к восстановлению нитрата фермент проявляет и нитритредукгазную активность Способность к восстановлению нитрита значительно слабее

Совмещение нитрат- и нитритредуктазной молибденсодержаших нитратредуктаз А

134 <Дэ

функций нехарактерно для классических

134 кДа 116 кДа 97 кДа

67 кДа

67 кй»

45 кДа

29 кДа

1 2

Рисунок 5. Электрофорез очищенного препарата нитратредуктазы в полиакриламидном геле А - Определение молекулярной массы нативного фермента Окрашивание белковых полос серебром (1 -метчик, 2 - нитратредуктаза) Идентификация нитрат- (3) и нитритредуктазной активности фермента (4) Б - Определение субъединичного состава нитратредуктазы методом денатурирующего 505-электрофореза Окрашивание белковых полос серебром (1 - смесь метчиков, 2 - нитратредуктаза)

Анализ металлов в активном центре нитратредуктазы методами рентгеновского микроанализа, плазменной атомно-эмиссионной спектрометрии и плазменной масс-спектрометрии показало отсутствие в нем молибдена Таким образом, фермент относится к немногочисленной пока группе нитратредуктаз, в составе которых отсутствует не только молибденовый кофактор, но и любые иные формы этого элемента Однако все известные к настоящему времени нитратредуктазы, в том числе безмолибденовые, являются металлсодержащими На наличие металла указывают данные ингибиторного анализа с металлохелатирующими агентами азидом и цианидом Небольшие концентрации этих веществ оказывают существенное влияние на активность нитратредуктазы, как это характерно для всех металлсодержащих ферментов Концентрации, вызывающие 50% подавление активности, составили 80 мкМ для ШКз и 120 мкМ для КСК В соответствии с данными металлоанализа в составе фермента не обнаружено никаких иных металлов, кроме меди и железа Эти переменновалентные металлы теоретически могут участвовать в восстановлении нитрата, находясь в активном центре нитратредуктазы, однако окончательное установление их роли в функционировании фермента требует дополнительных исследований

При тестировании искусственных доноров электронов активность была обнаружена только в присутствии метил- и бензилвиологена, причем первый оказался предпочтительным Было обнаружено, что в зависимости от донора электронов смещается рН оптимум фермента (Рис 6) При использовании метилвиологена он находится при рН 7, а при реакции с бечзилвиологеном - при рН 6 Активность фермента в области оптимального значения рН с метилвиологеном в 2 2 раза выше, чем с бензилвиологеном Фермент не работает с NADH, МАОРН и бромфеноловым синим ни при одном значении рН в интервале 4-12

Несмотря на то, что Я сатр^Ыи является истинным алкалофилом, растущим оптимально при рН 9 5 и не растущим при рН 7 и ниже, рН оптимум нитратредуктазы лежит в области нейтральных значений (Рис 6) Известно, что клетка способна поддерживать внутриклеточный рН по крайней мере на две единицы ниже, чем рН среды (5йит е1 а!, 1994, Кги1илсЬ ег а!, 1998)

Обнаруженные значения рН оптимума представляются более логичными для цитоплазматических ферментов, однако, учитывая выявленное влияние используемого донора электронов на рН профиль, можно предположить, что в физиологических для фермента условиях (m vivo) рН оптимум фермента может лежать в слабощелочной области.

Температурный оптимум нитратредуктазы смещен в область повышенных температур и составляет 70°С (Рис. 7). При 30-40°С активность оказалась не высока и возрастала на порядок при увеличении температуры инкубационной смеси от 30 до 70°С Это необычно для фермента, выделенного из мезофильного организма Однако такой повышенный температурный оптимум обнаружен у всех исследованных ранее «альтернативных» нитратредуктаз и, вероятно, является одним из отличительных признаков этой новой группы ферментов. Кроме того, фермент обнаружил высокую термостабильность. Инкубация при 50°С в течение двух часов не влияла на его активность, а в результате двухчасовой инкубации при 70°С фермент сохранял 50% активности. Высокая термостабильность также отмечена ранее для безмолибденовых нитратредуктаз (Antipov et al, 1998; Antipov et al., 2003). 1,8 1,6

l M

1,2 -'6 1 л 0,8 § 0,6 I 0,4 0,2 -0

- с метилвиологеном ■

- с бензилвиологеном

Рисунок 6. Влияние рН на активность нитратредуктазы при использовании различных искусственных доноров электронов.

Рисунок 7. Влияние температуры на активность нитратредуктазы

Солетолерантность. При изучении отношения к солям в качестве дополнительного объекта исследования была выбрана нитратредуктаза Я kenyensis, описанного в этой работе и являющегося в соответствии с классификацией Кашнера факультативным галофилом. С целью изучения влияния условий роста на зависимость активности нитратредуктаз от концентрации солей культуры выращивали при разных уровнях солености среды. Нитратредуктазы Н campisalis и Н kenyensis оказались крайне устойчивы как к NaCl, так и KCl Характер отклика не зависел от условий культивирования, хотя описаны случаи влияния условий роста на оптимум и интервалы активности фермента (Bylund et al, 1991) Активность сохранялась во всем изученном интервале концентраций солей в реакционной смеси: 0-4.1 М NaCl и 0-3.2 М KCl. При 4 1 М NaCl нитратредуктазы Н. campisalis и Я. kenyensis сохраняли соответственно около 40 и 60% активности от максимальной. При 3.2 KCl эти значения составляли приблизительно 70 и 60% Однако максимальная активность обоих ферментов проявлялась при умеренных концентрациях солей.

Следует отметить, что не все нитратредуктазы галомонад обладают столь высокой солетолерантностью. Так, нитратредуктаза умеренно галофильной бактерии Halomonas halodenitriflcans активна в значительно более узком интервале концентраций NaCl, составляющем 0-1.7 М, причем максимальная активность проявляется в отсутствие соли (Kamekura, 1986). При этом рост бактерии возможен вплоть до 3 4 М NaCl. В отличие от нитратредуктазы Я halodenitriflcans, исследованные нами ферменты активны при крайне высоких концентрациях солей, значительно превышающих границы роста данных микроорганизмов. Таким образом, широкие адаптационные возможности, превосходящие, по всей видимости, реальные потребности микроорганизмов при относительном распреснении содовых озер в сезон дождей, могут играть важную роль в условиях пересыхания водоемов в засушливый период, когда происходит

15

концентрирование рассолов вплоть до выпадения солей в осадок. Способность к осуществлению дыхания в условиях, когда рост уже не возможен, предопределяет высокую выживаемость этих бактерий и их способность конкурировать с другими членами алкалофильного микробного сообщества. Сопоставляя приведенные выше данные по Н. ИаМет^Асапз с полученными нами, можно также предположить, что высокая ««»устойчивость нитратредуктаз связана не только с галофюгаей, но и с особенностями «альтернативных» нитратредуктаз. Проводя аналогию с температурными оптимумами этих ферментов, явно превышающими как максимально допустимую для роста данных организмов температуру, так и возможный нагрев воды озера, учитывая также их высокую термостабильность, вероятно, можно говорить об общей устойчивости этой группы ферментов к воздействию стрессовых факторов.

Обнаружение безмолибденовых нитратредуктаз у галоалкалофильных бактерий, приуроченных к экстремальным местообитаниям (высокоминерализованные содовые озера) согласуется с гипотезой о целесообразности поиска таких нитратредуктаз у экстремофилов (Антипов, 1999), послужившей предпосылкой для нашей работы.

4. СТРАТЕГИИ ОСМОАДАПТАЦИИ ГАЛОАЛКАЛОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

В микробном мире существуют две принципиально различных стратегии приспособления к высоким концентрациям солей. Первая заключается в поддержании низких концентраций солей в цитоплазматическом пространстве и накоплении небольших органических молекул, совместимых с метаболизмом клетки и позволяющих поддерживать ее осмотический баланс с внешней средой (стратегия «совместимые осморегуляторы») Вторая связана с поддержанием высоких концентраций солей внутри клетки (стратегия «соль внутри»). Она более выгодна с энергетической точки зрения, однако требует значительных адаптации внутриклеточных структур. Накопление солей характерно для экстремально галофильных архей, а также для бактерий порядка На1апаегоЫа1е8. Для остальных галофильных и галотолерантных организмов характерно использование разнообразных органическихо сморегуляторов. Однако у некоторых галофилов. использующих эту стратегию, наряду с осмолитами в клетках можно обнаружить повышенные концентрации неорганических ионов - Ка4, К+ и СГ Целью данной работы было изучение стратегий осмоадаптации различных галоалкалофильных бактерий, выделенных из содовых озер, где высокая концентрация солей сочетается с высокими значениями рН.

4.2. Оценка внутриклеточных концентраций ионов К4 и СГ

Ион калия, как правило, является компонентом осмопротекторной системы, ион натрия, являющийся основным катионом высокоминерализованных мест обитания, может проникать в клетку из среды, несмотря на действие препятствующих этому Ка+/Н+-антипортеров. Хлорид-ион может быть связан с обоими катионами. Определение внутриклеточных концентрацией ионов является сложной процедурой, результат которой зависит от большого количества факторов, поэтому возможна только ориентировочная оценка их содержания. Нами были определены внутриклеточные концентрации неорганических ионов у галоалкалофильных бактерий Н. сатриаНь-, Н. кепуегкгз, Т. та$а<Иеп81з и N. acetigena, выращенных при разных уровнях солености среды Результаты представлены в таблице 7.

У Я сатрясйЬ внутриклеточное содержание иона 1Ча+ составляло приблизительно 0.23 М и практически не возрастало при увеличении его концентрации в среде с 0.70 М до 1.90 М. У Н. кепуепзЬ внутриклеточные концентрации оказались вдвое выше и составляли около 0.5 М. При увеличении общей концентрации Ка+ в среде от 0.53 М до 1.56 М содержание этого иона в клетках Н кепуспз'.з возрастало незначительно. Следует отметить, что при росте бактерии на среде с 2% ЫаС1 концентрации во внутриклеточном пространстве и в среде были близки. Напротив, у Н. сатрнаШ внутриклеточное содержание иона натрия всегда было значительно ниже его содержания в среде.

Содержание хлорид-иона в клетках Я. сатрц-а/и не зависело от количества КаС1 в среде и составляло около 0.22 М. Это значение практически совпадает с внутриклеточной концентрацией N3 , что свидетельствует о возможности совместного накопления двух ионов. У Н. кепуепягя внутриклеточная концентрация СГ возрастала с увеличением содержания 1ЧаС1 в среде, однако

оставалась крайне низкой и не коррелировала с концентрацией Na+ Таким образом, в обоих случаях не отмечено накопление хлорид-иона до концентраций, позволяющих поддерживать цитоплазму клетки в изоосмотическом состоянии с внешней средой.

Содержание иона калия в клетках обоих организмов значительно превышало его концентрацию в среде. Клетки Н campisahs содержали 0.12 и 0.26 М К* при общем содержании Na в среде 0.70 и 1.90 М Na+, соответственно. У Н kenyensis концентрация иона К+ во внутриклеточном пространстве возрастала от 0 20 М при 0.53 М Na* в среде до 0 34 М при 1 56 М Na Таким образом, можно говорить о возможности накопления калия клетками обоих штаммов Однако, такое накопление, слабо коррелирующее с увеличением солености среды, не является достаточным для уравновешивания внешнего осмотического давления. Это указывает на побочную роль ионов К+ в осмоадаптации этих бактерий. Возможно, калий играет определенную роль в осмоадаптации при росте на низкоминерализованных средах. Результаты нашего исследования вполне согласуются с данными, известными для этой группы микроорганизмов Несмотря на то, что концентрации ионов во внутриклеточном пространстве разных видов галомонад несколько отличаются, во всех случаях они недостаточны, чтобы уравновешивать внешнее осмотическое давление в условиях высокой солености (Vreeland et а!, 1983; Ventosa et al, 1998b).

Таблица 7. Концентрации ионов К+ и СГ во внутриклеточном пространстве (кл.) и в культуральной жидкости (кж.) в зависимости от общей солености среды.

Микроорганизм и условия культивирования* NaY*,M Na^i, M К*кж",М К*кл> M С1кж,М СГкл.М

Halomonas campisalis

0.70 М Naf(0Hin 0.75 0.23 0.015 0.12 0.42 0.22

1.90 М Na*(0siui 2.06 0.24 0.015 0.26 1.47 0 22

Halomonas kenyensis

0.53 M Na\oum 0.60 0.49 0 015 0.20 0 34 0 08

1.56MNa+(oBim 1.73 0.58 0.015 0.34 1.27 0.16

Natroniella acetigena

1.91 M Na' юти 2.07 0.91 0.013 0.83 0 18 0.29

2.59MNa\OTO, 2 78 1.98 0.013 0.94 0.86 0 89

TindaUia magadiensis

0 48 M Na^osim 0 49 0.40 0.004 0.17 0.012 0 009

1 03 M Na+ ,онш 1.14 0.65 0.004 0.22 0.015 0014

Примечания' *- теоретические концентрации, рассчитанные на основании суммарного содержания в среде N82003, №НС03 и КаС1; **- теоретические концентрации, рассчитанные на основании суммарного содержания в среде солей калия - КН2РО4 и КС1 С целью учета вклада других компонентов среды, измеряли концентрации ионов в культуральной жидкости, обозначенные в Таблице 7 как Скж. Приведены средние данные не менее чем по трем экспериментам.

У Т magadlensls внутриклеточная концентрация возрастала от 0 40 до 0 65 М при увеличении концентрации этого иона в среде от 0.48 до 1.03 М Следует отметить, что, как и в случае Н. кепуеп$и, при низкой солености внеклеточные и внутриклеточные концентрации Ка1 были близки. Содержание К+ в клетках значительно превышало его содержание в среде, однако мало зависело от общей солености Таким образом, в клетках Т, та§аЛеп5и имеются соли, позволяющие лишь частично сбалансировать внешнее и внутреннее осмотическое давление.

Иные результаты были получены при исследовании экстремально галоалкалофильного ацетогенного галоанаэроба ИМготеИа асе^епа. Внутриклеточные концентрации ионов Кта+, К+ и СГ зависели от осмотического давления среды и возрастали соответственно от 0.91 М до 1.98 М для Ха*, от 0.83 М до 0.94 М для К+ и от 0.29 М до 0.89 М для СГ при увеличении общего содержания в среде от 1.91 М до 2.59 М. Таким образом, эта бактерия способна поддерживать высокие внутриклеточные концентрации ионов N8*, К+ и СГ, позволяющие сбалансировать внутреннее осмотическое давление с внешней средой и обеспечивающие тургор клетки. Внутриклеточное содержание К+ почти на два порядка превышало его содержание в среде

Обнаруженные внутриклеточные концентрации этого иона около 0.9 М достаточно высоки, что указывает на возможность его участия в осмоадаптации N acetigena. Участие С1" в осморегуляции N acetigena хорошо согласуется с облигатной зависимостью организма от присутствия этого аниона в ростовой среде (Zhilina et al., 1996). Внутриклеточные концентрации ионов Na+, Кт и С1" у N acetigena близки к тем, которые характерны для других галоанаэробов (Oren, 2000), и достаточны для уравновешивания внешнего осмотического давления среды.

4.1. Оценка возможности накопления органических осмолитов

Нами был проведен анализ низкомолекулярных внутриклеточных веществ у N. acetigena, Т. magadiensis и одной из галомонад. Для определения низкомолекулярных внутриклеточных веществ были применены методы 'Н и 13С ЯМР, не дающие возможности точного количественного определения веществ, однако позволяющие судить об их качественном составе и приблизительном соотношении. Для данного эксперимента использовали экстракта культур, выращенных на высокоминерализованных средах. Н. campisalis Z-7398-2 культивировали в присутствии или в отсутствие дрожжевого экстракта.

В обоих случаях в клетках Я campisalis содержались эктоин и глутамат. При росте в присутствии дрожжевого экстракта в дополнение к эктоину и глутамату, детектировался бетаин. Обнаружение бетаина в этих условиях хорошо согласуется с литературными данными, поскольку в составе дрожжевого экстракта имеются вещества, являющиеся его предшественниками. Иные вещества, присутствующие в клетках различных видов Halomonas в качестве минорных примесей и выполняющие осмопротекторную функцию, например, глюкоза и аланин, не обнаружены. Известно, что эктоин является наиболее распространенным осмолитом аэробных хемотрофных бактерий (Severin et al., 1992; Ventosa et al., 1998b; Троценко и Хмеленина, 2002). Учитывая широкую распространенность этого вещества у нейтрофильных галомонад, можно предполагать, что изучаемый микроорганизм не является исключением. Как правило, в клетках представителей рода Halomonas присутствует одновременно несколько осмолитов, состав и соотношение которых зависит как от видовой принадлежности организма, так и условий культивирования. Однако во всех случаях эктоин является основной составляющей осмопротекторного «коктейля», и иные его функции в клетке до настоящего времени неизвестны. Что касается глутамата, то он может выполнять осмопротекторную функцию (Severin et al., 1992; del Moral et al., 1994; Ventosa et al., 1998b), однако его роль в клетке значительно шире, поскольку он может являться как конечным, так и промежуточным продуктом метаболизма. Однако заряженные аминокислоты никогда не накапливаются в клетках в концентрациях выше 0.4 М (Ventosa et al, 1998b), таким образом, роль глутамата в осмоадаптации микроорганизма, живущего при значительно более высоких концентрациях солей в среде, не может бьггь основополагающей.

Согласно данным 'Н ЯМР в клетках Т. magadiensis имеется бетаин. Его участие в осмоадаптации этой бактерии представляется весьма вероятным Несмотря на относительно высокие концентрации солей в клетке, они недостаточны для поддержания осмотаческого баланса. У N acetigena осмолиты не обнаружены, что согласуется с экстремально высокими концентрациями солей в клетке и характерно для всех представителей порядка Halanaerobiales.

4.3. Анализ аминокислотного состава внутриклеточных белков

Присутствие солей в цитоплазматическом пространстве требует от организма специфических адаптаций всех клеточных систем, причем чем выше внутриклеточные концентрации солей, тем значительнее изменения, претерпеваемые клеткой Одним из важнейших эффектов принято считать изменение общего аминокислотного состава всех внутриклеточных белков, приводящее к их стабилизации Такие изменения уже были отмечены ранее у нейтрофильных галофилов (Lanyi, 1974; Werber et al, 1986; Gandbhir et al, 1995; Oren and Mana, 2002), тогда как подобный анализ белков галоалкалофилов не проводился Между тем представляло интерес выяснить, насколько уже известные закономерности распространяются на эту группу экстремофилов. С этой целью в сравнительном аспекте был исследован аминокислотный состав общего клеточпого белка галоалкалофилов с разной степенью галофилии - экстремально галоалкалофильной бактерии N acetigena и умеренно галоалкалофильных Т magadiensis, Н campisalis Z-7398-2 и Н kenyensis AIR-2, а также нейтрофильного умеренного

галофила Hal saccharolyticum и (для контраста) обитателя ультрапресных вод A. paludosum (Табл 8).

Таблица 8. Сравнительный анализ аминокислотного состава общего клеточного белка галоалкалофи лов.___

Аминокислота Acetobacterlum Halomonas Halomonas Ttndallla Halanaerobium Natronieila

paludosum campisalis kenyensis magailensls saccharolyticum acetigena

Ala 11.94 13 35 12 57 11.17 10.73 10.02

Gly 10.95 12 14 10 66 9.60 9.80 984

Thr 6.94 5 61 5.39 5 69 5.69 4.71

Ser 6.54 5.00 5 03 4 88 5.33 3 92

Val 9.56 8.71 9.11 9.54 9.36 9.39

Leu 7.70 8.82 9.12 8.16 8.66 8 35

lie 7 73 4 95 5.83 7.37 8.47 7 33

Pro 3.89 5.15 4.71 4.06 3.66 3.88

Asx 10.50 10.94 10.87 12.31 13.33 13.66

GIx 10.27 12.21 12.71 12.05 12.36 17.25

Phe 3.21 3.37 3.88 3.64 3.54 3.01

Lys 5.58 4.42 3.03 5.26 4.02 4.84

Туг 2.41 2.26 _ 2.17 2.16 2.35 1.70

Arg 2.78 3.06 4.93 4.10 2.70 2.08

Glx+Asx 20.77 23.15 23.58 24.36 25.69 30.91

Lys+Arg 8.36 7.48 7.96 936 6.72 6.92

(Glx+Aix)-(Lys+Arg) 12.41 15.67 15.62 15.00 18.97 23.99

Из данных, представленных в таблице 8 видно, что доля кислых аминокислот (глутаминовой и аспарагиновой) от общего количества аминокислот клеточного белка и их избыток по сравнению с основными аминокислотами (лизин и аргинин) возрастают при увеличении степени галофилии микроорганизма. Сумма Glx+Asx у пресноводного А. paludosum составляет 20.77 мол.%, а разность между долями кислых и основных аминокислот (Glx+Asx) -(Lys+Arg) - 12.41 мол.%. Эти показатели являются минимальными среди исследованных организмов. У умеренно галоалкалофильных Т. magadiensis, Н. campisalis и Я. kenyensis и нейтрофильного умеренного галофила Hal. saccharolyticum доли кислых аминокислот выше, чем у пресноводного А paludosum, и составляют 24.36, 23.15, 23.58 и 25.69 мол.%, соответственно. Разности между содержанием кислых и основных аминокислот у данных микроорганизмов составляют 15.00, 15.67, 15.62 и 18.97 мол.%, соответственно. Максимальный процент кислых аминокислот от общего количества обнаружен у N. acetigena и составляет 30.91 мол.%. Избыток кислых аминокислот по сравнению с основными также является наибольшим - 23.99 мол.%. N acetigena и Hal. saccharolyticum, как и все изученные представители порядка Halanaerobiales, используют для осмоадаптации стратегию «соль внутри», что предопределяет максимальные среди исследованных объектов изменения в аминокислотном составе белка. Обнаруженный эффект изменения количества и соотношения кислых и основных описан для всех изученных ранее галофильных белков Кислые аминокислоты более высоко гидратированы, чем все остальные, и могут использоваться для образования солевых мостиков со стратегически важными основными остатками внутри белка. Предполагается, что такие внутренние солевые мостики обеспечивают защиту галофильного белка от раствора ионов, придают ему структурную жесткость, а также способствуют стабилизации его трехмерной структуры (Dennis and Shimmin, 1997). Таким образом, изменения в составе белков галоалкалофильных микроорганизмов подчиняются закономерностям, выявленным ранее для белков галофилов.

При сравнении двух галоанаэробов (алкалофильного N. acetigena и нейтрофильного Hal saccharolyticum), использующих для осмоадаптации стратегию «соль внутри» было обнаружено, что доли основных аминокислот в составе белка этих организмов очень близки - 6.92 и 6.72 мол.%, соответственно. Однако, доля кислых аминокислот в белках N. acetigena значительно

превышает аналогичный показатель у Hal saccharolyticum. Возможно, такой большой избыток кислых аминокислот у галоалкалофильиого микроорганизма необходим не только для осмоадаптации, но и для регуляции внутриклеточного рН в условиях высокощелочной внешней среды. Известно, что внутриклеточный рН у облигатных алкалофилов поддерживается, по крайней мере, на 2 единицы ниже, чем рН внешней среды (Srurr et al., 1994; Krulwich et a!., 1998). Механизмы поддержания баланса рН достаточно разнообразны. Подкисление происходит за счет действия электрогенных №+/Н+-антипортеров, а также благодаря отрицательно заряженным кислым полимерам клеточной стенки, уменьшающим рН на клеточной поверхности. Можно предположить, что дополнительные кислые аминокислоты N. acetigena участвуют в регуляции внутриклеточного рН, связываясь с присутствующими в цитоплазме катионами. В свою очередь, избыточный положительный заряд катионов, нейтрализующий заряд белков, позволяет поддерживать их в метаболически активном состоянии. Возможность связывания также способствует соблюдению условия электронейтральности клетки, поскольку концентрация хлорид-иона во внутриклеточном пространстве N. acetigena недостаточна для нейтрализации положительного заряда (Табл. 7), создаваемого катионами, а другие неорганические анионы (сульфат, фосфат, нитрат) в клетке не обнаружены.

4.4. Влияние солей на активность ферментов галоалкалофилов.

Присутствие солей во внутриклеточном пространстве требует адаптации ферментативных систем. Многие ферменты галофилов толерантны к солям или даже требуют их наличия для сохранения высокой активности. Известно также, что соли различной природы могут оказывать разное влияние на активность ферментов. Предполагается, что поведение ферментов по отношению к солям до определенной степени может быть прогнозировано на основании данных о внутриклеточном ионном составе и, как следствие, - аминокислотном составе общего клеточною белка (Oren and Mana, 2002). Объектами данного исследования являлись ферменты метаболизма исследованных галоалкалофилов: Я. campisalis, Т. magadiensis и N. acetigena.

Влияние солей на активности лактатдегидрогеназы (далее лактат-ДГ), глутаматдегидрогеназы (глутамат-ДГ) и одного из ферментов гликолиза глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (глицеральдегид-3-Ф-ДГ) Я. campisalis цредставлены на рисунке 8.

KCl, м

—♦—лактагдегидрогеназа

В глутвмотделлдрогекаэа —А— глицеральдегид-З-Ф-дегцдрогеназа

Рисунок 8. Влияние NaCl (a), KCl (б) и NaHCOa (в) на активности лактат-ДГ, глутамат-ДГ и глицеральдегид-З-Ф-ДГ.

0,4 0,6 0,8 NaHCO,, М

Лактат-ДГ Я. campisalis была максимально активна в присутствии 0 3 М NaCl, 0.24 М KCl и 0.4 М NaHCOj. При этом активность возрастала на 10-20 %. Однако, дальнейшее увеличение

концентраций солей приводило к ингибированию фермента Глутамат-ДГ была максимально активна в отсутствие KCl, однако остаточная активность сохранялась при 2.4 М (около 10% от максимальной) Глугамат-ДГ оказалась наиболее толерантной из трех изученных ферментов по отношению к KCl. Небольшие концентрации NaCl (0.3-0.75 М) оказывали стимулирующее действие на фермент, а дальнейшие увеличение концентрации NaCl приводило к снижению активности. NaHC03 вызывал 40% увеличение активности при концентрации 0.65 М, однако далее активность снижалась. В случае глицеральдегид-З-Ф-ДГ влияние трех различных солей было сходным. Фермент был максимально активен в отсутствие солей, а при содержании в реакционной смеси около 1 М NaCl, KCl или NaHCC>3 активность падала приблизительно на 40 % 2.2 М NaCl и 1 8 М KCl полностью подавляли активность.

У Т magadiensis была исследована СО-дегидрогеназа - ключевой фермент метаболизма ацетогенных бактерий, а также гидрогеназа, высокая активность которой была продемонстрирована у организма ранее (Деткова, 2003). Влияние солей на активность этих ферментов представлено на рис. 9.

0 0,5 1

1 5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 NaCl, М

120 100 во во

40 20

0+-

1 1,5 2 KCI,M

2,5

—4—СО-двгидрогеназа N acebgena —СО-дегцдрогеназа T magadiensis k— Гидрогеназа Т magadiensis

Рисунок 9. Влияние NaCl (а), KCl (б) и NaHCC>3 (в) на активности СО-дегидрогеназ N. acetigena и Т magadiensis и гидрогеназы Т. magadiensis

0,4 0,6 0,8 NaHCOj, М

1,2

СО-дегидрогеназа и гидрогеназа Т. magadiensis угнетались высокими концентрациями NaCl и проявляли максимальную активность в его отсутствие (Рис. 9а). Несмотря на ингибирующее действие соли, ферменты сохраняли около 40% от максимального уровня активности при концентрации NaCl, превышающей 4.0 М. Напротив, оба фермента оказались толерантиы к KCl: активности слабо зависели от его присутствия в интервале концентраций 0-2.2 М (Рис. 96) Активность СО-дегидрогеназы была максимальна в присутствии 0.25 М NaHCÜ3 и уменьшалась при дальнейшем увеличении концентрации бикарбоната. Уровень активности гидрогеназы Т magadiensis оставался примерно постоянным в интервале концентраций ЫаНСОз 0-1.2 М (Рис. 9в).

Известно, что в большинстве случаев внутриклеточные ферменты бактерий, использующих стратегию «совместимые осморегуляторы», ингибируются высокими концентрациями солей Несмотря на то, что изученные ферменты Н campisalis проявляют определенную устойчивость, сохраняя небольшую активность в присутствии около 2 М NaCl и 1.5 М KCl, их максимальная активность проявляется либо в отсутствие солей, либо при их низких концентрациях. Концентрации, оказывающие стимулирующий эффект близки к тем, которые обнаруживаются во внутриклеточном пространстве бактерии У Т magadiensis внутриклеточные концентрации солей

оказались выше, чем у Н campisalis, что объясняет более высокую солетолерантность ферментов этой бактерии.

СО-дегидрогеназа экстремального галоалкалофила N. acetigena оказалась активна в пределах 0 - 4.1 М NaCl, причем в отсутствие соли и при ее концентрации 3.5 М активность была одинаковой. Максимум наблюдался при 0.7 М NaCl. Активность сохранялась во всем исследованном диапазоне концентраций NaHCCb с широким максимумом при 0-0.7 М. Высокая солетолерантность этого фермента хорошо согласуется с обнаруженными высокими концентрациями солей в клетках N acetigena.

В целом, независимо от интервалов активности, все исследованные ферменты галоалкалофилов до некоторой степени адаптированы к присутствию солей, что может представлять собой дополнительный механизм приспособления организма к высокосоленой среде обитания. На основании проведенного исследования можно заключить, что изученные галоалкалофилы независимо от таксономической принадлежности располагают комплексом адаптационных механизмов, способствующих их выживанию в условиях гиперсоленых экосистем.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что изученные гетеротрофные денитрификаторы из содовых озер не образуют новых филогенетических ветвей, а являются представителями рода Halomonas Восемь штаммов из кенийского озера Магади отнесены к ранее описанному виду Я campisalis. Следовательно, данный вид не является строго приуроченным к определенному местообитанию, а имеет широкий ареал распространения, включающий щелочные экосистемы Африки и Северной Америки. Штаммы Z-7009 и AIR-2 оггисаны в качестве типовых штаммов новых видов рода Halomonas с названиями Я natronophila и Я kenyensis, соответственно. У новых организмов обнаружена приспособленность к изменению физико-химических условий содовых озер, проявляющаяся в возможности роста в широком интервале значений солености, рН и температуры, способности существовать как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Использование многочисленных субстратов, относящихся к различным классам органических веществ, позволяет выдерживать конкуренцию за источник углерода в условиях микробного сообщества. Способность к анаэробному дыханию определяет возможность выживания в условиях недостатка кислорода, например, при концентрировании рассолов за счет высыхания Широкие адаптационные возможности новых представителей рода Halomonas определяют их важнейшую роль в утилизации органического вещества и в круговороте азота и объясняет выявленную ранее (Duckworth et a1, 1996) высокую численность этой группы в содовых водоемах.

У восьми штаммов из озера Магади, а также у новых видов галомонад, показано отсутствие молибденового кофактора в составе нитратредукгазы. У выбранного для изучения штамма Я. campisalis Z-7398-2 нитратредуктаза выделена и очищена до электрофоретически гомогенного состояния. Доказано отсутствие в составе ее активного центра молибдена. Распространенность безмолибденовых нитратредуктаз в микробном мире остается неизученной, однако полученные нами данные по ферменту галоалкалофильной бактерии, способной расти при высоких значениях солености и рН, подтверждает гипотезу о том, что подобные нитратредуктазы следует искать у экстремофильных микроорганизмов. Фермент имеет повышенный температурный оптимум, обладает высокой термостабильностью, способен к восстановлению нитрита и хлората. На примере нитратредуктаз Я campisalis и Я. kenyensis продемонстрирована исключительная устойчивость к высокому содержанию солей в среде (вплоть до насыщающих концентраций) По аналогии с обнаруженной термостабильностью, превосходящей реальные потребности организма, можно предположить, что высокая солетолерантность исследованных ферментов связана в первую очередь с особенностями «альтернативных» нитратредуктаз, а не с осмоадаптационными механизмами.

Исследованы механизмы осмоадаптации галоалкалофильных бактерий из содовых озер. Галоалкалофильные представители рода Halomonas, как и нейтрофильные галомонады, используют стратегию «совместимые осморегуляторы» для поддержания осмотического баланса клетки. Основным осмопротектором является эктоин, часто выполняющий эту функцию у различных v-Proteobacteria, и в том числе - представителей рода Halomonas (Sevenn et al., 1992;

Galinski and Trüper, 1994; Ono et al, 1998; Ventosa et al, 1998b) Таким образом, можно сделать вывод о единстве используемых для осмоадаптации органических веществ у алкалофилъных и нейтрофильных галомонад. Помимо эктоина детектирован глутамат, часто являющийся минорным компонентом смеси осмопротекторов у Halomonas, и, вероятно, связанный в клетках с ионами К+. Следует отметить, что глутамат не может способствовать поддержанию изоосмотического с внешней средой состояния клетки в условиях высокой солености (Imhoff, 1986). Таким образом, у Н campisalis, растущего вплоть до 3.1 М Na+ в среде, он может являться только дополнительным осмопротектором. При росте на среде, содержащей дрожжевой экстракт, также обнаружен бетаин, часто детектируемый в клетках, выращенных на такой среде (Wohlfarth et al, 1990). У экстремально галоалкалофильной бактерии N acetigena, как и у всех изученных ранее нейтрофильных галоанаэробов, осмолиты не обнаружены. Поддержание осмотического баланса осуществляется за счет накопления крайне высоких концентраций солей. Анализ осмолитов у Т magadiensis выявил наличие бетаина, участие которого в осмоадаптации этой бактерии представляется вполне вероятным.

Впервые проведен аминокислотный анализ общего клеточного белка галоалкалофильных микроорганизмов. Установлено сравнительно высокое содержание кислых аминокислот при уменьшении доли основных, что было показано ранее для белков нейтрофильных галофилов Дополнительным механизмом, способствующим выживанию исследованных бактерий в условиях высокой солености, является солетолерантность ферментов. Изученные ферменты проявили различную устойчивость к NaCl, КС1 и NaHCC>3, однако в целом можно заключить, что они достаточно хорошо адаптированы к функционированию при высоких концентрациях солей.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что изученные галоалкалофильные бактерии представляют собой хорошо адаптированную к экстремальным условиям содовых озер группу микроорганизмов за счет различных физиолого-биохимических механизмов.

ВЫВОДЫ

1. Подробно исследована физиология галоалкалофильных гетеротрофных денитрифицирующих бактерий, выделенных из содовых озер и способных к восстановлению нитрата, нитрита и закиси азота. На основании проведенного филогенетического анализа они отнесены к роду Halomonas. Описано два новых вида этого рода - Н natronophila с типовым штаммом Z-7009T и Н. kenyensis с типовым штаммом AIR-2T. Восемь штаммов из озера Магади отнесены к ранее монотипическому виду Halomonas campisalis.

2. Выявлены широкие адаптационные возможности изученных штаммов галоалкалофильных денитрификаторов, заключающиеся в способности к росту в широком интервале значений рН, минерализации и температуры, использовании большого количества органических субстратов разных классов, переключении с аэробного дыхания на анаэробное.

3. Доказано отсутствие молибдена и молибденового кофактора в составе нитратредуктаз исследованных галоалкалофильных денитрифицирующих бактерий, что подтверждает гипотезу о распространенности «альтернативных» нитратредуктаз у экстремофильных микроор1 анизмов У выбранного для изучения Н. campisalis Z-7398-2 выделен и очищен до гомогенного состояния фермент, обладающий как нитрат-, так и нитритредуктазной активностью и отличающийся значительной солетолерантностью, термостабилыюстью и высоким температурным оптимумом около 70 °С.

4. Исследованы стратегии осмоадаптации галоалкалофильных бактерий с разной степенью галофилии, принадлежащих к различным таксономическим группам. Алкалофильные представители рода Halomonas, как и нейтрофильные виды, используют для осмоадаптации стратегию накопления низкомолекулярных органических веществ, основным из которых является эктоин. У Tindallia magadiensis наряду с умеренными концентрациями солей, недостаточными для поддержания осмотического баланса, обнаружен бетаин. У экстремально галоалкалофильного ацетогена Natroniella acetigena осмотический баланс клетки достигается благодаря накоплению солей до крайне высоких концентраций, что характерно для всех галоанаэробов Показано, что дополнительным механизмом адаптации к высокосоленым средам является солетолерантность ферментов исследованных организмов.

5. Впервые в сравнительном аспекте исследован аминокислотный состав общего клеточного белка галоалкапофилышх микроорганизмов. Обнаружено, что внутриклеточные белки исследованных бактерий обогащены остатками кислых аминокислот при сравнительно небольшом количестве основных, как это характерно для белков нейтрофильных галофилов Разность между содержаниями кислых и основных аминокислот в составе общего клеточного белка растет с увеличением степени галофилии организма.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Болтянская Ю.В., Антипов А.Н., Колганова Т.В., Лысенко A.M., Кострикина H.A., Жилина Т Н Облигатно алкалофильный денитрификатор Halomonas campisalis из озера Магади, способный к восстановлению закиси азота и лишенный молибденового кофактора в составе нитратредуктазы II Микробиология. 2004. Т.73 (3). С.326-334.

2 Болтянская Ю.В., Кевбрин В.В, Жилина Т.Н Новые виды алкалофильных денитрификаторов группы Halomonas из содовых озер // «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» / сборник статей под ред. О В. Турковской - Саратов, издательство «Научная книга», 2005. С.25-32.

3 Болтянская Ю.В., Деткова Е Н, Шумский А.Н., Дулов Л.Е., Пушева М А Осмоадагггация у представителей галоалкалофильных бактерий из содовых озер// Микробиология. 2005. Т.74 (6).

4 Деткова Е Н, Болтянская Ю.В. Связь между стратегией осмоадапгации, аминокислотным составом общего клеточного белка и свойствами некоторых ферментов галоалкалофильных бактерий // Микробиология 2006. Т.75 (3) (принята к печати).

5. Антипов А.Н., Салина Е.Г., Болтянская Ю.В., Чичикало Е В. Особенности нитратредуктаз алкалофильных микроорганизмов // III Съезд биохимического общества. - Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 г. С.62-63.

6 Болтянская Ю.В. Алкалофильный денитрификатор НаЬтопся сатриа1^ г-7398-2 как возможный агент для очистки щелочных нитратсодержащих стоков // XVI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». -Москва, 9-12 февраля 2004 г. С.77.

7. Болтянская Ю.В., Жилина Т Н. Физиологические особенности нового штамма На1атогии> сатр15аНз - облигатно алкалофильного денитрификатора из содового озера Магади // 8-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Микробиология - наука XXI века». - Пущино, 17-21 мая 2004 г. С. 142.

8. Болтянская Ю.В., Кевбрин В.В., Жилина Т.Н. Новые виды алкалофильных денитрификаторов группы На1отопай из содовых озер // Вторая региональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой». - Саратов, 26-28 октября 2004 г. С.7-8.

9. Болтянская Ю.В., Шумский А.Н., Пушева М.А. Стратегии осмоадаптации галоалкалофильных денитрификаторов рода На1отопаз из содовых озер // 9-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Микробиология - наука XXI века». - Пущино, 18 - 22 апреля 2005 г. С. 183-184.

10. Болтянская Ю.В., Пушева М.А. Стратегии осмоадаптации галоалкалофильных денитрификаторов рода На1отопаз // Конференция молодых ученых «Актуальные проблемы современной микробиологии». - Москва, 1-3 ноября 2005 г. С.11-12.

С.738-744.

к исполнению 06/04/2006 Исполнено 07/04/2006

Заказ № 237 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 т^тоту.аийгеГеШ ги

¿QOGk 7 bXg

- 76 5 ff

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Болтянская, Юлия Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиолого-биохимические особенности представителей галоалкалофильных бактерий из содовых озер"

Актуальность. Микробное сообщество содовых озер активно изучается с начала 1990-х годов. В нашей стране интерес к ним в значительной степепи обусловлен гипотезой Г.А. Заварзина о том, что эпикоптинентальные содовые водоемы могут являться центром формирования наземной биоты в прошлом (Заварзип, 1993) и рассматриваться, таким образом, как реликтовые. Содовые озера представляют собой уникальную экосистему, в которой экстремально высокий рН часто сочетается с высокими концентрациями солей вплоть до насыщающих. Чтобы выжить в таких условиях, микроорганизмы должны располагать комплексом адаптационных механизмов. В настоящее время существует большое количество работ, посвященных изучению этих механизмов у разнообразных галофильных бактерий (Sadler et al., 1980; Vreeland et al., 1984; Vreeland, 1987; Galinski and Triiper, 1994; Canovas et al., 1996; Mojica et al., 1997; Ono et al., 1998; Valderrama et al., 1998; Roepier and Miiller, 2001). Однако галоалкалофильпые представители содовых озер с этой точки зрения мало изучены. Активное исследование микробного сообщества содовых озер, начатое в лаборатории акад. Г.А. Заварзина (Zhilina and Zavarzin, 1994) и описание ряда новых микроорганизмов различных систематических групп (Заварзин и др., 1999) позволило провести сравнительное изучение механизмов адаптации этих бактерий к экстремальным условиям.

В настоящее время известны представители основных групп микроорганизмов, осуществляющих круговороты элементов в содовых водоемах. Среди них новые представители групп первичных и вторичных анаэробов, совместное действие которых приводит к полной деструкции органического вещества (Zavarzin and Zhilina, 2000). С циклом углерода напрямую связан цикл азота, являющийся важнейшим звеном в функционировании любой экосистемы.

Диссимиляциоиное восстановление нитрата (денитрификация) является хорошо изученным процессом в микробиологическом плане, однако первые алкалофильные денитрификаторы были описаны относительно недавно. Новейшие исследования показали, что к литотрофному восстановлению нитрата способны представители рода Thioalkalivibrio (Sorokin et al., 2002c; Sorokin et al., 2003b; Sorokin et al., 2004b), а в условиях органотрофного питания важнейшую роль играют представители рода Halomonas. Высокая численность галомонад в щелочных экосистемах подтверждается результатами молекулярно-биологических исследований (Duckworth et al., 1996), однако на данный момент идентифицировано лишь небольшое число облигатно алкалофильных представителей этого рода (Berendes et al., 1996, Mormile et al., 1999, Duckworth et al., 2000). Предполагается, что алкалофильные галомопады могут обладать уникальными свойствами, отличающими их от нейтрофильных представителей этого рода (Jones and Grant, 2000). Таким образом, их изучение представляет определенный интерес.

Ключевым ферментом ассимиляции нитратов у эукариот, а также ассимиляции и диссимиляции нитратов у прокариот является нитратредуктаза, катализирующая восстановление нитрата в нитрит. Несмотря на разнообразие форм, универсальность фермента для про - и эукариот определяется наличием общего молибденового кофактора у всех выделенных до сих пор нитратредуктаз. Зависимость питратредуктаз от молибдена была установлена еще 50 лет назад (Wolfe, 1954) и многократно подтверждалась дальнейшими исследованиями (Львов, 1989; Кильдибеков и др., 1996). Однако индийскими исследователями было показано, что у вольфрамустойчивого мутанта Nostoc muscorum нитратредуктазная активность стимулировалась не молибденом, а ванадием (Singh Н et al., 1993; Singh S. et al., 1993). Таким образом, уникальность молибдена в биологическом восстановлении нитратов впервые была поставлена под сомнение.

В 1998 году в лаборатории проф. Н.П. Львова (ИНБИ им. А.Н. Баха РАН) из клеток вападатредуцирующей бактерии Pseudomonas isachenkovii впервые были выделены две так называемые «альтернативные» нитратредуктазы, не содержащие молибден и молибденовый кофактор (Antipov et al., 1998). У ферментов был обнаружен ряд необычных свойств (Антипов и др., 1999). На основании результатов этого исследования была сформулирована гипотеза, согласно которой безмолибденовые нитратредуктазы, возможно, синтезируются у организмов, населяющих экстремальные местообитания. Были обозначены возможные пути поиска микроорганизмов с новым типом нитратредуктаз (Антипов, 1999). В числе экстремальных факторов рассматривается и высокий рН окружающей среды. К началу нашей работы исследований, касающихся структуры и свойств нитратредуктаз алкалофилов, не проводилось. По предложению проф. Н.П. Львова было предпринято исследование нитратредуктаз облигатно алкалофильных штаммов денитрификаторов, выделенных из содовых озер Т.Н. Жилиной и Д.Ю. Сорокиным, что потребовало описания этих организмов и изучения особенностей их физиологии.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение особенностей физиологии и биохимии новых алкалофильных денитрифицирующих бактерий и исследование механизмов осмоадаптации у этих и описанных ранее галоалкалофильных представителей содовых озер.

В рамках основной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Описание новых штаммов алкалофильных гетеротрофных денитрифицирующих бактерий, выделенных из содовых озер;

2. Поиск безмолибденовых нитратредуктаз у новых штаммов галоалкалофильных денитрификаторов. Исследование свойств безмолибденовой нитратредуктазы штамма Z-7398-2 как модельного объекта;

3. Изучение механизмов адаптации галоалкалофильных бактерий к осмотическому стрессу на примере новых штаммов денитрификаторов и описанных ранее микроорганизмов: а) определение внутриклеточных концентраций ионов натрия, калия и хлора; б) идентификация внутриклеточных осмопротекторов; в) аиализ аминокислотного состава общего клеточного белка; г) исследование способности ферментов метаболизма к функционированию в условиях высоких концентраций солей.

Научная новизна и практическая значимость. Определен таксономический статус 11-ти штаммов алкалофильных денитрифицирующих бактерий из содовых озер. Штамм Z-7009, а также штаммы AIR-1 и AIR-2 отнесены к роду Halomonas в качестве новых видов. Остальные 8 штаммов из озера Магади отнесены к ранее известному виду Halomonas campisalis. У выбранного для изучения штамма Н. campisalis Z-7398-2 выделена и очищена до гомогенного состояния «альтернативная» нитратредуктаза, не содержащая молибден и молибденовый кофактор в активном центре.

Исследованы стратегии осмоадаптации галоалкалофильных бактерий. Обнаружено, что внутриклеточные концентрации ионов Na , К+ и СГ у //. campisalis и Н. kenyensis недостаточны для уравновешивания внутреннего и внешнего осмотического давления, и баланс достигается благодаря накоплению органических осморегуляторов, как это характерно для нейтрофильных представителей этого рода. В клетках Tinclallia magadiensis обнаружен бетаин. Напротив, у галоалкалофильного представителя порядка Halanaerobiales Natroniella acetigena осмолиты не обнаружены, а осмоадаптация осуществляется за счет накопления в клетке экстремально высоких концентраций солей. Установлено, что белки изучаемых галоалкалофильных бактерий обогащены остатками кислых аминокислот, как это характерно для галофильных белков. Показано, что дополнительным способом приспособления изученных микроорганизмов к осмотическому стрессу является возможность функционирования их ферментов в широком интервале концентраций солей.

Полученные результаты расширяют представления о физиолого-биохимическом разнообразии галоалкалофильных денитрифицирующих бактерий и их месте в круговороте азота в содовых водоемах. Новые штаммы могут быть рекомендованы в качестве потенциальных агентов для очистки щелочных нитратсодержащих сточных вод различного происхождения. Исследованные галоалкалофильные микроорганизмы представляют интерес как источники эктоина, бетаина и новых солетолераптных ферментов.

Апробация работы. Отдельные материалы диссертации докладывались на III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), 8-й и 9-й международных школах-конференциях «Биология - наука XXI века» (Пущиио, 2004 и 2005), 2-й региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004). На конкурсе научных работ Института биохимии им. А.Н. Баха РАН 2002 года работа заняла второе место. На 9-й Пущинской школе-конференции «Биология -паука XXI века» работа была отмечена как лучшее стендовое сообщение.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисов, 1 статья принята к печати.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста и включают 29 рисунков и 15 таблиц. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Выводы», «Заключение» и «Список литературы», включающий 279 наименований.

Благодарность. Автор выражает глубокую признательность д.б.и. Т.Н. Жилиной за предоставление культур и цепные советы по их описанию, к.б.н. А.Н. Аптипову (ИНБИ РАН) за руководство биохимической частью работы, д.б.н. Д.Ю. Сорокину за предоставление штаммов AIR-1 и AIR-2, к.б.н. В.В. Кевбрину и к.б.н. Е.Н. Детковой за советы и помощь в освоении методик, к.х.н. А.Н. Шумскому (ИОХ РАН), к.х.и. Н.С. Иконникову (ИНЭОС РАН), к.б.н. JI.E. Дулову, к.б.н. A.M. Лысенко, к.т.н. Т.В. Колгановой за помощь на отдельных этапах работы. Я особенно благодарна д.б.н. М.А. Пушевой за общее научное руководство и заведующему лабораторией реликтовых микробных сообществ ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН акад. Г.А. Заварзину за помощь в интерпретации результатов.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ 01-04-48553, 01-0448217, грантов Президента РФ «Ведущие научные школы» НШ-1101.2003.4 и РИ-112/001/027, гранта Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (руководитель Г.А. Заварзин).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Болтянская Ю.В., Антипов А.Н., Колганова Т.В., Лысенко A.M., Кострикина Н.А., Жилина Т.Н. Облигатно алкалофильпый денитрификатор Halomonas campisalis из озера Магади, способный к восстановлению закиси азота и лишенный молибденового кофактора в составе нитратредуктазы // Микробиология. 2004. Т.73 (3). С.326-334.

2. Болтянская Ю.В., Кевбрип В.В., Жилина Т.Н. Новые виды алкалофильпых денитрификаторов группы Halomonas из содовых озер // «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» / сборник статей под ред. О.В. Турковской -Саратов, издательство «Научная книга», 2005. С.25-32.

3. Болтянская Ю.В., Деткова Е.Н., Шумский А.Н., Дулов Л.Е., Пушева М.А. Осмоадаптация у представителей галоалкалофильпых бактерий из содовых озер // Микробиология. 2005. Т.74 (6). С.738-744.

4. Деткова Е.Н., Болтянская Ю.В. Связь между стратегией осмоадаптации, аминокислотным составом общего клеточного белка и свойствами некоторых ферментов галоалкалофильпых бактерий // Микробиология. 2006. Т.75 (3) (принята к печати).

5. Антипов А.Н., Салина Е.Г., Болтянская Ю.В., Чичикало Е.В. Особенности нитратредуктаз алкалофильпых микроорганизмов // Тезисы докл. III Съезда биохимического общества. - Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 г. С.62-63.

6. Болтянская Ю.В. Алкалофильпый денитрификатор Halomonas campisalis Z-7398-2 как возможный агент для очистки щелочных нитратсодержащих стоков // Тезисы XVI зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - Москва, 9-12 февраля 2004 г. С.77.

7. Болтянская Ю.В., Жилина Т.Н. Физиологические особенности нового штамма Halomonas campisalis - облигатно алкалофилыюго денитрификатора из содового озера Магади // Тезисы 8-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Микробиология - наука XXI века». - Пущипо, 17-21 мая 2004 г. С. 142.

8. Болтянская Ю.В., Кевбрип В.В., Жилина Т.Н. Новые виды алкалофильпых денитрификаторов группы Halomonas из содовых озер // Вторая региональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой». - Саратов, 26 - 28 октября 2004 г. С.7-8.

9. Болтянская Ю.В., Шумский А.П., Пушева М.А. Стратегии осмоадаптации галоалкалофильпых денитрификаторов рода Halomonas из содовых озер // Тезисы 9-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Микробиология -наука XXI века». - Пущино, 18 - 22 апреля 2005 г. С. 183-184.

10. Болтянская Ю.В., Пушева М.А. Стратегии осмоадаптации галоалкалофильных денитрификаторов рода Halomonas II Конференция молодых ученых «Актуальные проблемы современной микробиологии». - Москва, 1 - 3 ноября 2005 г. С.11-12.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Болтянская, Юлия Владимировна

выводы

1. Подробно исследована физиология галоалкалофильных гетеротрофных денитрифицирующих бактерий, выделенных из содовых озер и способных к восстановлению нитрата, нитрита и закиси азота. На основании проведенного филогенетического анализа они отнесены к роду Halomonas. Описано два новых вида этого рода - Н. natronophila с типовым штаммом Z-7009 и Н. kenyensis с типовым штаммом AIR-2 . Восемь штаммов из озера Магади отнесены к ранее монотипическому виду Halomonas campisalis.

2. Выявлены широкие адаптационные возможности изученных штаммов галоалкалофильных денитрификаторов, заключающиеся в способности к росту в широком интервале значений рН, минерализации и температуры, использовании большого количества органических субстратов разных классов, переключении с аэробного дыхания на анаэробное.

3. Доказано отсутствие молибдена и молибденового кофактора в составе нитратредуктаз исследованных галоалкалофильных денитрифицирующих бактерий, что подтверждает гипотезу о распространенности «альтернативных» нитратредуктаз у экстремофильпых микроорганизмов. У выбранного для изучения Н. campisalis Z-7398-2 выделен и очищен до гомогенного состояния фермент, обладающий как нитрат-, так и нитритредуктазной активностью и отличающийся значительной солетолерантностью, термостабилыюстыо и высоким температурным оптимумом около 70 °С.

4. Исследованы стратегии осмоадаптации галоалкалофильных бактерий с разной степенью галофилии, принадлежащих к различным таксономическим группам. Алкалофильпые представители рода Halomonas, как и нейтрофильные виды, используют для осмоадаптации стратегию накопления низкомолекулярных органических осмолитов, основным из которых является эктоин. У Tindallia magadiensis наряду с умеренными концентрациями солей, недостаточными для поддержания осмотического баланса, обнаружен бетаин. У экстремально галоалкалофильного ацетогена Natroniella acetigena осмотический баланс клетки достигается благодаря накоплению солей до крайне высоких концентраций, что характерно для всех галоанаэробов. Показано, что дополнительным механизмом адаптации к высокосоленым средам является солетолераптпость ферментов исследованных организмов.

5. Впервые в сравнительном аспекте исследован аминокислотный состав общего клеточного белка галоалкалофильных микроорганизмов. Обнаружено, что внутриклеточные белки исследованных бактерий обогащены остатками кислых аминокислот при сравнительно небольшом количестве основных, что характерно для белков нейтрофильных галофилов. Разность между содержаниями кислых и основных аминокислот в составе общего клеточного белка растет с увеличением степени галофилии организма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное нами исследование показало, что новые хемоорганогетеротрофпые денитрификаторы из содовых озер не образуют новых филогенетических ветвей, а являются представителями рода Halomonas. Несмотря на высокую численность алкалофильных галомонад в щелочных экосистемах (Duckworth et al., 1996), их разнообразие пока ограничивается небольшим числом видов. Восемь штаммов из кенийского озера Магади принадлежат к ранее описанному виду Halomonas campisalis с типовым штаммом 4АТ, изолированным из щелочного озера США (Mormile et al., 1999). Таким образом, данный вид не является эндемичным, строго приуроченным к опеределенному местообитанию, а имеет широкий ареал распространения, включающий щелочные экосистемы Африки и Северной Америки. Штамм Z-7009 из низкоминерализованного содового озера Дзун-Тухэм-Нур (Восточная Монголия) описан в качестве нового вида в составе рода Halomonas с названием II. natronophila. Штаммы AIR-1 и AIR-2, выделенные из смешанной пробы илов пяти кенийских озер, также составили новый вид с предложенным названием Н. kenyensis и

•т* типовым штаммом AIR-2 .

Обнаружена приспособленность новых организмов к переменным физико-химическим условиям содовых озер, проявляющаяся в возможности роста в широком интервале значений солености, рН и температуры, использовании разнообразных органических субстратов, способности переключаться с аэробного дыхания па анаэробное. Использование многочисленных субстратов, относящихся к различным классам органических веществ, позволяет выдерживать конкуренцию за источник углерода в условиях микробного сообщества. Способность к анаэробному дыханию определяет возможность выживания в условиях недостатка кислорода, например, при концентрировании рассолов за счет пересыхания водоема, в результате чего снижается растворимость кислорода. Широкие адаптационные возможности новых представителей рода Halomonas определяют их важнейшую роль в утилизации органического вещества и в круговороте азота и объясняют выявленную ранее (Duckworth et al., 1996) высокую численность этой группы в содовых водоемах.

У восьми штаммов из высокоминерализованного содового озера Магади, а также у новых видов галомонад, показано отсутствие молибденового кофактора в составе нитратредуктазы. У выбранного для изучения штамма II. campisalis Z-7398-2 нитратредуктаза выделена и очищена до электрофоретически гомогенного состояния. Доказано отсутствие в составе ее активного центра молибдена как в форме классического молибденового кофактора, так и в любом ином виде. Впервые безмолибденовая нитратредуктаза была выделена из клеток ванадатвосстанавливающей бактерии Pseudomonas isachenkovii штамм А-1 (Antipov et al., 1998). Она содержала в активном центре не молибден, а ванадий. Распространенность «альтернативных» нитратредуктаз в микробном мире остается неизученной, однако описанный в данной работе фермент, выделенный из клеток галоалкалофильной бактерии, способной расти в условиях высоких значений минерализации и рН, подтверждает гипотезу о том, что подобные нитратредуктазы следует искать у экстремофильных микроорганизмов (Антипов, 1999). Несмотря на то, что нитратредуктаза 11. campisalis Z-7398-2 является ключевым ферментом диссимиляционного пути восстановления нитрата, она представляет собой мономер. Такая структура описана для ассимиляционных бактериальных нитратредуктаз (Richardson and Watmough, 1999), но не встречалась у диссимиляциопных. Фермент имеет повышенный температурный оптимум, составляющий 70°С, и обладает высокой термостабилыюстыо. Такие свойства не характерны для ферментов, выделенных из мезофильных организмов, и в том числе - для классических нитратредуктаз. Однако они описаны для всех известных на данный момент безмолибденовых нитратредуктаз (Antipov et al., 1998; Антипов и др., 2002; Antipov et al., 2003) и являются, по всей видимости, их отличительной особенностью. У фермента обнаружена небольшая нитритредуктазная активность, также не характерная для молибденсодержащих нитратредуктаз.

На примере нитратредуктаз штаммов Н. campisalis и Н. kenyensis была продемонстрирована исключительная устойчивость к высокому содержанию солей в среде. Обе нитратредуктазы сохраняли активность в широком интервале концентраций NaCl и КС1 вплоть до насыщающих. Известно, что активность фермента часто зависит не только от концентрации, но и от природы соли (Огеп and Мапа, 2002), однако у нитратредуктаз галоалкалофильпых представителей рода Halomonas характер отклика не зависел от природы соли. Также было обнаружено, что характер зависимости активности ферментов от концентрации соли не зависел от условий культивирования, хотя описаны случаи влияния условий роста микроорганизма па оптимум и интервалы активности его ферментов (Bylund et al., 1991). По аналогии с обнаруженной термостабилыюстыо, превосходящей реальные потребности организма, можно предположить, что высокая солетолераптпость исследованных ферментов связана в первую очередь с особенностями «альтернативных» нитратредуктаз, а не с осмоадаптационными механизмами.

Содовые озера представляют собой экосистему, где щелочность часто сопровождается высокими концентрациями солей и высокой ионной силой. Это побудило нас исследовать механизмы осмоадаптации галоалкалофильпых бактерий из содовых озер. Известно, что в микробном мире существуют две принципиально различных стратегии приспособления к таким условиям. Первая заключается в транспорте внутрь клетки или в синтезе ею небольших органических молекул (осмолитов), вторая связана с накоплением неорганических ионов, как правило, К+ и СГ. Для аэробных хемотрофных бактерий типа Halomonas характерно использование первой стратегии. В клетках Н. campisalis Z-7398-2, выращенных на высокоминерализованной среде, обнаружен эктоин - типичный осмопротектор y-Proteobacteria, и в том числе - представителей рода Halomonas (Severin et al, 1992; Galinski and Triiper, 1994; Ono et al., 1998; Ventosa et al, 1998b), что позволяет сделать вывод о единстве используемых для осмоадаптации органических веществ у алкалофильных и нейтрофильных галомонад. Помимо эктоина был детектирован глутамат, часто являющийся минорным компонентом смеси осмопротекторов у Halomonas. В частности, он обнаружен в клетках Halomonas elongata, где связан с ионами калия (Kraegeloh and Kunte, 2002). В отличие от эктоина, глутамат является не только осмопротектором, по и важнейшим продуктом метаболизма клетки, основой для биосинтеза нескольких аминокислот, поэтому в данном случае его осмопротекторная функция требует дополнительных количественных подтверждений. Следует также отметить, что глутамат, как и другие аминокислоты, используется в качестве осмолита в основном у слабогалофильных бактерий, поскольку он не может способствовать поддержанию изоосмотического с внешней средой состояния клетки в условиях высокой солености (Imhoff, 1986). С увеличением степени галофилии микроорганизма роль глутамата в осмоадаптации уменьшается. Таким образом, у Н. campisalis, растущего до 3.1 М Na+, глутамат может являться только дополнительным осмопротектором, роль которого уменьшается с увеличением концентрации солей в среде. Прочие вещества, использующиеся в качестве компонентов осмопротекторного «коктейля» у нейтрофильных галомонад - глюкоза и аланин - не выявлены. При росте на среде, содержащей 0.1 г/л дрожжевого экстракта, также обнаружен бетаин, часто детектируемый в клетках, выращенных на такой среде (Wohlfarth et al, 1990).

У экстремально галоалкалофильной бактерии N. acetigena, как и у всех изученных ранее нейтрофильных галоапаэробов, осмолиты ие обнаружены, что согласуется с крайне высокими внутриклеточными концентрациям ионов, обнаруженными у этой бактерии. Поддержание осмотического баланса клетки осуществляется за счет накопления солей. Анализ осмолитов у Т. magadiensis выявил наличие бетаина, участие которого в осмоадаптации этой бактерии представляется вполне вероятным.

Установлено, что в составе белков галоалкалофильных бактерий преобладают кислые аминокислоты при сравнительно низком содержании основных. Соотношение между кислыми и основными аминокислотами зависит от степени галофилии микроорганизма. Таким образом, изменения в составе белков галоалкалофилов подчиняются закономерностям, известным для нейтрофильных галофилов. Особый аминокислотный состав галофильных белков предопределяет их высокую устойчивость к действию солей (Lanyi, 1974). Известно, что кислые аминокислоты (глутамат и аспартат) более сильно гидратированы, чем прочие, и могут использоваться для образования солевых мостиков со стратегически важными основными остатками внутри белка. Предполагается, что такие внутренние солевые мостики придают галофильному белку структурную жесткость и способствуют его стабилизации (Dennis and Shimmin, 1997). Дополнительным механизмом, способствующим выживанию исследованных бактерий в условиях высокой солености, является солетолерантиость ферментов. Изученные ферменты проявили различную устойчивость к NaCl, КС1 и NaHCOj, однако в целом можно заключить, что они достаточно хорошо адаптированы к функционированию при высоких концентрациях солей.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что изученные галоалкалофильпые бактерии представляют собой хорошо адаптированную к экстремальным условиям гиперсолепых щелочных экосистем с переменным режимом группу микроорганизмов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Болтянская, Юлия Владимировна, Москва

1. Антипов А.Н. 1999. Новый тип диссимиляторных нитратредуктаз, не содержащих молибден и молибденовый кофактор // Дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук. Москва.

2. Антипов А.Н., Ляликова Н.Н., Хижняк Т.В., Львов Н.П. 1999. Некоторые свойства диссимиляторных нитратредуктаз, не содержащих молибден и молибденовый кофактор // Биохимия. Т.64. С.581-586.

3. Антипов А.Н., Салипа Е.Г., Болтянская Ю.В., Чичикало Е.В. 2002. Особенности нитратредуктаз алкалофильпых микроорганизмов // Тезисы докл. III Съезда биохимического общества. Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 г. С.62-63.

4. Гарпова Е.С. 2003. Алкалофильные сахаролитические анаэробы содовых озер // Дисс. на соискание ученой степени канд. биол. паук. Москва.

5. Герасименко Л.М., Дубинин А.В., Заварзип Г.А. 1996. Алкалофильные циапобактерии содовых озер Тувы и их экофизиология // Микробиология. Т.65. С.844-849.

6. Герасименко Л.М., Дубинин А.В., Митюшина Л.Л., Заварзин Г.А. 1999. Микроскопическая зеленая водоросль из содовых озер // Микробиология. Т.68. С.696-700.

7. Горленко В.М., Брянцева И.А., Пантелеева Е.Е., Турова Т.П., Колгапова Т.В., Махнева З.К., Москаленко А.А. 2004. Ectothiorhodosinus mongolicum gen. nov., sp. nov. новая пурпурная серная бактерия из содового озера Монголии // Микробиология. Т.73. С.80-88.

8. Горленко В.М., Намсараев Б.Б., Кулырова А.В., Заварзина Д.Г., Жилина Т.Н. 1999. Активность сульфатредуцирующих бактерий в донных осадках содовых озер Юго-Восточного Забайкалья // Микробиология. Т.68. С.664-670.

9. Деткова Е.Н. 2003. Физиология, биохимия и биоэнергетика галофильных и алкалофильпых ацетогенных бактерий // Дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук. Москва.

10. Доронина Н.В., Дармаева Ц.Д., Троцепко Ю.А. 2001. Новые анаэробные метилотрофные изоляты из содовых озер Южного Забайкалья // Микробиология. Т.70. С.398-404.

11. Дубинин А.В., Герасименко Л.М., Заварзин Г.А. 1995. Экофизиология и видовое разнообразие цианобактерий озера Магади // Микробиология. Т.64. С.845-849.

12. Жилииа Т.Н. 1983. Новая облигатно-галофильиая метанобразующая бактерия // Микробиология. Т.52. С.375-382.

13. Жилина Т.Н., Гарнова Е.С., Турова Т.П. 2001а. Amphibacillus fermentum sp. nov., Amphibacillus tropicus sp.nov. новые алкалофильные и факультативно анаэробные сахаролитические бациллы из озера Магади // Микробиология. Т.70. С.825-837.

14. Жилина Т.Н., Гарнова Е.С., Турова Т.П., Кострикина Н.А., Заварзии Г.А. 2001 Q.Halonatronum saccharophilum gen.nov., sp. nov. новая галоалкалофильная бактерия пор. Haloanaerobiales из озера Магади // Микробиология. Т.70. С.77-85.

15. Жилина Т.Н. и Заварзин Г.А. 1987. Methanohalobium evestigatus gen. nov., sp. nov. экстремально-галофильная метанобразующая архебактерия // Докл. АН СССР. Т.293. С.464-468.

16. Жилина Т.Н. и Заварзин Г.А. 1990. Новая экстремально галофильная гомоацетатная бактерия Acetohalobium arabaticum gen. nov., sp. nov. // Доклады АН СССР. T.311. С.745-747.

17. Жилина Т.Н. и Заварзин Г.А. 1991. Анаэробные бактерии деструкторы в галофильном цианобактериалыюм сообществе // Журн. общ. биологии. Т.52. С.302-308.

18. Жилина Т.Н., Кевбрин В.В., Лысенко A.M., Заварзин Г.А. 1991а. Сахаролитические анаэробы в галофильном цианобактериалыюм мате // Микробиология. Т.60. С. 139147.

19. Жилина Т.Н., Кевбрин В.В., Турова Т.П., Лысенко A.M., Кострикина Н.А., Заварзин Г.А. 2005. Clostridium alkalicellum sp. nov. облигатно алкалофильный целлюлозолитик из содового озера Прибайкалья // Микробиология. Т.74. С.642-653.

20. Жилина Т.Н., Мирошникова Л.В., Осипов Г.А., Заварзин Г.А. 19916. Halobacteroides lacunaris sp. nov. новый сахаролитический анаэробный экстремально галофильный организм из лагунного гиперсоленого озера Чокрак // Микробиология. Т.60. С.114— 121.

21. Заварзин Г.А. 1993. Эпиконтинентальные содовые водоемы как предполагаемые реликтовые биотопы формирования наземной биоты // Микробиология. Т.62. С.789-800.

22. Заварзии Г.А., Герасименко Л.М., Жилина Т.Н. 1993. Цианобактериальные сообщества гиперсоленых лагун Сиваша // Микробиология. Т.62. С.1113-1126.

23. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Кевбрин В.В. 1999. Алкалофильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие // Микробиология. Т.68. С.579-599.

24. Заварзин Г. А., Жилина Т.Н., Пикута Е.В. 1996. Вторичные анаэробы в галоалкалофильных сообществах озер Тувы // Микробиология. Т.65. С.546-553.

25. Звягильская Р.А., Вартапетян Б.Б., Львов Н.П. 1996. Диссимиляция нитратов у эукариот // Прикладная биохимия и микробиология. Т.32. С. 179-184.

26. Иванова Н.Н., Дробышева Н.И. 1976. Исследование сульфитзависимого восстановления нитратов, катализируемого пероксидазой растений // Физиология растений. Т. 23. С. 1141-1148.

27. Иванова Н.Н., Дробышева Н.И. 1985. Участие анион-радикала кислорода в энзиматических реакциях восстановления нитрата // Физиология растений. Т. 32. С.488-493.

28. Иванова Н.Н., Овчаренко Г.А., Худякова Е.М., Рощупкина Т.Г. 1979. Антагонизм нитратредуктазы и пероксидазы в проявлении их питратвосстанавливающих активностей // Физиология растений. Т. 26. С. 302-308.

29. Исаченко Б.Л. 1951. Хлористые, сульфатные и содовые озера Кулундинской степи и биогенные процессы в них // Б.Л. Исаченко. Избранные труды. М. Л. Изд-во АН СССР. С.143-162.

30. Калюжпая М.Г., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е., Лысенко A.M., Троценко Ю.А. 1999. Новые метилотрофные изоляты из щелочных озер южного Забайкалья // Микробиология. Т.68. С.677-685.

31. Кашнер Д. 1981. Жизнь микроорганизмов при высоких концентрациях солей и растворенных веществ: галофильные бактерии // Жизнь микробов в экстремальных условиях / Под ред. Д. Кашнера. М.: Издательство «Мир».

32. Кевбрин В.В. и Заварзин Г.А. 1992. Влияние соединений серы на рост галофилыюй гомоацетатной бактерии Acetohcilobium arabaticum II Микробиология. Т.61. С.812-817.

33. Кевбрин В.В., Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. 1997а. Ростовые характеристики алкалофильных спирохет Spirochaeta cilkcilicci, Spirochaeta cifricana и Spirochcieta asiatica II Микробиология. T.66. С.60-53.

34. Кевбрин В.В., Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. 1999. Разложение целлюлозы анаэробным алкалофильным микробным сообществом // Микробиология. Т.68. С.686-695.

35. Кевбрин В.В., Кострикипа Н.А., Лысенко A.M. 1994. Выделение и идентификация Pseiulomonas nautica гетеротрофного спутника цианобактерий Microcoleus chtonoplastes II Микробиология. Т.63. С. 1072-1080.

36. Кевбрин В.В., Лысенко A.M., Жилина Т.Н. 19976. Физиология алкалофильного метаногена Z-7936, нового штамма Methanosalsus zhilinae, выделенного из озера Магади // Микробиология. Т.63. С.315-320.

37. Кильдибеков Н.А., Омаров Р.Т., Львов Н.П. 1996. Молибденовый кофактор // Успехи биологической химии. Т.36. С. 163-186.

38. Компанцева Е.И., Сорокин Д.Ю., Горленко В.М., Намсараев Б.Б. 2005. Фототрофное сообщество соленого щелочного озера Хилганта (Юго-восточное Забайкалье) // Микробиология. Т.74. С.410-419.

39. Крылов И.Н. и Заварзин Г.А. 1983. Цианобактериальные сообщества колодец в прошлое // Природа. №3. С.59-69.

40. Львов Н.П. 1989. Молибден в ассимиляции азота у растений и микроорганизмов // 43-е Баховское чтение. М.: Наука. 85 с.

41. Львов Н.П., Кильдибеков Н.А., Миронов Е.А., Москалева И.В., Вольпин М.Е., Кретович В.Л. 1983. Молибдокофакторы ксантиноксидазы и нитратредуктазы и возможные продукты их окисления // ДАН СССР. Т.272. С. 1264-1267.

42. Мишустин Е.Н. 1979. Круговорот азота и его соединений в природе // Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе / иод ред. Г.А. Заварзипа. М.: Наука. 288 с.

43. Намсараев Б.Б., Жилина Т.Н., Кулырова А.В., Горленко В.М. 1999. Бактериальное образование метана в содовых озерах юго-восточного Забайкалья // Микробиология. Т.68. С.671-676.

44. Николаев Ю.А., Матвеева Н.И., Лирова С.А., Соколов Д.П., Плакунов В.К. О механизме воздействия циклически изменяющихся значений рН среды на метаболизм Candida utilis II Микробиология. 1987. Т.56. С.537-541.

45. Пейве Я.В., Иванова Н.Н., Овчаренко Г.А., Ширипская М.Г. 1975. О возможном участии пероксидазы в восстановлении нитратов в растениях // Физиология растений Т.22, С. 527-535.

46. Пикута Е.В., Жилипа Т.Н., Заварзин Г.А., Кострикина II.А., Осипов Г.А., Рейпи Ф.А. 1998. Desidfonatronum lacustre gen. nov., sp. nov. новая алкалофильиая сульфатвосстапавливающая бактерия, использующая этанол // Микробиология. Т.67. С. 123-131.

47. Пикута Е.В., Лысенко A.M., Жилина Т.Н. 1997. Распространение Desidfonatronovibrio hydrogenovorans в содовых озерах Тувы // Микробиология. Т.66. С.262-268.

48. Пиннекер Е.В. 1968. Минеральные воды Тувы. Кызыл: Тувинское книжное изд-во.

49. Пушева М.А. 1996. Экстремофильные гомоацетогенные бактерии: физиология, метаболизм и биотехнологический потенциал // Дисс. на соискание ученой степени доктора биологических наук. Москва.

50. Пушева М.А., Берестовская Ю.Ю., Бородулииа Н.П. 1989. Влияние никеля на метаболизм гомоацетатных бактерий // Микробиология. Т.58. С.206-211.

51. Пушева М.А., Деткова Е.Н., Болотина Н.П., Жилина Т.Н. 1992. Свойства пери плазматической гидрогеназы экстремально-галофильной гомоацетатной бактерии Acetohalobium arabaticum II Микробиология. Т.61. С.933-938.

52. Пушева М.А., Соколова Т.Г. 1995. Распределение активностей СО-дегидрогепазы при СО-зависимом и пируватзависимом росте анаэробной термофильной карбоксидотрофной бактерии Carboxydothermus hydrogenoformans II Микробиология. Т.64. С.581-586.

53. Сорокин Д.Ю. 2003. Окисление неорганических серных соединений облигатно хемогетеротрофными бактериями // Микробиология. Т.72. С.725-739.

54. Сорокин Д.Ю. и Митюшина JI.JI. 1998. Особенности ультраструктуры алкалофильиых гетеротрофных бактерий, окисляющих серные соединения до тетратионата// Микробиология. Т.67. С.93-101.

55. Сорокин Д.Ю., Лысенко A.M., Митюшина Л.Л. 1996. Выделение и характеристика хемооргапотрофных бактерий, окисляющих восстановленные неорганические серные соединения до тетратионата // Микробиология. Т.65. С.370-383.

56. Троценко Ю.А. и Хмеленина В.Н. 2002. Особенности биологии и осмоадаптации галоалкалофильных метанотрофов // Микробиология. Т.71. С.149-159.

57. Турова Т.П., Гарпова Е.С., Жилина Т.Н. 1999. Филогенетическое разнообразие алкалофильиых сахаролитических бактерий, выделенных из содовых озер // Микробиология. Т.68. С.701-709.

58. Фурина Е.К., Бонарцева Г.А., Андреищева Е.Н., Полякова Л.И., Вартапетян Б.Б., Звягильская Р.А., Львов Н.П. 1997. Об особенностях восстановления нитратов у дрожжей Candida utilis II Прикладная биохимия и микробиология. Т.ЗЗ. С.603-610.

59. Хмеленина В.Н., Калюжпая М.Г., Троценко Ю.А. 1997. Физиолого-биохимические особенности галоалакалофилыюго метанотрофа//Микробиология. Т.66. С.437-443.

60. Юркова Н.А. и Ляликова Н.Н. 1990. Новые факультативпо-хемолитотрофпые бактерии, восстанавливающие ванадат // Микробиология. Т.59. С.968-975.

61. Abd-el-Malek Y. and Rizk S.G. 1963a. Bacterial sulfate reduction and the development of alkalinity. I. Experiments with synthetic media II J. Appl. Bacteriol. V.26. P.7-13.

62. Abd-el-Malek Y. and Rizk S.G. 1963b. Bacterial sulfate reduction and the development of alkalinity. II. Laboratory experiments with soils // J. Appl. Bacterid. V.26. P. 14-19.

63. Abd-el-Malek Y. and Rizk S.G. 1963c. Bacterial sulfate reduction and the development of alkalinity. III. Experiments under natural conditions // J. Appl. Bacteriol. V.26. P.20-26.

64. Afshar S., Kim C., Monbouquette H.G., Schroder I. 1998. Effect of tungstate on nitrate reduction by hypertermophilic archaeon Pyrobaculum aerophilum И Syst. Appl. Microbiol. V.64. P.3004—3008.

65. Antipov A.N., Lyalikova N.N., Khijniak T.V., L'vov N.P. 1998. Molybdenum-free nitrate reductases from vanadate-reducing bacteria // FEBS Lett. V.441. P.257-260.

66. Antipov A.N., Lyalikova N.N., Khijniak T.V., L'vov N.P. 2000. Vanadate reduction by molybdenum-free nitrate reductases from vanadate-reducing bacteria // IUBMB Life. V.50. P.39-42.

67. Antipov A.N., Sorokin D.Yu., L'vov N.P., Kuenen J.G. 2003. New enzyme belonging to the family of molybdenum-free nitrate reductases // Biochem. J. V.369. V. 185-189.

68. Arahal D.R., Castillo A.M., Ludwig W., Schleifer K.H., Ventosa A. 2002a. Proposal of Cobetia marina gen. nov., comb. nov. within the family Halomonadaceae, to include the species Halomonas marina II System. Appl. Microbiol. V.25. P.207-211.

69. Arahal D.R., Ludwig W., Schleifer K.H., Ventosa A. 2002b. Phylogeny of the family Halomonadaceae based on 23S and 16S rDNA sequence analyses // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V.52. P.241-249.

70. Avazeri C., Turner R.J., Pommier J., Weiner J.H., Giordano G., Vermeglio A. 1997. Tellurite reductase activity of nitrate reductase is responsible for the basal resistance of E coli to tellurite // Microbiology. V.143. P.l 181-1189.

71. Barnes I., O'Neil J.R., Trescares J.J. 1978. Present day serpentization in New Caledonia, Oman and Yugoslavia// Geochim. Cosmochim. Acta. V.42. P.144-145.

72. Baumann L., Bowditch R.D., Baumann P. 1983. Description of Deleya gen. nov. created to accommodate the marine species Alcaligenes aestus, A. pacificus, A. cupidus, A. venustus, and Pseiulomonas marina II Int. J. Syst. Bacteriol. V.33. P.793-802.

73. Baumgarte S. 2003. Microbial diversity of soda lake habitats // Doctoral thesis. Carolo-Wilhelmina Universitat, Braunshweig, Germany.

74. Bergmeyer H.U., 1963. Methods of enzymatic analysis. New York: Academic Press. 1064 P

75. Berendes F., Gottschalk G., Heine-Dobbernack E., Moore E.R.B., Tindall B.J. 1996. Halomonas desiderata sp. nov., a new alkaliphilic, halotolerant and denitrifying bacterium isolated from a municipal sewage works // Syst. Appl. Microbiol. V.19. 158-167.

76. Berks B.C., Ferguson S.J., Moir J.W.B., Richardson D.J. 1995. Enzymes and associated electron transport systems that catalyse the respiratory reduction of nitrogen oxides and oxyanions // Biochim. Biophys, Acta. V.1232. P.97-173.

77. Bickel-Sandkotter S. and Ufer M. 1995. Properties of a dissimilatory nitrate reductase from the halophilic archaeon Haloferax volcanii IIZ. Naturforsh. V.50c. P.365-372.

78. Blasco R., Castillo F., Martinez-Luque M. 1997. The assimilatory nitrate reductase from the phototrophic bacterium, Rhodobacter capsidatus E1F1, is a flavoprotein // FEBS Lett. V.414. P45-49.

79. Bluemle S. and.Zumft W.G. 1991. Respiratory nitrate reductase from denitrifying Pseudomonas stutzeri: purification, properties, and target proteolysis // Biochim. Biophys. Acta. V.1057. P. 102-108.

80. Bonin P. 1996. Anaerobic nitrate reduction to ammonium in two strains from coastal marine sediment: a dissimilatory pathway // FEMS Microbiol. Ecol. V. 19. P. 27-38.

81. Brewer P.G. and Goldman J.C. 1976. Alkalinity changes generated by phytoplankton growth // Limnol. Oceanogr. V.21. P. 108-117.

82. Bryantseva I.A., Gorlenko V.M., Kompantseva E.I., Imhoff J.F. 2000a. Thioalkalicoccus limnaeus gen. nov., sp. nov., a new alkaliphilic purple sulfur bacterium with bacteriochlorophyll b // Int. J. Syst. Bacterid. V.50. P.2157-2163.

83. Bryantseva I.A., Gorlenko V.M., Kompantseva E.I., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Osipov G.A. 2000b. Alkaliphilic heliobacterium Heliorestis bacuolata sp. nov. and emended description of the genus Heliorestis II Arch. Microbiol. V.174. P.283-291.

84. Bylund J.E., Dyer J.K., Thompson T.L., Martin E.L. 1991. Alanine dehydrogenase activity of the extensively halotolerant eubacterium Halomonas elongata II Microbios. V.66. P.45-53.

85. Campbell W.H. 1999. Nitrate reductase structure, function and regulation: bridging the gap between biochemistry and physiology // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V.50. P.277-303.

86. Canovas D., Vargas C., Csonka L.N., Ventosa A., Nieto J.J. 1996. Osmoprotectants in Halomonas elongata: high-affinity betaine transport system and choline-betaine pathway // J. Bacterid. V.178. P.7221-7226.

87. Caskey W.H., Tiedje J.M. 1980. The reduction of nitrate to ammonium by Clostridium sp. isolated from soil //J. Gen. Microbiol. V. 119. P. 217-223.

88. Chauret C. and Knowles R. 1991. Effect of tungsten on nitrate and nitrite reductases in Azospirillwn brasilense Sp. 7 // Can. J. Microbiol. V.37. P.744-750.

89. Deng M., Moureaux Т., Caboshe M. 1989. Tungstate, a molybdate analog inactivating nitrate reductase, deregulates the expression of the nitrate reductase structural gene // Plat. Physiol. V.91. P.304-309.

90. Dennis P.P. and Shimmin L.C. 1997. Evolutionary divergence and salinity-mediated selection in halophilic archaea // Microbiol. Mol. Biol. Rev. V.61. P. 90-104.

91. Desmarais D., Jablonski P.E., Fedarko N.S., Roberts M.F. 1997. 2-Sulfotrehalose, a novel osmolyte in haloalkaliphilic archaea // J. Bacteriol. V.179. P.3146-3153.

92. Duckworth A.W., Grant S., Grant W.D., Jones B.E., Meijer D. 1998. Dietzia natronolimnaios sp. nov., a new member of the genus Dietzia isolated from an east African soda lake // Extremophiles. V.2. P.359-366.

93. Duckworth A.W., Grant W.D., Jones B.E., Meijer D., Marquez M.C., Ventosa A. 2000. Halomonas magadii sp. nov., a new member of the genus Halomonas, isolated from a soda lake of the East African Rift Valley // Extremophiles. V.4. P.53-60.

94. Duckworth A.W., Grant W.D., Jones B.E., van Steenbergen R. 1996. Phylogenetic diversity of soda lake alkaliphiles // FEMS Microbiol. Ecol. V.19. P.181-191.

95. Eugster H.P. 1970. Chemistry and origin of the brines of lake Magadi, Kenya // Mineral. Soc. Am. Special publication 3. P.215-235.

96. Eugster H.P. and Hardie L.A. 1978. Saline lakes // Lakes: chemistry, geology and physics / Ed. A. Lermann. Springer-Verlag, New York. P.237-293.

97. Fagerbakke K.M., Norland S., Heldal M. 1999. The inorganic content of native aquatic bacteria // Can. J. Microbiol. V.45. P. 304-311.

98. Franzmann P.D., Wehmeyer U., Stakebrandt E. 1988. Halomonadaceae fam. nov., a new family of the class Proteobacteria to accommodate the genera Halomonas and Deleya H System. Appl. Microbiol. V.l 1. P. 16-19.

99. Galinski E.A. Salzadaptation durch compatible Solutes bei halophilen phititrphen Bakterien // Dissertation. 1986 (цитировано no: Galinski and Triiper, 1994).

100. Galinski E.A. and Triiper H.G. 1994. Microbial behaviour in salt-stressed ecosystems // FEMS Microbiol. Rev. V.15. P.95-108.

101. Galinski E.A., Pfeiffer H.-P., Triiper H.G. 1985. l,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid a novel cyclic amino acid from halophilic phototrophic bacteria of the genus Ectothiorhodospira II Eur. J. Biochem. V.l 49. P. 135-139.

102. Gandbhir M., Rashed I., Marliere P., Mutzel R. 1995. Convergent evolution of amino acid usage in archaebacterial and eubacterial lineages adapted to high salt // Res. Microbiol. V.l46. P. 113-120.

103. Garnova E.S., Zhilina T.N., Tourova T.P., Lysenko A.M. 2003b. Anoxynatronum sibiricum gen. nov., sp.nov. alkaliphilic saccharolytic anaerobe from cellulosolytic community of Nizhnee Beloe (Transbaikal region) // Extremophiles. V.7. P. 213-220.

104. Gorny N., Wahl G., Brune A., Schink B. 1992. A strictly anaerobic nitrate-reducing bacterium growing with resorcinol and other aromatic compounds // Arch. Microbiol. V.158. P.48-53.

105. Grant W.D. Alkaliphiles // Microbiology of extreme environments and its potential for biotechnology / eds. M.S. Da Costa et al. FEMS Symposium №49, 1989.

106. Grant W.D. and Jones B.E. 2000. Alkaline environments // Encyclopedia of Microbiology. V.l. P.126-133.

107. Grant W.D., Mwatha W.E., Jones B.E. Alkaliphiles: ecology, diversity and applications // FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 75. P. 255-270.

108. Grant W.D. and Ross H.N.M. 1986. The ecology and taxonomy of halobacteria // FEMS Microbiol. Rew. V.39. P.9-15.

109. Grant W.D. and Tindall B.J. 1986. Alkaline saline environments // Microbes in extreme environments / Eds. Herbert R.A. and Codd G.A., Academic Press, London. P.22-54.

110. Groth I., Schumann P., Rainey F.A., Martin K., Schuetze В., Augsten K. 1997. Bogoriella caseilytica gen. nov., sp.nov. a new alkaliphilic actinomycete from a soda lake in Africa // Int. J. Syst. Bacterid. V.47. P.788-794.

111. Hanson R.S. and Hanson Т.Е. 1996. Methanotrophic bacteria // Microbiol. Rev. V.60. P.439-471.

112. Hochstein L.I. and Lang F. 1991. Purification and properties of a dissimilatory nitrate reductase from Haloferax clenitrificans II Arch. Biochem. Biophys. V.288. P.380-385.

113. Hochstein L.I. and Tomlinson G.A. 1985. Denitrification by extremely halophilic bacteria //FEMS Microbiol. Lett. V.27. P.329-331.

114. Hocking A.D. and Norton R.S. 1983. Natural-abundance 13C nuclear magnetic resonance studies on the internal solutes of xerophilic fungi // J. Gen. Microbiol. V.129. P.2915-2925.

115. Horikoshi K. 1996. Alkaliphiles from an industrial point of view // FEMS Microbiol. Rev. V.18. P.259-270.

116. Horikoshi K. 1999. Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology // Microbiol. Mol. Biol. Rev. V.63. P.735-750.

117. Imhoff J.F. 1986. Survival strategies of microorganisms in extreme saline environments // Adv. Space Res. V.6. P.299-306.

118. Ito S., Kobayashi Т., Ara K., Ozaki K., Kawai Sh., Hatada Y. 1998. Alkaline detergent enzymes from alkaliphiles: enzymatic properties, genetics and structure // Extremophiles. V.2. P. 185-190.

119. Javor B. 1989. Hypersaline environments: microbiology and biogeochemistry. Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo. 328 pp.

120. Jetten M.C., Sliekers O., Kuypers M. and 24 other authors. 2003. Anaerobic ammonium oxidation by marine and freshwater planctomycete-like bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. V.63. P. 107-114.

121. Jetten M.S., Strous M., van de Pas-Schoonen K.T., Schalk J., van Dongen U.G., van de Graaf A.A., Logemann S., Muyzer G., van Loosdrecht M.C., Kuenen J.G. 1998. The anaerobic oxidation of ammonium // FEMS Microbiol. Rev. V.22. P.421-437.

122. Jones B.F., Eugster H.P., Rettig S.L. 1977. Hydrochemistry of the lake Magadi basin, Kenya // Geochim. Cosmochim. Acta. V.41. P.53-72.

123. Jones B.E. and Grant W.D. 2000. Microbial diversity and ecology of alkaline environments // In: Journey to diverse microbial worlds / Ed. J. Seckbach. Kluwer Academic Publishers, Netherlands. P. 179-190.

124. Jones B.E., Grant W.D., Collins N.C., Mwatha W.E. 1994. Alkaliphiles: diversity and identification // Bacterial diversity and systematics / eds. F.G. Priest et al. Plenum Press, New York. P. 195-230.

125. Jones B.E., Grant W.D., Duckworth A.W., Owenson G.G. 1998. Microbial diversity of soda lakes // Extremophiles. V.2. P.l91-200.

126. Kamekura M. 1986. Production and function of enzymes of eubacterial halophiles // FEMS Microbiol. Rev. V.39 P.145-150.

127. Kempe S. and Degens E.T. 1985. An early soda ocean? // Chem. Geol. V.53. P.95-108.

128. Kempf B. and Bremer E. 1998. Uptake and synthesis of compatible solutes as microbial stress responses to high-osmolality environments // Arch. Microbiol. V.170. P.319-330.

129. Kevbrin V.V., Zhilina T.N., Rainey F.A., Zavarzin G.A. 1998. Tindallia magadii gen. nov., sp. nov.: an alkaliphilic anaerobic ammonifier from soda lake deposits // Curr. Microbiol. V.37. P.94-100.

130. Khijniak T.V., Medvedeva-Lyalikova N.N., Simonoff M. 2003. Reduction of pertechnetate by haloalkaliphilic strains of Halomonas IIFEMS Microbiol. Ecol. V.44. P. 109-115.

131. Khmelenina V.N., Kalyuzhnaya M.G., Starostina N.G., Suzina N.E., Trotsenko Y.A. 1997. Isolation and characterization of halotolerant alkalophilic methanotrophic bacteria from Tuva soda lakes // Curr. Microbiol. V.35. P.257-261.

132. Kildibekov N.A., Omarov R.T., Antipov A.N., Shvctsov A.A., Mironov E.A. and L'vov N.P. 1996. Purification of a molybdocofactor-containing protein from pea seeds and identification of molybdopterin // Plant Physiol. Biochem. V.3. P.677-682.

133. Kletzin A. and Adams M.W.W. 1996. Tungsten in biological systems // FEMS Microbiol. Rev. V.18. P.5-63.

134. Knowles R. 1996. Denitrification: microbiology and ecology. // Life Support Biosph. Sci. V.3. P.31-34.

135. Knowles R. 2000. Nitrogen cyclc // Encyclopedia of Microbiology. V.3. P.379-391.

136. Kobayashi M., Matsuo Y., Takimoto A., Suzuki S., Maruo F., Shoun H. 1996. Denitrification, a novel type of respiratory metabolism in fungal mitochondrion // J. Biol. Chem. V.271. P. 16263-16267.

137. Kotsyurbenko O.R., Simankova M.V., Nozhevnikova A.N., Zhilina T.N., Bolotina N.P., Lysenko A.M., Osipov G.A. 1995. New species of psychrophilic acetogens:

138. Acetobacterium bakii sp. nov., A. paludosum sp. nov., A. fimetarium sp. nov. // Arch. Microbiol. V.163. P.29-34.

139. Kraegeloh A. and Kunte H.J. 2002. Novel insights into the role of potassium for osmoregulation in Halomonas elongata II Extremophiles. V.6. P.453-462.

140. Krulwich T.A. and Guffanti A.A. 1989. Alkalophilic bacteria // Annu. Rev. Microbiol. V.43. P.435-463.

141. Krulwich T.A. Ito M., Gilmour R., Hicks D.B., Guffanti A.A. 1998. Energetics of alkaliphilic Bacillus species: physiology and molecules // Adv. Microb. Physiol. V.40. P.401-438.

142. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T 4 // Nature. V.227. P.680-685.

143. Langworthy T.A. 1978. Microbial life in extreme pH values. // In: Microbial life in extreme environments / Ed. D.J. Kushner. Academic Press, London and New York. P.279-317.

144. Lanyi J.K. 1974. Salt dependent properties of proteins from extremely halophilic bacteria // Bacteriol. Rev. V.38. P.272-290.

145. Lensi R., Beaupied H., Mouroud A. 1990. Denitrifying activity in the actinorhizae. Acta Oecol. V.ll. P391-398.

146. Lin J.T. and Stewart V. 1998. Nitrate assimilation by bacteria // Adv. Microb. Physiol. V.39. P. 1-30.

147. Lippert K. and Galinski E.A. 1992. Enzyme stabilization by ectoine-type compatible solutes: protection against heating, freezing and drying // Appl. Microbiol. Biotechnol. V.37. P.61-65.

148. Liu Y., Boone D.R., Choy C. 1990. Methanohalophilus oregonese sp. nov., a methylotrophic methanogen from an alkaline, saline aquifer // Int. J. Syst. Bacteriol. V.40. P.lll-116.

149. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. 1951. Protein measurement with Folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. V. 193. P.265-275.

150. Ma Y., Zhang W., Xue Y., Zhou P., Ventosa A., Grant W.D. 2004. Bacterial diversity of the Inner Mongolian Baer Soda Lake as revealed by 16S rRNA gene sequence analyses // Extremophiles. V.8. P.45-51.

151. Madern D., Ebel C., Zaccai G. 2000. Halophilic adaptation of enzymes // Extremophiles. V.4. P.91-98.

152. Madern D., Pfister C., Zaccai G. 1995. A single acidic amino acid mutation enhances the halophilic behaviour of malate dehydrogenase from Haloarcula marismortui II Eur. J. Biochem. V.230. P. 1088-1095.

153. Madigan M.T. 2003. Anoxygenic phototrophic bacteria from extreme environments // Photosynth. Res. V.76. P. 157-171.

154. Mancinelli R.L. and Hochstein L.I., 1986. The occurrence of denitrification in extremely halophilic bacteria// FEMS Microbiol. Lett. V.35. P.55-58.

155. Martin D.D., Ciulla R.A., Roberts M.F. 1999. Osmoadaptation in archea // Appl. Environ. Microbiol. V.65. P.1815-1825.

156. Martin D.D., Ciulla R.A., Robinson P.M., Roberts M.F. 2001. Switching osmolyte strategies: response of Methanococcus thermolithotrophicus to changes in external NaCl // Biochim. Biophys. Acta. V.1524. P.1-10.

157. Martins L.O., Huber R., Huber H., Stetter K.O., da Costa M.S., Santos H. 1997. Organic solutes in hyperthermophilic archaea // Appl. Environ. Microbiol. V.63. P.896-902.

158. Martinez-Canovas M.J., Quesada E., Llamas I., Bejar V. 2004. Halomonas ventosae sp. nov., a moderately halophilic, denitrifying, exopolysaccharide-producing bacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V.54. P.733-737.

159. Mata J.A., Martinez-Canovas J., Quesada E., Bejar V. 2002. A detailed phenotypic characterization of the type strains of Halomonas species // System. Appl. Microbiol. V.25. P.360-375.

160. Mathrani I.M., Boone D.R., Mah R.A. Fox G.F., Lau P.P. 1988. Methanohalophihis zhilinae sp. nov., an alkaliphilic, halophilic methylotrophic methanogen // Int. J. Syst. Bacteriol. V.38. P.139-142.

161. Melack J.M. and Kilham P. 1974. Photosynthetic rates of phytoplankton in East African alkaline, saline lakes// Limnol. Oceanogr. V.19. P.743-755.

162. Mojica F.J.M., Cisneros E., Ferrer C., Rodriges-valera F., Juez G. 1997. Osmotically induced response in representatives of halophilic prokaryotes: the bacterium Halomonas elongata and archeon Haloferax volcanii II J. Bacteriol. V.179. P.5471-5481.

163. Moreno-Vivian С., Cabello P., Martinez-Luque M., Blasco R., Castillo F. 1999. Prokaryotic nitrate reduction: molecular properties and functional distinction among bacterial nitrate reductases // J. Bacteriol. V.l81. P.6573-6584.

164. Mormile M.R., Romine M.F., Garcia M.T., Ventosa A., Bailey T.J., Peyton B.M. 1999. Halomonas campisalis sp. nov., a denitrifying, moderately haloalkaliphilic bacterium // System. Appl. Microbiol. V.22. P.551-558.

165. Mulder A., van de Graaf A.A., Robertson L.A., Kuenen J.G. 1995. Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor // FEMS Microbiol. Ecol. V.l6. V.l 77-184.

166. Nason A., Antoine A.D., Ketchum P.A., Frazier W.A., Lee D.K. 1970. Formation of assimilatory nitrate reductase by in vitro inter cistronic complementation in Neurospora crassa II Proc. Natl. Acad. Sci. V.65. P.137-144.

167. Nesterenko M.V., Tilley M., Upton S.J. 1994. A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in polyacrylamide gels // J. Biochim. Biol. V.28. P.231-242.

168. Notton B.A. and Hewitt E.J. 1972. Comparative aspects of incorporation of vanadium, tungsten or molybdenum into protein of nitrate reductase of Spinacea oleracea L. leaves // Biochim. Biophys. Acta. V.275. P.355-357.

169. Ollivier В., Caumette P., Garsia J.-L., Max R.A. 1994. Anaerobic bacteria from hypersaline environments // Micribiol. Rev. V.58. P.27-38.

170. Oremland R.S. and Boone D.R. 1994. Methanolobus tailorii sp. nov., a new methylotrophic, eustuarine methanogen // Int. J. Syst. Bacteriol. V.44. P.573-575.

171. Oremland R.S. and King G.H. 1989. Methanogenes in hypersaline environments // In: Microbial mats: physiological ecology of benthic microbial communities / Eds. Y. Cohen, E. Rosenberg. AM Soc. Microbiol., Washington. P.180-190.

172. Oren A. 1999. Bioenergetic aspects of halophilism // Microbiol. Mol. Biol. Rev. V.63. P.334-348.

173. Oren A. 2002. Diversity of halophilic microorganisms: environments, phylogeny, physiology and applications // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. V.28. P.56-63.

174. Oren A. and Mana L. 2002. Amino acid composition of bulk protein and salt relationships of selected enzymes of Salinibacter ruber, an extremely halophilic bacterium // Extremophiles. V.6. P.217-223.

175. Oren A., 1986. The ecology and taxonomy of anaerobic halophilic eubacteria // FEMS Microbiol. Rev. V.39. P.23-29.

176. Oren A., 2001. The bioenergetic basis for the decrease in metabolic diversity at increasing salt concentrations: implications for functioning of salt lake ecosystems // Hydrobiologia. V.466. P.61-72.

177. Oren A., Heldal M., Norland S., Galinski E.A. 2002. Intracellular ion and organic solute concentrations of the extremely halophilic bacterium Salinibacter ruber II Extremophiles. V.6. P.491-498.

178. Ornstein L. 1964. Disc electrophoresis-I: Background and theory. // Ann. N.Y. Acad. Sci. V.121. P.321-349.

179. Payne W.J. 1981. Denitrification. John Wiley & Sons, Inc, New York. 214 p.

180. Pepi M., Cesaro A., Liut G., Baldi F. 2005. An antarctic psychrotrophic bacterium Halomonas sp. ANT-3b, growing on /г-hexadecane, producing a new emulsyfying glycolipid // FEMS Microbiol. Ecol. V.53. P. 157-166.

181. Peters P., Galinski E.A., Triiper H.G. 1990. The biosynthesis of ectoine // FEMS Microbiol. Lett. V.71. P. 157-162.202.203.204.205.206.207.208.209,210211,212213214215

182. Poolman B. and Glaasker E. 1998. Regulation of compatible solute accumulation in bacteria // Mol. Microbiol. V.29. P.397-407.

183. Potter L., Angove H., Richardson D., Cole J. 2001. Nitrate reduction in the periplasm of gram-negative bacteria// Adv. Microb. Physiol. V.45. P.51-112.

184. Richardson D.J. 2000. Bacterial respiration: a flexible process for a changing environment //Microbiology. V.146. P.551-571.

185. Richardson D.J. and Watmough N.J. 1999. Inorganic nitrogen metabolism in bacteria // Curr. Opin. Chem. Biol. V.3 .P.207-219.

186. Richardson D.J. and Ferguson S.J. 1992. The influence of carbon substrate on the activity of the periplasmic nitrate reductase in Thiospaera pantotropha II Arch. Microbiol. V.157. P.535-537.

187. Richardson D.J. and Watmough N.J. 1999. Inorganic nitrogen metabolism in bacteria // Curr. Opin. Chem. Biol. V.3. P. 207-219.

188. Richardson D.J., Berks B.C., Russell D.A., Spiro S., Taylor C.J. 2001. Functional, biochemical and genetic diversity of prokaryotic nitrate reductases // Cell. Mol. Life Sci. V.58. P.165-178.

189. Roepier M. and Miiller V. 2001. Osmoadaptation in bacteria and archaea: common principles and differences // Environ. Microbiol. V.3. P.743-754.

190. Sadler M., McAninch M., Alico R., Hochstein L.I. 1980. The intracellular Na+ and K+ composition of the moderately halophilic bacterium, Paracoccus haloilenitrificans II Can. J. Microbiol. V.26. P.496-502.

191. Salvarrey M.S. and Cazzulo J.J. 1980. Some properties of the NADP-specific malic enzyme from the moderate halophile Vibrio costicola II Can. J. Microbiol. V.26. P.50-57.

192. Severin J., Wohlfarth A., Galinski E.A. 1992. The predominant role of recently discovered tetrahydropyrimidines for the osmoadaptation of halophilic eubacteria // J. Gen. Microbiol. V.138. P. 1629-1638.

193. Shapleigh J.P. 2000. The denitrifying prokaryotes // The Prokaryotes. A handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, identification, applications / Eds. Dworkin M. et al. 3rd ed. Springer-Verlag, New-York (electronic publication).

194. Sharp R.J. and Munster M.J. 1986. Biotechnological implications for microorganisms from extreme environments // Microbes in extreme environments / Eds. Herbert R.A. and Codd G.A., Academic Press, London. P. 215-295.

195. Singh H.M., Chakravarty D., Srinivasa Rao. K., Sing A.K. 1993. Vanadium requirement for growth on N2 or nitrate as nitrogen source in a tungsten-resistant mutant of the cyanobacterium Nostoc muscorum II J. Basic. Microbiol. V. 33. P. 201-205.

196. Singh S., Chakravarty, D., Singh H.M. 1993. Mutational replacement of molybdenum by vanadium in assimilation of N2 or NO3" as nitrogen source in the cyanobacterium Nostoc muscorum II Biochem. Mol. Biol. Int. V. 29. P. 1083-1093.

197. Smith M.S. and Zimmerman K. 1981. Nitrous oxide production by non-denitrifying soil nitrate reducers // Soil Sci. Am. J. V. 45. P. 865-871.

198. Sorokin D.Yu., Antipov A.N., Kuenen J.G. 2003a. Complete denitrification in coculture of obligately chemolithoautotrophic haloalkaliphilic sulfur-oxidizing bacteria from a hypersaline soda lake // Arch. Microbiol. V.180. P.127-133.

199. Sorokin D.Yu., Gorlenko V.M., Namsaraev B.B., Namsaraev Z.B., Lysenko A.M., Eshinimaev B.Ts., Khmelenina V.N., Trorsenko Yu.A., Kuenen J.G. 2004a. Prokaryotic communities of the north-eastern Mongolian lakes // Hydrobiologia. V.522. P.235-248.

200. Sorokin D.Yu., Jones B.E., Kuenen J.G. 2000a. Obligate methylotrophic, methane-oxidizing Methylomicrobium species from a highly alkaline environment // Extremophiles. V.4. P.145-155.

201. Sorokin D.Yu. and Kuenen J.G. 2005. Chemolithotrophic haloalkaliphiles from soda lakes // FEMS Microbiol. Ecol. V.52. P.287-295.

202. Sorokin D.Yu., Kuenen J.G., Jetten M.S.M. 2001a. Denitrification at extremely high pH values by alkaliphilic, obligately chemolithoautotrophic, sulfur-oxidizing bacterium Thioalkalivibrio denitrificans strain ALJD // Arch. Microbiol. V.175. P.94-101.

203. Sorokin D.Yu., Muyzer G., Brinkhoff Т., Kuenen J.G., Jetten M.S.M. 1998. Isolation and characterisation of a novel facultatively alkaliphilic Nitrobacter species, Nb. alcalicus sp.nov. // Arch. Microbiol. V.170. P.342-350.

204. Sorokin D.Yu., Tourova T.P., Kolganova T.V., Sjollema K.A., Kuenen J.G. 2002b. Thioalkalispira microaerophila gen. nov., sp. nov., a novel lithoauthotrophic, sulfur-oxidizing bacterium from a soda lake // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V.52. P.l -8.

205. Sorokin D.Yu., Tourova T.P., Kuenen J.G. 2000c. A new facultatively autotrophic hydrogen- and sulfur-oxidizing bacterium from an alkaline environment // Extremophiles. V.4. P.237-245.

206. Sowers K.R., Robertson D.E., Noll D., Gunsalus R.P., Roberts M.F. 1990. Ne-acetil-p-lysine: an osmolyte synthesized by methanogenic archebacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. V.87. P.9083-9087.

207. Stetter K.O. 1996. Hyperthermophilic prokaryotes // FEMS Microbiol. Rev. V.18. P.149-158.

208. Stolz J.F. and Basu P. 2002. Evolution of nitrate reductase: molecular and structuralvariations on a common function // ChemBioChem. V.3. P. 198-206.

209. Stouthamer A.H. 1988. Dissimilatory reduction of oxidized nitrogen compounds // Biologyof anaerobic microorganisms / Ed. Zehnder A.J.B. John Wiley, NY. P. 179 244.

210. Straub K.L., Benz M., Schink В., Widdel F. 1996. Anaerobic, nitrate-dependent microbialoxidation of ferrous iron // Appl. Environ. Microbiol. V.62. P. 1458-1460.

211. Strous M., Kuenen J.G., Jetten M.C. 1999. Key physiology of anaerobic ammoniumoxidation // Appl. Environ. Microbiol. V.65. P.3248-3250.

212. Thamdrup B. and Dalsgaard T. 2002. Production of N2 through anaerobic ammonium oxidation coupled to nitrate reduction in marine sediments // Appl. Environ. Microbiol. V.68. P. 1312—1318.

213. Tiemey T. 1997. Geology of the Mono Basin // Kutsavi Press, Mono Lake Committee, Lee Vining, California, p. 1-73.

214. Tindall B. 1988. Prokaryotic life in alkaline, saline, athalassic environment // Halophilic bacteria / ed. F. Rodriguez-Valera. CRC Press. P.31-67.

215. Trotsenko Yu.A. and Khmelenina V.N. 2002. Biology of extremophilic and extremotolerant methanotrophs // Arch. Microbiol. V.177. P. 123-131.

216. Valderrama M.J., Monteoliva-Sanchez M., Quesada E., Ramos-Cormenzana A. 1998. Influence of salt concentration on the cellular fatty acid composition of the moderately halophilic bacterium Halomonas salina // Researh Microbiol. V.149. P.675-679.

217. Ventosa A., Marquez M.C., Garabito M.J., Arahal D.R. 1998a. Moderately halophilic gram-positive bacterial diversity in hypersaline environments // Extremophiles. V.2. P.297-304.

218. Ventosa A., Nieto J.J., Oren A. 1998b. Biology of aerobic moderately halophilic bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. V.62. P.504-544.

219. Volkl P., Huber R., Drobner E., Rachel R., Burggraf S., Trincone A., Stetter K.O. 1993. Pyrobaculum aerophilum sp. nov., a novel nitrate-reducing hyperthermophilic archeum // Appl. Environ. Microbiol. V.59. P.2918-2926.

220. Vreeland R.H. 1987. Mechanisms of halotolerance in microorganisms // Crit. Rev. Microbiol. V.14. P.311-356.

221. Vreeland R.H. 1992. The family Halomonadaceae / The Prokaryotes: a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, identification, applications / Eds. Ballows A. et al, 2nd ed. Springer-Verlag, New-York. P.3181-3188.

222. Vreeland R.H., Anderson R., Murray R.G.E. 1984. Cell wall and phospholipid composition and their contribution to the salt tolerance of Halomonas elongata II J. Bacterid. V.160. P.879-883.

223. Vreeland R.H., Litchfield C.D., Martin E.L., Elliot E. 1980. Halomonas elongata, a new genus and species of extremely salt-tolerant bacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. V.30. P.485-495.

224. Vreeland R.H., Mierau B.D., Litchfield C.D., Martin E.L. Relationship of the internal solute composition to the salt tolerance of Halomonas elongata II Can. J. Microbiol. 1983. V.29. P.407—414.

225. Ward B.B., Martinko D.P., Diaz M.C., Joye S.B. 2000. Analysis of ammonia-oxidizing bacteria from hypersaline Mono Lake, California, on the basis of 16S rRNA sequences // Appl. Environ. Microbiol. V.66. P.2873-2881.

226. Ward B.B. and Priscu J.C. 1997. Detection and characterization of denitrifying bacteria from a permanently ice-covered Antarctic lake // Hydrobiologia. V. 347. P.57-68.

227. Wayne L.G., Brenner B.J., Colwell P.R., Grimont P.A.D., Kandler O., Krichevsky M.T., Moore L.H., Myrrey R.C.E., Stakebrandt E., Starr M.P., Triiper H.G. 1987. Report of the

228. AD Hoc Committee on recommendation of approaches to bacterial systematics // Int. J. Syst. Bacteriol. V.37. P.463-464.

229. Wegmann K. 1986. Osmoregulation in eukaryotic algae// FEMS Microbiol. Rev. V.39. P.37-43.

230. Werber M.M., Sussman J.L., Eisenberg H. 1986. Molecular basis for the special properties of proteins and enzymes from Halobacterium marismortui II FEMS Microbiol. Rev. V.39. P.129-135.

231. Wohlfarth A., Severin J., Galinski E.A. 1990. The spectrum of compatible solutes in heterotrophic halophilic eubacteria of the family Halomonaclaceae II J. Gen. Microbiol. V.l36. P.705-712.

232. Yamamoto I., Shimizu H., Tsuji Т., Ishimoto M. Purification and properties of nitrate reductase from Mitsuokella miiltiaciclus И J. Biochem. (Tokyo). V.99. P.961-969.

233. Yoon J.-H., Lee K.-C., Kho Y.H., Kang K.H., Kim C.-J., Park Y.-H. 2002. Halomonas alimentaria sp. nov., isolated from jeotgal, a traditional Korean fermented seafood // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V.52. P.123-130.

234. Zahran H.H. 1997. Diversity, adaptation and activity of the bacterial flora in saline : environments // Biol. Fertil. Soils. V.25. P.211-223.

235. Zavarzin G.A. and Zhilina T.N. 2000. Anaerobic chemotrophic alkaliphiles // In: Journey to diverse microbial worlds / Ed. J. Seckbach. Kluwer Academic Publishers, Netherlands. P.191-208.

236. Zhilina T.N. 1986. Methanogenic bacteria from hypersaline environments // System. Appl. Microbiol. V.7. P.216-222.

237. Zhilina T.N. and Zavarzin G.A. 1994. Alkaliphilic anaerobic community at pH 10 // Curr. Microbiol. V.29. P. 109-112.

238. Zhilina T.N., Zavarzin G.A., Detkova E.N., Rainey F.A. 1996a. Natroniella acetigena gen. nov., sp. nov., an extremely haloalkaliphilic, homoacetic bacterium: a new member of Haloanaerobiales // Curr. Microbiol. V.32. P.320-326.

239. Zumft W.G. 1997. Cell biology and molecular basis of denitrification // Microbiol. Mol. Biol. Rev. P. 533-616.