Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые экстремофильные анаэробные бактерии, восстанавливающие соединения серы и железа

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новые экстремофильные анаэробные бактерии, восстанавливающие соединения серы и железа"

9 15-3/131

На правах рукописи

РЫЖМАНОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА

НОВЫЕ ЭКСТРЕМОФИЛЬНЫЕ АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ, ВОССТАНАВЛИВАЮЩИЕ СОЕДИНЕНИЯ СЕРЫ И ЖЕЛЕЗА

Специальность: 03.02.03 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2015

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук

(ИБФМ РАН).

Научный руководитель: Щербакова Виктория Артуровна,

кандидат биологических наук, заведующая лабораторией анаэробных микроорганизмов ИБФМ РАН

Официальные оппоненты: Горлеико Владимир Михайлович,

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией экологии и геохимической деятельности микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук

Потехина Наталья Викторовна,

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биологически активных веществ кафедры микробиологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Ведущая организация: Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение высшего образования

«Национальный исследовательский Томский государственный университет»

Защита состоится «15» октября 2015 г. в 14 час на заседании Диссертационного совета

Д 002.121.01 при ИБФМ РАН по адресу:

142290, г. Пущино Московской области проспект Науки, д.5.

С диссертацией можпо ознакомиться в библиотеке ИБФМ РАН. Автореферат размещен на сайтах http://vak.ed.gov.ru и http://www.ibpm.ru

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.В. Кулаковская

Актуальность проблемы. К настоящему времени известным фактом ' я'е^йтс^ участие микроорганизмов в природных биогеохимических циклах. Анаэробные микроорганизмы принимают участие в процессах восстановления соединений переменновалентных элементов, к которым относятся сера и железо. Сульфатвосстанавливающие прокариоты - это обширная группа микроорганизмов, объединяющая археи и бактерии, представители которой способны, кроме соединений серы, восстанавливать соединения железа, марганца, мышьяка, хрома и других элементов. Сульфатредукторы населяют различные экосистемы и хорошо адаптированы к экстремальным условиям существования.

Несмотря на общепринятое представление о низких скоростях биохимических реакций, идущих при пониженных температурах, глобальный вклад низкотемпературных микробных сообществ может быть значительным, учитывая масштабы занимаемых ими территорий. В последнее время интерес к микроорганизмам холодных экосистем активизировался еще и в связи с угрозой глобального потепления, в случае которого огромное количество захороненного органического вещества окажется вновь вовлеченным в биогеохимические циклы с участием присутствующей микрофлоры. Все перечисленные факторы обусловили активное развитие относительно новой области микробиологии -исследования холодоустойчивых микроорганизмов и микробных сообществ (Cowan et al., 2002; Deming, 2002; Priscu et al., 2004; Rivkina et al., 2004; Trotsenko et al., 2005; Steven et al.,

2006). Уникальной экологической нишей являются криопэги - закрытые водные системы морского происхождения, залегающие в мерзлых толщах возрастом 6-120 тысяч лет на глубине нескольких десятков метров в виде линз хлоридно-натриевых вод. характеризующиеся постоянной отрицательной температурой и высокой минерализацией (Gilichinsky et al., 2005). Как показали исследования последнего десятилетия, криопэги являются местом обитания психрофильных, психротрофных и гапофильных микроорганизмов. Арктические криопэги характеризуются высоким содержанием сульфата (0.62-3.84 г/л) и населены сульфатредукторами, которые осуществляют в них терминальную стадию разрушения органического вещества (Gilichinsky et al., 2003; Печерицына и др.,

2007). Однако на данный момент выделен и описан лишь один психроактивный сульфатредуктор из распресненного криопэга полуострова Варандей - Desul/ovibrio arclicus (Pecheritsyna et al., 2012). Исследования сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) криопэгов методами молекулярной биологии до настоящего времени не проводились.

Содовые озера распространены во внутриконтинентальных аридных районах и по своим характеристикам относятся к экстремальным системам из-за высокой минерализации (от 10 до 475 г/л) и рН (от 8.5 до II). Первые комплексные микробиологические исследования центрально-азиатских содовых озер были проведены в Кулундинской степи Б.Л. Исаченко в 30-х годах XX века (Исаченко, 1951). Исследования были возобновлены в 90-х годах во многом благодаря гипотезе Г А. Заварзина о том, что микробные сообщества внутриконтинентальных содовых водоемов могут рассматриваться как реликтовый аналог наземной биоты раннего протерозоя и, возможно, могли являться центрами микробного биоразнообразия (Заварзин, 1993; Заварзин и др., 1999; Zavarzin et al., 2000). В результате изучения этих экосистем, были выделены представители почти всех микроорганизмов, обеспечивающих замкнутость циклов основных биогенных элементов в содовых озерах. Описанию микрофлоры содовых водоемов как целостных экосистем посвящен ряд обзоров (Заварзин и др., 1999; Заварзина и др., 2012; Tindall, 1988; Grant et al., 2000; Zavarzin et al., 2000; Sorokin el al., 201 la, 2014a). Изучение разнообразия и распространения СВБ в соленых

и гиперсоленых содовых озерах Африки, Алтая и Северной Америки показало доминирование в них родов Desuljonatronovibrio, Desulfonatronum и Desulfonatronospira (Schölten et a)., 2005; Foti et al., 2007; Sorokin et al., 2010a; Sorokin et al., 2011a). Однако исследования биоразнообразия СВБ содовых озер Бурятии молекулярными методами до сих пор не проводились. Также до настоящего времени не было известно случаев описания алкалофильной железоредукции, осуществляемой сульфатвосстанавливающими бактериями.

В настоящее время изучение микроорганизмов экстремальных экосистем создает основы для новых биотехнологических разработок (Horikoshi, 1999; Podar et al., 2006; Cavicchioli et al., 2011; Zhang et al., 2011). Выделенные и охарактеризованные эксгремофильные и экстремотолерантные микроорганизмы представляют интерес как модели для изучения механизмов адаптации и способов стабилизации биомолекул и целых клеток при воздействии различных физико-химических факторов, в также являются возможными источниками получения криопротекторов и ферментов, стабильных в широком диапазоне pH, солености и температуры.

Цель данной работы - поиск, количественная оценка и идентификация анаэробных бактерий, способных использовать соединения серы и железа в качестве акцепторов электронов, в криопэгах полуострова Ямал и донных осадках содовых озер Соленое и Сульфатное (Южная Бурятия) с использованием микробиологических и молекулярно-биологических методов.

Задачи работы.

1. Оценка численности сульфатредукторов в криопэгах полуострова Ямал и донных осадках содовых озер Соленое и Сульфатное с помощью метода ПЦР "в реальном времени" (ПЦР-РВ).

2. Разработка праймеров для детекции алкапофильных сульфатредукторов рода Desulfonatronum в природных экосистемах.

3. Выделение новых экстремофильных анаэробных бактерий из содовых озер и криопэгов и их физиолого-биохимическая и филогенетическая характеристика.

4. Изучение способности новых изолятов алкалофильных сульфатредукторов восстанавливать Fe(III) в щелочных условиях.

Научная новизна работы. Впервые проведена оценка численности сульфатредукторов в двух экстремальных экосистемах - содовых озерах Соленое и Сульфатное (Южная Бурятия) и криопэгах полуострова Ямал - методом ПЦР-РВ. В результате численность СВБ в образцах донных осадков содовых озер составила 7.9*10''-2.4* 106 копий гена dsrAlг, а в воде криопэгов - 2.7*102-6.9*103 копий гена скгАВЫп.

Получены новые данные о видовом разнообразии и метаболическом потенциале сульфатвосстанавливающих бактерий содовых озер и криопэгов. Из арктического криопэга выделен новый психротолерантный галофильный сульфатредуктор, являющийся представителем нового вида 'Desulfovibrio algoritolerans' sp. nov., способный расти при отрицательных температурах и восстанавливать Fe(III). Из донных осадков содовых озер выделены и охарактеризованы три штамма галотолерантных алкалофильных СВБ. Описан новый вид алкалофильных сульфатредукторов Desulfonatronum buryatense sp. nov. Выделена и охарактеризована бактерия-спутник алкалофильных сульфатредукторов протеолитическая аммонифицирующая бактерия 'Anoxynatronum buryatense' sp. nov., характеризующаяся способностью восстанавливать соединения серы в процессе роста. Впервые у представителей алкалофильных сульфатредукторов обнаружена способность к восстановлению трехвалентного железа в условиях высокой щелочности среды.

Практическая значимость. Разработаны и экспериментально проверены новые пары праймеров на ген dsrA, являющийся маркерным для сульфатвосстанавливающих бактерий, и ген 16S рРНК сульфатредукторов рода Desulfonalronum, подходящие для использования в ПЦР "в реальном времени". Новый психротолерантный галофильный сульфатредуктор ' Desulfovibrio algoritolerans' K3ST может представлять интерес как источник холодоактивных ферментов, а также как компонент искусственно создаваемых сообществ, способных к биодеградации поллютантов в условиях холодного климата. Галоапкалофильные штаммы видов Desulfonalronum buryatense Ki5T и 'Anoxynatronum buryatense' Su22T также могут найти применение в системах биоремедиации, осуществляя удаление токсичных ионов металлов и серы из сточных вод с повышенными значениями солености и pH.

Апробация работы. Материалы работы представлены на российских и международных конференциях: "Биология - наука XXI века- 2009, 2013", на всероссийском симпозиуме с международным участием "Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов - 2009", на международной конференции "10lh European Workshop on Astrobiology EANA'2010", на международной конференции "The 5'hFEMS Congress of European Microbiologists - 2013", на 10-м международном конгрессе "Extremophiles 2014" (Санкт-Петербург, Россия).

Публикации. Материалы диссертации представлены в 8 печатных работах: 2 экспериментальных статьях и б тезисах.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и включает 22 рисунка и 15 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования и их обсуждение, выводов и списка литературы, который включает 230 наименований.

Место проведения работы и благодарности. Работа выполнена в лаборатории анаэробных микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН). Автор выражает искреннюю благодарность Щербаковой В. А. и всему коллективу лаборатории анаэробных микроорганизмов за практическую помощь, ценные советы и поддержку при написании диссертации. Особую благодарность хочется выразить к.б.н. Арискиной Е В. (ИБФМ РАН) за помощь в определении Г+Ц состава ДНК и проведении анализа ДНК-ДНК гибридизации; к.б.н. Сузиной Н Е. и к.б.н. Абашиной Т.Н. (ИБФМ РАН) за помощь в проведении микроскопических исследований; к.б.н. Автуху А Н. (ИБФМ РАН) за помощь в определении продуктов метаболизма; дб.н. Осипову Г А за определение жирнокислотного состава клеток; д.б.н. Сорокину ДЮ. (ИНМИ РАН) за предоставленные культуры СВБ; д.б.н., проф. Намсараеву Б.Б. (ИОЭБ СО РАН) за предоставленные образцы донных осадков содовых озер; к.г-м.н. Демидову Н.Э. (ИФХиБПП РАН) за предоставленные образцы воды ямальских криопэгов, а также д.б.н. Хмелениной В Н., к.б.н. Решетникову A.C. и дб.н. Троценко Ю.А. (ИБФМ РАН) за ценные советы при написании диссертации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования являлись 4 образца донных осадков содового озера Соленое (Селенгинский район, Бурятия) (глубина отбора проб 0-5, 15-17, 19-21 и 23-25 см) и 1

образец поверхностных донных осадков содового озера Сульфатное (Кяхтинский район, Бурятия) (глубина отбора пробы 0-5 см), полученные от дб.н., проф. Б. Б. Намсараева (ИОЭБ СО РАН), а также образцы воды трех криопзгов полуострова Ямал, предоставленные к.г-м.н. Н.Э. Демидовым (ИФХиБПП РАН). Гидрохимические характеристики воды озер Соленое, Сульфатное и криопэгов приведены в Таблицах 1 и 2.

Тяблнца 1. Гидрохимическая характеристика воды озер Сульфатное и Соленое

Озеро Т°С рн Eh, Соленость, Концентрация, мг/л

мВ г/л СОз1" HCOj S' SO,*

Сульфатное 22.1 9.1 +290 4.9 150.0 854.0 < 1 1400

Соленое 14.3 9.9 +380 14 360.0 2342.8 7.5 723.1

Таблица 2. Гидрохимическая характеристика воды криопэгов полуострова Ямал

Глубина Минерали- Иоиный состав В0ДЬ1'г/л

Криопэг Место отбора отбора, рн зация, Катионы Анионы

м г/л К* Na+ Са1+ Mgi+ НСОз er so4J"

1Y Бованенковское газовое 120 7.9 14.6 0.12 0.196 2.0 2.04 0.46 9.59 0.19

2Y месторождение Устье р. Ярояха 5 7.4 56.23 0.85 16.35 0.52 2.38 1.02 31.24 2.88

ЗУ Пойма р. Ярояха 12.5-20.0 7.5 77.16 0.41 22.68 1.04 3.79 1.71 47.22 0.31

Объектами исследования также служили чистые и накопительные культуры анаэробных бактерий, выделенные из образцов донных осадков содовых озер и воды криопэгов полуострова Ямал. Для сравнительных экспериментов использовали штаммы СВБ, полученные из коллекций ВКМ (Россия), DSMZ (Германия), а также любезно предоставленные д б.н. Д.Ю. Сорокиным (ИНМИ РАН). Рост СВБ оценивали по накоплению сульфида, рост штамма Su22T и A. sibiricum В-2327т - по оптической плотности при длине волны 600 нм.

Учет численности бактерий микробиологическими методами осуществляли методом прямого счета (МПС) по Разумову (1962) и методом предельных разведений. Чистоту культур проверяли прямым наблюдением клеток в световой микроскоп Axioslar PLUS (Carl Zeiss, Германия) с фазовым контрастом при увеличении 100*3.5, в также по отсутствию роста посторонней микрофлоры на основной среде с добавлением пептона (1.0 г/л) и глюкозы (2.0 г/л).

Морфологию клеток изучали с помощью светового микроскопа Axiostar PLUS (Carl Zeiss, Германия) при увеличении 100*3.5, а также на электронном микроскопе JEM-100B (Jeol, Япония). Электронно-микроскопические исследования ультратонких срезов, полученных на ультратоме LKB-3 (LKB, Швеция), проводили по методу Рейндольса (Reynolds, 1963). Культуральные свойства и физиологические особенности новых изолятов изучали по общепринятым методикам (Powell, 1983; Gerhardt, 1994).

Определение продуктов брожения и окисления (ацетат, пропионат, бутират, изобутират, валерат, гексаноат и геггганоат) проводили методом ВЭЖХ на хроматографе Knauer (Германия). Спирты определяли методом газовой хроматографии на хроматографе Pye Unicum 300 (Великобритания) с пламенно-ионизационным детектором. Сероводород определяли по методу Cline (1969). Содержание лактата в среде определяли

ферментативным способом (Hohorst, 1970). Определение ионов двухвалентного железа осуществляли путем экстракции ионов Fe2+ феррозином (Lovley et al., 1986). Определение десульфовиридина проводили по методике Постгейта (Postgate, 1959). Состав цитохромов определяли спеюрофотометрически на двулучевом спектрофотометре Shimadzu UV-160 (Япония) при длинах волн 552, 523 и 420 им.

Анализ жирноккслотного состава клеток проводили на приборе Sherlock (MIDI Inc. Delawere, США) в автоматическом режиме.

Выделение хромосомной ДНК из 5 природных образцов донных осадков проводили с помощью Ultra Clean Mega Prep Soil DNA Kit (MO BIO, США). ДНК из воды криопэгов выделяли набором 'Томо-Сорб" (Синтол, Россия). Выделение хромосомной ДНК чистых культур проводили модифицированным методом Мармура (Marmur, 1961). Определение и расчет содержания Г+Ц пар в ДНК осуществляли по температуре плавления ДНК (Mesbah et al., 2011; Owen et al., 1985) на спектрофотометре DU800 Beckman Coulter (Beckman, США).

ДНК-ДНК гибридизацию проводили в соответствии с протоколом Rossello-Mora с со авт. (Rossello-Mora et al., 2011) на спектрофотометре DU800 Beckman Coulter (Beckman, США). Разработка праймеров in silico. Поиск нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и dsrAB СВБ проводили в международной базе данных GenBank. Процедуру выравнивания нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, а также поиск консервативных участков осуществляли с помощью программы CLUSTAL W (Larkin et al., 2007). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на амплификаторе Терцик (ДНК-Технология, Россия). В Таблице 3 представлены праймеры, использованные в работе.

Таблица 3. Праймеры, использованные в работе

Праймер Ген - мишень Последовательность (5'-3') Темп, отжига, "С Литературный источник

27f 16S рРНК бактерий AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG 55 Lane et al., 1991

1492r 16S рРНК бактерий ACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT 55 Lane et al., 1991

DSRIF dsrAB AC(C/G)CACTGGAAGCACG 55 Wagner et al., 1998

DSR4R dsrAB GTGTAGCAGTTACCGCA 55 Wagner étal., 1998

DSR170f dsrAB TGACCAACATGCACGGCTCC 53 наши исследования

DSR860r dsrAB TGCCTTCTTCCATCCACCA(G/A)T CCCA 53 наши исследования

Natr_F I6S рРНК рода Desulfonatronum CTAGAGAGACTGCCCCGGTTA 63 наши исследования

NatrR I6S рРНК рода Desulfonatronum CTGCAATCCGAACTGTGGTGA 63 наши исследования

ПЦР "в реальном времени" (ПЦР-РВ) проводили на амплификаторе АНК32 (Россия) В качестве калибровочного стандарта использовали десятикратные разведения геномной ДНК Desul/ovibrio arcticus В15т или Desulfonatronum lacustre Z-79517 Анализ результатов проводили с использованием программного обеспечения, поставляемого с прибором. Секвенироввние нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и dsrAB проводили в ЦКП "Геном" ИМБ РАН (г. Москва) с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v.3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems (США).

Филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей и построение дендрограмм проводили с использованием пакета программ MEGA6 (Tamura et al., 2013).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Определение численности бактерий в криопэгах полуострова Ямал Оценку общей численности бактерий в образцах воды трех криопэгов осуществляли методом прямого счета (МПС) и методом ПЦР "в реальном времени" (ПЦР-РВ) с использованием универсальных бактериальных праймеров 27£Ч492г на ген 16S рРНК. В результате общая численность бактерий, полученная с помощью ПЦР-РВ, составила 5.2*10' и 1.2*107 копий гена 16S рРНК/мл в криопэгах 1Y и 3Y, соответственно. Численность бактерий, полученная методом прямого счета, составила 8.2* 10', 4.2* 10' и 3.2* 106 кл/мл в криопэгах IY, 2Y и 3Y, соответственно (Таблица 4). Для определения общего количества СВБ использовали метод предельных разведений (МПР) и ПЦР-РВ с применением стандартной пары праймеров DSR1F/DSR4R (Wagner et al., 1998) на ген бисульфитредуктазы dsrAB. СВБ были обнаружены в криопэгах 1Y и 3Y в количестве 6.9* Ю3 и 2.7* 102 копий гена dsrAB/мл, соответственно. Порядок численности СВБ соответствует данным, полученным МПР: 2*103 и 2*102 кл/мл в криопэгах 1Y и 3Y, соответственно.

Таблица 4. Общая численность бактерий и сульфатредукторов в криопэгах Ямала

Общая численность бактерий Общая численность СВБ

Криопэг Минерализация, г/л МПС*, кл/мл ПЦР-РВ**, копий гена16в рРНК/мл МПР***, кл/мл ПЦР-РВ, копий гена dsrAB/мп

1Y 14.6 8.2*10" 5.2*10" 2* 103 6.9*103

2Y 56.23 4.2*107 но. 0 0

3Y 77.16 3.2*10' 1.2* 107 2* 102 2.7*102

•МПС - метод прямого счета;♦♦ПЦР-РВ - ПЦР "в реальном времени";♦•♦МПР - метод предельных разведений; н о. - не определяли.

Для оценки эффективности подбора селективных условий в накопительных культурах ямальских криопэгов К1Б, К2Б и КЗБ для роста сульфатредукторов при разных температурах культивирования был применен метод ПЦР-РВ. Накопительные культуры выращивали при 6 и 15°С в течение 60 дней. Тотальную ДНК, выделенную из накопительных культур, использовали в ПЦР-РВ с праймерами DSR1F/DSR4R на ген dsrAB. Анализ полученных данных показал, что численность СВБ в накопительной культуре К15 увеличилась с Ю3 до Ю4, а в накопительной культуре КЗБ - с 102 до 103 копий гена dsrABIмл по сравнению с начальной численностью сульфатредукторов в воде криопэгов (Таблицы 4, 5). В накопительной культуре К25, как и в образце воды криопэга 2У, СВБ не были обнаружены, что может быть связано с их полным отсутствием или низкой численностью, не превышающей пороговый уровень чувствительности пары праймеров DSR1F/DSR4R, наличием представителей новых родов СВБ, не амплифицирующихся с данной парой праймеров, или созданием неоптимальных селективных условий в накопительной культуре для присутствующих в образце СВБ.

Таблица 5. Численность СВБ в накопительных культурах при различных температурах культивирования__

Накопительная Численность СВБв накопительной культуре,

культура копий гена dsrAB/мл

6°С 15"С

K1S 5.8*10" 2.7* 104

K2S 0 0

K3S 7.9* 10S 1.9*10'

2. Психротолераитный сульфятредуктор из криопзга полуострова Ямал

Из накопительной культуры криопзга ЗУ выделен штамм СВБ, обозначенный К38т Изолят представлен подвижными одиночными грамотрицательными вибрионами размером 0.5 х 2.0 мкм. Штамм подвижен за счет двух монополярных очехленных жгутиков (Рисунок 1). Споры не обнаружены.

Рисунок 1. Морфология клеток штамма К38т.

Ж - жгутик, Ч - чехол жгутика. Длина масштабной линейки -1 мкм.

Штамм КЗЙТ является психротолерантным и способен расти при температурах от -2 до 36°С, оптимум 26°С (Рисунок 2 а). Рост при температуре -2°С сопровождается образованием 2.65 мМ сульфида в течение 35 дней. Исследуемый изолят является умеренным галофилом, облигатно зависит от присутствия ионов Ыа+ в среде и растет в диапазоне №С1 от 5 до 40 г/л с оптимумом при 20 г/л (Рисунок 2 б). Изолят является нейтрофилом и растет в узком диапазоне рН от 6.8 до 7.4 с максимальной скоростью роста при рН 7.0-7.2.

0,017

0,025

12 19 26 33 Температура, "С

10 20 30 NaCl, г/л

Рисунок 2. Влияние температуры (а) и NaCl (б) на скорость роста штамма K3S .

Штамм K3ST способен использовать лактат, формиат, пируват, фумарат, аланин, этанол и молекулярный водород в качестве доноров электронов в присутствии сульфата, причем наибольшее образование сульфида (7.9 мМ) происходило при росте на аланине.

Помимо сульфата как конечного акцептора электронов, штамм K3Sr использует сульфит, тиосульфат и элементную серу. Штамм K3ST способен также восстанавливать Fe(HI) цитрат и Fe(III) ЭДГА без видимого роста.

Содержание Г+Ц пар в ДНК штамма K3ST составляет 42.3 мол.%.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена I6S рРНК показал, что штамм K3Sr кластеризуется с бактериями рода Desulfovibrio. На филогенетическом древе (Рисунок 3) его ближайшим соседом с 97.4% сходства является D. ferrireducens DSM 16995г - бактерия, выделенная из донных отложений Арктического шельфа в районе о. Шпицберген (Vandieken et al., 2006). Нуклеотидная последовательность гена I6S рРНК штамма K3ST депонирована в GenBank под номером KJ739728.

ТоИ г 68 «—

59

7Д-Г

98 П-

-ОЭМ 17176т (00148943)

—О. {егНгеёисепх ОЯМ 16995т (00148944) "КЗв7 (К3739728)

-О. ЬуЛгсНИегтЫи АМ1ЭТ(АР458778)

"О. ЬазНпп Б11Ь4225Т (АУ359868)

-О. роииг М5[,79Т(АВ110541)

~1Х аезроеелт Азро-2т (Еиб80957)

-О. рго{ипс!их 500-1Т (П1733706)

-Л агсА'олг В15т (00296030)

100

-о. 1оп&м ЭЕВЯ 2582 (АУ359867)

-О. ряусИг&Ыегапя й 1т (АМ418397)

-а охусПпае Р1 Вт (1133316)

0.01

Рисунок 3. Филогенетическое древо, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК, показывающее положение штамма К3вт среди представителей рода Оези[/оу1Ьпо. СВБ арктических экосистем показаны жирным шрифтом. Учетный номер базы данных вепВапк указан в скобках. Дендрограмма построена с использованием метода "пе1Ьоиг^отп£\ Данные "Ьоо1з1гар"-анализа (выраженные в процентах от 1000 реплик) указаны в точках ветвления.

Таблица 6. Сравнительная характеристика штамма К38т с представителями рода Ре5и1/оу1Ьпо, выделенными из арктических экосистем_

Признак КЗв1- А /еггЬейисепз ОБМ 16995т А /г^Миз 08М17176Т А агсЧсиз В15т

Жгутики монополярное битрихальное Монотрих Монотрих Монотрих

Размер, мкм 0.5*2.0 0.7*2.5-5.5 0.7*2.0-5.0 0.4-0.5*3.0-4.0

рН

пределы 6.8-7.4 6.3-7.5 6.9-7.5 5.5-8.5

оптимум 7.0-7.2 7.1-7.5 7.1 6.7-7.0

Температурите

пределы -2-36 -2-30 -2-25 -2-28

оптимум 26 23 20-23 24

N>01, г/л

пределы 5-40 7-40 20-35 0-20

оптимум 20 10-25 20-30 2

Доноры

электронов/+804

Пируват + - - +

Фумарат + + + -

Алании + - + -

Акцепторы

электронов/+лактат

Тиосульфат + + - +

Сера + - + +

аморфное Ие(111) - +/- +/- +/-

Ре(Ш) цитрат +/- +/- +/- н.д.

Ре(Ш) ЭДТА +/- н.д. н.д. +/-

Г+Ц, мол. % 42.3 42,0 43.3 55.2

Авторы описания Наши УалсИекеп е! а1, УатЛекеп е! а1, РесИег^упа е1 а1.,

исследования 2006а 2006а 2012

+/-, восстановление субстрата без роста; н.д.- нет данных.

По ряду фенотипических и физиолого-биохимических признаков штамм К38т оказался близок к представителям уже известных психротолерантных сульфатредукторов рода йе5и1/оУ1Ьг1о (Таблица 6).

Сравнение свойств штаммов K3ST и D. ferrireducens DSM 16995х показало, что их объединяет способность к росту на лактате, формиате, водороде, фумарате и этаноле, а также к восстановлению сульфата, сульфита и тиосульфата. Оба штамма являются нейтрофилами и способны расти при отрицательных температурах. Штамм K3ST, как и D. ferrireducens DSM 16995т, является умеренным галофилом и облигатно нуждается в ионах Na+. Кроме того, новый изолят, как и его ближайшие родственники, способен восстанавливать цитрат Fe(lll) и ЭДТА Fe(]]]) без видимого роста. В отличие от D. ferrireducens, штамм K3ST использует пируват и апанин в качестве донора электронов, а также элементную серу как акцептор электронов.

Уровень сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК штамма K.3ST и D. ferrireducens DSM 169957, составляющий 97.4%, а также ряд фенотипических отличий свидетельствуют о том, что штамм K3ST является новым психротолерантным видом рода Desulfovibrio, для которого предложено название 'Desulfovibrio algorilolerans' sp. nov.

3. Обнаружение СВБ в содовых озерах Соленое и Сульфатное

Для поиска сульфатвосстанавливающих бактерий в щелочных экосистемах нами были исследованы 4 образца донных осадков озера Соленое и 1 образец поверхностных донных осадков озера Сульфатное. Из пяти образцов была выделена тотальная ДНК, которую использовали для обнаружения СВБ методом ПЦР с применением стандартной пары праймеров DSR1F/DSR4R на ген бисульфитредуктазы dsrAB. В результате были получены ПЦР-фрагменты ожидаемой длины 1900 и.о. из ДНК всех образцов (Рисунок 4 а), что доказывало присутствие СВБ в донных осадках озер Соленое и Сульфатное.

с использованием праймеров DSR1F/DSR4R (а) и DSR170f/DSR860r (б): 1 - оз. Соленое (0-5 см), 2 - оз. Соленое (15-17 см), 3 - оз. Соленое (19-21 см), 4 - оз. Соленое (23-25 см), 5 - оз. Сульфатное (0-5 см), 6 - D. lacustre (положительный контроль), 7 - контрольная ПЦР без ДНК. М1 - маркер молекулярной массы ДНК GeneRuler™ 100+ н о. (Fermentas, Литва). 142 -маркер молекулярной массы ДНК FastRuler™ 50-1500 н.о. (Fermentas, Литва).

Однако при использовании праймеров DSRIF/DSR4R образовывалось большое количество неспецифических продуктов амплификации, что ограничивало применение данной пары праймеров для количественной оценки СВБ методом ПЦР-РВ. В связи с этим, следующий этап работы был направлен на разработку новых праймеров для детекции СВБ в щелочных экосистемах, подходящих для ПЦР-РВ.

На основании имеющихся в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей гена dsrA сульфатредукторов различных филогенетических подгрупп, нами разработана новая пара праймеров DSR170f/DSR860r. С использованием этой пары праймеров получены ПЦР-фрагменты гена dsrA ожидаемой длины (740 н.о.) с ДНК из исследованных образцов

донных отложений содовых озер. Полученные ПЦР-фрагменты не содержали неспецифических продуктов амплификации (Рисунок 4 б).

Известно, что представители рода Desulfonalronum являются активным компонентом алкапофильного микробного сообщества содовых озер. Для количественной оценки СВБ этого рода на основе нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК бактерий рода Desulfonalronum, имеющихся в базе данных GenBank, нами разработана пара родоспецифичных праймеров Natr_F/Natr_R, позволяющая амплифицировать фрагменты длиной 164 н.о. только с представителями рода Desulfonalronum. Новая пара праймеров была использована для поиска бактерий рода Desulfonalronum в образцах донных осадков озер Соленое и Сульфатное. ПЦР-фрагменты ожидаемой длины получены с ДНК из всех пяти исследуемых проб (Рисунок 5), что подтвердило наличие представителей рода Desulfonalronum в исследуемых озерах. Рисунок 5. Электрофорегрямма продуктов

1 2 3 4 5 6 7 M ПЦР-амплнфнкацнн фрагментов гена 16S

рРНК с использованием праймеров Natr_F/Natr_R: I - оз. Соленое (0-5 см), 2 -оз. Соленое (15-17 см), 3 - оз. Соленое (19-21 см), 4 - оз. Соленое (23-25 см), 5 - оз. Сульфатное (0-5 см), 6 - D. lacustre н 0 (положительный контроль), 7 - контрольная ПЦР без ДНК. М- маркер молекулярной массы ДНК FastRuler™ 50-1500 но. (Fermentas, Литва).

4.Определение численности СВБ в содовых озерах Соленое и Сульфатное

Численность СВБ в образцах донных осадков содовых озер Соленое и Сульфатное оценивали методом предельных разведений (МПР) и Г1ЦР-РВ. Для подсчета общего числа СВБ и численности бактерий рода Desulfonalronum использовали разработанные пары праймеров DSRI70f/DSR860r на ген dsrA и Natr_F/Natr_R на ген 16S рРНК бактерий рода Desulfonalronum. Результаты количественной ПЦР показали, что общая численность СВБ в донных осадках озера Соленое составляет 7.9x104 - 2.4x106 копий гена dsrA/г. При этом наибольшее содержание сульфатредукторов выявлено в поверхностном слое ила (Таблица 7). Таблица 7. Численность СВБ в образцах донных осадков озер Соленое и Сульфатное

Озеро Глубина Общее число Численность Численность Общее

отбора, СВБ, Desulfonalronum Desulfonalronum число

(см) копий гена spp., копий гена spp. от общего СВБ, кл/г

iIsrA/r 16S рРНК/г числа СРБ, % (МПР*)

Соленое 0-5 2.4x10" 1 8x10" 75 10"

15-17 7.9x104 З.ОхЮ4 38 ю5

19-21 1.9x105 2.9x10" 15.3 ю5

23-25 1.5 х 10S 6.6x10" 44 106

Сульфатное 0-5 1.2x10' 7.7х103 6.5 10"

*МПР - метод предельных разведений

Численность бактерий рода Ое5и1/опа1гопит в донных отложениях озера Соленое составляет 2.9х10"-1.8х|0' копий гена 165 рРНК/г с максимальным количеством этих бактерий в поверхностном слое (75% от общей численности СВБ). В подповерхностных слоях ила озера Соленое численность бактерий рода Оейи^опаКопит составила 2.9х104-6.6х|04копий гена 165 рРНК/г (15-44% от общей численности СВБ).

В образце поверхностных донных осадков озера Сульфатное общая численность СВБ составила 1.2x105 копий гена dsrA/г. Численность бактерий рода Оези^опа/гопит в озере

10

Сульфатное оказалась ниже, чем в озере Соленое (6.5% от общей численности СВБ). Возможно, это связано с преобладанием алкалофнльных СВБ других родов, к примеру, Эе5и1/опа1гопоУ1Ьпо или СетЦопсИгопозрма.

Общая численность СВБ в донных осадках озер Соленое и Сульфатное, подсчитанная методом предельных разведений (МПР), составила 104-106 и 104 кл/г, соответственно. Расхождение данных численности СВБ, полученных методами ПЦР-РВ и МПР, возможно объясняется недостатком метода предельных разведений, позволяющего подсчитывать только культивируемые виды СВБ, и высокой чувствительностью метода ПЦР-РВ.

Полученные нами результаты подтвердили, что СВБ и, в частности, представители рода Ое5и1/опа1гопит, являются активным компонентом микробного сообщества содовых озер.

5. Новые анаэробные бактерии содовых озер

5.1. Сульфатвосстаиявливающне бактерии

Из образцов донных осадков озера Соленое выделены два штамма СВБ - К|4 и К15т, из донных осадков озера Сульфатное - штамм Би2. Изучение свойств изолятов выполнено в совместных исследованиях с рядом соавторов (Рыжманова и др., 2011; КугЬшапоуа е1 а!., 2013). Клетки новых штаммов представлены подвижными неспоровыми одиночными вибрионами разного размера: штамм К>4 0.6-0.8x2.0-2.5 мкм (Рисунок 6 а), штамм К|5т-0.5-0.7x2.0-2.5 мкм (Рисунок 6 б), штамм 5и2 - 0.8-0.9x2.3-2 6 мкм (Рисунок 6 в) Все изоляты имеют клеточную стенку грамотрицательного типа.

Рисунок 6. Морфология клеток штаммов Ю4 (а), Ю51 (б), 8и2 (в). Ж - жгутик,

П - пили, ВВМ - везикулы внешних мембран. Длина масштабной линейки - I мкм

Клетки штаммов 8и2 и Ю5Т часто образуют короткие цепочки - спириллы - из 2-3 клеток. Для штамма К ¡4 характерно перитрихиальное жгутикование и наличие боковых пилей (Рисунок 6 а). Подвижность клеток штаммов Би2 и Ю51 обусловлена одним полярно расположенным жгутиком (Рисунок 6 б,в). Клетки КМ и К|5г образуют везикулы внешних мембран.

Все выделенные штаммы являются мезофилами и растут в диапазоне температур от 20 до 40°С. Оптимальной температурой для роста штаммов К¡4 и Би2 является 29°С, для штамма К15т - 34°С. Все три изолята являются облигатными апкалофилами и не растут при рН ниже 7.5. Штамм К14 растет в диапазоне рН 7.5-10.0, штамм К¡51 - 7.5-10.5, штамм Зч2 -

8.0-11.5. Максимальные скорости роста наблюдались при рН 8.9, 9.4 и 10.0 для штаммов К14, К15т и Би2, соответственно (Рисунок 7). Иэоляты растут в широком диапазоне солености. 180 г/л ЫаС1 (штамм К14), 2-40 г/л ЫаС! (штамм К|5Т) и 5-100 г/л ЫаС1 (штамм 8и2). Оптимальная концентрация ЫаС1 для роста штаммов 8и2 и К|4 - 10 г/л, для штамма К/5Т - 5 г/л. Штаммы К/4 и К|5Т облигатно нуждаются в ионах эквнмолярная замена солей натрия на соответствующие калиевые соли не поддерживает рост изолятов. Замена хлорид-иона эквимолярным количеством карбонат-ионов в среде, где рН поддерживался 50 мМ глициновым буфером, не влияет на рост штаммов 5и2, К¡4 и Кл5т, хотя подвижность клеток значительно снижается.

Рисунок 7.

Влияние рН на скорость роста штаммов KÍ4, KÍS1 и Su2.

Штаммы 5и2, К14 и К¡5 различаются по спектру используемых доноров и акцепторов электронов, но все культуры используют для роста лактат, этанол и сульфат с образованием ацетата и сульфида водорода. Рост на формиате сопровождается образованием только сульфида водорода. Измерение СОг как конечного продукта метаболизма при высоких значениях рН невозможно ввиду высокого уровня карбонатов в среде.

Штаммы К|4 и К|5Т используют в качестве донора электронов пируват, а штаммы К¡4 и Би2 - молекулярный водород в присутствии ацетата. Штаммы К¡4 и Ю5Т способны также к ферментации лактата в отсутствии источника серы с образованием ацетата, пропионата и валерата, являясь, таким образом, факультативными бродилыциками.

Помимо сульфата как акцептора электронов, штаммы КИ и Би2 используют сульфит,

и Би2 - аморфную гидроокись Ре(Ш).

штаммы К14 и Ю5Т - тиосульфат, штаммы Кл5т Штамм К15т, кроме того, медленно восстанавливает элементную серу.

клетках штаммов Ю4, Ю5Т и 5и2 обнаружен СО-связывающий цитохром с

В

пигмент характерный для представителей рода

16S рРНК и dsrAB последовательностей с бактериями рода

Ki4, K.Í5

менахинон MK6(bh). Десульфовиридин Desulfovibrio - не обнаружен.

Нами определены нуклеотидные последовательности генов алкалофильных изолятов. Филогенетический анализ нуклеотидных гена I6S рРНК показал, что новые штаммы кластеризуются Desulfonatronum (Рисунок 8), а их ближайшим соседом является D. lacustre Z-7951T (99.0, 99.2 и 99.6% сходства для штаммов Ki4, Ki5T и Su2, соответственно). На дереве бисульфитредуктаз представители рода Desulfonatronum также представляют собой довольно тесную группу, но штамм K¡5T выделился в отдельную ветвь и, вероятно, представляет новый вид рода Desulfonatronum (Рисунок 9).

Содержание Г+Ц пар в ДНК штаммов Ki4, Ki5T и Su2 составляет 56.3, 48 8 и 59.6 мол.%, соответственно. Согласно методу ДНК-ДНК гибридизации, уровень сходства ДНК

штаммов Ki4, Ki5T и Su2 и типового штамма D. lacustre Z-7951Т составил 89, 53 и 79%, соответственно.

Жирнокислотные профили штаммов Ki4, Ki5T и Su2 показали, что преобладающими жирными кислотами у штамма Ki4 являются С но, С.и, C|<¡ |Ш7С и Сц|Ш7; у штамма Ki5T -Сы-.о. С .а и С,и; а у штамма Su2 - Сцо, C0¡i и Cj6i„7C. Типовой штамм вида D. lacustre Z-7951т отличается от изолятов значительным содержанием жирных кислот С щи и Cimu».

Выделенные из содовых озер штаммы СВБ, помимо сходства по ряду фенотипических и физиолого-биохимических признаков, имеют и некоторые существенные отличия от типового штамма D. lacustre Z-7951T (Таблица 9). Новые изоляты способны расти на пирувате (штаммы KÍ4 и Su2), а также использовать элементную серу (штамм Ki5T) и аморфную гидроокись Fe(III) (штаммы Ki5T и Su2) - нехарактерный для апкалофильных сульфатредукторов акцептор электронов. У изученных штаммов СВБ отсутствует облигатная зависимость от карбонат-ионов, характерная для D. lacustre Z-7951т.

Таблица 8. Дифференцирующие признаки штаммов Ki4, Ki5T, Su2 и D. lacustre Z-7951T

Признак К14 Ki5T Su2 D. lacustre Z-795Г

Размер, мкм

ширина 0.6-0.8 0.5-0.7 0.8-0.9 0.7-0.9

длина 2.0-2.5 2.0-2.5 2.3-2.6 2.0-3.0

Жгутики Перитрих Монотрих Монотрих Монотрих

РН

пределы 7.5-10.0 7.5-10.5 8.0-11.5 7.0-10.5

оптимум 8.9 9.4 10.0 9.5

Температура,°С

оптимум 29 34 29 37-40

N80, г/л

пределы 1-80 2-40 2-100 0-100

оптимум 10 5 10 0

Доноры электронов/+80.|"1

Нг+ ацетат + - + +

пируват + + - -

Акцепторы

электронов/+лактат

сульфит - + + +

тиосульфат + + - +

Б0 — + — _

Ре3+ - + + -

Ферментация ляктата + + - -

Г+Ц, мол.% 56.3 48.8 59.6 57.3

Авторы описания Наши Наши Наши Пикуга и

исследования исследования исследования др., 1998

Учитывая высокое сходство нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, а также высокий уровень сходства ДНК штаммов K¡4 и Su2 с типовым штаммом вида D. lacustre Z-7951Т (89 и 79%), мы полагаем, что штаммы KÍ4 и Su2 являются новыми штаммами вида D. lacustre. При этом штамм Su2 является первым представителем вида D. lacustre, способным к восстановлению Fe(IIl), что расширяет представления о данном виде. Низкий уровень сходства ДНК штамма Ki5T и D. lacustre (53%), а также фенотипические и генотипические характеристики нового штамма свидетельствуют о том, что штамм Ki5T является представителем нового вида Desulfonatronum buryatense sp. nov.

97JKi4 (KC417373) 9W*iSr(KC417374)

Desulfonatronum lacuslre DSM Z-7951T(NR041848) Su2 (EU315115)

Desulfonatronum tlilodlsnmtans DSM !4708T(AF373920) ■Desulfonatronum thloautotrophlcum DSM 21337T(FJ469577) Desulfonatronum IhlosulfatophUum DSM 21338T (FJ469S78) Desulfonatronum cooperatlvum DSM 16749T (AY725424) Desulfovlbrlo alkalltolerans DSM 16529T(AY649785) Desuifblhermus naphthae DSM 13418T (X80922) Desulfonnulicus submarine DSM 15269T (AF524933) —Desul/bhalobium retbaense DSM 5692r(U48244) ISQr-Desulfonatronospira dellcata DSM 19491T(EU296539)

Desulfonatronospira thiodlsmutans DSM 19093T (EU296537) Desulfonatronovlbrlo hydrogenovorans DSM 9292T (X99234) Desulfonatronovibrio magnus DSM 24400T (GU196831) Desulfonatronovlbrlo thiodlsmutans DSM 21540T (FJ469579) Desulfotalea uriiica DSM 12342r (AF099061) 'Desulfopila ae.ituarii DSM 18488T (AB110542) 'Desulfocapsa sulfexigens DSM 10S231 (YI3672) Desulforhopa!us singaporensis DSM 12130T (AF118453) ■Desulfafustts glycolicus DSM 9705T (X99707) Desulfurivibrio alkallphilus DSM 19089T (NR044206)

-Desul/ocella halophila DSM 11763r (AF022936)

Desuljubucterium autolrophicum DSM 3382T (AF418I77)

-Desul/bbacler halololerans DSM 11383T (Y14745)

'Desulfobotulus alkallphilus DSM 22078T (FJ788S23) 'Desutfofrigux fragile DSM 123451 (AF099065) Desulfosalsimonas propionicica DSM 17721T (DQ067422) Desulfosarcina variabilis DSM 2060T (M34407) Desulfonema magnum DSM 2077T (U45989)

0.02

Рисунок 8. Филогенетическое древо галоалкалофильных СВБ в пределах Ое11арго1еоЬас1епа (СВБ содовых озер выделены жирным шрифтом), построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16в рРНК. Длина масштабной линейки: 2 замены на 100 нуклеотидов. Учетный номер базы данных СепВапк указан в скобках. Дендрограмма построена с использованием метода поиска ближайших соседей ("яе/боиг-уошшв"). Данные "Ьоо1з1гар"-аналиэа (выраженные в процентах от 1000 реплик) указаны в точках ветвления.

9318и2

-ШОт 1)ехи1/опа1гопит /ЫмиЦаЮрИНит А504-2Г

100

99

ш

1 Desulfonatronum lacuslre Z-7951 (AF418189)

KiS'

" Desulfonatronum thioautotmphicum AS03-6 (JQ519396)

100

96

100

-Desulfonatronum cooperalivum Z-79991

Desulfonatronospira thiodlsmutans AHT8 (JQ519392)

-Desulfonatronovibrio hydrogenovorans Z-7935r (AF418197)

-Desulfonatronovibrio halophilus HTR1T (JQ519393)

Desulfonatronovibrio thiodlsmutans AHT9T

j Desulfonatronovibrio thiodismutans AS04-5 (JQ519395)

100 Desulfonatronovibrio magnus AHT22T (JQ519394)

0.05

Рисунок 9. Филогенетическое древо алкалофильпых СВБ содовых озер, построенное па основе анализа нуклеотидных последовательностей гена dsrAB. Дендрограмма построена с использованием метода поиска ближайших соседей ("neibour-foining"). Данные "bootstrap"-анализа (выраженные в процентах от 1000 реплик) указаны в точках ветвления.

5.2. Выделение и характеристика анаэробной алкалофильной протеолнтической бактерии

В процессе выделения и очистки алкалофильного сульфатредуктора 5и2 была обнаружена устойчивая ассоциация этого штамма с палочковидной бактерией. Бактерия-спутник была выделена в чистую культуру и названа штамм Ви22т. Новый изолят представлен неподвижными палочками со слегка заостренными концами 0.4-0.7*2.0-6.5 мкм (Рисунок 10 а,б), имеет клеточную стенку грамположительного типа, содержащую 5-слой (Рисунок 10 б,в). Наличие спор не выявлено, хотя в конце логарифмической фазы роста часто наблюдаются утолщения в центре клетки (Рисунок 10 а). Пастеризация культуры при 80°С в течение 20 минут с последующей инкубацией в оптимальных условиях выявила терморезистентность клеток штамма 5и22т. Анализ ультратонких срезов позволил обнаружить в начинающих лизироваться клетках образования, напоминающие проспоры (Рисунок 10 в). Таким образом, полученные результаты не дают однозначного ответа на вопрос о способности к спорообразованию у новой бактерии.

Рисунок 10. Морфологии клеток штамма Su22'. S - S-слой, PS -"проспора", N -нуклеоид.

Штамм Su22T не содержит каталазу и является оксидазо-положительной бактерией. Не способен расти в аэробных условиях, однако присутствие < 4.5% 02 в газовой фазе не ингибирует рост. Изолят является мезофилом и растет в диапазоне температур от 20 до 40°С с оптимумом при 30°С. Изолят является облигатным алкалофилом и способен расти в диапазоне рН 7.4-11.0 с оптимумом роста при рН 9.6 (Рисунок II а). Штамм растет в диапазоне NaCI от 2 до 60 г/л, оптимальная концентрация NaCI - 20 г/л (Рисунок 11 б). Рост изолята зависит от присутствия карбонатов-ионов, их замена на глициновый буфер ингибирует рост во втором пересеве.

0.1 0,07 т -

"j-0,08 • • /Л

Г \ g 0,05

g.0,06-- / \ I 0.04

g 0,04 ■ ■ JT \ рО.ОЗ

g. S \ 2 0.02

I0'02--/ V^^ |o,o.

7 9 11 0 20 40 60 80

pH NaCI, г/л

Рисунок 11. Влншшс pli (a) il NaCI (б) lia рост штамма Su22'.

В качестве источника углерода и энергии штамм 5и22т использует дрожжевой экстракт, триптон, казеин и разрушенную биомассу сульфатредуктора штамм 5и2. Пируват, пептон, глюкоза, фруктоза, триптикаэа, фумарат, манноэа, лактат, формиат, бутират, пропионат, гептоноат, капроат, малат, сукцинат, сорбит, цитрат, метанол, бутанол, индивидуальные аминокислоты и их пары не поддерживают рост изолята. Все потребности штамма в макро- и микроэлементах могут удовлетворяться средой, содержащей только карбонаты, ЫаС1 и дрожжевой экстракт, причем выход биомассы пропорционален концентрации дрожжевого экстракта. Витамины (>УоНп е1 а!.. 1963) не заменяют дрожжевой экстракт.

Штамм Зи22т не зависит от присутствия в среде акцепторов электронов. Тем не менее, добавление в среду серосодержащих акцепторов электронов стимулирует рост изолята. Рост штамма Зи22т в присутствии тиосульфата и элементной серы сопровождается образованием сульфида (1.98 и 3.2 мМ, соответственно).

При росте на дрожжевом экстракте (2 г/л) штамм 5и22т образует аммоний, формиат, ацетат и пропионат, не выделяет водород и этанол. Таким образом, физиологически штамм 5и22т относится к первичным анаэробам, использующим белковые соединения для роста.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена 16Б рРНК показал, что штамм 5и22т образует отдельную ветвь с А. 51Ыпсит г-7981т - единственным видом рода АпохупШгопит - со сходством 98.1%. Дендрограмма на Рисунке 12 демонстрирует положение штамма 5и22т среди представителей второго кластера семейства С/о^Гг/Лосеое, в основном относящихся к алкалофильным протеолитическим и сахаролитическим бактериям содовых озер.

811 TlndatUa magadiensis Z-7934T (Y15626) 441Clostridium bogoril' B8NS1-Cf (AJ271457)

'Clostridium alcalipliilum' B8NS1-AT (AJ2714S6) Clostridium amlnovorans' B7FT-AT (AJ27145S) TlndatUa californlensls APOT (AF373919) Tlndallia texcoconensls IMP-300T (DQ234901) Clostridium elmenteltll' E2SE1-BT(AJ271453)

'Clostridium alcallbutyricum' E2SE1-C7 (AJ2714S4) J- Su22T (EU315116) 100l Anoxynatronum slblrlcum Z-7981T (NR_0252S6)

Clostridium formicaceticum DSM 92T (HF679208) Anaerovlrgula muMvorans SCAT(AB2017S0) Natronlncola ferrireducens Z-0S11T (EU87827S) Natronincola peptidivorans Z-7031T (EF382661) Natronlncola hlstidlnovorans Z-7940T (Y16716) - Alkaliphilus halonhilus E2Rr (EU627628) Alkuliphilus oremlandii OhILAsT (NR 074435) Alkaliphilus crotonatoxidans B11-2T (AF467248) Alkaliphiluspeptidlfermentans Z-70367 (EF382660) Alkaliphilus Iransvaalensis SAGM1T (AB037677)

Clostridium Jelsineum DSM 7941 (AF270501)

0.02

Рисунок 12. Филогенетическое древо второго кластера семейства ОохМФасеае, построенное на основе анализа гена 16в рРНК. Бактерии, выделенные из содовых озер, показаны жирным шрифтом. Дендрограмма построена с использованием метода поиска ближайших соседей ("яе/Аомг-уош/я^"). Данные "Ьоо151гар"-анализа (выраженные в процентах от 1000 реплик) указаны в точках ветвления.

Сравнение профилей жирных кислот штаммов Su22T и A. sibiricum Z-7981Т показало, что доминирующими жирными кислотами являются С(б.1ш7с1 С/си и Сiú;(i„. В сумме они составляют 54.34% от общего количества ЖК для штамма Su22T, и 42.51% для A. sibiricum Z-7981Т. Однако по составу минорных компонентов профили значительно различаются. Так, клетки штамма Su22T содержат жирные кислоты С120 и Сп и1), а клетки штамма Z-7981т -С|3;о , См:[ш5,Сн5, CalJ, С 16:1 ОМв, Сц оц, Ci|7, C„I7, Ci7cyc, С|9(|, Сци 1 0-OXO И С[в:0 Ю-ОН.

Содержание Г+Ц пар в ДНК штамма Su22T составляет 46.) мол %. Уровень сходства ДНК штамма Su22T и A. sibiricum Z-7981Т составляет 69%.

Выделенная из содового озера новая протеолитическая бактерия Su22T имеет значительные отличия по ряду фенотипических и генотипических свойств от типового штамма вида A. sibiricum Z-7981T, являющегося сахаролитической бактерией (Таблица 9). В отличие от A. sibiricum Z-7981Т, штамм Su22T не сбраживает сахара, пептон, и не растет на отдельных аминокислотах. Кроме тиосульфата, он восстанавливает элементную серу при росте на дрожжевом экстракте.

Таким образом, полученные фенотипические и генотипические характеристики новой бактерии убедительно свидетельствуют в пользу того, что она является представителем нового вида рода Anoxynalronum, для которого предложено название 'Anoxynatronum buryatense' sp. nov.

Таблица 9. Дифференцирующие характеристики штаммов Su22T и A. sibiricum Z-7981T

Признак Su22T A. sibiricum Z-7981т

Размер, мкм

ширина 0.4-0.7 0.5-0.7

длина 2.0-6.5 3.8-5.0

Подвижность - +

Кяталаза - +

рН

пределы 7.4-11.0 7.1-10.1

оптимум 9.5 9.1

Температура, °С

диапазон 20-40 25-41

оптимум 30 35

N80, г/л

пределы 2-60 2-40

оптимум 20 10-20

Доноры электронов:

углеводы - +

пируват - +

глутамат - +

цистеин - +

хитин - + •

казеин + н.д.

Акцепторы электронов:

Б" + -

Г+Ц, мол.% 46.1 48.4

Авторы описания Наши исследования Garnova et al., 2003

6. Восстановление №(111) еульфатвосстянявливиющими бактериями в щелочных условиях

Большинство железоредуцирующих бактерий являются нейтрофилами. До недавнего времени восстановление аморфного и слабокристаллического оксида железа в содовых озерах считалось невозможным из-за низкой доступности Ре(ПГ) при щелочной реакции среды (Ус е( а!., 2004). Однако, некоторые алкапофильные бактерии, выделенные из содовых озер, восстанавливают как растворимые, так и плохо растворимые соединения железа (гауаггша е1 а!., 2006; 2Ы\та е! а!., 2009 а,Ь).

т

Нами впервые выделены два штамма СВБ (штамм Кг5 и 8и2), способные использовать аморфную гидроокись 1''е(Ш) как акцептор электронов во время роста при рН 9.5-10.0. Восстановление аморфного гидроксида Ре(Ш) сопровождалось образованием 3.54

т

(8и2) и 3.12 (Ю5 ) молей Ре(И) на 1 моль потребленного лактата в третьем пересеве. Как показано для штамма ви2 (Рисунок 13), процесс восстановления железа сопровождается потреблением лактата, накоплением ацетата и увеличением численности клеток от единичных до !08 кл/мл. Таким образом, это первое описание алкалофильной железоредукции, осуществляемой СВБ. Экологическую роль данного феномена в содовых озерах следует изучить более детально. Возможно, способность к железоредукции генетически закрепилась у сульфатвосстанавливающих бактерий содовых озер во времена доминирования на Земле цикла железа, что придало им метаболическую гибкость и позволило адаптироваться к окружающей среде при подавленном цикле серы.

Рисунок 13.

Образование ионов двухвалентного железа и ацетата при окислении лактата штаммом 8и2. Условные обозначения: (А) — лактат; (•)-ацетат;

(■)-Ре(П).

Время, час

7. Новые виды анаэробных бактерий Диагноз Desulfovibrio algoritolerans sp. nov.

Desulfovibrio algoritolerans [al.go.ri'to'le.rans. L. mase. n.algor -oris, холод, холодный; N.L. neut. adj. algoritolerance, L. pres. part, tolerans толерантный; N.L. part. adj. algoritolerans холодоустойчивый].

Клетки представлены грамотрицательными неспоровыми подвижными одиночными вибрионами размером 0.5*2.0 мкм. Движение осуществляется за счет двух монополярных очехленных жгутиков. Размножение клеток происходит бинарным делением. Строгий анаэроб. Каталазо-отрицательная бактерия. Использует лактат, формиат, водород, этанол, фумарат, аланин и пируват в качестве доноров электронов в присутствии сульфата. Использует сульфат, сульфит, тиосульфат, элементную серу, Fe(III) цитрат и Fe(IIl) ЭДТА как акцептор электронов в присутствии лактата. Психротолерантная бактерия, растет в диапазоне температур от -2 до 36°С (оптимум 26°С). Нейтрофил, растет при рН 6.8-7.4 (оптимум 7.0-7.2). Умеренный галофил, растет в диапазоне NaCI от 5 до 40 г/л (оптимум 20 г/л). Облигатно зависит от ионов Na+. Содержание Г+Ц в ДНК 42.3 мол %.

Типовой штамм K3ST (=ВКМ B-2877T=DSM 10034 !т) выделен из арктического криопэга (полуостров Ямал, Россия). Номер нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК в GenBank KJ739728.

Диагноз Desul/onatronum buryalense sp.nov. Desul/onatronum buryatense [bu.ry.at.en'se NL. neut. adj. buryatense, регион выделения Бурятия].

Клетки представлены грамотрицательными неспоровыми подвижными вибрионами размером 0.5-0.7x2.0-2.5 мкм с одним полярным жгутиком. Клетки встречаются одиночно или образуют короткие спириллы. Размножение клеток происходит бинарным делением. Строгий анаэроб. Каталазо-отрицательная бактерия. Использует лактат, формиат, этанол и пируват как донор электронов и источник углерода в присутствии сульфата. Использует сульфат, сульфит, тиосульфат, аморфную гидроокись Fe(lll) и элементную серу как акцептор электронов в присутствии лактата. Способен к сбраживанию лактата в отсутствии сульфата.

Мезофил, растет в диапазоне температур от 20 до 40°С (оптимум 34°С). Облигатный алкалофил, растет при рН 7.5-10.5 (оптимум 9.4). Умеренный галофил, растет в диапазоне NaCl от 2 до 40 г/л (оптимум 5 г/л). Облигатно зависит от ионов Na+, зависимость от карбонатных ионов не обнаружена. Доминирующие жирные кислоты (>10%) Сцо и С„и. Содержит менахинон МК-6(Н2). Содержание Г+Ц в ДНК 48.8 мол.%.

Типовой штамм Ki5T (=ВКМ B-2477T=DSM 26308т) выделен из донных осадков содового озера Соленое (Кяхтинский район, Бурятия, Россия). Номер нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК в GenBank KC4I7373.

Диагноз Anoxynatronum buryalense sp.nov.

Anoxynatronum buryalense [bu.ry.at.en'se NL. neut. adj. buryatense, регион выделения Бурятия].

Клетки представлены неподвижными палочками со слегка заостренными концами размером 0.4-0.7х2.0-6.5мкм. Размножение клеток происходит бинарным делением. Клеточная стенка грамположительного типа, содержит S-слой. Каталазо-отрицательная и оксидаэо-положительная бактерия. Аэротолерантна, присутствие < 4.5% Ог в газовой фазе не ингибирует рост. Осуществляет ферментативный метаболизм. В качестве источника углерода использует дрожжевой экстракт, триптон, казеин и разрушенную микробную биомассу. Не утилизирует сахара, пептон, пируват, фумарат, лактат, формиат, глутамат, пропионат, хитин, цитрат, метанол, бутанол, индивидуальные аминокислоты или пары аминокислот. Способен восстанавливать элементную серу и тиосульфат с образованием сульфида. При росте на дрожжевом экстракте образует аммоний, формиат, ацетат и пропионат.

Мезофил, растет в диапазоне температур 20-40°С (оптимум 30°С). Облигатный алкалофил, растет в диапазоне рН 7.4-11.0 (оптимум 9.6). Умеренный галофил, растет в диапазоне NaCl от 2 до 60 г/л (оптимум 20 г/л). Доминирующие жирные кислоты (>10%) Си 1Ш7с, С „к, о, С|6 о. Содержание Г+Ц в ДНК 46.1 мол. %.

Типовой штамм Su22T (=ВКМ В-2510т = СЕСТ 8731Т) выделен из донных отложений содового озера Сульфатное (Селенгинский район, Бурятия, Россия), Номер нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК в GenBank EU3I5116.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сульфатвосстанавливающие бактерии являются важным звеном микробных сообществ современных осадков Мирового океана, а также наземных экосистем, характеризующихся высокими концентрациями сульфатов. Диссимиляционное восстановление сульфатов в процессах образования минералов - широко известный биогеохимический процесс, в результате которого сера выводится из ее глобального круговорота.

Нами впервые проведена оценка численности СВБ с помощью ПЦР-РВ в двух экстремальных экосистемах - в криолэгах полуострова Ямал и донных осадках содовых озер Соленое и Сульфатное. Численность сульфатредукторов составила 7.9* копий

гена dsrA/т в донных осадках содовых озер, и 2.7*102-6.9*103 копий гена dsrABlмл в криопэгах. Представители рода Desulfonatronum присутствовали во всех исследованных образцах донных отложений содовых озер и составили 6.5-75% от общей численности СВБ.

Донные осадки содовых озер Соленое и Сульфатное стали источником выделения трех штаммов галоалкалофильных сульфатредукторов. Применение методов полифазной таксономии убедительно показало, что один из выделенных штаммов (Ki5T) представляет новый вид Desulfonatronum buryatense sp. nov. и является первой СВБ, способной к восстановлению Fe(III) в щелочных условиях. Новое свойство для представителей алкалофильных сульфатредукторов - способность использовать трехвалентное железо в качестве акцептора электронов - экспериментально подтверждено и для нового представителя вида D. lacustre - штамма Su2.

Новая протеолитическая бактерия 'Anoxynatronum buryatense' Su22T характеризуется способностью к росту на клетках сульфатредуктора, выделенного из этого же места обитания, что определяет экофизиологическую роль нового вида как поставщика аминокислот, ацетата и формиата в трофическую цепь алкалофильных микробных сообществ содовых озер.

Из арктического криопэга выделен новый психротолерантный галофильный сульфатредуктор, являющийся представителем нового вида 'Desulfovibrio algoritolerans' sp. nov. и характеризующийся способностью восстанавливать Fe(III) и расти при отрицательных температурах.

Новый психротолерантный изолят может представлять интерес как источник холодоактивных ферментов, а также как компонент искусственно создаваемых сообществ, способных к биодеградации загрязняющих природу веществ в холодном климате. Галоалкалофильные штаммы D. buryatense Ki5T и 'A. buryatense' Su22T также могут найти применение в биоремедиации окружающей среды, удаляя тяжелые металлы и соединения серы из сточных вод с высокими значениями рН и солености. Наличие S-слоя у штамма Su22T открывает перспективы его исследования и определения возможности применения в бионанотехнологии: в нанолитографии, а также для создания ультрафильтрующих мембран.

Таким образом, сочетание микробиологических и молекулярно-биологических методов позволило не только оценить численность сульфатредукторов в исследованных эконишах, но и получить новые данные о видовом разнообразии и метаболическом потенциале СВБ содовых озер и криопэгов. Выделены новые представители родов Desulfonatronum, Desulfovibrio и Anoxynatronum обладающие уникальными свойствами. Дальнейшее изучение этих свойств, расшифровка геномов новых бактерий и их анализ позволит оценить общие для прокариот и специфические для этих бактерий механизмы адаптации к соответствующим условиям среды.

ВЫВОДЫ:

1. Впервые проведена оценка численности сульфатвосстанавливающих бактерий в донных осадках содовых озер Соленое и Сульфатное (Южная Бурятия) и криопэгах полуострова Ямал методом ПЦР "в реальном времени". Численность СВБ в донных осадках содовых озер составила 7.9* IOJ-2.4* 106 копий гена dsrAIг, в криопэгах - 2.7*102-6.9*103 копий гена dsrAB/мп.

2. Применение разработанных праймеров на ген I6S рРНК рода Desulfonatronum позволило оценить распространение и численность СВБ этого рода в природных образцах содовых озер, составившую 6.5-75% от общего числа СВБ.

3. Психротолерантный галофильный сульфатредуктор, выделенный из арктического криопэга, является представителем нового вида ' Desulfovibrio algorilolerans' sp. nov. (K3ST= BKM B-2877T= DSM 10034IT) и характеризуется способностью восстанавливать Fe(III) и расти при отрицательных температурах.

4. Из донных осадков содовых озер выделены и охарактеризованы 4 новых штамма галоалкалофильных анаэробных бактерий, относящихся к родам Desulfonatronum (штаммы Ki4, Ki5T и Su2) и Anoxynatronum (Su22T). Штамм Ki5T (=ВКМ B-2477T=DSM 2630ВТ) является представителем нового вида Desulfonatronum buryatense sp. nov. Протеолитическая бактерия штамм Su22T представляет собой новый вид 'Anoxynatronum buryatense' sp. nov. (=BKM B-2510т=СЕСТ 8731т).

5. Впервые обнаружена способность использовать Fe(lII) в качестве акцептора электронов в условиях высокой щелочности среды (pH 9.5-10.0) представителями алкапофильных сульфатредукторов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Рыжманова Я.В., Вайнштейн М.Б., Щербакова В.А. Анаэробные бактерии содовых озер Южного Забайкалья // Вестник Уральской медицинской академической науки, 2011. № 4/1 (38). с. 86.

2. Ryzhmanova У, Nepomnyashchaya У, Abashina Т., Ariskina Е„ Troshina О., Vainshtein М., Shcherbakova V. New sulfate-reducing bacteria isolated from Buryatian alkaline brackish lakes: description of Desulfonatronum buryatense sp. nov. // Extremophiles, 2013. V. 17. p. 851-859.

Тезисы:

1. Рыжманова Я.В., Лауринавичюс КС. Применение ПЦР "в реальном времени" для определения состава анаэробных микробных сообществ в толщах многолетнемерзлых отложений // Сборник тезисов 13-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущине, 2009. с. 209.

2. Рыжманова Я.В., Лауринавичюс КС. Анализ анаэробных микробных сообществ в толщах многолетнемерзлых отложений методом ПЦР "в реальном времени".// Сборник тезисов всероссийского симпозиума с международным участием "Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов", Москва, МГУ им. М.В.Ломоносова, 2009. с. 159.

3. Ryzhmanova К, Troshina О., Laurinavichius К., Rivkina Е., Shcherbakova V. Development and application of a real-time PCR method for characterization of permafrost anaerobic microbial communities // 10th European Workshop on Astrobiology EANA, Institute of Physico-Chemical and Biological Problems of Soil Science, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Russia, 2010. p. 29.

4. Рыжманова Я.В., Ошуркова В.И., Лауринавичюс КС., Щербакова В.А. Анаэробные бактерии-спутники из умеренно минерализованного содового озера Сульфатное, Южная Бурятия // Сборник тезисов 17-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино, 2013. с. 43.

5. Ryzhmanova К, Shcherbakova V., Troshina О. Diversity of sulfate-reducing bacteria of Buryatian alkalinity-brackish lakes // The 5lh FEMS Congress of European Microbiologists, Leipzig, 2013.

6. Ryzhmanova У, Shcherbakova V. Molecular detection of the sulfate-reducing bacteria in extreme ecosystems and isolation of a new psychrotolerant sulfate-reducing bacterium from Arctic cryopeg // 10-й международный конгресс "Extremophiles", Санкт-Петербург, Россия, 2014.

Подписано в печать:

09.07.2015

Заказ № 10842 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.auloreferat.ru

-931 S

2015675307

2015675307