Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биоаккумулирование некоторых долгоживущих радионуклидов из природных и техногенных вод микроорганизма

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биоаккумулирование некоторых долгоживущих радионуклидов из природных и техногенных вод микроорганизма"

' На правах рукописи

2 Ь НДР 1997

ХИЖНЯК Татьяна Владимировна

БИОАККУМУЛИРОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ Д ОЛГОЖИВУЩИХ РАДИ ОНУКЛИДОВ ИЗ ПРИРОДНЫХ И ТЕХНОГЕННЫХ вод МИКРООРГАНИЗМАМИ

Специальность 03.00.07 — Микробиология 02.00.14 — Радиохимия

Автореферат

диссертации на сонсклние ученой стеиеии кандидата биологических наук

Москва — 1997

Работа выполнена в Институте физической химии РАН и в Институте микробиологии РАН.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор В. Ф. Перетрухни доктор биологических наук Н. Н. Медведева-Ляликова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В. К. Плакунов кандидат химических наук И. М. Косарева

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет имени М. В. Ломоносова,

факультет почвоведения, кафедра биологии почв

Защита диссертации состоится « ^ » —......

1997 г. в часов на заседании специализированного со-

вета Д 002.64.01 в Институте микробиологии РАН по адресу: 117811, Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН и Института физической химии РАН.

Автореферат разослан < У » .....^^г^/^ТЛ^г-___ 1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета, к. б. и.

Л, Е. Никитин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.. Проблема загрязнения окружающей среды актуальна для всех с фан, поскольку се решение не может быть эффективным только на национальном уропне

Загря темпе окружающей среды токсичными металлами и радионуклидами происходит п результате все возрастающей производственной активности человека, более широкой индустриализации всех отраслей промышленное!!! и сельскою хозяйства. Эти "за: рязннтелн" (промышленные отход!.!, в том числе радиоактивные) выбрасываются в атмосферу п волу, в почву и подземные горизошы, где нередко достигают высоких концентраций, превышающих предельно допустимые, особенно вблизи городских и промышленных центров. В связи с этим остро стоит проблема обезвреживания отходов. Существуют процессы иммобилизации и перевода в нерастворимую или менее растворимую форму токсичных металлов и радионуклидов в окружающей среде, которые основаны на микробной деятельности (например, при очистке вод от урана)

В настоящей работе основным объектом исследовании является технеций, искуственно полученный радиоактивный элемент, существование которого было предсказано /I И Менделеев!,1м иод N 43 в подфуппе Мп VII ipyniii.i Периодической систем!.! Техиеций-49 - долюживущпй продукт деления урана ("Г|/2~ 2.12*10? лег, испускает мягкое бета-шлучеиие. средняя энергия 150 юв) Содержание технеция в отработанном ядерном юнчнве колеблется от I кг*Т' до 3 кг*Т ' (в шшснмосги от типа реактора) В связи с большим периодом полураспада вклад в общую Р-акппшость составляет 0,1% через три юла после выгрузки топлива и увеличивается чере? 300 лег до .30-50% Технеций, благодаря споим сложным фтико-химичеекпм свойствам (например, леп'чесп. и растворимость) попадас! mi все типы радиоактивных о!ходов 3apci исфпроианы случаи попадания к'хнения в окружающую среду Так, гсхнецнн обнаружен в водах Ирландского моря, куда в 60-70-е п сбрасывались отходы английских предприятий по перерабо!ке отработанного ядерною топлива Миграция технеция-90 и других продуктов деления от английской атомной станции Селлафилд до Скандинавского полуострова занимает 4-5 лет Технеций обнаружен в подземных водах под подстилающими породами хранилища радиоактивных отходов в Хэнфорде (США). Технеций найден также в микроколичествах в водах рек Рона и Енисей

Химия технеция изучена слабее, чем у ею аналогов марганца и рения Технеций обладает переменной валентностью от +7 до -I, в степени окисления 7+ существует в виде оксида Тс207, который имеет кислотный характер и при растворении в воде дает юхнсцисвую кислоту- Гс207 + Н20 - 2ТсО/ + 2Н' В водных растворах иертсхнетатов в отсутствие восстановителей технеций (VII) достаточно устойчив в виде нона [Tc(V] в

различных средах (рН 0-14). Основная форма существования технеция в водных средах -ТсС>4" - слабо сорбируется минералами и горными породами. Технеций незначительно концентрируется большей частью растений и животных. Однако обнаружены некоторые организмы обладающие повышенной сорбционной способностью. К таким относятся лангусты, омары, некоторые представители красных и бурых водорослей. В то же время роль микроорганизмов в превращении и сорбции технеция изучена недостаточно

В связи с вышеизложенным, изучение роли микроорганизмов в аккумулировании и превращениях технеция представляется важным не только для общей микробиологии, по также с точки зрения очистки окружающей среды от долгоживущих радионуклидов

Нелыо настоящей работы является выяснение взаимодействия технеция с микроорганизмами, выяснение способности микроорганизмов восстанавливать пергехнетат для получения его в нерастворимом или слаборастворимом виде, а также возможность иммобилизации технеция микроор! аннзмами. Также предполагалось изучение экологического поведения таких долгоживущих радионуклидов как плутоний и кюрии. Все это дало бы научные основы для поиска или создания барьеров, препяговующих распространению технеция и, возможно, других радионуклидов в природе, что имеет существенное значение для охраны окружающей среды.

Основные задачи исследования

1. Провести скрининг микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам, для 01бора более активных по отношению к технецию.

2. Изучить устойчивость микроорганизмов к технецию.

3. Выяснить возможность использования технеция как конечного акцептора электронов в энергетическом метаболизме бактерий.

4. Попытаться создать систему с иммобилизованной биомассой для очистки растворов, содержащих технеций

5. Рассмотреть влияние микроорганизмов, обитающих в пресных водоемах, па технеций и некоторые трансурановые элементы в случае их попадания в водоем

Научная новизна работы Впервые рассмотрена роль ацидофильных тионовых бактерий ТМоЬасШдо 1"еггоох1с1ап8 и Т 1Ыоох1с1апз в превращениях технеция. Установлена возможность использования пертехнетата в анаэробных условиях как конечного акцептора электронов. Определены восстановленные формы технеция. Изучена устойчивое! ь названных тионовых бактерий к пертехнетагу.

Рассмотрена роль смешанных микробных популяций пресноводных анаэробных осадков в удалении технеция из водной толщи в нлы.

.ч

С (плана молельная лабораторная система с иммобилизованной биомассой сульфатрелуннруюпптх бактерий лля удаления технеция in растворов

Пракг11меска^с1!110сть_11сследава1!11я. Мы предполагаем, что полученные результаты Moiyr быть использованы для создания микробиологических методов очистки сточных вод, содержащих технеций, а также природных вод ок-р и рек, зараженных технецием и некоторыми трансурановыми элементами.

Апробация_работы Материалы диссертации докладывались на следующих

международных и российских конференциях и семинарах: в 1994 г - на I Российской конференции по радиохимии (Дубна, Россия); - на 5-ой Пжегадной научно-технической конференции ядерного общества (Обнинск, Россия), в 1996 г. - на конференции по аптотрофным микроорганизмам (Москва); - па русско-японском семинаре "Технеций-96" (Москва, Россия). В виде тезисов были представлены в 1995 г на 5-ой международной конференции "Миграцня-95" (С -Мало, Франция),

Публикации По материалам диссертации опубликованы три работы и одна сдана в печать

Объем тмяруктура^аботы^ Диссертация состоит нз введения, 8 глав, включающих обюр литературы и экспериментальную часть, заключения и выводов Работа изложена на 97 страницах машинописного текста, включает И таблиц и 21 рисунок Список литературы содержит 32 отечественных и 125 иностранных наименований

Место проведения работы. Работа выполнялась одновременно в Институте физической химии РАН в лаборатории радиохимических исследований (заведующий лабораторией -доктор химических наук проф В Ф Перетрухни) и в Институте микробиологии РАН в лаоораторпн экологии и геохимической деятельности микрооргани шов (заведующий лабораторией - доктор биологических наук проф В М Горлснко)

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ 11ССЛЕДОПЛШШ

Па первых этапах работы были использованы микроорганизмы различных таксономических групп бактерии: Psetu/omonas fluorescem, P.isachenkovii, P.cltromalopltila, I'.vanailiimircihiclaiis, Metliylobaclcrium nrgaimfiltim, Arlhrobacler sp; грибы Aspergillus nigcr; дрожжи I'iclmi wicker. Hhtxlntoriila rubra , актиномпцеты Slivphimyccs ¡¿albas, S. scabies

В опытах с тиоттовымн бактериями были использованы чистая культура Thiohacillus /crriimitlaiis BKM-U-458, выделенная Ляликовой нз шахтных иод Подмосковного угольного бассейна, тт чистая культура Thiohacillus thiooxufan.s BfCM-B-460 из Рочдольского серного месторождения, любеито предоставленная Г И Карапаико

В опытах с сульфап редуцирующими бактериями был использован вид Desulfuvihrio dcsuljuricans.

Для культивнрования сульфатредуцнрующих бактерий вида Demilfuvibrio desulfuricwis использована среда Постгеита С: г/л - К.Н2Р04- 0,5; NH4CI - 1; Na2SO, - 4,5; СаС1/6П,0 -0,06; MgS04*7H20 - 0,06, лактат натрия - 6 мл (50% раствор); дрожжевой экстракт .- 1; FeS04'|,7H20 - 0,004, цитрат натрия двуводнып - 0,3; вода дистиллированная - I л, рН среды -7,0-7,2

Среда разливалась во флаконы но 100 мл, закрывалась резиновыми пробками, фиксировалась металлическими крышками, была продута азотом в течение 10 мин. Автоклавировалась 15 мин Анаэробно инокулировалась бактериями, посевной Maiepnaa -10% Для экспериментов была использована 48 часовая культура, трижды отмытая стерильным буфером 20мМ MOPS - 3-(N- Morpliolino-propane-sulfonic acid) ( для полного удаления сероводорода)

Дли культивировании тионоиых бактерий: для Thiobacillus t'errooxidans была использована среда 9К с меньшим количеством железа - 700 мл дистил. воды - (NH^jSOj - 3 г, KCI - 0,1 г, К2ПР04 - 0,5 г; MgSO, - 0,5 г; Ca(NOj)2 - 0,01 г; 300 мл дистил воды - I мл конц H2S04; 10 г FeS04*7H20

Два раствора юговягся отдельно, автоклавируются и непосредственно перед употреблением смешиваются pli среды 2,5. Бактерии выращивались на качалке. Перед экспериментами отмывались подкисленной водой для удаления трехвалентного железа

Для Thiobacillus thiooxidaiis была использована - среда Ваксмана на I л водопр. воды -(NH4)2S04 - 0,2 г; КН2Р04 - 3 г; MgS04 - 0,5 г; СаС12 - 0,25 г; FeS04*7H20 - следы, серу (порошок) стерилизовали отдельно в колбе 96% этиловым спиртом.

Дли хромвосстанавлииающих бактерий использовали среду, дистил.вода I л -NH4CI - 0,3 г; КИ2Р04- 0,3 г; MgSO/711.0- 0,1 г; NaCl- 0,1 г; (NH4).Cr04 - 0,2 г; лактат натрия - 2 мл (50% раствор). После стерилизации доводили рН до 7,0.

Дли сульфагредуцнрующей ассоциации использовали среду, дистил вода - 1 л, лактат натрия - 1.5 мл (50% раствор), NH4C1 - 0,5 г; КН2Р04 - 0,3 г; дрожжевой экстракт -0,05 г; MgS04 - 0,1 г, микроэлементы по Пфенншу - 1мл.

Двух и трехвалент ное железо определили колориметрическим методом (Резников и др., 1970]

I'aiiioua.ieiiTiibie формы технеции Tc(VII), Tc(V) и Tc(IV) определяли хроматографическнм мстодом [Shukla, 1966],

Биомассу бактерий определяли по количеству белка микрометодом Бредфорда [Bradford, 1976] пли с бнепнхоншювой кислотой [Smith et al, 19S5]

Определение радиоактивности растпора: Определение плутония и кюрия в растворах проводилось радиометрически или по альфа-спектрам обратной, приготовленных нанесением на полированные мишени in нержавеющей стали, высушенные и прокаленные в течение I мин при температуре 500-600 С на отечественном спектрометре типа СЭА-01, в котором п качестве детектора альфа частиц исполыовался юлото-кремниевый детектор мша ДКП-сд-125 Точность измерении ± 3% Определение технеция проводили на бета-установке типа NZQ 605 (ЧСР) после нанесения растпора на мишенн in нержавеющей стали н высушивания при комнатной температуре Или на жидкостном сцшпилляциомном счетчике LKB Wallak Oy RACKBETA

Во всех экспериментах (кроме оговоренных) был использован долгоживуший иютон технеция - ""'Гс (Тп = 2,12* Ю5 лет)

Необходимо разделить термины виксчрбчии - пассивная сорбция и комплексообразование попов металлов микробной биомассой п/илп петсспзами, производимыми клетками и йипакьуиуш/книнше - пол которым мы подразумеваем все тгроцсссы связывания ионов мечалюв живыми клетками, а также все механизмы бпосорбцни, внутриклеточной аккумуляции и бпоосаждсиия В настоящей работе мы считаем более корректно использование термина бпоаккумул про ванне

ПМУЛЬТЛТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОГ.СУ/КДКШП;

1 Скрининг культур микроорганизмов различных таксопомпчских трупп Нами быта исследована сорбция технеция микроорганизмами различных таксономических ipvini - бактерий, грибов, дрожжей, актиномицетов Работа проводилась совместно с доктором Френкелем В Л в институте геохимии РАН В целом микроорганизмы слабо сорбируют lexHCHiin в виде пертехнетата (ТсОГ). гак как клеточная стенка микроорганизмов заряжена отрицательно

I,

Таблица I Сорбция коротко-живущего техпецпя-У5м (Т 1,2-6,1 ч) мпкроорииппмамп различных таксономических групп и аэробных и анаэробных условиях и течение 1,5-2 ч Точность определения -10%___

Микроорганизмы OciiUO'lllUM радиоактивность pac i вора, % MiiKpoopi аишмы Ociarciiiiiu радиоакт iiuiioct 1. раст вора, %

Контроль 80 Arthrobacter sp 47

Pseudomonas fluorescein 40-30 Methylobacterium sp. 30

P. vanadiunireductans 32 Aspergillus niger 2-4

P isachenkovii .50 Pichia wicker 26-48

P.cliromatophila 33 Streptomyces galbus 53

Rhodotorula rubia 34-55 S. scabies 49

Накопит к-ра 12

Мы предположили, чт большой пшерес и перспективу и удалении семивалсш 1101 о технеция из раствора должны представлять мнкроорганн ¡мы, обладающие восстановнтельнымп св0нс1вамп Ьыли исследованы бактерии, восстанавливающие ванада! - l'.wiidoimnias vaiiadiiiiiiivdialans 11 l'.wiidninoiias i.viclicnkovii, ipno Scupulariop.sis bicvicaii/is (восстанавливающий мышьяк (V) и теллура! ы), микробные ассоциации, восстанавливающие сульфаты и хромат ы

Наиадашосстанавлнвающие бактерии оказались способны сорбирован, технеции Коэффициент концентрирования составил 15-21, причем сорбция живыми бактериями оказалась в 4-5 ра) выше, чем кле1камн, убшыми кипячением Механшм сорбции Tc(Vll) этими мнкроортанншамн пока не выяснен Однако методом бумажной хромаю: рафии доказано образование нятпвалеппкно технеция

Таблица 2. Сорбция техпецня-УУ ваиада! восстанавливающими бактериями

и) водно! о раствора за 7 дней при комнатной температуре, pi I 7-7,2;

Бактерии Копией трацпя NaTcOj мг/л Количест во белка в опыте mi Радиоактивность фильтра 1>к (имп/сек) Контроль Живые Убитые без клеток клетки клетки Ks * мл/1

I', vanadium leductuns 48 60 1,3 285 48 21

!'. isachenkovii 48 50 1,3 205 48 15

* Rs= конце! п рация Тс в микроор! ашпмах * V (мл)

концентрация Тс в исходном растворе ш (г)

Среди использованных нами микроорганизмов, наиболее высокие знамения коэффициента концентрирования технеция получены при использовании анаэробной чроматвпсстанапливающей ассоциации, выделенной нами in р Яузы ниже вагоностроительного завода Коэффициент концентрирования составил (4,1 0,1)*ю\ Однако мы столкнулись с рядом трудностей при культивировании данной группы микроорганизмов и вынуждены были пока отказаться от нее.

Эксперименты с использованием грибов Scopuhmopsis brcvicitiilis и дрожжей I'ichia wicker показали, что при начальной концентрации технеция 24 мг/л через 5 дней радиоактивность раствора уменьшалась па 58% и 40% (соответственно)

Опыты с сульфатредуцпрующей анаэробной ассоциацией показали 47% очистку раствора, содержащего технеций (см. табл 3). В дальнейших исследованиях были определены оптимальные условия.

Таблица 3 Гиюакумулпроваиие технепия-99 анаэробной сульфат редуцирующей

ассоциацией в анаэробных условиях при 3U°C за 2 cyi

Объем Концентрация Радиоактивность раствора. Iïk/20 мкл У*

рпст вора NaTcOi, мг/л Контроль Опыт %

i мл 30 378 281 25

4 мл 30 370 148 47

* У - степень итпечепня радионуклидов из водной фазы в микроорганизмы и коллоид, рассчитанная по формуле [ (С,,,., - С„„„) / С,,.,., ]* 100%.

2 Исследованиероста тионо!1ЫХ_ба1пер_ип с использование пергехпетта

Основное внимание в нашей работе было уделено авнирофным тионовмм бактериям рода Пш>Ьас111н\, окисляющим в кислой среде закненое желею, различные соединения серы, в юм числе сульфидные минералы, четырехвалентный уран, а также способным восстанавливать трехвалентное железо в процессе анаэробного роста

Впервые нами было установлено, что тионовые бактерии рода НниЬааНнх способны осуществлять принципиально новый тип энергетического метаболтма - анаэробное дыхание с пертехнетатом как конечным акцептором электронов. 13 качестве доноров электронов в этом процессе может быть использовано двухвалентное железо и элементная сера, при этом происходит восстановление семивалентного технеция, а восстановленные формы технеция обладают меньшими значениями растворимости и легко соосаждаются с фехваленгным железом; при этом радиоактивность раствора уменьшается. Нами было получено уменьшение радиоактивности на 60-70%.

Опыты но воздействию 'ШоЬасШи.ч/егго/т^ат на пертехнетат натрия проводились как в а>робпы\, гак п в анаэробных условиях на среде УК с 5 г/л закисного железа. Опыты

проводились в пеницнллиновых флаконах, куда вносили суспензию бак!ерий с ппипслыюп средой в количестве 3-4 мл. Флаконы были закрыты резиновыми пробками и продуты аргоном в течение I мин для создания анаэробных условий. В опытах, где использовали аэробные условия пеницнллнновые флаконы были закрыты ватными пробками. За1ем стерильно с помощью шприца вносили раствор нертехнетата натрия так, что конечный объем раствора равнялся 4-5 мл, а конечная концентрация раствора - 50 мг Тс/л Длительность опыта - 8 дней

Перед началом опыта (отцентрпфушровав содержимое флаконов) отбирали 20 мкл для определения начальной радиоактивности раствора После окончания экспозиции содержимое флакона также центрифугировали и отбирали 20 мкл суиернаганга для измерения конечной радиоактивности раствора. Радиоактивность измеряли с помощью сцинтилляционного счетчика КАСКВНТА. Бактерий отделяли фильтрованием (поликарбонатный фнлыр, размер нор 0,08 мкм). Результаты трех серии оныюв представлены в таблице 4, |де дакмся средние данные из 8 повторное!ей В таблице помещены данные, пересчитанные на полный обьем жидкости в опыте.

Таблица 4. Бноаккумулироиание 1схнепня тионовымп бактериями У'./ет/охикшч рП 2,5; 1^30оС, Т-8 дней_

Начальное Конечное Радиоактивное п. Радиоакшвносп. У*

Условии КО.ТИЧ1Ч'111(1 количсс ■ - коллонднон о I фильтрованных %

1СХ11СЦШ1 110 фа н>1 клеток'

имп/мнп технеции пмн/мнн ими/мни ими/мин

Аэробные 1,1*10' 0,8* 4 О7 2,0*10" 1,04* Ю5 25

Анаэроб 2,1 * 107 1,14*10' 2,1*10" 2,3 * 105 46

н ые 1,16*107 0.8* 101 0,06*10" 1,3*105 30

*У-см выше (таблица .3)

Необходимо отметить еще один факт. После окончания опыта содержимое центрифужных пробирок (не перемешивая) было помещено в морозильную камеру После замораживания наблюдалось образование темно-коричневой пленки, которая была проанализирована и представляет собой коллоид Рентгеновски!! микроанализ покашл, чю в коллоиде содержшся технеций, железо и сера Мы предполагаем, что во время рашшня бактерий происходило восстановление семивалентного технеция до ТсО;, который за!ем образовывал коллоидные формы Ренттеноструктурный анализ не иошолпл оиределшь строение вещества, т.к данное соединение оказалось ренггеноаморфным

Была исследована решаентиость тноновых бактерий к технецию Полученные результаты показывают, чю Т./с/гоохи/чп.ч обладает достаточной устойчивости к

технецию, чтобы эти бактерии можно было использовать для удаления технеция из кислых растворов Тионопыс бактерии оказались способны осуществлять метаболические процессы до концентрации технеция 100 мг/л, и, таким образом, более устойчивы чем несерные пурпурные бактерии, растущие до концентрации технеция 1 мг/л, однако тиоиовые уступают в резистентности зеленым водорослям рода СЫогеНа, способным расти до концентрации технеция 600 мг/л

Таблица 5. Влияние различных концентраций технеция на окисление железа и рост 'Мсттхнктх и аэробных условиях Т=30 С, время - 7 дней, начальная концентрация белка в эксперименте 10 мкг/мл. 2.5

Конпситранил технеция мг/л Количество образованного Ре'1*, мг/л Концентрация белка к концу опыта, мкг/мл

0 2500-2800 75

50 275-285 35

100 200,400 30,45

250 50-60 15

500 0 10

750 0 10

11100-1750 0 10

Памп было выяснено влияние высоких концентрации юхмения на фишологнческое состояние тоновых бактерий с помощью метола рентгеновского мнкроаналтна При концентрации технеция 200 мг/л в элементном составе клеток Г.^пчипи/аи* снижается количество некоторых биохимически значимых элементов (таких как калий и фосфор) (см рис 1) Тноновые бактерии еще могут окислять двухвалентное желето (для поддержания жтнеспособности), однако уже не способны расти и накапливать биомассу. Отсутствие или снижение количества таких важных элементов клетки как фосфор и калин свидетельствует о высокотоксичном воздействии данной концентрации технеция иа Т./сггоохШат. Концентрация технеция, обычно используемая нами в экспериментах (50 мг/л технеция), и концентрация сбросных растворов атомной промышленности (1-30 мг/л) значительно ниже найденной нами пороговой концентрации технеция (100 - 200 мг/л) и не оказывает отрицательного воздействия на биохимические процессы клетки Таким образом, устойчивость тноиовых бактерий к технецию достаточна для их использования при очистке тппкоактппнмх отходов, содержащих технеций.

Для уточнения того, как изменилось валентное состояние технеция под воздействием бактерии при росте Т./сггппхШа/н с нспочыопаинем двухвалентного желе та и пертехнетата.

РИС.1. ' '.кMUiim.iii .iimjiii cociaiia h лоток Tliiohaullu.s Гиич>лк1.ш.> ;i ) i iii-n. и выражены IM «(Н ДС IK' lOju p'Kaiiu'ii u-nu'iimi 0) i.jii ikii m.ipaiiuTii.i на срсдс i iomuuikm.

был использован метод бумажной хроматографии. Например, при исследовании кулыуральной жидкости было получено следующее: 80% технеция находится в семнвалеитной форме (1^ = 0,7), 10,9 % перешло в пятивалентное состояние и (согласно данной методике) остается на старте (Яг = 0), н 5,2% технеция перешло в четырехвалентное состояние и движется с фронтом растворителя (1^ = 0,9). На следующем рисунке (см. Рис.2) покатаны результаты компьютерной обработки хроматограммы, на которую был нанесен коллоид. 'Здесь семивалентного технеция осталось только 10,9%, 61,6% переходит в мя | ивалентное состояние (Яг = 0) и 27,5% в четырехвалентное (1^ = 0,9).

3

Рис 2 Хроматографнческое распределение размовалентных форм технеция в коллоидной фракции, полученной в анаэробных условиях с Т./атоохиктх. I - Тс (V) -61%, 2 - Те (VII) - 10,9%; 3 - Тс (IV) - 27,5%.

Помимо опытов на среде с закисным железом, Т./сггоохнктх был выращен также на среде Иаксмана с элементной серой и пертехнегатом в анаэробных условиях. Через 7 дней в пеипцнллнновые флаконы был добавлен раствор трехвалентного железа (500 мг/л). Хорошо и ¡вестно, что гидроксид трехвалентного железа не захватывает семивалентный технеций, но соосаждает четырех и в меньшей степени пятивалентный. В этих условиях нами было получено уменьшение радиоактивности раствора на 39-43%, что показывает наличие четырехвалентного технеция в растворе.

Исходя из данных Брока и Густавсона о возможности анаэробного развития ТШоЬааНих //штук/чих на элементной сере, была поставлена серия опытов с этой культурой, но вместо трехвалентного железа в качестве акцептора электронов был добавлен семивалентный технеций (40 мг/л). Опыты проводились как в аэробных, так п в анаэробных условиях. Для

этого часть флаконов была продута аргоном и углекислотой. Трехвалентное железо (в концентрации 200 мг/л) было добавлено через 8 дней опыта. В Таблице 6 приведены полученные результаты.

Таблица 6. Биоаккумулирование технеция-99 из раствора пол действием ТМшюхШат при росте на элементной сере. Исходная концентрация технеция 40 мг/л, 1~30 С; Т= 8 дней

Остаточная радиоактивность Биоаккумулнрованис

Условия раствора, имп/мнн %

Контроль без бактерии 1,57*10" 0

Аэробные 1 0,55*10" 65

2 0,20*10" 87,3

Анаэробные 3 0,69*104 56,1

4 0,53*10" 64,3

Методом бумажной хроматографии показано наличие пятивалентного технеция в культуральной жидкости

Для выяснения того, вовлечен ли технеций в метаболические процессы клетки, был поставлен ряд экспериментов с одним из ингибиторов - азидом. Согласно гипотетической схеме, предложенной Пронком, азид в концентрации 10 мкМ ингибирует на 95% окисление закпеного железа за счет кислорода у ТЫоЬасШив 1е:тоох1с1а115, но не подавляет окисление элементной серы и формиата за счет трехвалентною железа В наших опытах с азидом длительностью 7 дней процент ннтпбирования окисления железа кислородом был 20-40% В анаэробных условиях без азида остаточная радиоактивность раствора 54-70% (по отношению к начальной), в опытах с азидом - 48-80%. Если учесть погрешности измерении и взять средние значения, то они окажутся равными 62 и 64% Это свидетельствует о -том, что азид не влияет на анаэробное дыхание клетки за счет пертсхнстата, и что самое главное -пертехнетат вовлечен в метаболические процессы получения энергии Т./егпюхШапх.

При росте тноновых бактерий на сульфидных рудах (колчеданная руда Дсгтярского месторождения) происходит 40% уменьшение радиоактивности раствора через 1 месяц

Полученные результаты расширяют наши представления об энергетическом метаболизме ацидофильных тноновых бактерий.

60-70% извлечение технеция из раствора (при начальной концентрации технеция 30-60 мг/л) даст основание надеяться, что дальнейшая работа по оптимизации биоаккумулирования технеция тионовыми бактериями перспективна и может привести к разработке биотехнологического метода очистки низкоактивных слабо-кислых отходов, содержащих технеции.

К)

.4 Извлечение. тг-*"риия__кюрия и плутония из волной фазы илами—гщееновлаиого

ев1московской области.

Как уже отмечалось выше, технеций образуется с достаточно большим выходом (-6%) в процессе деления урана. В последнее время отмечены случаи попадания технеция в окружающую среду из хранилищ атомных отходов. В связи с этим нами было исследовано жологическое поведение технеция и некоторых актинидов в пресноводном евтрофном озере средней полосы России (в лабораторных модельных экспериментах).

Пробы ила и придонной воды были отобраны батометром Молчанова в апреле 1994 юда на глубине 9 м Соотношение взвешенных иловых частиц к жидкости (в объемных долях) составляло 13. Соотношение твердой и жидкой фаз - 0,023 г/мл. рН озерной воды равнялась 7 н практически не изменялась после введения радионуклидов

Сорбция технеция естественными илами озера составила 98%, причем основную роль в эюм процессе играют микроорганизмы Кинетика сорбции технеция дана на рнс.З. Кривая У К-(1п\)'' (где М- начальная концентрация технеция, х - время) удовлетворительно описывает полученные результаты Сорбция актинидов (см. таблицу 7) также составляет 9№о, но оказалась сложной - двухкомпонентноГг фнзикохпмическая сорбция илами (соаавившая -34%) и биологическая (-65%). Необходимо отметить, что в сорбции плуюппя и кюрия также важную роль траст микрофлора плов.

У = N - (1и х)и. Ось X - время, ось У - остаточная радиоактивность раствора, %.

математическая обработка

экспериментальных данных:

Рис 3 Кинетика удаления технеция естественными илами евтрофного озера (1) при соотношении тв/ж фаз=0,023 г/мл (2)

3 '/ 5 й У 8 ]п X

»

Таблица 7. Сорбция плутоиия-239 и кюрня-244 естественным и стерильиым »лом при соотношении тв/ж фаз = 0,023 г/мл__

Радионуклид Дата 'Гни нла Удельная радиоактивность р-ра Бк/мл Сорбция актинидов илом У*, %

Ст-244 IV. 1994 естественный 3600 97

стерильный 3700 100

VIII. 1994 естественнй 50 1,5

стерильный 2300 62

Ри-239 IV. 1994 естественный 1100 92 -

стерильный 1200 100

VIII. 1994 естественный 0,8 0,07

стерильный 800 66

* У - степень извлечения радионуклидов из водной фазы в ил,

рассчитанная по формуле. [ (Снач - Скон)/Снач ]*100%

В случае попадания изучаемых нами радионуклидов (технеция, плутония и кюрия) в окружающую среду, они будут полностью сорбированы иламп пресноводного евтрофного (богатого органикой) озера за один летний сезон Полученные нами результаты могуг быть в той или иной степени перенесены и на другие пресные водоемы нашей страны

4 Кинетика удаления технеция-99 из растворов чистыми культурами сульфатредуцирующих бактерий.

Как показали результаты первого этапа наших исследовании, сульфатредуцнруюшпе бактерии перспективны для очистки растворов, содержащих технеции В тгнх экспериментах была использована культура Desuifovibrio dcsulfuncans. Использовались бактерии, выращенные на среде Постгейта С в течение 48 часов. Затем биомасса была отделена центрифугированием (3000 об/мни) и трижды отмыта буферным стерильным раствором 20 мМ MOPS. Условия эксперимента: в мешщнллшювые флаконы (объем 12 мл) добавлено 0,025 мл 50 мМ раствора пертехнетата натрия, флаконы закрыты резиновыми крышками и металлическими колпачками, продуты азотом 5 мин, затем в течение 11 мин при 126°С автоклавированы. Далее стерильно, анаэробно добавлены (1 мл) клегкн бактерий в буферном растворе. Количество белка определялось с помощью бисинхониновой кислоты В качестве доноров электронов в экспериментах были использованы водород и формиат натрия (1 М раствор). Для этого первая серия флаконов была продута в течении 3 мин водородом, во вторую серию стерильно добавлено 0,025 мл раствора формиата натрия В

Iречью сершо флаконов ничего не добавлялось, так как эта серия была использована в качест ве контроля, не содержащего доноров электронов. Эксперименты проводились при 30 С. Через каждый час были отобраны пробы по 0,1 мл, отцентрифугированы 10 мин при 13000 об/мин. Пробы но 10 мкл нанесены на хроматографическую бумагу (Ватман ЗМ) и помешены в Pospliour Screen Imager на 8-15 часов. Полученные результаты представлены на рисунке -4 В случае с формиатом остаточная радиоактивность раствора составляет 20-27% через 4 часа эксперимента

Рис 4. Извлечение технеция пз раствора сул ьфатредуцирующ ими бактериями вида 1)ехч1/тчЬгю Ж\н1/иг1Ссш.ч. В качестве допоров электронов использованы 1 водород, 2 - формиат; 3 - донора ист. Ось X - время, час; ось У -остаточная радиоактивность

раствора, %

Удаление гехмецня__из_раствора иммобилизованной биомассой

сульфа I редупфуюшмх бактерий

Впервые нами покатана возможность сорбпии технеция иммобилизованной биомассой сульфат редуцирующих бактерий Удаление радионуклидов из раствора иммобилизованной оиомассой бактерий имеет ряд преимуществ перед свободиоживущими бактериями: клетки расположены на носителе, не вымываются раствором, более длительный срок жизни системы, самовосстановление системы. Нами была предпринята попытка создания лабораторной установки с иммобилизованной биомассой 1Х>\и1/о\чЬг1о

В многочасовых экспериментах (140 ч) в лабораторных условиях проверена способность бактерий восстанавливать и удалять технеций из раствора. При низких скоростях подаваемого в систему раствора (когда идет смена нескольких объемов опореактора в сутки) идет восстановление семивалентного технеция и полная иммобилизация Тс02 на волокнах системы. При увеличении скорости протока (когда смена рабочею раствора биореактора происходит каждый час) наблюдается снижение эффект нвностн сорбции технеция до 70% (см. рис.5) Отличительная особенность в том, что при снижении скорости система снова возвращается к равновесному состоянию п полному

удалению технеция из раствора. Сравнение наших результатов и данных, полученных Ллойдом (Бирмингемский Университет, Англия) прн работе гетеротрофных бактерий в аналогичной системе. показывает более высокую эффективность работы сульфагредуцнрующнх бактерий, используемых нами, по сравнению с Е.соИ (см. рис.5)

Рис.5. Удаление технеция из раствора бактериями видов 1).с/е.чи1/шчс1ш.\ и Е-сок при одинаковых условиях оныга (40 мг биомассы. 25 мМ раствор технеция-99) Ось У - процент удаленного технеция; ось У. -скорость протока, мл/ч

Полученные памп факты позволяют предположить в будущем использование системы с иммобилизованной биомассой бактерий для очистки низкоактивных оводов, содержащих технеций

6 Исследование ферментной системы сульфатрсдуцпрующих бактерий, вовлеченной в в осста но в лен не сем! I в ал с 11 гного техпещ |я

Нами была предпринята попытка выяснить какая группа ферментов полисмена в восстановление пертехнетата натрия у /)е.чн//(тЬпо Жм^/ипсшп. Приготовление биомассы описано выше Во всех случаях был использован раствор пертехнетата натрия, далее доноры и акцепторы электронов были следующими I - формиат; 2 - контроль (нет донора), 3 -формиат + 1мМ КЫОЗ; 4 - формиат + 10 мМ ККОЗ; 5 г формиат + 100 мМ КШ.З; 6 -водород (3 мин), 7 - водород (3 мин) + 10 мМ КК'Оз Условия эскпсриментов и отбор проб аналогичны.

Известен целый ряд микроорганизмов, способных восстанавливать переменновалентные элементы. Процесс восстановления идет с участием как специфических, так и неспецифнческнх ферментных систем. Однако необходимо отмстить следующую последовательность передачи электронов от окисляемого вещества к

терминальным акцепторам электронов в анаэробных условиях: N03", Мп4+, РеЗ+, 5042-, С02, УОз", ТсОЛ

В наших экспериментах были проанализированы такие акцепторы электронов как шпрат и пертехнетат. В анаэробных условиях у НехиЦт&г'ю АехиЦигшстх, который имеет ннтратредуктазу, добавление нитрата подавляет восстановление семивалентного технеция, по уменьшения радиоактивности раствора не происходит (см. рис.6).

Рис. 6. Удаление технеция-99 (Тс(УН)) из буферного раствора, содержащего пертехнетат, под действием Оехи1/и\чЬпо

скчи1/и/1сш1Х. Доноры и акцепторы электронов: 1 - формиат; 2 -

формиат, 1 мМ КЫОз, 3 -

формиат, 10 мМ К1М03; 4 -

формиат, 100 мМ КЬЮз, 5 -

донора нет. Ось X - время, час, ось У - остаточная радиоактивность раствора, %.

Конкурентное действие нитрата на ферментную систему было проверено и в иммобилизованной системе микроорганизмов. При добавлении нитрата в процессе опыта идет в первую, очередь потребление нитрата, и таким образом, в это время не происходит потребление технеция и наблюдается увеличение остаточной радиоактивности раствора. При1 полном потреблении нитрата идет удаление технеция. При добавлении большего количества нитрата в систему, снова идет в первую очередь удаление нитрата и увеличение конечной радиоактивности раствора, так как система продолжает работать в проточном режиме. При смене исходного раствора на раствор, не содержащий нитрата, система возвращается в исходное состояние - полное или почти полное удаление технеция из раствора (см рис.7 ).

60 ■ ко ¿o

+

<.„/II KfJP,

+

ЮмН KV03

to

30

5E>

КЩ

10

Рис. 7. Конкурентное удаление нитрат-иона и технеция (VII) in буферного раствора

иммобилизованной биомассой Desuljovihrio dcsulfiiricans. Ось X -время, час; ось У - остаточная радиоактивность раствора. %

Полученные результаты позволяют придти к выводу, что вероятнее всего в восстановление технеция сульфатредуцирующимн бактериями, которые обладают иитратредуктазнои активностью, вовлечена нитратредуктаза.

ВЫВОДЫ:

1 В настоящее время литературные данные о взаимодействии технеция и микроорганизмов немногочисленны. В связи с этим нами был проведен скрининг культур микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам Показано, что наиболее перспективны в удалении семнвалентного технеция из раствора микроорганизмы, обладающие восстановительными свойствами - бактерии, восстанавливающие ванадаты, сульфаты и хроматы.

2. Впервые показано, что автотрофные тноновые бактерии (Thiobacillus ferrooxidans и Т thiooxidans) способны расти в анаэробных условиях с использованием в качестве донора электронов двухвалентного железа и элементной серы, а в качестве акцептора электронов -семивалентного технеция. При этом происходит восстановление семивалентного технеция до пяти н четырехвалентного состояния и уменьшение радиоактивности раствора в анаэробных п аэробных условиях на 60-70% (по отношению к исходному).

3 Показана способность Т.ferrooxidans окислять колчеданную руду (состоящую из иприта FeS.i с примесью халькопирита CuFeS) в анаэробных условиях за счет восстановления семивалентного технецмя - при этом 40% технеция было восстановлено и перешло в осадок под действием трехвалентного железа и коллоидных рудных частиц.

4 Исследована кинетика сорбции технеция, плутония и кюрия илами пресноводного евтрофного озера, на примере оз.Белое Коснно Московского региона. Основными микробными процессами в илу были меганогенез и сульфатредукция. Модельными опытами показано, что в случае попадания радионуклидов в окружающую среду они будут полностью сорбированы илами за один летний сезон. Сорбция технеция составляет 98%, причем основную роль в этом процессе играют микроорганизмы Сорбция актинидов более сложная

- можно выделить физико-химическую сорбцию, которая составила ~ 34%, и биологическую

- составившую ~ 65%.

5. Впервые показана возможность удаления технеция иммобилизованной биомассой сульфагредуцирующнх бактерий Desulfovibno clesulfuricans. Исследованы различные параметры удаления технеция из раствора (скорость протока в системе, используемые доноры электронов). Если смена объема биореактора проходила за время не менее 2 часов, технеций был удален на 100%.

6. Полученные результаты позволяют предложить использование системы с иммобилизованной биомассой сульфагредуцирующнх бактерий для очистки низкоактивных отходов, содержащих технеций. Также проведенные исследования дают основания надеяться па применение биотехнологнческнх методов в промышленных условиях для удаления и других долгожнвущих радионуклидов.

Материалы диссертации были опубликованы и представлены:

1. Ляликова Н И , Хнжняк Т.В. Восстановление семивалентного технеция иод действием ацидофильных бактерии рода Thiobacillus Микробиология, 1996, т.65, N 4, стр. 533-539

2. Перетрухни В.Ф., Хнжняк Т.В., Ляликова Н.Н., Герман К.Э Ьиосорбция тсхнеция-99 и некоторых актинидов донными осадками, взятыми из озера Белое Косино Московского региона Радиохимия, 1996, т.38, N 5, стр.471-475.

3. К Е German, T.V.Khiznyak, N.N.Lyalikova, V.F.Pcretrukhin. Technetium bioac- cumulation by microorganisms Journ. Nucl. Biology and Medicine, 1994, v.38, N 3, p.406

4. Герман К.Э , Хнжняк Т В., Ляликова Н.Н , Перетрухни В Ф. Влияние примесных нород и микроорганизмов на сорбцию технеция из НЛО и природных вод 1-я Российская конференция по радиохимии, Дубна 17-19 мая 1994, тезисы конференции, стр 144

5. Герман К.Э, Хнжняк ТВ., Ляликова ПН., Перетрухни В.Ф. Биоаккумулирование технсцня-99 микроорганизмами различных таксономических групп и их влияние на поведение технеция в окружающей среде Пятая ежегодная научная конференция Ядерного общества, Обнинск, июнь 27-июль 1,1994, р.498-499

6 T.V.Khizhnyak, K.E.German, N N Lyalikova, V.F.Pcretrukhin. The role of microorganisms, algae and organic remains of sediments in the behaviour of technetium in fresh water lakes Fifth International Conference "MIGRATION,95", Saint-Malo, France, September 10-15, 1995, Ahstr N PB4-07.

7. Хнжняк Т.В . Ляликова Н II Использование семивалентиого технсипя в метаболических процессах ацидофильных тиоиовых бактерий. Конференция "Авгозрофныс микроорганизмы", 23-25 апреля 1996, МГУ Тезисы конференции, стр.79

8. Khijniak T.V. , Lyalikova N N., German K.E., Peretmchin V.F. Uptake of technetium by bottom sediment of fresh water lake and role of microorganisms in this process. Russian-Japanese seminar "Technetium-96", 1-5 July 1996, Moscow. Proceedings, p 38-40.