Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Распространение и активность алкалофильных сульфат- и железоредуцирующих бактерий в содовых озерах Забайкалья

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Распространение и активность алкалофильных сульфат- и железоредуцирующих бактерий в содовых озерах Забайкалья"



На правах рукописи

ЗАХАРЮК Анастасия Геннадьевна

РАСПРОСТРАНЕНИЕ И АКТИВНОСТЬ ЛЛКЛЛОФИЛЬНЫХ СУЛЬФАТ- И ЖЕЛЕЗОРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В СОДОВЫХ ОЗЕРАХ ЗАБАЙКАЛЬЯ

03.00.16 - экология 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Улан-Удэ - 2010

003493227

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Козырева Людмила Павловна

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук Пименов Николай Викторович кандидат биологических наук Сыренжапова Арюна Сыдынжаповна Учреждение Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Защита диссертации состоится «25» марта 2010 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 212.022.03 в Бурятском государственном университете по адресу: 670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24 а, биолого-географический факультет, конференц-зал.

Факс: (3012)210588

E-mail: d21202203(8)mail.ru kuran82@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского научного центра СО РАН и Бурятского государственного университета

Автореферат разослан <<20» февраля 2010 г.

Ученый секретарь /•

диссертационного совета, Ь

кандидат биологических наук (jMfä^ " Шорноева H.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На территории Забайкалья насчитывается более 500 содовых озер, отличающихся по степени минерализации, рН и ионному составу воды (Дзюба и др., 1997; Намсараев и др., 2007) и представляющих тип экосистем, широко распространенных в аридных условиях. В озерах, характеризующихся щелочными значениями рН и повышенной минерализацией, функционирует алкалофильное микробное сообщество, включающее продуцентов и деструкторов органического вещества (Завар-зин, 2007).

Одним из ключевых метаболитов, образуемых на первых этапах деструкции органического вещества является ацетат. В пресноводных экосистемах и кислых средах ацетат на конечных этапах деструкции используется сульфатредукторами. В содовых озерах использование ацетата вторичными анаэробами до сих пор до конца не изучено, хотя известно, что сульфатредукция является доминирующим процессом анаэробной деструкции (Горленко и др., 1999; Намсараев, Намсараев, 2007).

В настоящее время выделено и описано несколько представителей алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий (СРБ), способных окислять Н2, формиат, лактат и некоторые и другие соединения с образованием H2S (Pikuta, 1998; Pikuta, 2003; Zhilina, 2005). Способностью окислять ацетат среди сульфатредукторов, выделенных из содовых озер, обладает только Desulfonatronum cooperativum в бинарной культуре с Contubernalis alcalaceticum (Жилина и др., 2005). Выделение и описание СРБ, окисляющих ацетат до H2S и С02 в содовых водоемах представляет значительный интерес для понимания механизма стока водорода в алкалофильном микробном сообществе.

Изучению процессов восстановления железа (III) в пресноводных водоемах, термальных источниках и морских экосистемах уделено достаточно много внимания. Из этих экосистем выделено и описано более 30 культур (Слободкин и др., 1995; Slobodkin et.al., 1999; Coates et al., 1996; Fin-neran et al., 2002 и др.). В содовых водоемах в связи с низкой растворимостью окислов железа в щелочных условиях возможность процесса микробной железоредукции до последнего времени ставилась под сомнение. Лишь недавно были выделены и описаны единичные представители алкалофильных железоредуцирующих бактерий (ЖРБ) (Ye Q. et al., 2004; Заварзина и др., 2006; Жилина и др., 2009). К началу данных исследований железоредукторов из содовых озер выделено не было.

Исследование распространения и функционирования бактерий, восстанавливающих сульфаты и железо в щелочных условиях, имеет большое значение для понимания их роли в природе.

Целью настоящей работы являлось изучение распространения и активности гало-алкалофильных сульфат- и железоредуцирующих бактерий в содово-соленых озерах Забайкалья, выделение и характеристика культур.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать содово-соленые озера Забайкалья - места обитания алкалофильных микроорганизмов.

2. Определить численность алкалофильных сульфат- и железовос-станавливающих бактерий в донных осадках содовых озер.

3. Определить скорость сульфатредукции в донных осадках озер.

4. Выделить активные накопительные и чистые культуры сульфат-и железоредукторов.

5. Изучить экофизиологические и метаболитические характеристики выделенных чистых культур, определить филогенетическое положение бактерий.

Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые проведена оценка численности железоредуцирующих бактерий в содовых озерах Забайкалья.

Из содового озера Хилганта выделена и описана культура диссимиля-торных железоредуцирующих бактерий - облигатно алкалофильная (рН0ПХ. 10,3) спорообразующая палочка, восстанавливающая цитрат железа (III) (штамм Х-07-2). Филогенетически штамм близкородственен недавно описанному. железоредуктору Alkaliphilus peptidofermentans (98% сходства) (Жилина и др., 2009), однако имеются существенные отличия от типового штамма.

Из содового озера Алгинское выделен новый вид алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий (штамм А1915-01), способный к окислению ацетата. По совокупности физиологических и филогенетических свойств штамм предлагается выделить в новый вид «Desulfonatronum асе-toxidans».

Практическая ценность. Полученные результаты расширяют представление о разнообразии СРБ в природе, могут быть использованы для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях. Выделенные штаммы сульфат- и железоредуцирующих бактерий представляют интерес для биотехнологии как продуценты солеустойчивых и устойчивых к высоким pH ферментов.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всероссийской конференции молодых ученых «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007), 2-м Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007), III Международной Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007), Международной научной конфе-

ренции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), IV Международной Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008), научной конференции преподавателей, научных работников и аспирантов ВСГТУ (Улан-Удэ, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, включая 4 статьи и 9 тезисов.

Объем и структура работы: Диссертационная работа изложена на 42.5 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация содержит таблиц, 37- рисунков. Список литературы состоит из s~Q отечественных и (>Ц зарубежных источников.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к.б.н. Л.П. Козыревой за общее научное руководство, заведующему лабораторией микробиологии д.б.н., проф. Б.Б. Намсараеву за постоянное внимание и помощь в работе и обсуждении результатов. Автор приносит искреннюю благодарность сотрудникам и аспирантом лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, родным и близким за поддержку и ценные советы.

Автор выражает благодарность заведующему лабораторией Экологии и геохимической деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН д.б.н. В.М. Горленко, к.б.н. Т.В. Хижняк и всем сотрудникам данной лаборатории за советы и помощь в освоении методик, сотрудникам ИНМИ РАН H.A. Ко-стрикиной, д.б.н. Т.Н. Туровой за помощь на отдельных этапах работы.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Президиума СО РАН № 38 и 95, УрО РАН и СО РАН «Микробные сообщества экстремальных экосистем», МО РФ РНП.2.1.1./2165, НОЦ «Байкал».

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты исследования. Объектами исследования являлись 8 содовых и содово-соленых озер, расположенных на территории Бурятии (Белое, Алгинское, Соленое, Нухэ-Нур) и Забайкальского края (Хилганта, Горбунка, Доронинское, Зун-Торей). Микробиологические и гидрохимические исследования проводились с 2005 по 2008 гг.

Методы исследования.

Физико-химические характеристики воды и донных осадков в изучаемых озерах определяли стандартными методами (Намсараев и др., 2006).

Органический углерод в осадках анализировали методом мокрого сжигания по Тюрину, со спектрофотометрическим окончанием (Аринуш-кина, 1961).

Среды и условия культивирования. Для определения численности бактерий использовали жидкую и агаризованную минеральную среду 1, состава (г/л): КН2Р04 - 0,2; М§С12 х 6Н20 - 0,1; Ш4С1 - 0,5; КС1 - 0,2; КаС1 - 15; дрожжевой экстракт - 0,05; раствор микроэлементов по Пфеннигу - 1мл/л. Для культивирования сульфатредуцирующих бактерий к вышеописанной среде добавляли (г/л): Ка2804 х10Н2О - 3; №2Б х 9Н20 -0,05; натриевые соли молочной или уксусной кислот - 4; металлическую скрепку или раствор Ре804 добавляли как индикатор процесса. Железоре-дуцирующие бактерии выращивали на минеральной среде /, используя в качестве доноров электронов (г/л): лактат - 4; ацетат — 4; пептон - 4; глюкозу - 4. Акцепторам электронов служила (мМ): АГОЖ [аморфная гидроокись железа (III)] - 90.

Значения рН, соответствующие гидрохимии озер, устанавливали соотношениями N811003 и 1Ча2СОз. 10% растворы гидрокарбоната и карбоната натрия стерилизовали отдельно. Культивирование бактерий осуществляли в термостате при 30°С. В качестве химического контроля использована среда без инокуляции. Статистическую обработку при определении численности бактерий проводили по таблице Мак-Креди (Большой практикум по микробиологии, 2005).

Выделение чистых культур алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий проводили с использованием анаэробной техники Хангейта [Нш^е, 1966] на среде 2 следующего состава (Эогокт, 2008) (г/л): №2С03 - 1,2; ЫаНСОз - 1,85; №С! - 15; К2НР04 - 0,5; д/э - 0,05; раствор м/э по Пфеннигу - 1 мл/л. Из концентрированных растворов в стерильную среду добавляли (мМ): Г^С12 - 1; Ыа2Б х 9Н20 - 1; №2$04 - 20. В качестве источника углерода и донора электронов использовали лактат натрия, с конечной концентрацией в среде 4 г/л. рН при посеве 9,6.

Чистые культуры алкалофильных железоредуцирующих бактерий выделяли также на среде 2. Из концентрированных растворов в стерильную среду добавляли (мМ): Л^С12 - 1; цитрат Ре (III) - 30. В качестве источника углерода и донора электронов использовали ацетат натрия с конечной концентрацией в среде 4 г/л. рН при посеве 9,3.

Температурную зависимость роста изучали в области от 5 до 47°С. При исследовании рН-зависимости в диапазоне рН 8,0 - 8,5 использовали раствор по Кларку-Лабсу, для рН 7,0 - фосфатный буфер, а для приготовления высокощелочных сред (рН 9,0 - 11,0) применяли карбонатные буферные растворы (Справочник по биохимии, 1996).

Определения зависимости роста от ЫаС1 проводили на среде 3, следующего состава (г/л): К2С03 - 1,2; КНС03 - 1,85; К2НР04 - 0,5; д/э - 0,05; раствор м/э по Пфеннигу - 1 мл/л. Из концентрированных растворов в стерильную среду добавляли (мМ): для СРБ М£Б04 - 1; (1ЧН4)2804 - 20; для ЖРБ М£Б04 - 1; цитрат Ре (III) - 30. рН устанавливали 10% КОН. ЫаС1 в концентрации от 0,5% до 20% добавляли отдельно в каждый флакон. Для

оценки влияния ионов Na+ на рост бактерий NaCl заменяли на KCl (1,5%). Зависимость от ионов СГ у выделенных организмов исследовали на среде 2, исключив NaCl. Зависимость от карбонат-гидрокарбонатов определяли, заменяя эти соли эквимолярным количеством NaCl в среде, где pH поддерживался 10% NaOH.

При определении возможных доноров электронов их вносили в конечной концентрации 0,12%. Способность к литогетеротрофному росту наблюдали с молекулярным водородом (100% газовой фазы).

Микроскопические методы исследования. Морфологию клеток бактерий изучали с использованием микроскопа Olympus ВХ41 с фазово-контрастным устройством и цифровой фотокамерой при увеличении 1300х и на тотальных препаратах и ультратонких срезах в электронном микроскопе Jeol JEM-100С (Япония) по стандартным методикам.

Определение роста. Рост бактерий фиксировали по изменению оптической плотности среды при длине волны 560 нм на фотоколориметре КФК - 3 (Россия), прямым подсчетом клеток и по образованию конечного продукта реакции - сульфида (для СРБ) (Triiper, Schlegel, 1964) и Fe(II) (для ЖРБ) (Шапиро, Шапиро, 1971).

Скорость сульфатредукции определяли радиоизотопным методом с помощью меченного ^Б-сульфата (Иванов и др., 1975).

Измерение содержания стабильных изотопов углерода 12С и 13С в виде газообразной формы С02 проводили на масс-спектрометре МИ-1201 (СССР). Результаты приведены в виде величин 5 13С в промилле по отношению к общепринятым стандартам PDB. Анализ проведен к.б.н. В.Б. Дамбаевым (ИОЭБ СО РАН).

Метод анализа жирных кислот. Жирные кислоты анализировали хро-мато-масс-спектрометрическим методом (ГХ-МС). Исследования выполнены Г.А. Осиповым в детской клинической больнице им. Филатова, г. Москва.

Молекулярно-генетические методы. Выделение и очистку ДНК, амплификацию и секвенирование гена 16S рРНК выполняли в Институте биоинженерии РАН (г. Москва). Для сравнительного анализа полученных нуклеотидных последовательностей с известными в GENBANK использовали пакет программ BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Полученные последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших гомологов с помощью программы CLUSTALX. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий проводили с помощью программы TREECONW по методу объединения ближайших соседей (Van de Peer, 1994).

Статистические методы. Статистическую обработку данных проводили стандартными методами по Плохинскому Н.А.(1969); Ашмарину И.П., Воробьеву A.A. (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Физико-химическая характеристика исследованных содовых озер Забайкалья.

По минерализации в период исследований (июнь 2005 - сентябрь 2008 гг.) воды озер, в соответствии с классификацией Валяшко, различались от солоноватых (сумма солей 1,0-25,0 г/дм3) до соленых (26-45 г/дм3). По химическому составу большинство озер относится к карбонатному типу. Значения рН воды в озерах находились в щелочной области и варьировали от 8,7 до 9,98 (табл. 1).

Таблица 1.

Физико-химическая характеристика исследуемых содовых озер, мг/ дм3

Озеро Дата отбора проб Место-положе-ние рн ОМ, г/ дм1 а во,2 НСО/ СО,1 Ре общее

Соленое октябрь 2005 г. 1 9,9 5,6 199,72 376,5 2171,6 ' 720 (Ч с*-> О О о"

Нухэ-Нур 2005 г. 2 9,84 5,7 137,7 575,9 4758 3900 т гч о о о"

Алгинское июнь 2005 г. 3 9,62 45,0 34,43 25694 3050 3000 45 О О О о"

Белое июль 2005 г. 4 8,7 1,82,6 335,5 477,7 106,7 54,0 _

Хнлганта сентябрь 2005 г. 5 9,15 71,0 19700 14461 1037 0 _

Горбунка сентябрь 2005 г. 6 8,7 41,3 3560 6424 920 420

Доронин-ское сентябрь 2008 г. 7 9,98 30 4830 117 480,8 138,0

Зун-Торей сентябрь 2008 г. 8 9,68 5,7 „ 600 1952 600 _

Примечание:

1 - Кяхтинский район, Республика Бурятия, 2 - Баргузинский район, Республика Бурятия, 3 - -11-, 4 - Иволгинский район, Республика Бурятия, 5 - Агинский район, Забайкальский край, 6 - -//-, 7 - Улетовский район, Забайкальский край, 8 - Онон-ский район, Забайкальский край; в момент отбора проб озеро Хилганта пересохло, приведены результаты, полученные из водных вытяжек; «ОМ» - здесь и далее общая минерализация; «-» - не определено.

Концентрация НСОз" и С032" в озерах изменялась в широких пределах от 0,1 до 4,8 г/дм3 и от 0,05 до 3,90 г/дм3, соответственно. Во всех исследованных озерах наблюдается преобладание содержания гидрокарбонатов над карбонатами. Максимальное содержание ионов СГ (16,7 г/дм3) отмечено в озере Хилганта, минимальная концентрация СГ-иона (0,034 г/дм3) зафиксирована в озере Алгинское. Концентрация сульфат-ионов в разных озерах существенно варьирует (от 0,12 до 25,7 г/дм ). Наибольшее количество БО.*2" выявлено в озерах Алгинское - 25,7 г/дм3 и Хилганта - 14,5 г/дм3. В озере Доронинское содержание сульфат-ионов было минимальным и составило 0,12 г/дм3. Содержание общего железа в воде содовых озер было низким и колебалось в пределах от 0,0006 до 0,0032 мг/дм3.

Количество органического вещества в воде и донных осадках озер играет важную роль в функционировании микробного сообщества. Нами было определено содержание органического вещества (ОВ) в колонках донных отложений озера Соленое и в пробах песчаных матов озер Доронинское и Зун-Торей. В озере Соленое максимальное количество Сорг (19,25%) выявлено в подповерхностных слоях донных отложений на глубине 5 см. С увеличением глубины от 6 до 13 см количество органического вещества заметно снижалось и варьировало от 18 до 4,9%. Второй пик максимума зафиксирован на глубине 16 см (Сорг 18%), далее содержание ОВ снижается.

В песчаных матах озер Доронинское и Зун-Торей содержание органического вещества было незначительным и составило 1,6-1,7%. Изменение Сорг по слоям не зафиксировано. Низкое содержание ОВ в песчаных матах резко отличает их от цианобактериальных матов, развивающихся в содовых озерах и характеризующихся высоким содержанием органического вещества (до 19%). Исследуемые нами маты были представлены песчаными фунтами, которые, как правило, бедны органикой.

2. Распространение сульфат- и железоредуцирующих бактерий в донных осадках и песчаных матах содовых озер.

С целью изучения распространения алкалофильных сульфат- и желе-зоредукторов в содовых озерах Забайкалья нами была определена численность этих физиологических групп в период с 2005 по 2008 гг.

В пробах донных осадков всех исследуемых водоемов численность сульфатредукторов была высокой и варьировала от 10 до 100 млн. кл/мл. Наиболее активный рост сульфатредуцирующих бактерий был отмечен на среде с лактатом. Наивысшая численность СРВ на лактате (>100 млн. кл/мл) была зафиксирована в пробах озера Соленое. На ацетате численность СРБ варьировала от 10 кл/мл (в оз. Белое), до 1 млн кл/мл (в пробе осадков оз. Соленое).

Численность железоредуцирующих бактерий в донных осадках исследуемых озер также была определена методом посева на элективные среды. Максимальная численность ЖРБ (10 млн. кл/мл) зарегистрирована в озере Хилганта. Наименьшее значение численности (1 тыс. кл/мл) выявлено в донных осадках озер Белое и Алгинское. Наблюдается определенная корреляция численности сульфат- и железоредуцирующих бактерий (табл.2).

Таблица 2.

Численность сульфат- и железоредукторов в донных осадках исследуемых __озер__

Озеро Численность, кл/мл

2005 г. 2006 г. 2008 г.

СРБ ЖРБ СРБ ЖРБ СРБ

лактат ацетат смесь доноров лактат ацетат смесь доноров лактат ацетат

Белое ю4 10 105 \0Ь 1(И 10 10* 10ь

Соленое >108 106 106 10ь 10J 10ь 10i 10ь

Хилганта 10' - 10' 10ь 104 10' ю5 10ь

Горбунка 10б - 106 10ь Юь 106 - -

Алгинское 106 - 103 - - 10J - -

Нухэ-Нур - - ю5 - - 10* -

Доронинское - - - - - - ю7 10*

Зун-Торей - - - - - - ю4 10*

Примечание:

«-» - не определено, смесь доноров - пелтон+сахароза

Таким образом, нами показано, что в щелочных условиях содовых озер широко распространены бактерии, активно участвующие в процессе анаэробной деструкции органического вещества. Вследствие высоких концентраций сульфатов в воде исследуемых содовых озер, численность суль-фатредукторов превышает число железоредуцирующих бактерий.

3. Интенсивность процесса сульфатредукции в донных осадках и микробных матах озера Соленое.

В содовых озерах сульфатредукция является наиболее активным процессом на заключительных этапах деструкции органического вещества. В донных осадках и микробных матах озера Соленое была определена скорость сульфатредукции и произведен расчет органического вещества, затрачиваемого на этот процесс. Наиболее интенсивно процесс восстановления сульфатов протекал в пробах цианобактериального мата - 1,80 мг S/(Kr сут) (табл. 3).

Таблица 3.

Интенсивность процесса сульфатредукции в озере Соленое._

Озеро Тип пробы Дата Скорость, мг Б/(кг сут) Расход Сорг, мг С/(кг сут) макс. знач.

Соленое песок сентябрь 0,01-0,35 0,26

ил 0,35-0,64 0,48

цианобакт. мат 0,70-1,80 1,35

пурпурный мат 0,25-1,28 0,96

Полученные данные сравнимы с имеющимися в литературе. Сравнительный анализ с полученными ранее данными по интенсивности метано-генеза (Солоноватые и соленые озера Забайкалья, 2009) указывает на преобладание сульфатредукции на терминальных этапах деструкции ОВ.

4. Изотопный состав углерода донных осадков озера Соленое.

При исследовании вертикальной стратификации донных осадков оз. Соленое изотопный состав углерода органического вещества и карбонатов составлял от -26.14%о до -29.60%о и от -11.21 %о до -14.3%о, соответственно. В слое 6-7 см происходит облегчение органического вещества и карбонатов, по-видимому, здесь находится зона анаэробной деструкции органического вещества. В результате образования газов изотопно-легкой фракции в анаэробных условиях и их потребления микроорганизмами органическое вещество оказывается обедненным изотопом 13С. В толще донных осадков к нижним горизонтам изотопный состав углерода утяжеляется, что свидетельствует о разложении, в первую очередь, более легкой фракции органического вещества (рис. 1). Вниз по слоям донных осадков до 5 см происходит накопление органического вещества и карбонатов. На глубине от 5 до 7 см наблюдается резкое снижение и от 7 до 13 см происходит обратное увеличение содержания органического вещества и карбонатов (рис. 2).

-5 -15 -25 -33

V ■ /

ч )

1 гг

1. \

£ *

ю

12 ; /

1

14

_.».... Органическое а ей*стоо

Рис.1. Изотопный состав углерода карбонатов и органического вещества в донных осадках оз. Соленое

Рис. 2. Содержание органического вещества и карбонатов в донных осадках озера Соленое

5. Выделение и характеристика культур алкалофильных сульфат-и железоредукторов.

Из содовых озер Забайкалья выделены и охарактеризованы 4 чистые культуры микроорганизмов: три штамма алкалофильных сульфатредуци-рующих бактерий (В918-01, А1915-01 и 021) и один штамм алкалофильных железоредуцирующих бактерий (Х-07-2). Также из накопительной культуры, выделенной из донных осадкой озера Хилганта и поддерживаемой периодическими пересевами в течение 4 лет, была получена еще одна чистая культура сульфатредуцирующих бактерий — штамм Хил-05-ос. Для этого штамма изучена только нуклеотидная последовательность гена 168 рРНК и определены ближайшие гомологи.

5.1. Описание штаммов алкалофильных СРБ

Из проб донных осадков озер Белое, Алгинское (Бурятия) и озера До-ронинское (Забайкальский край) были выделены штаммы алкалофильных СРБ - В918-01, А1915-01 и Б21, соответственно.

Морфология. Выделенные штаммы представлены подвижными вибрионами, одиночными или соединенными в цепочки по 2-4 клетки. Размер клеток штамма А1915-01 0,4-0,5 х 1,2-2,25 рм, размеры клеток штамма В918-01 0,45-0,5 х 1,15-2,8 цм, штамма Б21 -0,35-0,41 х 1,2 х 2,18 рм. Образование спор не обнаружено.

Клетки бактерий имеют характерную для грамотрицательных организмов волнистую мембрану с выраженным периплазматическим пространством (рис. 3).

а) б) в)

Рис. 3. Световые и электронные микрофотографии штаммов СРБ; а) и б) штамм А1915-01, в) штамм В918-01

Физиологические свойства. Все организмы - облигатные алкалофилы с областью развития рН 8,0 - 10,5. Оптимум рН для штаммов А1915-01 и В918-01 - 9,3; для штамма Б21 рНопт9,87 (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость роста штаммов СРБ от pH

20

7

8

9

10

11

рн

Оптимальная концентрация NaCl для развития штаммов А1915-01 и В918-01 составила 4%, нижний предел концентрации NaCl - 0,5%, верхний для штамма А1915-01 - 10%, для штамма В918-01 - 15%. Штамм D21 растет при содержании NaCl от 0,5 до 10% с оптимумом NaCl 1%. Таким образом, выделенные СРБ являются умеренными галофилами (рис. 5). Установлено, что все штаммы облигатно нуждаются в ионе Na+. СГ- ионы не являются обязательным компонентом среды для данных культур.

Организмы облигатно нуждаются в карбонат-ионе: замена карбонатов эквимолярным количеством NaCl в среде, где pH поддерживался 10% NaOH, не давала роста.

По отношению к температуре микроорганизмы являются мезофилами. Температурные интервалы развития штаммов В918-01 и А1915-01 лежат в пределах 10 - 40°С с оптимумом роста 36°С. Для штамма Б21 оптимум температуры лежит в пределах 23-30°С, роста ниже 10°С и выше 47°С не наблюдали (Рис.6).

10

Рис.5. Зависимость роста штаммов СРБ от Концентрации NaCl

О 2 4 б а 10 12 14 16 18 20

Концентрация NaCl, (%)

AI915-01

Рис. 6. Зависимость роста штаммов СРБ от температуры

о

о

10 20 30 40 50

Температура. С

Из всех проверенных субстратов рост зафиксирован на лактате, ацетате, пирувате, формиате, оксалате, фруктозе, метаноле. На водороде (100% газовой фазы) рост слабый. Штамм D21, в отличие от штаммов В918-01 и А1915-01, окислял этанол. Дрожжевой экстракт не оказывал стимулирующего действия на рост бактерий.

Установлено, что в качестве акцепторов электронов организмы используют тиосульфат и сульфит. Отмечен слабый рост на Fe(OH)3. Штаммы А1915-01 и D21 способны расти на нитрате. Роста без акцептора электронов не обнаружено.

Состав жирных кислот. Был определен состав жирных кислот клеточной стенки для штаммов В918-01 и А1915-01. В значительном количестве в клеточной стенке штаммов обнаружена изо-гептадеценовая кислота (¡17:1) 16,83% у штамма А1915-01 и 19,88% - у штамма В918-01. Также доминировала октадеценовая кислота (18:1<в7) и в большом количестве выявлена антеозо-пентадекановая кислота (а15:0) - 15,29% у штамма А1915-01 и 15,46% - у штамма В918-01. У штамма А1915-01, в отличие от штамма В918-01 в большом количестве присутствует гексадеценовая кислота (16:1 0)7)- 12,05% от общего количества кислот.

Генотипическая характеристика. Для культур В918-01 и, А1915-01 Хил-05-oc была получена генотипическая характеристика.

Содержание Г+Ц пар в ДНК штамма А1915-01 составило 58,3 мол.%. Содержание Г+Ц пар в молекуле ДНК штамма В918-0доставило 58,2 мол.%.

По филогенетическому скринингу, проведенному в базе данных GenBank с помощью программы BLAST, все три исследуемых штамма относятся к семейству Desulfonatronumaceae 5-подкласса Proteobacteria. На построенном филогенетическом дереве (рис. 7) штаммы относятся к кластеру, объединяющему представителей семейства Desulfonatronumaceae. Наиболее близкий к штаммам оказался вид Desulfonatronum lacustre (99%

сходства).

По результатам молекулярной ДНК-ДНК гибридизации уровень сходства ДНК между штаммами В918-01 и Л1915-01 составляет 52%. Уровень сходства ДНК штамма В918-01 с ДНК вида Desulfonatronum lacustre составляет 71%. Штамм А1915-01 характеризуется относительно низким уровнем гомологии (40%) по отношению к типовому штамму Desulfonatronum lacustre.

0,02

58

54 98 Г

100

100

78_ 6

47

100

39

100 i

100

j Desulfonatronum lacustre (Y14594)

'— KhiI-05

В918-01

AL915-01

Desulfonatronum lacustre DSM 10312 (AF418171) Desulfonatronum thiodismutans strain MLF (AF373920) - Desulfonatronum cooperativum strain Z-7999 (AY725424) -Desulfovibrío sp. AS36 (DQ84H77) ~ Desulfovibrío ferrophilus (AY274449) Desulfovibrío alkaütolerans (AY649785) Desulfovibrío africanus (EU659693) Desulfovibrío marrakechensis (AM947130) Desulfovibrío burkinensis strain HDv (AF053752) Desulfovibrío magnéticas (DVURS1)

100

- Desulfomicrobium thermophiliun strain P6.2 (AY464939) Desulfobacterium macestii (AJ237604) Desulfomicrobium bacutatum (AJ277894)

- Escherichia coli

Рис. 7. Филогенетическое дерево на основе анализа 16S рРНК, показывающее положение штаммов В918-01 и А1915-01 в подклассе 5-Proteobacteria. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Значения "boot-strap''-анализа приведены в узлах дерева.

Сравнительный анализ выделенных штаммов с близкородственными видами (табл. 4) показал различия фено- и генотипических характеристик.

Выделенные штаммы способны расти и при температуре 10 °С, в то время как у D. lacustre рост начинался при 20 °С. Также отличен и нижний предел и оптимум роста в диапазоне солености - типовой штамм D. lacustre способен расти и при очень низкой солености, у выделенных же штаммов рост начинался только при солености среды 5%, а оптимум составляет 10-40 г/л. Типовой штамм не способен использовать лактат, ацетат и восстанавливать нитрат. И как уже отмечалось выше довольной низкий уровень сходства по ДНК-ДНК гибридизации.

Таким образом, основываясь на существенном отличие физиологических и фенотипических свойств выделенного штамма А1915-01 от известных видов рода ВеьиУопМгопит, предлагается выделить его в новый вид «Пехи1/опа1гопшп асе^ххйат».

Таблица 4.

Сравнительный анализ исследуемых штаммов с видами рода Ими^опШгопит

Характеристика D. lacustre D. thio- dismu- tans D. coopera-tivum Штамм В918-01 Штамм A19I5-01 Штамм т

Форма клеток вибрионы вибрионы вибрионы вибрионы вибрионы вибрионы

Размеры, цм 0,7-0,9х 2,5-3,0 0,6-0,7x 1,2-2,7 0,4-0,5x 1,0-2,5 0,45-0,5х 1,25-2,8 0,4-0,5х 1,2-2,25 0,35-0,41х 1,2-2,18

Температура, 22-45 15-48 15-40 10-40 1040 10-47

Пределы роста

Оптимум роста 40 37 35-38 36 36 23-30

РН: 8,0-10,1 8,0-10,0 6,7-10,3 8,0-10,5 8,0-10,5 8,0-10,5

Пределы роста

Оптимум роста 9,3-9,5 9,5 8,0-9,0 9,3 9,3 9,87

Рост С N801, г/л: 0-100 >10-70 >10-80 5-150 5-150 5-40

Пределы роста

Оптимум роста 0 30 5-15 40 40 10

Г+Ц ( мол.%) 57,3+1 63,1±1 56,5+1 58,2 58,3 и.о.

Нг + + + + + и.о.

формиат + + + + + +

лактат - - + + + +

ацетат - - - + + +/-

этанол + + - - - +/-

Тиосульфат + + + + + +

Сульфит + + + + + +

Ре(ОН), - H.O H.O +/- +/- -

- - +/- +/- н.о.

Нитрат - - - - + +/-

Литературный источник Pikuta et. al., 1998; Zhilina, 2005 Pikuta et. al., 2003 Zhilina et. al., 2005 Наши данные Наши данные Наши данные

5.2. Описание новых штаммов алкалофильных ЖРБ. Из донных осадков озера Хилганта выделен алкалофильный штамм ЖРБ - Х-07-2. Полученный организм восстанавливает цитрат железа с ацетатом в качестве донора электронов и единственного источника углерода с образованием, предположительно, сидерита.

Морфология. Клетки штамма Х-07-2 представлены длинными тонкими подвижными палочками, нередко изогнутыми (рис. 8). На 15 сутки культивирования наблюдается образование спор. Размеры клеток 5,58-8,87 цм, размеры спор - 0,85 цм.

?0

10 цм

ч>

1 1

4

Л

I

j

S цм

а) б)

Рис. 8. Световые (а) и электронные (б) микрофотографии штамма Х-07-2

Физиологические свойства. Штамм Х-07-2 является облигатным алка-лофилом с областью развития в диапазоне значений рН 7,0 - 10,7 и оптимумом при рН 10,27 (рис. 9а).

Оптимальная концентрация ЫаС1 для развития выделенного организма составила 4%, нижний предел концентрации ЫаС1 - 0,5%, верхний - 15% (рис. 96). Таким образом, штамм Х-07-2 являются умеренным галофилом.

Штамм Х-07-2 - мезофил. Температурные интервалы развития штамма лежат в пределах от 25 до 47 °С. Оптимум роста выявлен при 30 °С (рис. 9в).

10 15 20 25 30 35 « 45 И тмлерстура. ОС

а) б) в)

Рис. 10. Зависимость роста штамма Х-07-2 от pH (а), концентрации NaCl (б) и температуры (в).

Установлено, что в качестве альтернативных доноров электронов культура активно использует глюкозу и дрожжевой экстракт. С лактатом, пептоном и этанолом роста клеток не обнаружено. Выделенный организм не способен развиваться без добавления донора электронов. В качестве акцепторов электронов микроорганизм на среде с ацетатом восстанавливает аморфную гидроокись железа (III) и сульфат натрия. При использова-

б)

нии в качестве акцепторов электронов ЭДТА- Бе3+ , Ка2503 и Ка>Ю3 роста не зафиксировано. Штамм не растет без акцептора электронов.

Штамм Х-07-2 относится к диссимиляторным организмам, поскольку урожая клеток на среде без железа (III) зафиксировано не было (рис. 10). Максимум роста штамма с железом выявлен на 20 сутки культивирования.

Рис. 10. Рост штамма Х-07-2 с трехвалентным железом.

- с Fe(IU) —fit— без Fe(lÖJ

Филогенетические свойства. По филогенетическому скринингу, проведенному в базе данных GenBank с помощью программы BLAST, исследуемый штамм относятся 5-подклассу Proteobacteria. Штамм Х-07-2 оказался наиболее близок к Alkaliphihis peptidofermentans (98% сходства) (рис. И).

0,02 М

99

- Alkaliphilus transvaalensis (AJ630291)

- Alkaliphilus crotonoxidans (AF467248)

- Clostridium aceticum strain DSM 1496 (Y18183) -Geosporobacter sitbterrenus (DQ643978)

81

100

I— Alkalliphilus auruminator (AB037677)

ml

Лд I— Alkaliphilus peptidofermentans Z-7036 (EF382660)

- X-07-2

-Tindallia californiensis strain APO (AF373919)

Clostridium mesophilicum (AY682207)

Escherichia coli

Рис. 11. Филогенетическое дерево на основе анализа 16Б рРНК, показывающее положение штамма Х-07-2 в подклассе 5-Рго1еоЬас(епа.

Сравнительный анализ выделенного штамма с близкородственным видом А1каИрИИш рерНс1о/егтеп1ат показал отличия по фенотипическим характеристикам (табл. 5).

Таблица 5.

Сравнительная характеристика выделенного штамма с

Характеристика А1каИрЫ11и рерМо/егтеМат штамм Х-07-2

Форма клеток слабо изогнутые палочки палочки

Спорообразование + +

Размеры клеток (цм) 0,25-0,4 х 1,15-3,0 0,28-0,3 х 5,58-8,87

pH (оптимум) 7,5-9,7 (9,1) 7,0-10,7(10,27)

NaCl, г/л (оптимум) 0-50(20) 5- 150(40)

Т °С (оптимум) 6-40 (35) 25-47(30)

Доноры: глюкоза - +

дрожжевой экстракт + +

лактат - -

пептон + -

этанол - -

ацетат н.о. +

Акцепторы: цитрат Fe (III) - +

АГОЖ (III) + +

Na2S04 - +

ЭДТА-Fe3+ + -

Na2S03 - -

NaN03 - -

Источник выделения оз. Верхнее Белое (Бурятия) оз. Хилганта (Забайкальский край)

Авторы статей Жилина и др., 2009 Наши данные

Таким образом, выделение из содового озера железоредуцирующих бактерий еще раз подтверждает факт возможности микробного восстановления Ре(1Г1) в щелочных условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Микробиологические исследования, проведенные в различных содово-соленых озерах Забайкалья, показали, что в экосистемах с высокими значениями рН и минерализации, широко распространены анаэробные алка-лофильные и гало-алкалофильные сульфат- и железоредуцирующие бактерии.

Количественные исследования их деятельности показывают важную роль этих групп микроорганизмов в деструкции органического вещества на терминальных этапах. Сульфат- и железоредукторы играют определен-

ную роль в установлении равновесия между биогеохимическими процессами в донных осадках и водной толще озер.

До недавнего времени считалось, что микробная железоредукция в содовых водоемах невозможна в связи с низкой растворимостью окисного железа в щелочной среде. За последнее время появляется все больше новых сообщений, в которых описываются организмы, способные восстанавливать Fe(III) в щелочных озерах. Выделенный и изученный нами об-лигатно алкалофильный железоредуктор восстанавливает цитрат Fe(III) при рН среды 9,5 - 10,0.

Выделенный и описанный нами новый представитель СРБ рода Desul-fonatronum, расширяет список немногочисленных пока алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий. Использование ацетата выделенным организмом указывает на одну из важнейших экологических функций. Ацетат является несбраживаемым продуктом разложения органического вещества в анаэробных условиях. В большинстве экосистем его удаление осуществляется ацетатокисляющими метаногенами. Однако в содовых водоемах доминирующим процессом на терминальных этапах деструкции органического вещества является сульфатредукция. Таким образом, можно полагать, что выделенные организмы являются важным звеном, ответственным за утилизацию ацетата в алкалофильном микробном сообществе.

ВЫВОДЫ

1. Сульфатредуцирующие и железоредуцирующие бактерии широко распространены в донных осадках содовых озер Забайкалья. Численность сульфатредукторов варьирует от 10 кл/мл до 100 млн кл/мл, предпочтительным донором электронов является лактат. Впервые определена численность железоредукторов в донных осадках, которая достигает 10 млн кл/мл.

2. В донных осадках и мате озера Соленое, характеризующихся наиболее высокой численностью сульфатредуцирующих бактерий, скорость процесса сульфатредукции достигает 0,70-1,80 мгЭ/(кг сут).

3. Из содовых озер Алгинское, Белое и Хилганта, различающихся гидрохимическими параметрами, выделены чистые культуры сульфатредукторов, родственных Desulfonatronum lacustre. Тем самым показана широкая географическая распространенность данного вида.

4. Выделен новый представитель рода Desulfonatronum. На основании отличий физиологических и фенотипических свойств выделенного штамма А1915-01 от известных видов рода Desulfonatronum, предлагается выделить его в новый вид «Desulfonatronum acetoxidans».

5. Выявлено, что щелочные условия содово-соленых озер не препятствуют развитию железоредуцирующих бактерий. Из содово-соленого озера Хилганта выделен и охарактеризован новый штамм алкалофильного железоредуктора, близкий к ЛОсаНркНю рерШо/егтеЫат (уровень сходства 98%).

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

Статьи:

1. Захарюк А.Г, Восстановление Ре(III) накопительными культурами из донных отложений содовых озер Забайкалья / А.Г. Захарюк, Л.П. Козырева, Б.Б. Намсараев // Вестник БГУ. Сер. Химия. Биология. География. 2007. С. 136-138.

2. Захарюк А.Г. Морфологическое разнообразие алкалофильных микроорганизмов в содовом озере Соленое / Р.В. Колосов, А.Г. Захарюк, Л.П. Козырева // Вестник БГУ. Сер. Биология. География. 2009. С. 92-95.

3. Захарюк А.Г. Физико-химическая характеристика песчаных матов содовых озер Доронинское и Зун-Торей (Забайкалье) / А.Г. Захарюк, Л.П. Козырева, Б.Б. Намсараев // Вестник БГУ. Сер. Химия. Физика. 2009. С. 2022.

4. Захарюк А.Г. Численность и активность бактерий-деструкторов органического вещества содово-соленого озера Хилганта (Южное Забайкалье) в градиенте рН-соленость / А.Г. Захарюк, Л.П. Козырева, Б.Б. Намсараев / Сибирский экологический журнал. 2010. № 4. С. 425-429.

Тезисы:

5. Захарюк. А.Г. Распространение железовосстанавливающих бактерий в донных осадках содово-соленых озер Забайкалья /А.Г. Захарюк // Проблемы экологии и освоения недр. Труды десятого международного симпозиума имени академика М. А. Усова студентов и молодых ученых, посвященного 100-летию первого выпуска сибирских инженеров и 110-летию основания Томского политехнического университета. - Томск, 2006. С. 188-190.

6. Захарюк А.Г. Выделение железовосстанавливающих бактерий из содовых озер Забайкалья / А.Г. Захарюк, Л.П. Козырева // Материалы II Международной молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». МАКС Пресс. - Москва, 2006, С. 14-16.

7. Захарюк А.Г. Железовосстанавливающие бактерии донных осадков содово-соленых озер Забайкалья / А.Г. Захарюк, Л.П. Козырева // Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии: тез. Всерос. конф. с междунар. участием. - Улан-Удэ, 2006. Т. 2. С. 45-46.

8. Захарюк А.Г. Железо- и сульфатредукторы в содовых озерах Забайкалья / А.Г. Захарюк, Л.П. Козырева // Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ: материалы II Байкальского микробиол. симпозиума с междунар. участием. - Иркутск, 2007. С. 89-90.

9. Захарюк А.Г. Влияние рН и №С1 на распространение и активность бактерий-деструкторов в сухом мате озера Хилганта / А.Г. Захарюк, Л.П. Ко-

зырева // Материалы III Международной молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологию). МАКС Пресс. - Москва, 2007, С. 36-37.

10. Захарюк А.Г. Участие железовосстанавливающих бактерий в деструкции органического вещества в содовых озерах Забайкалья / А.Г. Захарюк, Л.П. Козырева // Экология в современном мире: взгляд научной молодежи: тез. Всерос. конф. молодых ученых,- Улан-Удэ, 2007. С. 159-160.

11. Захарюк А.Г. Алкалофильные сульфат- и железоредукторы в содовых озерах Забайкальского края и Бурятии / А.Г. Захарюк, Л.П. Козырева, Т.В. Хижняк // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Междун. науч. конф. - Минск, 2008. Т.1. С. 134136.

12. Захарюк А.Г. Распространение сульфатредуцирующих бактерий в донных осадках озера Соленое (Бурятия) / А.Г. Захарюк, Л.П. Козырева // Материалы IV Международной молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». МАКС Пресс. - Москва, 2008. С. 1820.

13. Захарюк А.Г. Распространение алкалофильных сульфатредукторов в содовом озере Доронинское / Р.В. Колосов, А.Г. Захарюк // Экология Южной Сибири и сопредельных территорий: тез. междун. научной школы-конференции студентов и молодых ученых. - Абакан, 2008. С. 129.

Подписано в печать 19.02.10. Формат 60 х 84 1/16. Усл. печ. л. 1,27. Тираж 100. Заказ № 670.

Издательство Бурятского госуниверситета 670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24 а

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Захарюк, Анастасия Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Содово-соленые озера Забайкалья

1.1.1. Физико-географическая характеристика Забайкалья

1.1.2. Описание содово-соленых озер Забайкалья

1.1.3. Химический состав вод содовых озер Забайкалья

1.1.4. Химический состав донных осадков в озерах Забайкалья

1.1.5. Органическое вещество в содовых озерах Забайкалья

1.2. Алкалофильное микробное сообщество

1.3. Экология сульфат- и железоредуцирующих бактерий

1.3.1. Численность сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) в водоемах разного типа

1.3.2. Интенсивность сульфатредукции в донных отложениях

1.3.3. Численность железоредуцирующих бактерий (ЖРБ) в водоемах разного типа

1.4. Характеристика сульфатредуцирующих бактерий

1.4.1. Метаболизм СРБ

1.4.2. Алкалофильные сульфатредуцирующие бактерии

1.4.3. Роль СРБ в биотехнологических процессах

1.5. Характеристика железоредуцирующих бактерий

1.5.1. Метаболизм ЖРБ

1.5.2. Ранние формы микробного дыхания

1.5.3. Алкалофильные железовосстанавливающие микроорганизмы

1.5.4. Перспективы применения железоредукторов в промышленности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Распространение и активность алкалофильных сульфат- и железоредуцирующих бактерий в содовых озерах Забайкалья"

Актуальность темы.

На территории Забайкалья насчитывается более 500 содовых озер, отличающихся по степени минерализации, рН и ионному составу воды (Дзюба, 2002; Намсараев и др., 2007) и представляющих тип экосистем, широко распространенных в аридных условиях. В озерах, характеризующихся щелочными значениями рН и повышенной минерализацией, функционирует алкалофильное микробное сообщество, включающее продуцентов и деструкторов органического вещества (Заварзин, 2007).

Одним из ключевых метаболитов, образуемых на первых этапах деструкции органического вещества, является ацетат. В пресноводных экосистемах и кислых средах ацетат на конечных этапах деструкции используется сульфатредукторами. В содовых озерах использование ацетата вторичными анаэробами до сих пор до конца не изучено, хотя известно, что сульфатредукция является доминирующим процессом анаэробной деструкции (Горленко и др., 1999; Намсараев, Намсараев, 2007).

В настоящее время выделено и описано несколько представителей алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий (СРБ), способных окислять Н2, формиат, лактат и некоторые другие соединения с образованием Н28 (Пикута и др., 1998; Р1ки1а е1 а1., 2003; Zhilina еЬ а1., 2005). Способностью окислять ацетат среди сульфатредукторов, выделенных из содовых озер, обладает только Ое8ы1/опа^опит соорегаНуит в бинарной культуре с СопШЪетаИБ а1са1асеисыт (Жилина и др., 2005). Выделение и описание СРБ, окисляющих ацетат до Н2Э и С02 в содовых водоемах представляет значительный интерес для понимания механизма стока водорода в алкалофильном микробном сообществе.

Изучению процессов восстановления железа (III) в пресноводных водоемах, термальных источниках и морских экосистемах уделено достаточно много внимания. Из этих экосистем выделено и описано более 30 культур (Слободкин и др., 1995; Slobodkin et.al., 1999; Coates et al., 1996; Finneran et al., 2002 и др.). В содовых водоемах в связи с низкой растворимостью окислов железа в щелочных условиях возможность процесса микробной железоредукции до последнего времени ставилась под сомнение. Лишь недавно были выделены и описаны единичные представители алкалофильных железоредуцирующих бактерий (Ye Q. et al., 2004; Заварзина и др., 2006; Жилина и др., 2009). К началу данных исследований железоредукторов из содовых озер выделено не было.

Исследование распространения и функционирования бактерий, восстанавливающих сульфаты и железо в щелочных условиях, имеет большое значение для понимания их роли в природе.

Цель работы - изучение распространения и активности гало-алкалофильных сульфат- и железоредуцирующих бактерий в содово-соленых озерах Забайкалья, выделение и характеристика культур.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать содово-соленые озера Забайкалья - места обитания алкалофильных микроорганизмов.

2. Определить численность алкалофильных сульфат- и железоредуцирующих бактерий в донных осадках содовых озер.

3. Определить скорость сульфатредукции в донных осадках озер.

4. Выделить активные накопительные и чистые культуры сульфат- и железоредукторов.

5. Изучить экофизиологические и метаболитические характеристики выделенных чистых культур, определить филогенетическое положение бактерий.

Научная новизна и теоретическая значимость.

Впервые проведена оценка численности железоредуцирующих бактерий в содовых озерах Забайкалья.

Из содового озера Хилганта выделена и описана культура диссимиляторных железоредуцирующих бактерий — облигатно алкалофильная (рН0ПХ 10,3) спорообразующая палочка, восстанавливающая цитрат железа (III) (штамм Х-07-2). Филогенетически штамм близкородственен недавно описанному железоредуктору Alkaliphilus peptidofermentans (98% сходства) (Жилина и др., 2009), однако имеются существенные отличия от типового штамма.

Из содового озера Алгинское выделен новый вид алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий (штамм А1915-01), способный к окислению ацетата. По совокупности физиологических и филогенетических свойств штамм предлагается выделить в новый вид «Desulfonatronum acetoxidans».

Практическая ценность.

Полученные результаты расширяют представление о разнообразии СРБ в природе, могут быть использованы для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях. Выделенные штаммы сульфат- и железоредуцирующих бактерий представляют интерес для биотехнологии как продуценты солеустойчивых и устойчивых к высоким pH ферментов.

Апробация работы.

Основные результаты работы доложены на Всероссийской конференции молодых ученых «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007), 2-м Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007), III Международной Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007), Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), IV Международной Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008), научной конференции преподавателей, научных работников и аспирантов ВСГТУ (Улан-Удэ, 2009).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, включая 4 статьи и 9 тезисов.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация содержит Г5 таблиц, 37 рисунков. Список литературы состоит из 69 отечественных и 83 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Захарюк, Анастасия Геннадьевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В Забайкалье широко распространенны содовые и содово-соленые озера. В воде и донных осадках содовых озер происходят интенсивные процессы продукции и деструкции органического вещества.

В исследованных озерах Забайкалья с минерализацией воды от 5,6 до 45 г/л, рН воды 8,7-9,98 и содержанием органического вещества до 19, 25% создаются благоприятные условия для развития и функционирования микробного сообщества алкалофильных и гало-алкалофильных микроорганизмов.

Нами установлено широкое распространение анаэробных алкалофильных и гало-алкалофильных сульфат- и железоредуцирующих бактерий в исследуемых озерах. Количественные исследования деятельности этих групп бактерий показывают их важную роль в деструкции органического вещества на терминальных этапах. Сульфат- и железоредукторы играют определенную роль в установлении равновесия между биогеохимическими процессами в донных осадках и водной толще озер.

Определение численности и активности бактерий-деструкторов в содово-соленом озере Хилганта в матрице рН-соленость показало, что в данном озере наиболее интенсивно процессы деструкции протекают при нейтральных или слабощелочных значениях рН и невысоких концентрациях соли. Одновременное действие двух факторов — высокой рН и солености среды приводит к снижению численности клеток и понижению деструкционной активности сообщества. Полученные данные подтверждают высказанное ранее предположение о том, что в условиях высокой концентрации соли деструкционные процессы подавлены, вследствие чего происходит накопление органического вещества в озерах (Намсараев, Намсараев, 2007).

Содовые озера характеризуются высокой интенсивностью процесса круговорота серы. Сульфатредукция в них является доминирующим анаэробным терминальным процессом в разрушении органического вещества. Определение скорости сульфатредукции в донных осадках и микробных матах содового озера Соленое показало, что наиболее интенсивно процесс восстановления сульфатов протекал в пробах цианобактериального мата. Сравнительный анализ полученных результатов с литературными данными по интенсивности метаногенеза в донных отложениях данного озера (Солоноватые и соленые озера Забайкалья, 2009) указывает на преобладание сульфатредукции на терминальных этапах деструкции ОВ.

До недавнего времени считалось, что микробная железоредукция в содовых водоемах невозможна в связи с низкой растворимостью окисного железа в щелочной среде. За последнее время появляется все больше новых сообщений, в которых описываются организмы, способные восстанавливать Fe(III) в щелочных озерах. Выделенный и изученный нами облигатно алкалофильный железоредуктор восстанавливает цитрат Fe(III) при рН среды 9,5-10,0.

Обнаружение нами СРБ, близкородственных виду Desulfonatronum lacustre, выделенного из прибрежного ила озера Хадын (Тува) (Пикута и др., 1998), в озерах с различными физико-химическими характеристиками свидетельствует о широком распространение данного вида.

Выделенный и описанный нами новый представитель СРБ рода Desulfonatronum, расширяет список немногочисленных пока алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий. Использование ацетата выделенным организмом указывает на одну из важнейших экологических функций. Ацетат является несбраживаемым продуктом разложения органического вещества в анаэробных условиях. В большинстве экосистем его удаление осуществляется ацетатокисляющими метаногенами. Однако в содовых водоемах доминирующим процессом на терминальных этапах деструкции органического вещества является сульфатредукция. Таким образом, можно полагать, что выделенные организмы являются важным звеном, ответственным за утилизацию ацетата в алкалофильном микробном сообществе.