Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Алкалофильные сульфатредуцирующие бактерии

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Алкалофильные сульфатредуцирующие бактерии"

Г' ">

К и ^

. . ч-< 1

I (Л -Л' V1. . -!

гц\.,гл -

На правах рукописи

ПИКУТА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

АЛКАЛОФИЛЬНЫЕ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1997

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук Т.Н.Жилина.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.М.Горленко,

у

доктор биологических наук Ю.А.Троценко.

Ведущая организация: факультет почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова.

Защита состоится 3.01997 г. в .А"часов на заседании диссертационного совета Д.002.64.01. в Институте микробиологии РАН по адресу : 117811 г.Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН.

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь . .

диссертационного совета, к.бЛ.Е.Никитин.

Актуальность темы. Сульфатредуцирующие бактерии (СРБ) -группа анаэробных бактерий, способная к окислению субстратов при восстановлении окисленных соединений серы до сульфида. Благодаря повсеместному распределению сульфатов в природе и достаточно низкой у представителей СРБ инициирующей сульфатредукцига концентрации сульфатов, они встречаются о различных зкотопах и являются широко распространенной группой микроорганизмов. С момента открытия в 1895 году Бейеринком первой СРБ на сегодня известен 21 род, включающий 73 вида этих бактерий. На рисунке 1 показан рост темпа исследования СРБ.

Рисунок 1. Описание новых видов СРБ. годы

С возникновением интереса к биоразнообразию СРБ увеличивалось и число видов, выделенных из необычных мест обитания, в их числе термо-, гало- и алкалофильные виды. К началу наших исследований картина среди СРБ в рамках рН/соленость выглядела следующим образом (рис.2). Как видно из диаграммы большая часть СРБ представлена пресноводными и морскими нейтрофилами, область развития и оптимумы рН у них лежат в пределах 6.5-8.0, а по солености 0-4% (ЫаС1). Заметно выделяются представители СРБ, принадлежащие к

АгсЬеа: их олтммумы рН значительно ниже 6.0. СРВ, развивающиеся при рН выше 8.0 до последнего времени не были известны.

.0

4.0

6.0

7.

?

3.0

а

10.Q

щ

Z-7951

A.profundiis

A.fulgidus

©

Z-7935T— D« v. hydrogen о voralis

Z-7952 Z-7953 Z-7954

D.gabonensis

D.halophilus D.postgatei

10

Dh.relbaense

16

20

(NaCI%)

Рис. 2. Сульфатредуцирующие бактерии в матрице рН/соленость.

Э

5

8

Несмотря на то, что активная деятельность СРВ в содовых озерах отмечалась исследователями сравнительно давно (Исаченко,1951; Abd-el-Malek and Rizk, 1963; Grant and Tindal,1986), получить чистую или, хотя бы, накопительную культуру СРВ долгое время не удавалось. В соответствии с выдвинутой рабочей гипотезой (3аварзин,1993) о том, что микробные сообщества эпиконтинентальных содовых водоемов могут рассматриваться как реликтовые и, возможно, могли являться центрами микробного биоразнообразия, в лаборатории Микробных сообществ ИНМИ РАН было впервые исследовано алкалофильное анаэробное сообщество, как целостная система, на примере самосадочного содового озера Магади (Кения). В результате была предложена схема трофического взаимодействия в алкалофильном сообществе и был выделен ряд первичных и вторичных анаэробов, участвующих • в деструкции органического вещества, в числе которых и первый представитель алкалофильных сульфатвосстанавливающих бактерий -штамм Z-7935, способный развиваться при рН 10 и использующий исключительно Нг и формиат в качестве доноров электронов (Zhilina, Zavarzin,1994). Таким образом, среди СРВ был обнаружен реальный агент, отвечающий за сульфидогенез в содовых озерах, и доказана принципиальная возможность их деятельности при высоких значениях рН и щелочности. В связи с этим открытием, представилась возможность для изучения ранее неисследовавшихся алкалофильных сульфатредующих бактерий (АСРБ), что важно как для понимания биологии СРВ, так и для расширения наших представлений об их экологической значимости в экстремальных щелочных экосистемах.

Целью работы было: изучение физиолого-биохимических свойств, определение таксономического положения алкалофильных сульфатвосстанавливающих бактерий из эпиконтинентальных содовых водоемов и выяснение трофического взаимодействия этих бактерий с другими членами алкалофильного сообщества.

1. Описание первой облигатно алкалофильной водородиспользующей сульфатвосстанавливающей бактерии Z-7935, выделенной ранее из

щелочного озера Магади (Кения);

2. Исследование распространения АСРБ в содовых озерах Тувы (Центральная Азия);

3. Выделение чистых культур и описание новых штаммов АСРБ из содовых озер Тувы.

4. Выяснение возможности участия СРБ в стоке Нг в алкалофильном сообществе.

Научная новизна: впервые проведено исследование АСРБ.

Исследована и описана первая алкалофильная сульфатвос-станавливающая бактерия из оз. Магади, составившая новый род и вид ОезиМопаКопомЬпо Ьубгодепоуогапз, способная использовать исключительно Нг и формиат в качестве доноров электронов. Этот род занимает самостоятельную ветвь дельта-подкласса Рл^ео£>ас£ег/а.

Из содовых озер Тувы (Центральная Азия) выделены в чистые культуры новые штаммы облигатно алкалофильных сульфатвос-станавливающих бактерий, в том числе и ОевиИопакопо^Ыо hydгogenovorans. Таким образом установлено широкое географическое распространение Оези/^опа^опоу/Ьг/о Ьубгодепоуогапз и подтвержден таксономический статус нового рода. В то же время, из озера Хадын (Тува) выделена новая алкалофильная сульфатвос-станавливающая бактерия штамм 2-7951, отличающаяся от О.Ьубгодепо\/огапБ морфологически и способностью использовать кроме Нг и формиата еще и этанол. Штамм 2-7951 по результатам ДНК-ДНК гомологии имеет низкий процент сходства с й^убгодепочогапэ и представляет самостоятельный таксон.

При изучении СРБ из содовых озер Тувы с разным гидрохимическим составом было установлено, что доминирующими формами в них являются Нг - использующие алкалофильные сульфатвосстанавли-вающие бактерии, развивающиеся в диапазоне рН 8-10 и солености 015% №С1. Показано, что в этих условиях алкалофильные сульфатвос-станавливающие бактерии являются главными агентами, отвечающими за сток Нг в системе.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты расширяют представление о разнообразии и экологическом значении СРБ в природе. Выделенные бактерии представляют интерес для биотехнологических исследований, связанных с применением солеустойчивых и устойчивых к высоким рН ферментам.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на заседании Отдела Микробных Сообществ (ИНМИ РАН), конференции "Автотрофные микроорганизмы" (МГУ, 1996) и на IV международном симпозиуме по программе "Эксперимент Убсу-Нур" г.Кызыл, 15-18 августа 1995.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 работы, 1- в печати, 1- представлена в печать.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 120 страницах, включая 9 таблиц и 22 рисунков. Список литературы содержит 50 отечественных и 150 иностранных наименований.

Автор выражает особую признательность м.н.с. Л.Е.Дулову, к.б.н. А.М.Лысенко, д.б.н. М.А.Пушевой, к.б.н. В.В.Кевбрину, д.б.н. Е.А.Бонч-Осмоловской, м.н.с. Е.Н.Детковой, н.с. Н.А.Кострикиной за помощь на определенных этапах работы, а также глубокую благодарность научному руководителю д.б.н. Т.Н. Жилиной и зав. лаб. Реликтовых Сообществ проф. Г.А. Заварзину за предложенную тему и общее научное руководство.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектами исследования были: 1. чистая культура алкалофильного сульфатредуктора, штамм Z-7935, выделенная д.б.н. Т.Н.Жилиной из осадка щелочного озера Магади (Кения);

2. пробы ила из содовых озер Тувы, отобранных в октябре 1994 года д.б.н.Т.Н.Жилиной и проф.Г.А.Заварзиным - участниками научной экспедиции, организованной Убсу-Нурским центром биосферных исследова-

ний.

Среды и условия культивирования. Получение накопительных культур проводили инокуляцией 0.5 г ила во флаконы, согласно анаэробной методике [Hungate,1966; Жилина и Заварзин,1978]. Инкубировали культуры при 30°С 2- 4недели. Чистые культуры получали методом предельных разведений на среде с ацетатом в качестве источника углерода и формиатом в качестве донора электронов. Чистые культуры АСРБ выделяли на среде с различным содержанием NaCI и определенным соотношением ЫаНСОз и Na2C03, соответствующим гидрохимии озер (в г/л) NaCI: 10.0, 50.0, 80.0; бикарбонат/карбонатную смеь подбирали в соответствии с необходимым рН (в г/л): рН 8.0 (10.0 NaHC03), рН 9.0 (4.5 NaHC03+ 2.0 Na2C03), рН 9.5 (10.0 NaHC03+ 2.76 Na2C03 ), рН 10.0 (2.76 №гСОз). Состав среды был следующим (в г/л): КН2Р04-0.2, MgCI2x6H20-0.1, NH4CI-0.5, KCI-0.2, Na2S04-3.0, дрожжевой экстракт-0.01, витамины по Волину-10мл/л, микроэлементы по Витману-1мл/л, резазурин-0.002%, Na2Sx9H20-0.5; В качестве субстратов использовали Н2 (2 атм.) и формиат (5г/л).

Для выделения и описания колоний применяли твердую среду с 3% агара (карбонат и бикарбонат добавляли отдельно после стерилизации).

Для определения зависимости роста от NaCI среда была следующего состава (г/л): К2С03-5.0; (NH4)2SQ4-2; КН2Р04-0.2; K2S-0.5; дрожжевой экстракт-0.5; раствор витаминов; раствор микроэлементов; резазурин 0.002%; субстрат-Н2-100% газовой фазы; рН 9.5 устанавливали 6N КОН; NaCI в концентрации от 0% до 20% добавляли отдельно в каждый флакон.

При определении возможных доноров электронов, их вносили в концентрации 5 г/л. Акцепторы электронов вносили в среду в следующих концентрациях: Na2S04-30 мМ, Na2S03-5 мМ, Na2S203x5H20-10 мМ, DMSO (диметилсульфоксид)-2 мл/л, S°-51mM, фумарат Na-Ю мМ, Fe(OH)3-6 мМ, NaN03-10 мМ.

Способность к неорганическому брожению (реакции дисмутации) Na2S03 и ЫагБгОз проверяли по методике Бака (Bak and Pfennig, 1987). Сульфат измеряли нефелометричесш по выпадению в осадок Ba2S04,

согласно методике (Cypionka and Pfennig, 1986), сульфид определяли колориметрически по образованию метиленовой сини [Truper and Schlegel,1964].

Микроскопические методы исследования. Морфологию клеток культур изучали в световом микроскопе с фазовым контрастом МБИ-3 при увеличении 90x15 и на тотальных препаратах и ультратонких срезах в электронном микроскопе JEM-100 С (Япония) по стандартным методикам.

Определение роста. Рост культур оценивали по приросту клеток и образованию конечного продукта реакции -сульфида, который определяли колориметрически по образованию метиленовой сини [Truper and Schlegel, 1964].

Аналитические методы. Водород и ЛЖК определяли на газовом хроматографе Chrom-5 (Чехия) с пламенноионизационным детектором. При определении Нг разделение проводили на стеклянной колонке 0.9м х Змм, заполненной Chromosorb - 101("Sigma",USA). Газом носителем служил аргон. Температура колонки при определении ацетата была 160° С. Для определения ацетата культуральную жидкость, осажденную от клеток, подкисляли концентрированной HCl до pH 2, после чего 2 мкл образца вводили в хроматограф.

Формиат определяли по методу Ланга (Lang and Lang,1972).

Глюкозу определяли с фенолом (Hansson and Phillips, 1Э81). При определенииоптимумов pH. температуры и концентрации NaCI у всех культур АСРБ использовали изотопный метод (Иванов, 1956) с меченным по атому серы сульфатом. Отгонку HS' проводили азотом. Поглотителем являлась смесь этанола, ß-n-фенилентетрамина и сцинтилляционной жидкости ЖС-106 в пропорции 0,5:1:1. Радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике LKB Rakbeta (Швеция). За активность принимали распад атома серы (количество импульсов в 1 минуту); за 100% принимали максимальное количество импульсов.

Десульфовиридин определяли по методике Постгейта (Postgate, 1959). Грубые экстракты готовили, воздействуя на клеточную массу щелочными буферами и ультразвуком.

Выделение и очистку ДНК проводили по методике Мармура

(Marmur,1961). Нуклеотидный состав определяли по температуре плавления ДНК (Owen et al., 1969). Гибридизацию ДНК проводили методом оптической реассоциации (De Ley et а!., 1970).

Состав цитохромов определяли по дифференциальным спектрам поглощения на спектрофотометре Ломо СФ-56 (СССР) восстановленных дитионитом против окисленных перекисью водорода мембранных препаратов согласно методике (Пушева и др., 1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1 ■ Описание штамма Z-7935, из озера Магади (Кения).

Морфологически штамм представляет собой мелкие подвижные вибрионы, одиночные или в парах шириной 0.5 мкм и длиной 1.5-2.0 мкм. Электронные фотографии показывают наличие полярно-расположенного жгутика. Размножение- бинарным делением. При неблагоприятных условиях образуются короткие спириллы - цепочки неразделившихся вибрионов. Клеточная стенка на ультратонких срезах имеет типичную грамотрицательную структуру. Образование спор не наблюдали.

Форма колоний линзовидная в толще агара и каплевидная на поверхности агара, цвет колоний желтоватый, размеры - менее 2 мм.

Организм катаболически очень ограничен. В качестве доноров электронов способен использовать только Нг и формиат. Не было роста на следующих субстратах: ацетат, пропионат, бутират, пируват, лактат, малат, фумарат, сукцинат, метанол, этанол, глицерин, глицин, цистеин, цистин, серин, аланин, глутамат, аспартат, казаминовые кислоты, дрожжевой экстракт, холин, бетаин, глюкоза, фруктоза, рамноза, манноза.

В качестве акцепторов электронов организм способен использовать сульфат и сульфит. На тиосульфате рост прекращается после 2-3 пересевов. Сера, DMSO (диметилсульфоксид), фумарат, нитрат, Fe(OH)3 не использовались как акцепторы электронов. Роста без акцепторов электронов не было. Организм является строгим анаэробом.

Микроорганизм способен осуществлять реакцию дисмутации тиосульфата и сульфита до сульфата и сульфида в соответствии с

реакцией [Bak and Pfennig, 1987]: БгОз2' + НгО -> S042" + HS" + H+

4S032" + H+ 3S0^2' + HS" В случае диспропорционирования 10 мМ ЫагЭгОз при двухнедельной инкубации образовывалось ЮмМ SO42' и 11 мМ HS" , численность бактерий при этом составила 14x107 кл/мл; а при дисмутации 5 мМ ЫагЭОз образовывалось 1 мМ HS" и 2.4 мМ SO*2", численность бактерий составила 17x10' кл/мл.

Штамм Z-7935 является литогетеротрофом и для анаболизма нуждается в органическом углероде - ацетате (2мМ) или дрожжевом экстракте (0.5-1.5 г/л).

Штамм Z-7935 облигатно нуждается в карбонат-ионе: замена карбонатов эквимолярным количеством NaCI в среде, где рН 9.0 поддерживался сериновым буфером , не давала роста. Оптимальным значением рН для роста были 9.4-9.7(рис.З). Нижним пределом роста был рН 8.0, верхним- 10.2. Роста при рН 7.5 и 10.5 не было. Таким образом, исследованный штамм является облигатным алкалофилом.

рН

Рис.3. Зависимость сульфидогенеза шт. 2-7935 от рН.

При эквимолярной замене в среде солей, содержащих ион на те же соли, но с ионом К+, роста получено не было, и, следовательно, штамм 2-7935 облигатно нуждается в ионе №+.

Была определена зависимость сульфидогенеза от ЫаС1 и температуры. Температурный оптимум штамма 2-7935 лежит в пределах

37-40°С, роста ниже 20°С и выше 45°С при двухнедельной инкубации не было. Следовательно, штамм Z-7935 является мезофилом.

Оптимальная концентрация NaCI для штамма Z-7935 составляет 3%, нижний предел коценграции NaCI - менее 1%, верхний - 12%. Следовательно, штамм Z-7935 является умеренным галофилом.

Десульфовиридин. характерный для представителей рода Desuifovibrio , у штамма Z-7935 обнаружен не был.

В мембранах клеток штамма был идентифицирован характерный для большинства СРБ цитохром С (пики: а-552 нм, (i-522,5 нм, у-419 нм).

Липидный анализ, выполненный д.х.н. Г.А. Осиповым, показал, что в клетках штамма Z-7935 доминирующими являются насыщенные жирные кислоты с Ci6- и С« -скелетами, они составляют 66,7% от всех жирных кислот. Разветвленные насыщенные жирные кислоты составляют только 11%. Из мононасыщенных жирных кислот, составляющих 12%, присутствуют следующие: Ci6.iw7, C¡8:1,.,9, Cib.i,.,ii, Ci9m жирные кислоты. Для штамма Z-7935 характерно отсутствие изогептадекановой кислоты H30-Ci7;i, которая является биомаркером рода Desuifovibrio, и присутствие цис-вакциновой Cía i,,n кислоты.

Филогенетический анализ был выполнен др. Ф. Рэйни в DSM (Германия) (рис.4). Оказалось, что штамм Z-7935 представляет отдельную линию в дельта- ветви Proteobacteria, кластируемую со штаммом TD3 (86,6%)[Rueter et al.,1994] и (88.7%) с Desulfohalobium retbaense-галофильной СРБ, выделенной из гиперсоленого озера Ретба (Сенегал) [Ollivier et al.,1991]. Но по последовательности 16S рДНК от ближайших соседей штамм Z-7935 отличается более чем на 11% и представляет отдельный род. На основании морфо-физиологических и генетических особенностей штамм Z-7935 был выделен в самостоятельный род Desulfonatronovibrío gen. nov. с типовым видом Desulfonatronovibrio hydrogenovorans sp. nov. Типовой штамм Z-7935T под номером 9292 помещен в немецкую коллекцию и узаконен [Zhilina et al., 1997].

Desulfonatronovibrio hydrogenovorans - штамм Z-7935

— -Desulfohalobium retbaense

- штамм TD3

-Desulfovibrio desulfuricans

— - Desulfovibrio vulgaris

--- Desulfovibrio africanus

-Desulfovibrio halophilus

-Desulfovibrio salexigens

_Desulfovibio longus

Desulfovibrio gigas Desulfomicrobium baculatus Desulfuromonas acetoxidans

-Desulfobulbus propionicus

-Desulfococcus multivorans

-Desulfomonile tiedjei

-Desulfacinum infernum

- Desulfobacter postgatei

_5%_

Рис.4. Филогенетическая дендрограмма, указывающая место D.hydrogenovorans Z-7935 среди СРБ на дельта-ветви Proteobacteria. Бар соответствует 5 нуклеогидным замещениям на 100 нуклеотидов.

Desulfonatronovibrio (De.sul.fo.nat.ro.no.vib.rio M.L. De -отрицание, sulfo -сульфат, natron -сода, vibrio- изогнутая палочка. Сульфат-редуцирующая изогнутая палочка из содовой среды.

Алкалофильная сульфатредуцирующая эубактерия. Клетки подвижные, спор не образуют, грам отрицательные вибрионы с полярным жгутиком. Литогетеротроф; использует водород для восстановления серных соединений. Строгий анаэроб. Облигатно зависит от Na'1' ионов. Нуждается в витаминах и ацетате как источнике углерода для роста на Нг или формиате. Ацетат может быть заменен дрожжевым экстрактом.

Члены дельта-ветви Proteobacteria. Типовой вид Desulfonatronovibrio hydrogenovorans.

Диагноз Desulfonatronovibrio hvdrogenovorans sp. nov. (hy.dro.ge.no.vo.rans от ML hydrogen - водород, vorans - использующий).

Подвижный вибрион с одним полярно расположенным жгутиком. Размеры: 0.5 х 1.5-2 мкм. Одиночный или в парах; при неблагоприятных условиях образует короткие спириллы. Размножается бинарным делением. Клеточная стенка имеет типичную для грамотрицательных бактерий структуру.

Строгий анаэроб, литогетеротроф. Способен использовать только водород или формиат как доноры электронов, а сульфат и сульфит как акцепторы электронов. Серу не восстанавливает. Сульфид является единственным продуктом катаболизма. Дрожжевой экстракт или ацетат используется для анаболизма.

Облигатный алкалофил, который не растет при нейтральных pH; Оптимальный pH для роста и сульфидогенеза - в пределах 9.5-9.7; выше 10.2 роста нет. Облигатно зависит от иона натрия; умеренный галофил: не растет ниже 1% и выше 12% NaCI. Нуждается в карбонат анионе. Мезофил: Оптимальная температура роста - 37°С; пределы - 15- 42°С; наблюдается слабый рост при 22°- 26°С после длинной лагфазы.

Содержание ГЦ в ДНК составляет 48.6 мол.% (метод термической денатурации).

Обитание: донные осадки содовых озер.

Типовой штамм: Z-7935, выделенный из самосадочного содового экваториального озера Магади (Африка) хранится в лаборатории реликтовых сообществ Института микробиологии РАН и в коллекции DSM, DSM 9292т.

2. Распространение алкалофильных сульфатвосстанавлив ало щих

бактерий в содовых озерах Тувы.

Следующим этапом нашей работы было выяснение распространения АСРБ □ галоалкалофильных сообществах озер Тувы (Центральная Азия). Исследованные озера различались по гидрохимии, рН (от 8.0 до 10.0) и солености (от 1% до 20 %); и для того чтобы выяснить пределы рН и солености для вторичных анаэробов этих озер был выполнен предварительный ориентирующий эксперимент на смешанной пробе всех девяти озер [Заварзин и др.,1996]. Для исследования сульфатредукторов посевной материал был инокулирован на характерные для вторичных анаэробов субстраты - Нг, формиат, ацетат, лактат - в матрице рН/соленость.

Рис.5. Сульфидогенез смешанной пробы на водороде.

Эксперимент показал, что доминирующими формами в озерах изучаемого региона являются Нг- использующие СРБ. Они наблюдаются в диапазоне рН: 8.0-10.0 при соленостях (по ЫаС1) от 5 до 15%, но не при 20% (рис.5). Они могут использовать также формиат в том же диапазоне

[НгЭ] мМ

[№С1] %

р..

о

5

20 [Н2Б]

мМ

15

10

Рис.6. Сульфидогенез смешанной пробы на формиате.

рН и солености (рис.6).

Сульфидогенез на лактате обнаружен и при 20% солености, но лишь при рН 8.0, что может указывать на возможное существование галофильных видов СРБ в этих озерах (рис.7). Ацетат не потреблялся ни в одном из вариантов. В целом можно сказать, что потенциальная способность к сульфидогенезу в смеси проб тувинских озер снижается при возрастании значений рН и солености (по ЫаС1).

В предварительном эксперименте было показано, что возможные конкуренты за Н2 среди вторичных анаэробов (метаногены и ацетогены) в экстремальных условиях щелочности и солености Нг не используют.

Использование СРБ именно Нг и формиата в широком диапазоне рН и солености, в том числе и при экстремальных значениях, свидетельствует о том, что именно СРБ осуществляют сток водорода, так как содержание сульфатов во всех озерах достаточно для поддержания процесса.

Предварительный эксперимент позволил с большей вероятностью обратиться к исследованию соответствующих конкретных проб с целью поиска экстремофильных по алкалофилии СРБ.

[№01] %

Рис.7. Сульфидогенез смешанной пробы на лактате.

3. Выделение АСРБ из проб содовых озер Тувы.

Выделение штаммов АСРБ проводили на элективных средах. Состав сред соответствовал гидрохимии содовых озер. Из проб озер Хадын, Чедер, Шара-Нур и Как-Холь были выделены четыре штамма алкалофильных СРБ (табл.1).

Таблица 1. Характеристика проб, из которых были выделены штаммы.

N Штамм Название рН Соленость Щелочность

проб озера : воды по №С1 (%) мг экв/л

3 г-7951 Хадын 10.0 2 450

18 г-7952 Чедер 9.0 8 240

20 г-7953 Шара- Нур 9.5 3 350

26 г-7954 Как- Холь 9.0 5 30

Описание штаммов г-7951. г-7952. г-795Э и г-7954

Все штаммы, за исключением 2-7951, представлены мелкими подвижными вибрионами по морфологии и размерам схожими с ОеэиНопаХгопо^1Ьпо 1пус1годепоуогапз. Штамм г-7951 имеет несколько большие размеры 1.2х 2.7-3 мкм Число пилей и ворсин варьирует, наибольшее число пилей оказалось у штамма 1-7954.

Колонии всех четырех штаммов по цвету, форме и размерам оказались близкими. В толще агара они линзовидные, а поверхностные -в виде капли. Размеры колоний 0.5-2.0 мм.

-•—2-7951 -»-2-7952

--1-7953

--г-7954

Рис. 8. Зависимость сульфидогенеза штаммов АСРБ,

выделенных из содовых озер Тувы, от температуры

Температурный оптимум всех штаммов, выделенных из тувинских озер, как и у типового ОЛус/годепоиогапв лежит в пределах 37-40°С (рис.8).

Как и О.Ьубюдепоуогапэ тувинские штаммы облигатно нуждаются в ионе и карбонат-ионе. Оптимумы рН так же оказались близкими и лежат в пределах 9.0-9.5 (рис.9). Таким образом, все штаммы являются облигатными алкалофилами.

Все четыре штамма, в отличие от О.Ьус/годелоуогапэ, не нуждаются в хлор-ионе и хорошо растут в отсутствии №С1, более того, добавление его в среду заметно увеличивает лаг-фазу (рис.10).

•*-г-7951

--г-7952

--г-7953

-ж-2-7954

Рис.9. Зависимость сульфидогенеза штаммов АСРБ, выделенных из озер Тувы от рН.

Из всех проверенных субстратов все штаммы, кроме 2-7951, обнаружили рост только на водороде и на формиате, которые используются ими в качестве доноров электронов (рост только в присутствии сульфата или сульфита). Штамм 2-7951 кроме водорода и формиата способен использовать еще и этанол, а как акцептор электронов может использовать дополнительно и тиосульфат.

5 10

N301 (%)

Рис.10. Сульфидогенез штаммов ЛСРБ в зависимости от N30!.

Рост бактерий без акцепторов электронов не обнаружен. Для полноценного роста все штаммы, выделенные из озер Тувы, как это было показано для штамма г-7935 (О.Ьус/годепоУогапз), нуждаются в дрожжевом экстракте, и являются литогетеротрофными.

Все четыре штамма как и О.Ьуйгодепочагапэ осуществляют неорганическое брожение сульфита и тиосульфата.

Десульфовиридин также не был обнаружен ни у одного из четырех штаммов.

Как видно из исследования, все четыре штамма по морфологии и физиологии оказались схожими с штаммом 2-7935, выделенным изоз. Магади, и только штамм 2-7951 отличался размерами, способностью потреблять этанол и использовать в качестве акцептора электронов тиосульфат. Лишь незначительные различия в физиологии (оптимум рН, отсутствие потребности в №С1) отмечаются у штаммов, выделенных из оз. Магади и озер Тувы. На основании большого сходства последних нами была проведена ДНК-ДНК гомология.

Анализ ДНК-ДНК гомологии штаммов АСРБ из озер Тувы с Р. Ьус!годепоуогапз.

Анализ показал, что по содержанию ГЦ пар в ДНК исследованные штаммы распались на два кластера: к первой группе относятся штаммы г-7952, 1-7953, г-7954 и D.hydгogenovorans г-7935 (47,9-48,5 мол.ГЦ); вторая представлена единственным штаммом 2-7951 с более высоким содержанием ГЦ пар (57.3 мол.ГЦ).

Штамм ГЦ Размер генома мол.% (дальтон)

(-2-7935 48.5 2.1 х 109

-2-7952 48.0 2.0 х 109

—2-7953 47.9 2.0x 109

'-2-7954 48.3 1.9x 109

2-7951 57.3 3.4 х 10

30

90 100 (%)

Рисунок 11. Геномные характеристики алалофильных СРБ.

На гистограмме показаны геномные характеристики всех штаммов АСРБ (рис.11).

Таким образом, данные по нуклеотидному составу подтверждают морфо-физиологическое отличие штамма 2-7951 от других алкалофильных сульфатвосстанавливающих штаммов.

По результатам молекулярной ДНК-ДНК гибридизации штамм 2-7951 также характеризовался относительно низким уровнем гомологии в пределах 20% как по отношению к типовому- О.Нус1годепсуогапз 2-7935, так и к штаммам, выделенных из озер Тувы. Изучение сходства в полинуклеотидных последовательностях ДНК алкалофильных сульфат-редуцирующих штаммов с более низким нуклеотидным составом показало, что все исследованные штаммы относятся к одной генетической группе с высоким уровнем гомологии (90-100%). Наличие генетического родства у штаммов 2-7952, 2-7953 и 2-7954 но вызывает особого удивления, так как они выделены из содовых озер Тувы, расположенных в сходных географических, геологических и климатических широтах. В то же время крайне любопытно, что им генетически близок типовой штамм D.hydrogenovcrans 2-7935, который изолирован из экваториального озера Магади с принципиально иными условиями. Таким образом, анализ ДНК-ДНК гомологии показал широкое географическое распространение Оези1^па^опо,ЛЬпо Иус1годепоУогапз в содовых эпиконтинентальных озерах, географически отдаленных континентов.

Изучение АСРБ, выделенных из содовых озер Тувы показало, что штамм 2-7951 отличается от других штаммов и представляет самостоятельный таксон на уровне нового рода. Выделение новых штаммов Оеги1(опа1гопо\/1Ьпо hydrogenovorans подтвердило таксономический статус этого нового рода.

Табл.2. Сравнительные характеристики изученных штаммов

алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий.

Изучаемый признак Штаммы Оези^опаКопоу1Ьпо hydrogenovorans

г-7951 2-7952 2-7953 г-7954 г-7935т

Форма клеток вибрион вибрион вибрион вибрион вибрион

Размеры (мкм) 1.2x2.7 0.6 х 2.0 0.6 х 2.0 0.6 х 1.8 0.6 х 2.0

Жгутик монотрих монотрих монотрих монотрих монотрих

Пили +/- +/- +/- + +/-

Г+Ц (%мол.) 57.3 48.0 47.9 48.3 48.5

Геном (дальтон) 3.4 х 109 2.0 х 109 2.0 х 109 1.9 х 109 2.1 х 109

Доноры электронов: водород формиат этанол + + + + + + + + + +

Акцепторы электронов: ЫагЭСи ЫагЭОз ЫагЭгОз + + + + + + + + 4- + +

Дисмутация: ЫагБОз ЫагЭгОз + + + + + + + + + +

Десульфови ридин _ _

Оптимум рН 9.5 9.0 9.3 9.0 9.5

Оптимум 40 40 37 40 37

Потребность в СГ НСОз' + + + + + +

4._Выясн_ение возможности участия СРБ в стоке Н? в алкал о ф и л ьно м сообществе.

Для доказательства способности АСРБ взаимодействовать с первичными анаэробами исследовали рост типового штамма г-7935 О.ИуФодепо^'огапз и штамма г-7951, использующего этанол, в бинарной культуре с 5ртос/7ае?а аШаИса 1-7491 при росте на глюкозе.

Количественные данные продуктов роста чистой культуры Бр.а1каИеа 2-7491 и бинарных культур приведены в таблице 3.

На рисунке 12 показан рост чистой культуры 3.а1каНса на глюкозе и продукты обмена. Конечными продуктами реакции являются ацетат и Н2, который при определенных концентрациях ингибирует рост, в результате чего глюкоза остается неполностью потребленной.

П 30 -,

20 -15 -10 -5 -

О Л

О 2 4 б 8 11

сутки

Рис.12. Потребление глюкозы и образование продуктов Б.аЖаПса

Таблица 3. Количественные данные потребления глюкозы и образования продуктов З.а/каНса и бинарными культурами.

—♦— глюкоза —•—ацетат --водород

Штаммы: Потребление глюкозы (мМ) Продукты роста (мМ): ацетат Нг НгБ

Эр.аШаНса г-7491 21 13 24

5р.а1каНса г-7491 + О.Ьус/годепоуогапэ г-7935 30 22 0 9

$р.а1каНса г-7491+шт.2-7951 30 30 0 13

Иная картина представлена в бинарной культуре D.hydrogenovorans с Б-а/каИса (рис.13). Глюкоза здесь потреблена до конца из-за постоянного оттока Нг, осуществляемого сульфатредуктором. Н2 в этой системе был использован до 0,7мкмоль. На рисунке 14 показана сходная картина, но ацетата в этом случае образовалось несколько больше.

сутки

Рис.13. Рост на глюкозе бинарной культуры 8.а1ка1юа и О.Ьуйгодепоуогапз.

—♦—глюкоза —•—ацетат --сульфид

30 , 25 : 20 . 15 . 10 . 5 .

О*.

4 6

сутки

—♦— глюкоза —•—ацетат --сульфид

11

Рис.14. Рост бинарной культуры 8.а1каПса и шт.г-7951.

Таким образом, опыт показал, что Нг - потребляющие СРВ могут вступать в тесные трофические взаимодействия с теми первичными анаэробами, которые в качестве продуктов обмена дают Нг, и использовать его, образуя при этом сульфид.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

Исследование показало, что Н2 - использующие АСРБ достаточно широко распространены в содовых озерах Африки и Центральной Азии и развиваются в достаточно узком диапазоне рН (8-10) и широком диапазоне солености (0 - 15% NaCI); также показано, что эти виды катаболически узко специализированы, так как в большинстве используют в качестве доноров электронов лишь Н2 и формиат, но и их разнообразие не ограничено D.hydrogenovorans. Эти микроорганизмы могут быть ответственными за сток Н2, в алкалофильном анаэробном сообществе содовых водоемов.

Выделение и изучение АСРБ стало возможным с применением принципиально иной среды [Zhilina and Zavarzin,1994], где высокий рН и буферность поддерживались за счет карбоноата и бикарбоната натрия, в которых, как было установлено нами, АСРБ облигатно нуждаются.

Выводы:

1. О писан первый представитель алкалофильн ых сульфатвос-станавливающих бактерий штамм Z-7935, выделенный ранее из озера Магади, который представляет самостоятельный таксон: новый вид нового рода Desulfonatronovibrio hydrogenovorans. Этот организм способен использовать крайне узкий спектр доноров электронов (Н2 и формиат) и развивается при высоком рН (оптимум 9.7).

2. При изучении содовых озер Тувы с разным гидрохимическим составом вод было установлено, что доминирующими формами в них являются Н2-потребляющие АСРБ, развивающиеся в диапазоне рН (8-10) и солености от 0 до 15 % NaCI, и в этих условиях осуществляющие сток Н2.

3. Из содовых озер Тувы (Центральная Азия) выделены в чистые культуры три новых штамма Z-7952, Z-7953, Z-7954 D.hydrogenovorans и описаны физиологически и таксономически. Тем самым была показана широкая географическая распространенность D.hydrogenovorans .

4. Из озера Хадын (Тува) была выделена новая алкалофильная сульфатвосстанавливающая бактерия штамм 2-7951, отличающаяся от О.Ьус1годепо\/огап5 морфологически и способностью использовать кроме Нг и формиата еще и этанол. Штамм ¿-7951 по ДНК-ДНК гомологии имеет низкий процент сходства с D.hydrogenovorans. и представляет самостоятельный таксон.

5. На примере взаимодействия со Бр.а/каИса показаны возможные трофические связи АСРБ с первичными анаэробами.

Список работ по теме диссертации.

1. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Ликута Е.В. 1995. Вторичные анаэробы аталассофильных водоемов Тувы.// Труды IV Международного симпозиума по программе "Эксперимент Убсу-Нур" (Global Change and Ubsu-Nur) Изд. "Интеллект", Москва, 15-18 августа 1995г.

2. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Пикута Е.В. Вторичные анаэробы в галоалкалофильных сообществах озер Тувы.// Микробиология. 1996. Т.65, вып.З, с.546-553.

3. Пикута Е.В., Жилина Т.Н., Лысенко A.M. Desulfonatronovibrio hydrogenovorans в содовых озерах Тувы.// В материалах конференции "Автотрофные микроорганизмы", МГУ, 23-25 апреля 1996, с.76.

4. Zhilina T.N., 2avarzin G.A., Reiney F.A., Pikuta E.V., Osipov G.A. and Kostrikina N.A. Desutfonatronovibrio hydrogenovorans gen. х\ом., щ. nov. alkalifphilic sulfate reducing bacterium.// Int.J.System.Bacteriol., V.47(1), pp.144-149.

5. Пикута E.B., Лысенко A.M., Жилина Т.Н. Распространение Desulfonatronovibrio hydrogenovorans в содовых озерах Тувы.// Микробиология. 1997, Т.66, вып.2, с.291-297.

6. Пикута Е.В., Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Новая алкалофильная сульфатвосстанавливающая бактерия, использующая этанол.// Микробиология. Представлена в печать.