Галоалкалофильные аэробные метилобактерии рода Methylophaga

Ли Цырегма Дармаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Галоалкалофильные аэробные метилобактерии рода Methylophaga
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Галоалкалофильные аэробные метилобактерии рода Methylophaga"

на правах рукописи

ЛИ ЦЫРЕГМА ДАРМАЕВНА

ГАЛОАЛКАЛОФИЛЬНЫЕ АЭРОБНЫЕ МЕТИЛОБАКТЕРИИ РОДА МЕТИПОРИЛвЛ

03,00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущине - 2006

Работа выполнена в Путинском государственном университете на оазе лаборатории радиоактивных изотопов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

ЮЛ. Троиенко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук доктор биологических наук

Л.И. Евтушенко С.Н. Дедыш

Ведущая организация: биологический факультет Московского Государственного

Университета им. М.В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится «14» декабря 2006 г. в & час. на заседании Диссертационного совета Д002Л21.01 в Институте биохимии и физиолоши микроорганизмов им Г К Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН,

Автореферат разослан « ноября 2006г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Аэробные метилобактерии — физиологическая и таксономическая под1руппа аэробных метилотрофных прокариот, использующих окисленные или замещенные производные метана (но не CHLt) в качестве источников углерода и энергии. Аэробные метилобактерии усваивают биогенные и антропогенные Ci-субсграты и являются природным барьером, препятствующим поступлению этих соединений в окружающую среду. Во многих экосистемах аэробные метилобактерии играют существенную роль в круговороте биогенных макроэлементов (С, N, Р). Хотя окисленные и замещенные производные метана повсеместно распространены в природе, имеется весьма ограниченная информация о биологии аэробных метилобактерии экстремальных экосистем с повышенными или пониженными значениями рН, солености и температуры. К настоящему времени лучше исследованы аэробные метилобактерии почвенных, пресноводных и морских экосистем. Выделены и охарактеризованы морские умеренно галофильные метилобактерии рода Meíhylophaga: М. marina и М. thalassica (Janvier, Grimont, 1985), М. siiljidovorans (de Zwart et al., 1996), M. limanica (Доронина с соавт.,1997), а также Methylarcula marina и Meíhylarcula terrícola (Doronina et al., 2000). Однако практически не изучены метилобактерии из биотопов с высокими значениями солености и рН, в том числе механизмы их осмоадаптации.

Изучение соленых и содовых озер (минерализация до 300 г/л, рН 9.0 - 10.5) на наличие метилобактерий и их роли в галоалкалофильных микробных сообществах было начато нами 7 лет назад. Первые изоляты алкалотолерантных метилобактерий из соленых и содовых озер Южного Забайкалья были идентифицированы как представители нового вида Ancylóbacter mironum (Доронина с соавт., 2001). Вполне очевидно, что эти изоляты не могли охватить потенциальное экофизиологическое и таксономическое многообразие галоалкалофильных/толерантных метилобактерий. Следовательно, целенаправленный поиск и изучение метилобактерий, адаптированных к условиям экстремальных биотопов, весьма актуальны для понимания роли этих бактерий в различных природных эконишах, а также в связи с перспективами использования в качестве модельных объектов для расшифровки молекулярных механизмов осмоадаптации и реализации биотехнологического потенциала.

Цель и задачи исследования. Цель работы - выделение и характеристика новых гало(алкало)фильных аэробных метилобактерий из соленых и щелочных экосистем. Для достижения этой цели были поставлены и решались следующие основные задачи: 1. Выделить чистые культуры аэробных метилобактерий из соленых и содовых озер Южного Забайкалья и Монголии, водорослей Красного моря и разрушающегося

2. Идентифицировать галоалкалофильные изоляты методами полифазной таксономии.

мрамора.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург

3. Исследовать основные механизмы осмоадапгации выделенных галофильных метилобактерий.

Научная новизна работы. Впервые выделены представители метилобактерий рода Methylophaga из соленых и содовых озер и из разрушающегося мрамора, идентифицированные на основании физиолого-биохимических, хемо- и генотаксономических характеристик как новые виды М. alcalica, М. natronica и М. múrala. Впервые обнаружены В^-независимые метилобактерии рода Methylophaga. Бактерии выделены с поверхности водорослей Красного моря и на основании данных секвенирования гена 16S рРНК предварительно отнесены к известному виду М. marina. Впервые показано, что в ответ на повышение солености среды гало(алкало)фильные метилобактерии рода Methylophaga синтезируют органические осмопротекгоры (зкгоин, глутамат и сахарозу), их суммарное внутриклеточное содержание (~1М) уравновешивает осмолярность среды. Определены пути биосинтеза этих осмопротекгоров из метанола. Установлено, что метилобактерии соленых и щелочных биотопов находятся в трудно разделимых ассоциациях с метанотрофами и гетеротрофами, поставляющими метилобактериям Ci-интермедиаты и ростовые факторы. Полученные результаты свидетельствуют о широком распространении и важной экофизиологической роли гало(алкало)фильных аэробных метилобактерий, как необходимого функционального компонента микробиоты соленых и содовых биотопов.

Практическое значение. Расширен спектр детально охарактеризованных коллекционных культур аэробных метилобактерий, устойчивых к высоким значениям pH и солености. Показано, что представители рода Methylophaga способны на основе дешевого непищевого возобновляемого сырья - метанола накапливать эктоин (до 20% от веса сухой биомассы), что позволяет считать их потенциальными продуцентами этого биопротектора широкого спектра действия, защищающего клетки и биомолекулы от губительного влияния высоких температур, высушивания и ультрафиолетового излучения. Исследованные галоалкалофильные, а также галофильные нейтрофильные метилобактерии рода Methylophaga могут являться модельными объектами для выявления особенностей их осмоадаптации на молекулярно-генетическом уровне с целью создания более эффективных штаммов-продуцентов эктоина.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на V и VI конференциях молодых ученых г. Пущино (2001, 2002), на VII Symposium on Bacterial Genomics and Ecology (Bergen, Norway, 2002), VIII и IX Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2004 и 2005), на молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (ИНМИ РАН, Москва, 2005), а также на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2000-2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и б тезисов.

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в Пущинском государственном университете на базе лаборатории радиоактивных изотопов и мегилотрофии в рамках плана научно-исследовательских работ ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН по теме "Структурно-функциональное и таксономическое разнообразие аэробных метилотрофов" (№ Госрегистрации 0120.040339S).

Благодарности. Автор глубоко признателен всем сотрудникам лаборатории мегилотрофии и радиоактивных изотопов, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы, а также д.б.н., проф. Намсараеву Б.Б. (Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, г. Улан-Удэ), д.б.н. Сорокину Д.Ю. (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, г. Москва), к.б.н. Петушковой Ю.П. (МГУ, г. Москва), д.б.н. Осипову Г.А. (Академическая группа ак. Исакова Ю.Ф., РАМН, г. Москва), к.б.н. Калиману А.В. (Институт Белка РАН), к.б.н. Сузиной НЕ., к.х.н. Сахаровскому В.Г., к.х.н. Шляпникову М.Г, к.х.н. Аданину В.М., Ильченко В.Я. (ИБФМ РАН). Особую благодарность автор выражает своим учителям д.б.н., проф. Троценко Ю.А. и д.б.н. Дорониной Н.В. за постоянное внимание и полезные советы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 114 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 215 ссылок, из них 40 на русском и 175 на английском языках, содержит 20 таблиц и 13 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследования. Образцы ила щелочных озер Южного Забайкалья получены от д.б.н. проф. Б.Б. Намсараева (Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, г. Улан-Удэ), из содовых озер Монголии любезно предоставлены д.б.н. Д.Ю. Сорокиным (Институт микробиологии РАН, г. Москва). Пробы соскоба разрушающейся части мраморного памятника Московского Кремля (рН 10-11) получены от к.б.н. Ю.П. Петушковой (МГУ, г. Москва). Образцы двух видов зеленых морских водорослей Ulva lactuca и Cystoseira trinodes отобраны И.А. Лапшиной (ИБФМ РАН, г. Пущино) в разных участках прибрежных зон Красного моря (Египет, январь 2004г). Объектами исследования служили выделенные нами 8 галоалкалофильных штаммов и 2 галофильных нейтрофильных штамма. Для сравнения в работе использовали коллекционные культуры Meíhylophaga marina АТСС 35842т (ВКМ-2056), Meíhylophaga thalassica АТСС 3314бт (ВКМ-2057) и Meíhylophaga sulfldovorans RB1 LMP 95.210T(BKMB-2175).

Выделение накопительных культур. Использовали среду «М» с добавлением 0.2-6% NaCl, содержащую (г/л): КН2РО4 - 1.0; KN03 - 1.0; MgS04'7H20 - 0.2 и 1 мл/л раствора микроэлементов (мг): FeMit-цитрат - 300; СаС12-2Н20 - 300; МпСЬЧНгО - 50; ZnS04'7H20 - 50; CuS04-5H20 - 5; Н2О - 100 мл. Среду и раствор микроэлементов стерилизовали отдельно (1 атм 30 мин). Соответствующие природному образцу значения рН устанавливали, добавляя Иа-карбонатный буфер в конечной концентрации 50-100 мМ. Для выделения галофильных нейтрофильных метилобакгерий использовали минеральную среду «К» с добавлением 6% NaCl, следующего состава (г/л): КН2РС>4 - 2.0; (NHt)2S04 - 2.0; NaCl - 60.0; MgS04'7H20 - 0.125; FeS04-7H20 - 0.002; рН 7.5. Отобранные образцы водорослей помещали в чашки Петри между листами стерильной фильтровальной бумаги. Обезвоженные таким образом водоросли использовали для инокуляции среды. После стерилизации в среды вносили 0.5% (по объему) метанола в качестве источника углерода и 0.05% (по объему) дрожжевого автолизата в качестве источника витаминов. Культивирование проводили в колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды и 0.5% (по объему) посевного материала (образцы ила и водорослей), при 29°С на роторной качалке (140 об/мин) в течение 1-2 недель. После появления роста бактерий, 10 мл накопительной культуры переносили в свежие среды с метанолом и повторно инкубировали.

Выделение чистых культур. Использовали метод истощающего посева накопительных культур на чашки Петри с агаризованными средами «М» и «К». Чистоту культур контролировали по однородности колоний на агаризованных средах с метанолом, глюкозой и пептоном, а также с помощью фазово-контрастной световой (Jenaval, Германия) и электронной микроскопии (JEM 100В, "Jeol", Япония).

Культивирование бактерий. Галоалкалофильные метилобактерии выращивали на описанной выше среде "М" с добавлением карбонатного буфера, раствора микроэлементов и оптимальной концентрации NaCl. Галофильные нейтрофильные штаммы культивировали на среде «К» в колбах объемом 750 мл, содержащих 200 мл среды, метанол (0.5 % по объему) на качалке (140 об/мин) при температуре 29°С. В качестве посевного материала использовали суточную культуру. Инокулят добавляли в среду в соотношении 1:10. Для галоалкалофильных штаммов в качестве фактора роста вносили витамин Ви (10 мкг/л).

Физиолого-биохимические свойства выделенных чистых культур изучали по общепринятым методам (Герхардт, 1984). Электронно-микроскопические исследования проводили по описанным методикам (Сузина, Фихте, 1986). Активность ферментов в бесклеточных экстрактах определяли известными методами (Доронина, 1999). Активности ферментов пути биосинтеза эктоина определяли по ранее описанным методам (Reshetnikov et al., 2004). Содержание белка определяли модифицированным методом Лоури (Schacterle and

Pollack, 1973). Хиноны, фосфолипидный и жирнокислотный состав клеток аналшировапн стандартными методами (Collins, 1985; Doronina et aL, 2000). Экзополисахариды (ЭПС) из культуральной среды осаждали ацетоном и мономерный состав определяли на углеводном или аминокислотном анализаторах "Biotronic" (Германия). Внутриклеточные органические соединения идентифицировали на ЯМР-спектрометре WP-80SY (Швейцария), ВЭЖХ и ТСХ, спеетрофотометрические измерения проводили на "Specord UV VIS" (Германия) и "Shimadzu UV-160" (Япония), радиометрические - на сцинтилляционном спектрометре SL-30 "Intertechnique" (Франция).

Модекулярно-генетичсские методы. ДНК выделяли и очищали известными методами (Marmur, 1961; Маниатис с соавт., 1984). Нуклеотидный состав определяли по температуре плавления ДНК на спектрофотометре "Pye Unicam" (Доронина с соавт., 1998). ДНК-ДНК гибридизацию проводили на нитроцеллюлозных фильтрах (Denhardt, 1966). ПЦР-амплификацию и секвенирование гена 16S рРНК проводили стандартными методами (Lane, 1991). Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе ABI Prizm 310 Applied Biosystems (США), а также на фирме «Силекс» (Москва). Для сравнения нуклеотидных и транслированных аминокислотных последовательностей с таковыми в GenBank использовали программу NCBI BLAST (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BIast), для выравнивания - программу Clustal (1.3w), для построения филогенетических деревьев -TreeconW (версия 1.3Ь).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение и характеристика галоалкалофильных изолятов из содовых озер.

Из проб ила озер Южного Забайкалья и Монголии с высокими значениями рН (9.510.6) выделены 21 бактериальные накопительные культуры, активно использующие метанол в качестве источника углерода и энергии при росте на карбонатной среде "М" при рН 9.010.0 и не требующие дополнительных ростовых факторов. Эти накопительные культуры были весьма стабильны; они поддерживались при 4°С в жидкой среде в течение ряда лет при пересеве один раз в год. Выделение чистых культур метилобакгерий из таких галоалкалофильных консорциумов осложнялось тем, что единичные колонии на агаризованных средах были представлены несколькими морфотипами клеток, т.е. были ассоциациями разных видов бактерий. Полагая, что монокультуры нуждаются в ростовых факторах, поставляемых спутниками, использовали агаризованные среды с добавлением культуральной жидкости метанотрофов, ранее изолированных из тех же самых проб ила содовых озер. В результате в чистые культуры удалось выделить 7 штаммов метилобакгерий. Штаммы MS, М9, М39, М50 выделены из содовых озер Монголии, а штаммы Бур2, Бур4, БТ - из содовых озер Южного Забайкалья.

Морфология. Все изоляты были представлены подвижными грамотрицательными палочками-монотрихами 0.3 - 0.65 х 1.4 - 4.3 мкм. Размножаются бинарным делением (рис.1 а, и). На ультратонких срезах клеток видно, что особенностью морфологии ряда штаммов является наличие большого периплазматического пространства (около 20 нм) (рис.1 б, г, е), характерное для морских бактерий родаMelhylophaga (Janvier et al.,1985).

Рис.1. Морфология и ультраструктура клеток штаммов: М39 (а, б), М8 (в, г), М50 (д, е), М9 (ж), Бур2 (з), БТ (и) и Бур4 (к). Длина масштабной метки 1 мкм.

Физнолого-бнохнмпческие н хемотаксономнческне хярзкгсристикп. Все штаммы, выделенные из содовых озер, строгие аэробы, нуждаются в витамине Вп, каталазо- и оксвдазоположительные, не гидролизуют крахмал и желатин. Нитраты восстанавливают до нитритов, образуют индол. Способны расти в диапазоне 4-37°С, рН 7 - 11, оптимально при 25-29 °С и рН 9.0- 9.5. При рН 7.0-8.0 растут только в присутствии в среде №С1. Выделенные культуры растут до 10% №С1, однако оптимальная концентрация соли в среде составляет 3 -4% для штаммов Бур2, Бур4, БТ и 3 - 6% для штаммов М8, М9, М39 и М50. Шесть штаммов являются облигатными метипотрофами, поскольку растут только на средах с метанолом и метиламином, а штамм Бур2 является ограниченно-факультативным метилотрофом, так как наряду с метанолом, метиламином и триметиламином использует фруктозу как источник углерода и энергии. В качестве источника азота все штаммы используют нитрат, глутамат, мочевину, а также метиламин и аммоний, но на средах с ИаС1 при рН £ 8.

Анализ изопреноидных компонентов клеток выявил, что в составе убихинонов всех штаммов доминирует СЬ- В фосфолипидном составе клеток преобладают фосфатидилэтаноламин (ФЭА), фосфатидилглицерин (ФГ) и кардиолипин (КЛ), в минорном количестве присутствует фосфатидилсерин (ФС). В жирнокислотном составе клеток изучаемых штаммов доминируют пальмитиновая (Сил), пальмитолеиновая (С16:0 и октадеценовая (Сии) жирные кислоты (табл.1).

Таблица 1. Состав жирных кислот клеток новых изолятов, выращенных на метаноле

при 29°С (% от общего содержания)

Жирные кислоты Штаммы

М8 М9 М39 М50 Бур2 Бур4

С 12:0 2.47 3.71 2.48 2.84 3.9 4.27

См:0 0.53 0.4 0.24 0.46 3.79 1.48

С15:0 0.35 0.44 0.20 0.24 1.09 1.07

Сш 26.63 32.93 30.14 30.47 39.09 31.32

Сил 33.25 26.39 30.41 35.72 36.53 33.26

Сто 1.03 0.7 1.02 0.84 0.98 1.93

Си:1 0.04 0.12 0.03 0.02 0.05 0.17

Сп:2 0.07 0 0.06 0.08 0 0

С 18:0 1.19 1.7 1.69 0.6 0.71 0.72

С18:1 31.09 24.39 32.10 24.96 8.97 16.72

Циклические кислоты

Сп:0 2.64 5.43 1.17 2.75 1.2 6.38

Сию 0 0 0 0 0 0

Гидроксикислоты

3-ОНСю:0 0.44 1.43 0.23 0.61 1.57 0.56

3-ОН С]4:0 0.26 2.64 0.21 0.27 1.93 2.01

3-ОНС16Ю 0.04 0.24 0.03 0.10 0.20 0.12

2. Выделение и характеристика галоалкалофильных нзолятов из разрушающегося мрамора. Из соскобов разрушающейся части мраморных памятников Московского Кремля (рН поверхности мрамора в месте отбора проб 8.7-9.1) выделены б накопительных и 5 чистых культур метилобактерий. Последние изоляты оказались идентичны по морфологии и физиолого-биохимическим свойствам. Наиболее детально исследован штамм КрЗ.

Морфология. Штамм КрЗ представлен подвижными грамотрицательными неспорообразующими палочками-монотрихами 0.7x1.7-2.0 (рис. 2). Размножается бинарным делением.

Физиолого-биохимические и хемотаксономические характеристики. Штамм КрЗ растет в жидкой среде без агрегации клеток, пигмент не образует. Строгий аэроб, нуждается в витамине В12. В качестве источника углерода и энергии изолят КрЗ использует метанол, метиламин, триметиламин и фруктозу. Желатин и крахмал не гидролизует; аммиак и сероводород на тестовых средах не обнаружены. Синтезирует индол из ¿-триптофана.

Оксидазо- и каталазо-положительный, нитраты восстанавливает до нитритов. В качестве источника азота использует нитраты, глутамат, мочевину, а также метиламин и аммоний, но на средах с 3% №С1 или №2804 при рН < 8. Устойчив к действию широкого спектра антибиотиков: ампициллин, гентамицин, канамицин, линкомицин, налидиксовая кислота, новобиоцин, но ингибируется стрептомицином, неомицином и эритромицином. В жидкой среде растет в интервале 4 - 42 °С, рН 6 - 11, оптимально при 20 - 32 °С и рН 8.0-9.0. Нуждается в ионах При замене солей натрия на соли калия, магния или лития штамм КрЗ не растет. Облигатно зависит от хотя и способен расти без ионов СГ (в нейтральной среде хлорид натрия может быть заменен сульфатом натрия, а в щелочной среде карбонатами натрия). Растет при содержании соли до 20%, но оптимально при 3-9% №С1. Следовательно, исследуемый штамм может рассматриваться как умеренный галофил. Активно растет при низких температурах: ц= 0.3 ч"1 при рН 8-9, 0.5 -1.5 М ИаС1 и 29 °С, а при 4 °С ц=0.04 ч1.

, «те! . ■' • 1 ■ ' ; -

Рис.2. Морфология и ультраструктура клеток штамма КрЗ. Длина масштабной метки 1 мкм.

Интересно, что на агаризованной среде слабый рост штамма наблюдали даже при 0°С. Растет при концентрации метанола в среде 0.02 - 7 %, оптимально - при 0.5 % СНэОН. В лимите по азоту, фосфору, железу, а также при недостаточной аэрации, изолят КрЗ синтезирует ЭПС, состоящий из углеводного и белкового компонентов. Преобладающими мономерами углеводного компонента являются арабиноза и глюкоза. Кроме того, обнаружены галактоза, манноза, рамноза и рибоза. Для белкового компонента гетерополисахарида характерно высокое содержание глутамата и аспарагина. При лимитировании роста штамма КрЗ азотом, фосфором, железом или кислородом выход ЭПС возрастал с 0.1 до 2.3 г на 1 г биомассы. Показано, что штамм КрЗ закисляет среду, образуя муравьиную кислоту (4-10 мМ) из метанола, что может быть одной из причин, вызывающих разрушение мрамора.

Основным хиноном штамма КрЗ является убихинон Оз. В фосфолипидном составе клеток преобладают ФЭА, ФГ и КЛ. В составе жирных кислот клеток доминировали пальмитиновая (Сш), папьмитолеиновая (Сш) и окгадеценовая (Сш), причем их уровни варьировали в зависимости от температуры культивирования (табл. 2). У клеток, выращенных при 29°С, преобладали насыщенные жирные кислоты, тогда как при 4°С повышалась доля ненасыщенных Сш и С|8:1 кислот.

Таблица 2. Состав жирных кислот клеток штамма КрЗ, выращенных на метаноле

при разных температурах (% от общего содержания)

Жирные кислоты 4°С 29°С

Сию 2.93 3.58

См:0 0.10 1.3

Си:0 0.60 0.74

Сш 15.0 33.02

Сш 50.60 35.99

Си:0 0.40 0.44

Сш 0.45 0.24

Сп;2 0 0

С 18:0 0.51 0.75

С18:1 29.08 15.5

Циклические кислоты

С17:0 0 0.62"

С19:0 0 0

Гидроксикислоты

3-ОН Сю:0 0.33 4.19

3-ОНСи.о 0 5.45

3-ОН С]б-о 0 0.2

3. Выделение и характеристика галофильных нейтрофильных метилобактерий с водорослей Красного моря.

Высшие растения постоянно ассоциированы с аэробными метилотрофными бактериями, поскольку образуют летучие Ci-соединения, а метилотрофы поставляют растениям фитогормоны (цитокинины и ауксины) и другие ростовые факторы (Троценко с соавт., 2001). Эмиссия метанола растениями оценивается до 100 тыс тонн С/год, часть которого растворяется в поверхностных слоях океана. Таким образом, мировой океан является огромным резервуаром метанола, запасы которого составляют 228 млн тонн (Galbally and Kirstine, 2002). Известно, что морские водоросли также образуют Ci-соединения, однако до сих пор морские растения не анализировали на присутствие метилотрофной микрофлоры. С водорослей Красного моря нами впервые выделены галофильные метилобакгерии, штаммы КМЗ и КМ5.

Морфология. Штаммы КМЗ и КМ5 представлены подвижными грамотрицательными неспорообразующими палочками 0.4 х 1.3 мкм. Штамм КМЗ - монотрих, штамм КМ5 -перитрих (рис.3). Размножаются бинарным делением.

Физиолого-биохимические и хемотаксономнческие характеристики. Изучаемые штаммы растут в жидкой среде без агрегации клеток, пигмент не образуют, в оптимальных условиях удельная скорость роста ц=0,4 ч*1. Строгие аэробы, не нуждаются в витаминах.

В качестве источника углерода и энергии изоляты КМЗ и КМ5 используют метанол, метиламин, диметиламин, триметиламин, диметилсульфид и фруктозу. Не растут на других моно- и полиуглеродных соединениях (формальдегид, формиат, органические кислоты, аминокислоты, сахара, Сг-Сб спирты, в атмосфере СН4+О2 или Н2 + Ог + СОг, на МПА и сусло-агаре).

Гидролизуют крахмал; аммиак, сероводород на тестовых средах не обнаружены. Синтезируют индолы из L-триптофана, в частности индолилуксусную кислоту (ИУК) в качестве доминирующего соединения. Исследуемые штаммы оксидазо-и каталазоположительные, нитраты восстанавливают до нитритов.

Рис.3. Морфология клеток штаммов КМ 3 (а) и КМ5 (б). Длина масштабной метки 1 мкм

В качестве источника азота используют соли аммония, нитраты, глутамат, мочевину и метиламины. В жидкой среде растут при температуре 4 - 37°С, рН 5.5 - 8.5, оптимально при 29 - 34°С и рН 7.5-8.0. Облигатно нуждаются в ионах но не растут при их замене на соли калия, магния и лития. Толерантны к 15 % №С1 и растут оптимально при 5-9 % КаС1. Следовательно, исследуемые штаммы могут рассматриваться как умеренные галофилы. Растут при концентрации метанола в среде до 7 % (об/об), оптимально при 0.5 % СНзОН (по объему). Основным хиноном штаммов КМЗ и КМ5 является убихинон СЬ. В фосфолипидном составе клеток преобладают ФЭА и ФГ, присутствуют также ФХ, ФС и КЛ. Доминирующие жирные кислоты С1&1 в7с и С1б:о (табл. 3).

Таблица 3. Состав жирных кислот клеток исследуемых штаммов, выращенных на метаноле при 29 °С (% от общего содержания)

Жирные кислоты Штаммы

КМЗ КМ5

Сил 2.8 2.8

См:0 5.5 3.7

Сил 0.9 0.6

С16:0 41.8 38.5

С1б:1ю7с 40.0 41.1

С 17:0 0.1 0

С] 8.0 0.3 0.6

С18:1а7 3.2 8.8

Циклические кислоты

Сп:0 3.9 3.0

С19.0 0.2 0.3

Гидроксикислоты

3-ОН Сю:0 0.2 0.2

3-ОН Сн:о 0.2 0.2

4. Особенности метаболизма галоалкалофнльных и галофнльных псйтрофильных метилобактерий.

Энзимологический анализ экстрактов клеток, выращенных на метаноле выявил у изучаемых штаммов активности ферментов прямого окисления метанола до СОг (дегидрогеназ метанола, формальдегида и формиата) (табл. 4). Присутствие высоких активностей гексулозофосфатсинтазы и КДФГ- альдолазы свидетельствует о том, что штаммы реализуют РМФ цикл (вариант Энтнера-Дудорова) ассимиляции формальдегида. Перестройки пентозофосфатов катализируются транскетолазой и трансальдолазой. Отсутствие ферментов серинового (гидроксипируватредуктазы и серин-глиоксилатаминотрансферазы) и РБФ (рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы) путей -

Таблица 4. Активности ферментов (нмоль/мнн/мг белка) в экстрактах клеток исследуемых штаммов, выращенных на метаноле

Фермент Кофактор Штаммы

М8 М9 М39 М50 Бур2 Бур4 БТ КрЗ КМЗ КМ 5

Мегганолдегидрогеназа ФМС 283 190 781 122 124 130 250 110 74 139

Формапьдепщцегидрогеназа ФМС 74 266 30 34 45 30 25 34 69 59

НАД*' 0 0 0 0 0 0 0 0 55 27

НАД^Н 0 0 0 0 25 0 0 26

Формиатдегидрогеназа ФМС 8 28 4 8 52 15 8 20 57 36

НАД* 0 0 0 0 0 0 0 0 50 35

Гидроксипируватредуктаза НАД(Ф)Н 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Серин-глиоксилатаминотрансфераза НАД(Ф)Н 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

РБФ карбоксилаза 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Гексулозофосфатсинтаза 1625 168 263 335 131 220 400 346 170 181

Глюкозо-6-фосфатаегидрогеназа НАД* 1250 134 300 430 660 550 410 460 605 153

НАДФ+ 2080 134 362 557 1536 700 643 2076 665 700

6-Фосфоглкжонатдегидрогеназа НАД* 0 0 0 0 0 0 0 0 268 27

НАДФ+ 75 45 238 120 43 60 20 119 89 108

КДФГ альдолаза 210 54 75 50 77 96 70 64 87 96

Фру ктозо-1,6-бисфосфатальдолаза 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Трансальдолаза 42 98 74 93 85 54 102 73 80 74

Транскетолаза 101 340 223 327 308 170 432 252 120 105

Цитратсингаза 20 42 20 16 56 40 32 45 н/о н/о

а-Кетоглутаратдегидрогеназа НАД* 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Изоцитратдегидрогеназа НАД* 106 70 193 53 120 74 82 182 0 0

Изоцитратлиаза 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Малатсинтаза 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Глугаматдегидрогеназа НАДН 35 0 59 0 14 23 0 331 79 47

НАДФН 21 0 52 0 28 37 162 12 108 108

Глутаминсиктетаза АДФ, Мп2" 365 240 462 320 400 372 422 1069 135 112

Глутаматсинтаза НАДН 60 18 59 17 9 0 0 44 19 32

НАДФН 38 56 44 14 80 25 81 0 99 150

Примечание: Представлены средние значения активностей ферментов в растворимой фракции клеток.

позволяет исключить их участие в Ci-метаболизме. Цикл трикарбоновых кислот у всех облигатных и ограниченно факультативных штаммов разомкнут на уровне а-кетоглутаратдегидрогеназы. Кроме того, у всех штаммов отсутствуют ферменты глиоксилатного шунта (малатсинтаза и изоцитратлиаза). Наличие активностей глутаматсинтазы, глутаминсинтетазы и глутаматдегидрогеназы у большинства штаммов (кроме М9 и М50) свидетельствует о том, что ассимиляция NH*4 осуществляется через глугаматный цикл, а также посредством восстановительного аминирования а-кеггоглутарата. Штаммы М9 и М50 ассимилируют аммоний только через глутаматный цикл.

5, Филогенетическое и таксономическое положение новых изолятов

Содержание ГЦ в ДНК облигатных и ограниченно-факультативных метилотрофных изолятов составляет 44.6 -48.6 моль%. Сравнительный анализ морфологии и физиолого-биохимических свойств указывал на большое сходство новых изолятов с метилобактериями рода Methylophaga. Результаты ДНК-ДНК-гибридизации исследуемых штаммов М39, М50, КрЗ и Бур2 с типовыми культурами рода Methylophaga (M. marina АТСС 35842т, M lhalassica АТСС 33146т и M. sulfidovorcms RB1 LMP 95.210т) выявили 25-41 % сходства, что дает основание отнести новые изоляты к новым видам этого рода (табл. 5). По данным ДНК-ДНК гибридизации, сходство штаммов М39 и М50 составило 92-95%, что указывает на их принадлежность к одному виду.

Таблица 5. Уровни ДНК-ДНК сходства (%) между новыми изолятами и

видами рода Methylophaga

Метилотроф М39 М50 КрЗ Бур2

Methylophaga marina АТСС 358421 30 28 39 26

Methylophaga thalassica АТСС 3314бт 27 27 23 29

Methylophaga sulfidovorans'RBl LMP 95.210т 25 26 35 25

Бур2 37 27 41 100

КрЗ 31 н/о 100

М50 92 100

М39 100

Филогенетический анализ 16Э рДНК выделенных изолятов подтвердил их принадлежность к роду Methylophaga (рис.4). Уровни сходства нуклеотидных последовательностей 168 рДНК галоалкалофильных штаммов с типовыми культурами рода Methylophaga составили 94-97 % (табл.б).

Уровни сходства нуклеотидных последовательностей 16Б рДНК галоф1шьных нейтрофильных штаммов КМЗ и КМ5 составили 99.8 % сходства между собой и 99.4 % - с М. таппа АТСС 35842т, что позволяет предварительно отнести данные изоляты к этому виду.

Уровни сходства нуклеотидных последовательностей 16Б рДНК галоалкалофильных штаммов М8 и М9 составили 99.8 % между собой и 98.5-98.6 % с изолзтгом М39, что указывает на принадлежность штаммов М8, М9 и М39 к одному виду, но для уточнения таксономического положения штаммов М8 и М9 необходима ДНК-ДНК гибридизация. Уровни сходства нуклеотидных последовательностей 168 рДНК галоалкалофильных штаммов Бур 4 и БТ составили 99.3 % между собой и 99.3-99.5 % с КрЗ, что позволило предварительно отнести штаммы к одному виду.

Таблица 6. Сравнение последовательностей 168 рДНК новых гало(алкало)фильных изолятов и типовых видов рода Methylophaga.

Метилотроф КМЗ КМ5 М39 М9 М8 Бур2 Бур4 ВТ КрЗ M.su^fidovorans МЛИакяяса М.таппа

М.таппа 99.4 99.4 95.1 94.8 95.1 96.2 94.3 ,94.7 94.6 97.9 97.7 100

М. Лю^згса 97.4 97.5 95.8 96 96.1 97.7 94.8 95.2 95.1 98.7 100

М. Ы/кЗоуогапз 97.8 97.9 95.3 95.2 95.4 96.9 95.5 95.9 95.8 100

КрЗ 94.8 94.9 96.3 97.1 97.2 95.4 99.3 99.5 100

ВТ 95 95.1 96.3 97.1 97.2 95.4 99.3 100

Бур4 94.7 94.7 96 95.9 96.8 95.1 100

Бур2 96 96.1 95.1 95.4 95.4 100

М8 94.8 94.9 98.6 99.8 100

М9 94.7 94.7 98.5 100

М39 94.9 94.9 100

КМ5 99.8 100

КМЗ 100

На основании физиолого-биохимических, хемо- и генотаксономических характеристик штаммы М39, М50, а также штаммы М8 и М9 и отнесены к новому виду рода Methylophaga: М. а1саИса. Для штамма Бур 2 предложен новый видовой эпитет М. тйготса, а штаммы КрЗ, Бур 4 и БТ классифицированы как новый вид М. тигаХа.

0.02

100

ЮС

- Methylopila capsúlala Ml АТСС 7007161 (AF004844) -Methylobacterium organophilum NCIMB 11278T(D32226)

— Meihylorhabdus multivorans ATCC 51890T (AF004845)

100Г— Paracoccus deniiriflcans LMG 4218т (X69159)

loot"-

100

1Щ

1001

t— ;

IOC

100

Paracoccus alcaliphilus JCM 7364T (D32238) Methylarcula terrícola VKM B-2160T (AF030437) Methylarcula marina VKM B-2159T (AF030436) Methylophilus mathylotrophus NCIB 10515T (L15475) Methylobacillus glycogenes ATCC 29475т (M95652) Methylophaga marina ATCC 35842т (X87338) Methylophaga marina ICM3 (=VKM B-2386) (DQ400507) Methylophaga marina KM5 (=VKM B-2387) (DQ 400508) - Methylophaga sulfidovorans RB-1T (X95461) г Methylophaga thalassica ATCC 33146т (X87339) '— "Methylophaga natronica" Бур2т (=VKM В-2288т) (АУ128533) 9gr- Methylophaga alcálica М39т (=ATCC BAA-297T) (АГ384373) (|M8 1 M9

9Й "Methylophaga murata" Kp3T (=NCIMB 139931) (AY694421)

Бур4 БТ

- Escherichia coli ATCC 11775т (X80725)

Рис.4. Филогенетическое положение новых галоалкалофильных изолятов по последовательности 16S рДНК среди известных культур метилобактерин. Показаны bootstrap значения выше 50%. Дерево построено относительно последовательности 16S рДНК Escherichia coli ATCC 11775т.

Дифференцирующие признаки наиболее исследованных умеренно гало(алкало)фильных аэробных метилобактерий роки Methylophaga представлены в таблице 7.

Таблица 7. Дифференцирующие признаки наиболее исследованных штаммов умеренно гало(алкало)фильных аэробных метнлобактсрий рода Ме(Ну1ор1га^а

Характеристики

М. marina

M.thalassica■

"M.limanica"

М. sulfidovorans

М. alcattca М39

"М. natronica" Бур2

"М. murata" КрЗ

М. marina КМЗ, КМ5

Размеры клеток, мкм

Тип меггилотрофии Факторы роста

Путь С1-ассимиляции

Доминирующие жирные кислоты

Основной убихинон

Диапазон температур, °С (оптимум)

Диапазон рН для роста (оптимум)

Максимальная концентрация №С1 для роста, % (оптимум)

Осмопротекторы

ГЦ ДНК, мол. % Источник выделения

0.2 х 1.0

0.4x1.2

10-40 (30-37)

5.0-9.0 (7.0-7.5)

12 (1-4)

8-42 (30-37)

5.0-9.0 (7.0-7.5)

12 (1-4)

Эктоин, глутамат, сахароза

43.0 44.0

Морская вода и ил

10-40 (30 -37)

6.0-8.5 (6.7-7.2)

10 (3-6)

н/о

43.5

Лиман Черного моря

0.2x0.9

0.4x2.8

0.6 х 2.8

0.7 х 2.0

0.4 х 1.3

ограниченно-факультативный Bl2 | В12 | В]2

Рибулозомонофосфатный Cl6:0, Cl6:l

облигатный

В]2

н/о

С>8

17-35 (22)

6.0-9.0 (7.4-7.8)

(1.5-2.5) н/о

42.4

Микробные маты побережья Нидерландов

Bl2

4-35 (25-29)

7.0-10.0 (9.0-9.5)

10 (3-4)

ограниченно-факультативный BlJ | Bl2 | Рибулозомонофосфатный Clí.o, Ci6:i, C]8:l

4-37 (25-29)

7.0-11.0 (S.5-9.0)

(3-6)

0-42 (20-32)

6.0-11.0 (8.0-9.0)

20 (3-9)

Смя, Cien

4-37 (29-34)

5.5-8.5 (7.5 - 8.0)

15 (5-9)

Эктоин; глутамат, сахароза

48.3

Содовое

озеро Монголии

45.0

Содовое озеро Забайкалья

44.6

Мраморный

памятник Московского Кремля

44.4; 44.7

Водоросли Красного моря

Примечание:«-» - отсутствие признака; «н/о» - не определяли. Жирным шрифтом выделены новые изоляты.

б. Осмоадаптация представителей рода Meíhylophaga.

Жизнь в экосистемах с высокой степенью минерализации и рН невозможна без особых механизмов,- позволяющих микроорганизмам нормально функционировать в условиях солевого и щелочного стресса. Поэтому одной из задач нашего исследования было изучение механизмов, обеспечивающих рост и активную жизнедеятельность гало(алкало)фильных метилобакгерий.

Используя 14С-метанол, исследовали фосфолипидный состав клеток М. múrala КрЗ в зависимости от солености среды. Оказалось, что с увеличением солености среды в клетках возрастал уровень ФГ и КЛ, но уменьшалась доля ФЭА. Основным изменением в составе жирных кислот у M.alcalica М39 кМ. murata КрЗ было увеличение доли ненасыщенных и циклопропановых кислот, что определяет поведение липидной фазы.

Нами впервые показано, что доминирующими осмопротекторами у исследуемых штаммов гапо(алкало)фильных метилобактерий рода Meíhylophaga являются эктоин и глутамат. Наряду с эктоином в клетках исследуемых штаммов накапливается сахароза, которая присутствует как минорный компонент в сочетании с другими более эффективными совместимыми веществами. У штаммов Бур2, КрЗ и М39 анализировали внутриклеточное содержание осмопротекгоров в зависимости от концентрации NaCl в среде (табл. 8, рис.5). У этих штаммов, выращенных при низких концентрациях NaCl (0.51.5%), обнаружен только глутамат, тогда как при увеличении солености среды до 3 -5 % NaCl накапливался эктоин. При б- 9 % NaCl наряду с увеличением содержания глугамата и эктоина клетки накапливали сахарозу.

Таблица 8. Внутриклеточное содержание осмопротекторов у новых изолятов (мкг/мг сухой биомассы), выращенных на среде с метанолом

Штаммы NaCl в среде, % Эктоин Глутамат Сахароза

М8 5 145 50 15

М39 0.5 0 15 0

1.5 0 30 0

5 160 45 0

9 235 70 35

Бур 4 5 60 25 20

Бур 2 0.5 0 15 0

3 75 20 0

7 195 90 40

КрЗ 3 30 18 0

6 60 25 8

9 155 50 35

КМЗ 9 30 45 25

КМ 5 9 200 60 60

1,5 5 9

NaCI,%

■ Эктоин ПГлутамат □ Сахароза

Рис.5. Влияние концентрации NaCI на биосинтез осмопротекторов M.alcalica М39.

Уровни эктоина, глутамата и сахарозы у штамма М39 при 1.5 М NaCI в среде достигали в пересчете на внутриклеточную воду соответственно, 1.4, 0.45 и 0.08 М. Следовательно, суммарное внутриклеточное содержание осмопротекторов вполне уравновешивает осмолярносгь среды.

Были также определены активности ферментов биосинтеза осмопротекторов у выделенных галоалкалофильных штаммов и у типовых культур галофильных нейтрофильных метилобактерий рода Methylophaga (табл.9).

Установлено, что галофильные метилобактерии рода Methylophaga, растущие на Ci-субстратах в присутствии NaCI, реализуют известный путь биосинтеза эктоина через аспартатполуальдегид, диаминобутират (ДАБ) и Ny - ацетилдиаминобутират с участием ДАБ - аминотрансферазы, ДАБ - ацетилтрансферазы и эктоинсинтазы (Peters et al., 1990).

У исследуемых галоалкалофильных метилобактерий выявлены активности аспартокиназы, аспартат-полуальдегиддегидрогеназы, ДАБ - аминотрансферазы (EctB), ДАБ - ацетилтрансферазы (EctA) и эктоинсинтазы (EctC) и обнаружен ген ectB, кодирующий ДАБ-аминотрансферазу. На основании данных энзимологического анализа предложена и обсуждается схема путей биосинтеза глутамата, сахарозы и эктоина у метилобактерий рода Methylophaga (рис. б).

Таблица 9. Активности ферментов (нмоль/мин/мг белка) биосинтеза глутамата, сахарозы и эктоина в экстрактах клеток штаммов рода МеИгуЬрИада, выращенных на метаноле в присутствии 6% №С1

Фермент Кофактор М. таппа М, 1ка1а$Бка М39 Бур 2 КрЗ

Глутаматдегидрогеназа НАДН 5 7 35 83 331

НАДФН 27 30 21 36 12

Глутаматсинтаза НАДН 18 20 60 44 45

НАДФН 24 25 38 57 0

Глутаминсинтетаза АТФ 168 190 365 168 240

УДФ-глюко-

пирофосфорилаза/ УТФ 102 85 88 85 108

сахарозофосфатсинтаза

Аспартокиназа АТФ 66 44 24 76 67

Аспартатполуальдегид дегидрогеназа НАДФН 34 28 26 18 25

ДАБ-аминотрансфераза 32 32 61 141 72

ДАБ-ацетилтрансфераза 105 110 129 130 160

Эктоинсинтаза 97 103 92 80 102

Как правило, устойчивость к одному из экстремальных воздействий внешней среды (осмотическое давление среды) повышает резистентность клеток к другим стрессовым факторам (температурному шоку). Во многом это связано со стабилизирующим воздействием органических осмопротекторов на макромолекулы (Прреп, СаИмИ, 1992). По-видимому, галоадаптация объясняет устойчивость клеток нового галоапкалофильного штамма КрЗ, имеющего высокое содержание эктоина, к нагреванию при 70°С, высушиванию (лиофилизации) и многократным циклам замораживания-оттаивания. Известно, что гетероциклическая иминокислота эктоин обладает сильным стабилизирующим действием на биополимеры (белки, ДНК), целые клетки и высокой водоудерживающей способностью (Ма^еят, ЭсЫппег, 2001).

Таким образом, галофильные аэробные метилобактерии рода MethyIophagal накапливающие эктоин до 20% сухой биомассы, хорошо приспособлены к существованию в экстремальных экосистемах, характеризующихся резкими колебаниями температуры и солености среды.

СНзОН Рибулозо-5Ф

Гексулозо- 6Ф-

ФФн

~УДФ-глкжоза

Фруктозо- 6Ф

Глгокозо- 6Ф

|Ч*~НАДФНг бФ-Глюконат

С О2 Ф Нг

КДФГ

Глицеральдегид- ЗФ

^ НАДН2

Глицерат-1,ЗФ2

АТФ

церат

Цитрат ♦

Изоцитрат НАД(Ф)+ \|

а- Кетоглутарат

Аспартил-Ф

|г~~надфн2

АДФ -"-ч^-Глутамин

-Глутамат

■НАДФН2 ЫН4+

Оксалоацетат НАД(Ф)Н2~>|

Мапат

Фумарат

Сукцинат

Аспартат

Глутамат

Аспартил-р-полуальдегид Глутамат—---л а- Кетоглутарат —*- ЫЩ* Диаминобутират

Ацетил-КоА —>1

| КоА

М-Ацетилдиаминобутират

Рис. б. Пути Сгметаболизма н биосинтеза осмопротекторов у бактерий рода Methylophaga.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В литературе метилобактерии рода Methylophaga описываются как представители морских экосистем. Аэробные умеренно галофильные метилобактерии род МеЛ1у1орЪа%а выделены нами из соленых и содовых озер, разрушающегося мрамора и с морских водорослей. Как правило, эти метилобактерии ассоциированы с метанотрофами, поскольку используют интермедиаты окисления метана - метанол, формальдегид и муравьиную кислоту, а также метиламины - продукты разложения глицинбетаина метаногенами. Кроме того, галофильные метилобактерии образуют с гетеротрофами устойчивые метилотрофные сообщества, поставляя гетеротрофам экзометаболиты и, в свою очередь, получают факторы роста (витамины).

Наши результаты дают основание считать представителей рода Methylophaga активными компонентами микробных сообществ соленых и щелочных экосистем и дополняют предложенные ранее схемы трофических взаимосвязей гало(алкало)фильных гетеротрофов, олиготрофов, метаногенов и метанотрофов (Заварзин, 1993; 1999; Калюжная с соавт., 1999). Следовательно, аэробные метилобактерии, рода Methy¡ophaga, являясь необходимым звеном трофической цепи микробиоты соленых и щелочных экосистем, обеспечивают возврат углерода продуктов неполного окисления метана в общий пул органического вещества (рис.7).

(Фото)хемотрофы Метаногены СОг -органическое вещество ->-СН4

СНзРШ2 /

Аэробные метилобактерии

Метаиотрофы

нсоон

сн2о

СНзОН

Аэробные метилобактерии

Рис.7. Трофические связи гало(алкало)фильиых аэробных метилобактерии в микробных сообществах щелочных, соленых и морских экосистем.

До недавнего времени одним из характерных свойств всех известных видов рода Methylophaga считали ауксотрофность по витамину Ви. Нами впервые выделены два новых штамма М. marina КМЗ и КМ5, не зависящих от факторов роста. Более того, их рост не стимулируется витамином В«, что исключает использование зависимости от витамина Вп в качестве родового признака. Интересно также отметить, что у выделенных галоалкалофильных метилобакгерий рода Methylophaga в составе жирных кислот преобладают пальмитиновая (Сию), пальмитолеиновая (Cic:i) и октадеценовая (Сда) кислоты, тогда как у нейтрофильных галофильных метилобактерий этого рода преобладают пальмитиновая (Cic:o) и пальмитолеиновая (Ci&i). По-ввдимому, такое отличие связано с адаптивным ответом галоалкалофильных метилобактерий на повышение рН среды.

Установлено, что у галофильных метилобактерий рода Methylophaga одним из механизмов осмоадапгации является синтез de novo и преимущественное накопление в клетках эктоина, обладающего высокой водоудерживающей способностью. Поскольку метилобактерии накапливают до 20-30% эктоина от веса сухой биомассы, их можно использовать в качестве продуцентов этого универсального биопротеетора на основе возобновляемого сырья - метанола.

Итак, осмоадаптация галоалкалофильных метилобактерий включает существенные структурно-функциональные изменения (модификацию жирнокислотного и фосфолипидного состава мембран, внутриклеточное накопление наряду с эктоином глутамата и сахарозы). Предстоит выяснить природу первичных сигнальных эффекторов и рецепторов, запускающих каскад ответных реакций на стрессовые воздействия солености и рН, включая особенности биоэнергетики поддержания внутриклеточного ионного гомеостаза. Очевидно, что постулируемые механизмы осмоадаптации у галоалкалофильных метилобактерий нуждаются в дальнейших специальных исследованиях с применением методов геномики и протеомики.

Более того, имеющиеся в нашей коллекции штаммы галоалкалофильных и галофильных нейтрофильных метилобактерий могут найти применение в качестве модельных объектов для выяснения особенностей их энергетического и конструктивного метаболизма, включая принципы организации и регуляции биосинтеза эктоина на молекулярно-генетическом уровне.

В целом, достижения последних лет в изучении биологии галоалкалофильных аэробных метилобактерий приблизили нас не только к пониманию основ их жизнедеятельности, но и к разработке биотехнологий синтеза эктоина из метанола и конструированию новых штаммов-деструкторов для биоремедиации от токсичных Сг соединений (окисленных и замещенных производных меггана).

выводы

1. Из проб ила содовых озер Южного Забайкалья и Монголии выделены в чистую культуру 7 штаммов галоалкалофильных облигатных и ограниченно-факультативных метилобактерий, классифицированных как новые виды рода Methylophaga: М. alcalica и М. naironica. Из соскоба разрушающегося мраморного памятника Московского Кремля выделен ограниченно-факультативный галоалкалофильный штамм, классифицированный как новый вид Methylophaga múrala.

2. С морских водорослей побережья Красного моря впервые выделены Вц-независимые штаммы галофильных нейтрофильных метилобактерий, которые отнесены к известному виду Methylophaga marina. Следовательно, ауксотрофность по витамину В12 не является обязательным признаком рода Methylophaga.

3. При снижении температуры культивирования в клетках М. murata КрЗ возрастало относительное содержание ненасыщенных жирных кислот Cie:i и Ci8:i, а при повышении солености среды увеличивалось относительное содержание отрицательно заряженных фосфолипидов фосфатидилглицерина и кардиолипина, что связано со стабилизацией внешних мембран

4. Обнаружено, что у гало(алкало)фильных метилобактерий рода Methylophaga основными осмопротекторами являются эктоин и глутамат. Их внутриклеточные концентрации возрастали с повышением осмолярности среды.

5. Галоалкалофильные представители рода Methylophaga, являясь необходимым звеном трофической цепи микробных сообществ соленых и щелочных экосистем, обеспечивают возврат углерода продуктов неполного окисления метана и метиламина в общий пул органического вещества этих биотопов.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи:

1. Doronina N.V., Darmaeva Ts. D., Trotsenko У.A. Methylophaga alcalica sp. nov., a new alkaliphilic and moderately halophilic, obligately methylotrophic bacterium from the East Mongolian saline soda lake. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 223-229.

2. Doronina N.V., Darmaeva Ts. D., Trotsenko Y.A. Methylophaga naironica sp.nov., a new alkaliphilic and moderately halophilic, restricted-facultatively methylotrophic bacterium from soda lake of the Southern Transbaikai Region. System. Appl. Microbiol. 2003. V. 26. P. 382389.

3. Доронина Н£., Ли Ц.Д., Леонова КГ, Троцгнко ЮЛ. Methylophaga murata sp.nov.,-галоалкалотолерантный аэробный ыетплслроф из разрушающегося мрамора. Микробиология. 2005, Т.74, >¡¿4, С. 511-519.

Тезисы:

1 Дармаееа Ц.Д. Новые алкалофильные аэробные метилобакгерии. Тезисы 5-ой Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино, 2001, С.219-220.

2 Дармаееа Ц.Д., Шитова О.В. Новые галоалкалофильные облигатно метилотрофные бактерии из содовых озер Южного Забайкалья н Монголии. Тезисы б-ой Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино, 2002, С.20-21

3 Nikitin D., Eshinimaev В., andDarmaeva Ts. The new haloalkaliphilic methylotrophs isolated from the Mongolian and Buryatian soda lakes. Proceedings of 7-th Symposium on Bacterial Genomics and Ecology. Bergen, Norway Proceedings, 2002, P. 17.

4 Родионова O.B., JIu Ц.Д., Иванова КГ. Methylophaga murata - новый алкапофильный гапотолерантный аэробный метилотроф. Тезисы 8-ой Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино, 2004, С.159.

5 ЛиЦ.Д, Решетников A.C., Рызюманова Я.В., Макарова Н.С. Детекция генов биосинтеза экгоина - основного осмопротекгора у галоапкалофильных аэробных метилобактерий Methylophaga alcatíca М8. Тезисы 9-ой Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино, 2005, С.200-201.

6 Ли Ц.Д. Выделение и характеристика новых галоапкалофильных метилобактерий. Тезисы Всероссийской молодежной школы-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии". Москва, 2005, С.41.

Принято к исполнению 08/11/2006 Исполнено 08/11/2006

Заказ № 904 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

»2 3 7 25

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ли Цырегма Дармаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Особенности биологии аэробных метилобактерий.

1.1. Общая характеристика и таксономия.

1.2. Особенности метаболизма.

1.3. Экология аэробных метилобактерий и их роль в природе.

1.4. Биотехиологический потенциал аэробных метилобактерий.

Глава II. Гало(алкало)фильные микроорганизмы.

2.1. Физиологические особенности.

2.2. Содовые озера - источник галоалкалофильных микроорганизмов.

2.3. Мраморные памятники как источники галоалкалофильных микроорганизмов.

2.4. Стратегии адаптации бактерий к высоким значениям солености и рН.

2.5. Галофильные и алкалофильные метилобактерии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава III. Материалы и методы.

3.1. Объекты исследования.

3.2. Выделение накопительных культур.

3.3. Выделение чистых культур.

3.4. Культивирование бактерий.

3.5. Электронная микроскопия.

3.6. Изучение культуральных и физиолого-биохимических свойств.

3.7. Определение активности ферментов.

3.8. Аналитические методы.

3.8.1. Выделение и идентификация изопреноидных компонентов.

3.8.2. Определение фосфолииидного состава.

3.8.3 Определение состава жирных кислот.

3.8.4. Выделение экзополисахаридов и определение мономериого состава.

3.8.5. *Н ЯМР-анализ осмоиротекторов.

3.8.6. ТСХ метод определения содержания осмоиротекторов.

3.8.7. ВЭЖХ метод определения содержания экгоина.

3.8.8. Определение внутриклеточного объема.

3.9. Молекулярпо-генетические методы и филогенетический анализ.

3.9.1. Выделение и очистка препаратов ДНК.

3.9.2. Определение нуклеотидного состава ДНК.

3.9.3. ДНК-ДНК - гибридизация.

3.9.4. ПЦР-амплификация гена 16S рРНК.

3.9.5. ПЦР-амплификация гена ДАБ-аминотрансферазы (ect В).

3.9.6. Секвенирование ДНК и филогенетический анализ.

Глава IV. Выделение и характеристика галофильных алкалофильиых и галофилышх нейтрофильиых метилобактерий.

4.1. Выделение и характеристика галоалкалофильных метилобактерий из содовых озер.

4.2. Выделение и характеристика галоалкалофильных мегилотрофов из разрушающегося мрамора.

4.3. Выделение и характеристика галофильных нейтрофильиых метилобактерий с водорослей Красного моря.

Глава V. Особенности метаболизма галоалкалофильных и галофильных нейтрофильиых метилобактерий.

Глава VI. Филогенетическое и таксономическое положение новых изолятов.

Глава VII. Осмоадаптация представителей рода Methylophaga.

7.1. Состав фосфолипидов и жирных кислот клеток в зависимости от солености среды.

7.2. Осмопротекторы.

Глава VIII. Обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Галоалкалофильные аэробные метилобактерии рода Methylophaga"

Актуальность темы. Аэробные метилобактерии - физиологическая и таксономическая подгруппа аэробных метилотрофных прокариот, использующих окисленные или замещенные производные метана (но не СН4) б качестве источников углерода и энергии. Аэробные метилобактерии усваивают биогенные и антропогенные Сi-субстраты и являются природным барьером, препятствующим поступлению этих соединений в окружающую среду. Во многих экосистемах аэробные метилобактерии играют существенную роль в круговороте биогенных макроэлементов (С, N, Р). Хотя окисленные и замещенные производные метана повсеместно распространены в природе, имеется весьма ограниченная информация о биологии аэробных метилобактерии экстремальных экосистем с повышенными или пониженными значениями рН, солености и температуры. К настоящему времени лучше исследованы аэробные метилобактерии почвенных, пресноводных и морских экосистем. Выделены и охарактеризованы морские умеренно галофильные метилобактерии рода Methylophaga: М. marina и М. lhalassica (Janvier, Grimont, 1985), М. sulfidovorans (de Zvvart ct al., 1996), M. limanica (Доронина с соавт.,1997), а также Methylarculci marina и Methylarcula icrricola (Doronina et al., 2000). Однако практически не изучены метилобактерии из биотопов с высокими значениями солености и рН, в том числе механизмы их осмоадаптации.

Изучение соленых и содовых озер (минерализация до 300 г/л, рП 9.0 - 10.5) на наличие метилобактерии и их роли в галоалкалофильных микробных сообществах было начато нами 7 лет назад. Первые изоляты алкалотолерантных метилобактерии из соленых и содовых озер Южного Забайкалья были идентифицированы как представители нового вида Ancylobacter nalronum (Доронина с соавт., 2001). Вполне очевидно, что эти изоляты не могут охватить потенциальное экофизиологическое и таксономическое многообразие галоалкалофильных/толерантных метилобактерии. Следовательно, целенаправленный поиск и изучение метилобактерии, адаптированных к условиям экстремальных биотопов, весьма актуальны для понимания роли этих бактерий в различных природных эконишах, а также в связи с перспективами использования в качестве модельных объектов для расшифровки молекулярных механизмов осмоадаптации и реализации биотехнологического потенциала.

Цель и задачи исследования. Цель работы - выделение и характеристика новых гало(алкало)фильиых аэробных метилобактерий из соленых и щелочных экосистем. Для достижения этой цели были поставлены и решались следующие основные задачи:

1. Выделить чистые культуры аэробных метилобактерий из соленых и содовых озер Южного Забайкалья и Монголии, водорослей Красного моря и разрушающегося мрамора.

2. Идентифицировать галоалкалофильные изоляты методами полифазной таксономии.

3. Исследовать основные механизмы осмоадаптации выделенных галофильных метилобактерий.

Научная новизна работы. Впервые выделены представители метилобактерий рода Methylophaga из соленых и содовых озер и из разрушающегося мрамора, идентифицированные на основании физиолого-биохимических, хемо- и генотаксономических характеристик как новые виды М. alcalica, М. natronica и М. murata. Впервые обнаружены В^-независимые метилобактерий рода Methylophaga. Бактерии выделены с поверхности водорослей Красного моря и на основании данных ссквенирования гена 16S рРИК предварительно отнесены к известному виду М. marina. Впервые показано, что в ответ на повышение солености среды гало(алкало)фильные метилобактерии рода Methylophaga синтезируют органические осмопротекторы (эктоин, глутамат и сахарозу), их суммарное внутриклеточное содержание уравновешивает осмолярность среды. Определены пути биосинтеза этих осмопротекторов из метанола. Установлено, что метилобактерии соленых и щелочных биотопов находятся в трудно разделимых ассоциациях с метанотрофами и гетерогрофами, поставляющими метилобактериям Ci-интермедиаты и ростовые факторы. Полученные результаты свидетельствуют о широком распространении и важной экофизиологической роли гало(алкало)фильных аэробных метилобактерий, как необходимого функционального компонента микробиоты соленых и содовых биотопов.

Практическое значение. Расширен спектр детально охарактеризованных коллекционных культур аэробных метилобактерий, устойчивых к высоким значениям рН и солености. Показано, что представители рода Methylophaga способны на основе дешевого непищевого возобновляемого сырья - метанола накапливать эктоин (до 20% от веса сухой биомассы), что позволяет считать их потенциальными продуцентами этого биопротектора широкого спектра действия, защищающего клетки и биомолекулы от губительного влияния высоких температур, высушивания и ультрафиолетового излучения. Исследованные 7 галоалкалофильмые, а также галофильпые нейтрофильные метилобактерии рода Methylophaga могут являться модельными объектами для выявления особенностей их осмоадаптации на молскулярно-генстическом уровне с целью создания более эффективных штаммов-продуцентов эктоина.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на V и VI конференциях молодых ученых г. Пущино (2001, 2002), на VII симпозиуме Symposium on Bacterial Genomics and Ecology (Bergen, Norway, 2002), VIII и IX Международных Путинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2004 и 2005), на молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), а также на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2000-2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 114 страницах м состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 215 ссылок, из них 40 на русском и 175 на английском языках, содержит 20 таблиц и 13 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ли Цырегма Дармаевна

выводы

1. Из проб ила содовых озер Южного Забайкалья и Монголии выделены в чистую культуру 7 штаммов галоалкалофильных облигатных и ограниченно-факультативных метилобактерий, классифицированных как новые виды рода Methylophaga: М. alcalica и М. natronica. Из соскоба разрушающегося мраморного памятника Московского Кремля выделен ограниченно-факультативный галоалкалофильный штамм, классифицированный как новый вид Methylophaga murata.

2. С морских водорослей побережья Красного моря впервые выделены В 12-независимые штаммы галофильных нейтрофильных метилобактерий, которые отнесены к известному виду Methylophaga marina. Следовательно, ауксотрофность по витамину В12 не является обязательным признаком рода Methylophaga.

3. При снижении температуры культивирования в клетках М. murata КрЗ возрастало относительное содержание ненасыщенных жирных кислот Ск,:| и Сш, а при повышении солености среды увеличивалось относительное содержание отрицательно заряженных фосфолииидов фосфатидилглицерина и кардиолипина, что связано со стабилизацией внешних мембран

4. Обнаружено, что у гало(алкало)фильных метилобактерий рода Methylophaga основными осмоиротекторами являются эктоин и глутамат. Их внутриклеточные концентрации возрастали с повышением осмолярности среды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В литературе метилобактерии рода Methylophaga описываются как представители морских экосистем. Аэробные умеренно галофильпые метилобактерии род Methylophaga выделены нами из соленых и содовых озер, разрушающегося мрамора и с морских водорослей. Как правило, эти метилобактерии ассоциированы с метанотрофами, поскольку используют интермедиа™ окисления метана - метанол, формальдегид и муравьиную кислоту, а также метиламины - продукты разложения глицинбетаина метаногенами. Кроме того, галофильпые метилобактерии образуют с гетеротрофами устойчивые метилотрофные сообщества, поставляя гетеротрофам экзометаболиты и, в свою очередь, получают факторы роста (витамины).

Нами впервые показано, что у галофильных метилобактерий рода Methylophaga одним из механизмов осмоадаптации является синтез de novo и преимущественное накопление в клетках биопротектора эктоина - циклической иминокислоты, обладающей высокой водоудерживающей способностью.

Обычно метилобактерии синтезируют эктоин только при высоком содержании соли (>3% NaCl), когда возрастают энергетические затраты па поддержание ионных градиентов и уменьшается энергетический статус клеток.

Интерес к биопротекторам (эктоины, бетаины) во многом обусловлен возможностью использования их в качестве "химических шаиеронов", оказывающих стабилизирующее и защитное действие на ферментативные системы, ДНК- и РНК-белковые комплексы (Margesin R., Schinner F., 2001). Наибольший интерес представляют эктоин поскольку является высокоэффективным биопротектором при криоконсервации генетического материала, при лиофилизации клеток, используется в биохимических исследованиях в качестве стабилизатора ферментов, в косметической промышленности как водоудерживающий агент, легко проникающий в клетки и повышающий их тургор. Неудивительно, что метилобактерии с высоким внутриклеточным содержанием эктоина выдерживают нагревание, высушивание, множественные циклы замораживания-оттаивания и, следовательно, весьма приспособлены к постоянно изменяющимся условиям среды обитания.

Осмоадаптацня галоалкалофильных метилобактерий включает существенные структурно-функциональные изменения (модификацию жирнокислотного и фосфолипидного состава мембран, внутриклеточное накопление наряду с эктоином глутамата и сахарозы). Предстоит выяснить природу первичных сигнальных эффекторов и рецепторов, запускающих каскад ответных реакций на стрессовые воздействия солености и рН, включая особенности биоэнергетики поддержания внутриклеточного ионного гомеостаза. Очевидно, что постулируемые механизмы осмоадаптацин у галоалкалофильных метилобактерий нуждаются в дальнейших специальных исследованиях с применением методов геномики и протеомики.

Более того, имеющиеся в нашей коллекции штаммы галоалкалофильных и галофильных нейтрофильиых метилобактерий могут найти применение в качестве модельных объектов для выяснения особенностей их энергетического и конструктивного метаболизма, включая принципы организации и регуляции биосинтеза эктоина на молекулярио-гснетическом уровне.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ли Цырегма Дармаевна, Пущино

1. Андреищсва Е.Н., Звягильская Р.А. Адаптация дрожжей к солевому стрессу. Прикл. биохим. и микробиол. 1999. Т.35. №3. С.243-256.

2. Васильева Л.В., Лафицкая Т.Н., Намсарасв Б.Б. Angulomkrobium lelraedrale, новый род почкующихся бактерий с радиальной симметрией клетки. Микробиология. 1979. Т.48. С.1033-1039.

3. Говорухина Н.И., Клецова Л.В., Цыганков Ю.Д., Троценко Ю.А., Негрусов А.И. Характеристика нового облигатного метилотрофа. Микробиология. 1987. Т.56. №5. С.849-854.

4. Горбушипа А.А., Лялпкова Н.Н., Власов Д.Ю., Хижняк Т.В. Микробные сообщества на мраморных памятниках Санкт-Петербурга и Москвы: видовой состав (разнообразие) и трофические взаимодействия. Микробиология. 2002. Т.71. №3. С.409-417.

5. Доронина Н.В, Дармасва Ц.Д., Троценко Ю.А. Новые аэробные метилотрофные изоляты из содовых озер Южного Забайкалья. Микробиология. 2001. Т.70. №3. С.398-404.

6. Доронина Н.В. Биоразнообразие и таксономия аэробных метилобактерий. Диссертация на соискание ученой степени доктора биол. наук: Пущино, 1999.

7. Доронина Н.В., Говорухина Н.И., Лысенко A.M. Троценко Ю.А. Анализ ДНК-ДНК гомологии у облигатно-мегилотрофных бактерий. Микробиология. 1988. Т.57. №4. С.629-633.

8. Доронина Н.В., Гришина Е.В., Диканская Э.М., Троценко Ю.А. Новый грамположитсльный факультативный метилотроф Mycobacterium methylovorum. Микробиология. 1991. Т.60. №4. С.725-732.

9. Доронина Н.В., Краузова В.И., Троценко Ю.А. Melhylophaga limanica новый вид умеренно галофильных аэробных метилобактерий. Микробиология. 1997. Т.66. №4. С.528-533.

10. Доронина Н.В., Кудинова Л.В., Троценко Ю.А. Methylovorus mays новый вид аэробных облигатных метилобактерий, ассоциированных с растениями. Микробиология. 2000. Т.69. №5. С.712-716.

11. П.Доронина И.В., Сахаровский В.Г., Драчук С.В., Троценко Ю.А. Органические осмопротекторы аэробных умеренно галофильных метилобактерий. Микробиология. 1998. Т.67. №4. С.458-463.

12. Доронина Н.В., Троцснко Ю.Л. Methylophilus leisingeri новый вид ограниченно-факультативных метилотрофных бактерий. Микробиология. 1994. Т.63. №3. С.530-537.

13. Доронина Н.В., Троцепко Ю.Л. Аэробные метилотрофные сообщества гиперсоленых экосистем. Микробиология. 1997. Т.66. № 1. С. 175-181.

14. Ешинимаев Б.Ц., Цырепжапова И.С., Хмеленина В.П., Троцепко Ю.А. Определение содержания осмопротектора эктоина у метилотрофных бактерий нормально-фазовой ВЭЖХ. Прикл. биохим. микробиол. 2007. Т. 43. № 2. в печати.

15. Заварзип Г.А. Эпиконтииентальные содовые водоемы как предполагаемые реликтовые биотопы формирования наземной биоты. Микробиология. 1993. Т.62. №5. С.789-800.

16. Заварзин Г.А., Жилина Т., Кевбрин В.В. Алкалофильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие. Микробиология. 1999. Т.68. №5. С.579-599.

17. Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Аэробные метилобактерии синтезируют ауксины. Микробиология. 2001. Т.70. №4. С.315-320.

18. Иванова Е.Г., Доронина И.В., Шепеляковская А.О., Ламан А.Г., Бровко Ф.А, Троценко Ю.А. Факультативные и облигатные аэробные метилобактерии синтезируют цитокинины. Микробиология. 2000. Т.69. №6. С.764-769.

19. Иванова Е.Г., Федоров Д.П., Доронина Н.В., Троцепко Ю.А. Образование витамина В12 аэробными метилотрофными бактериями. Микробиология. 2006. Т.75. № 4. С.570-572.

20. Исаченко Б.Л. Хлористые, сульфатные и содовые озера Кулундипской степи и биогенные процессы в них. Избранные труды. М.-Л. Издательство АН СССР. 1951. С. 143-162.

21. Качюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Сузина I I.E., Лысенко A.M., Троценко Ю.А. Новые метанотрофные изоляты из содовых озер Южного Забайкалья. Микробиология. 1999. Т.68. №5. С.677-685.

22. Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях. Москва. Изд. "Мир". 1981. 520с.

23. Логинова Н.В., Троценко Ю.А. Карбоксилазы нирувата и фосфоенолпирувата у метилотрофов. Микробиология. 1979. Т.48. №2. С.202-207.

24. Логинова Н.В., Троцепко Ю.А. Факультативный метилотроф, относящийся к Arlhrobactcr. Микробиология. 1975. Т.44. С.987-992.

25. Любимов В.И., Львов II.П., Кирштейпс Б.Э., Модификация микродиффузионного метода определения аммиака. Прикл. биохим. микробиол. 1968. Т.4. С. 120-121.

26. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М: Мир. 1984. 480 с.

27. Методы общей бактериологии. Под ред. Ф. Герхардта и др. Изд. "Мир". 1983. Т.1. С.360-361.

28. Намсараев Б.Б., Жилина Т.П. Кулырова А.В., Горленко В.М. Бактериальное образование метана в содовых озерах юго-восточного Забайкалья. Микробиология. 1999. Т.68. № 5. С.671-676.

29. Никитин Д.И. Новый почвенный микроорганизм Renobacter vacuolalum gen. et sp.n. Докл. АН СССР. 1971. Т.198. С.447-448.

30. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. Изд. "Мир". 1978. 332с.

31. Решетников А.С., Хмеленина В.И., Троценко Ю.А. Обнаружение генов биосинтеза эктоина у галотолерантных аэробных метилотрофных бактерий. ДАН. 2004. Т.396. С.831-834.

32. Скулачев В.П. Натриевый цикл новый тип бактериальной энергетики. Биохимия. 1985. Т.50. № 2. С.179-183.

33. Сорокин Д.Ю. О возможности процесса нитрификации в сильнощелочных условиях содовых биотопов. Микробиология. Т.67. №3. С.404-408.

34. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. Биохимия. 1958. Т.23. С.656-662.

35. Троценко Ю.А., Доронина II.В. Биология аэробных метилобактерий деструкторов галометанов. Микробиология. 2003. Т.72. №2. С. 149-160.

36. Троценко Ю.А., Иванова Е.Г., Доронина И.В. Аэробные метилотрофные бактерии как фитосимбионты. Микробиология. 2001. Т.70. №6. С. 725-736.

37. Троценко Ю.А., Логинова Н.В. Пути метаболизма метилированных аминов у бактерий. В сб. Успехи микробиологии. 1979. Т. 14. С.28-55.

38. Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. Особенности биологии и осмоадаитации галоалкалофильных метаноторофов. Микробиология. 2002. Т.71. №2. С. 149-159.

39. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир. 1988. 568 с.

40. Четина Е.В., Троценко Ю.А. Уровни адепин и ииридиннуклеотидов у метанотрофиых бактерий. Микробиология. 1987. Т.56. №3. С.369-393.

41. Al-Avvadhi N„ Egli Т., I lamer G„ Wehrli E. Thermotolerant and thermophilic solvent-utilizing methylotrophic, aerobic bacteria. System. Appl. Microbiol. 1989. V.l 1. P.207-216.

42. Anderson D.L., Lidstrom M.E. The moxFG region encodes four polypeptides in the methanol-oxidizing bacterium Methylobacterium sp.strain AMI. J. Bactcriol. 1988. V.170. P.2254-2262.

43. Anderson D.L., Morris C.J., Nunn D.N., Anthony C. and Lidstrom M.E. Nucleotide sequence of the Methylobacterium extorquens AMI moxF and moxJ genes involved in methanol oxidation. Gene. 1990. V.90. P. 173-176.

44. Anthony C. Methanol dehydrogenase in Gram-negative bacteria. In: Principles and Application of Quinoproteins (Davidson V.L., Ed.) 1993. P. 17-45. Marcel Dekker. New York.

45. Anthony C. The biochemistry of methylotrophs. Academic Press. London. 1982. 251 p.

46. Anthony C., Ghosh M., Blake C.C.F. The structure and function of methanol dehydrogenase and related quinoproteins containing pyrrolo-quinoline quinine. Biochem. J. 1994. V.304. №3. P.5-674.

47. Anthony C,, Zatman L.J. The microbial oxidation of methanol. The methanol-oxidizing enzyme of Pseuclomonas sp. M27. Biochem. J. 1964. V.92. P.614-621.

48. Aono R., Ito M., Joblin K.N., Ilorikoshi K. A high cell wall negative charge is necessary for the growth of the alcaliphile Bacillus lentus C-125 at elevated pi I. Microbiology. 1995. V.141. P.2955-2964.

49. Bacic M.K., Newell S.Y., Yoch D.C. Release of dimethylsulfide from dimethylsulfoniopropionate by plant-associated salt marsh fungi. Appl. Environ. Microbiol. 1998. V64. P.1484-1489.

50. Baker S.C., Kelly D.P., Murrcll J.C. Microbial degradation of methanesulfonic acid: a missing link in the biogeochemical sulphur cycle. Nature. 1991. V.350. P.627-628.

51. Batler J.H. Better budgets for methyl halides?. Nature. 2000. V.403. P.260-261.

52. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed. Eds. Brenner D.J., KriegN.R., Staley J.T. 2005. V.2. Springer.

53. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed. Eds. J.G. Holt, N.R. Krieg, P.I I.A. Sneath, T.Staley. S.T. Williams. Baltimore: Williams and Wilkins. 1994.

54. Bevcridge T.J., Pouwels P., Sara M., Kotiranta A., Launatmaa K. Functions of S-layers. FEMS Microbiol. Rev. 1997. V.20. № 1/2 P.99-149.

55. Blackmore M.A., Quayle J.R. Microbial growth on oxalate by a route not involving glyoxylate carboligase. Biochem. J. 1970. V.l 18. P.53-59.

56. Bock E., Sand IV. The microbiology of masonry biodeterioration. J. Appl. Bacteriol. 1993. V.74. №3. P.503-514.

57. Boer de L., Dijkhuizen L., Grobben G. Goodfellow M., Stackebrandt E., Parlett J.I I., Whitehead D., Witt D. Amycolatopsis melhanolica sp.nov., a facultatively methylotrophic Actinomyccte. Int. J. Syst. Bacteriol. 1990. V.40. P. 194-204.

58. Booth I.R. The regulation of intracellular pH in bacteria. In: Bacterial responses to pH. Wiley, Chichester (Novartis Found. Symp. 221) P. 167-182.

59. Bousfield I.J., Green P.N. Reclassification of bacteria of the genus Protomonas Urakami and Komagata 1984 in the genus Mcthylobacterium (Patt, Cole and Hanson) emend. Green and Bousfield 1983. Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. V.35. P.209.

60. Carls R.A., Hanson R.S. Isolation and characterization of tricarboxylic acid cycle mutants of Bacillus subtilis. J. Bactcriol. 1971. V.106. P.848-855.

61. Chistoserdova L., Chen S.-W., Lapidus A., Lidstrom M.E. Methylotrophy in Methylobacterium extorquens AMI from a genomic point of view. J. Bacteriol. 2003. V.185. P.2980-2987.

62. Chistoserdova L., Vorholt J.A, Thauer R.K., Lidstrom M.E. C| transfer enzymes and coenzymes linking methylotrophic and methanogenic archaea. Science. 1998. V.281. P.99-102.

63. Colby J., Zatman L.S. Enzymological aspccts of the pathways for trimethylamine oxidation and Ci-assimilation in obligate methylotrophs. Biochem. J. 1975. V.148. P.513-520.

64. Collins M.D. Analysis of isoprenoid quinines. In: Methods in Microbiology, (ed. Gottschalk G), New York, Acad. Press. 1985. V.18. P.329-366.

65. Da Costa M.S., Santos H., Galinski E.A. An overview of the role and diversity of compatible solutes in bacteria and archaea. In Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 1998. V.61. P.117-153. Ed. T. Schepcr. Berlin: Springer.

66. Dedysh S.N., Smirnova K.V., Khmelcnina V.N. Suzina N.E., Liesack W., Trotsenko Y.A. Methylotrophic autotrophy in Beijerinckia mobilis. J.Bacteriol. 2005. V.187. №11. P. 38843888.

67. Denhardt D.T. A membrane filter technique for determination of complementary DNA. Biochcm. Biophys. Res. Com. 1966. V.23. P.641-646.

68. Deyhly R.R., Barton L.L. Nicotinamideadenindinucleotide independent phlei. Can. J. Microbiol. 1977. V.23. P.125-130.

69. Dijken van J.P., Quayle J.R. Fructose metabolism in four Pscudomonas species. Arch. Microbiol. 1977. V.114. P.281-286.

70. Dijklniizen L., Arfman N. Methanol metabolism in thermotolerant methylotrophic Bacillus sp. In: Microbial growth on Ci-compounds. Eds.: Andreesen J.R., Bovvien B. 1990. P.215-219.

71. Dixon G.H., Kornberg H.L. Assay for key enzymes of glyoxylatc cycle. Biochem. J. 1959. V.72. P.3-11.

72. Doherty D. L-glutamate dehydrogenase (yeast). In: Methods in Enzymol. XXVII A. 1970. P.850.

73. Doronina N., Ivanova E., Trotsenko Y.A., Pshenichnikova A., Kalinina E., Shvets V. Melhylophilus quaylei sp. nov., a new aerobic obligately methylotrophic bacterium. System. Appl. Microbiol. 2005. V.28. P.303-309.

74. Doronina N.V., Tourova T.P., Trotsenko Y.A. Methylarcula, a new genus of aerobic moderately halophilic facultatively methylotrophic bacteria. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V.50. № 5. P.1849-1859.

75. Doronina N.V., Trotsenko Y.A. Reclassification of "Blastobacter viscosus 7d" and "Blastobacter aminooxidans 14a" as Xanthobacter viscosus sp. nov. and Xanthobacter aminooxidans sp.nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V.53. P. 179-182.

76. Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Krausova V.I., Boulygina E.S., Tourova 'P.P. Melhylopila capsulala gen.nov., sp.nov., a novel non-pigmented aerobic facultatively methylotrophic bacterium. Int. J. Syst. Bad. 1998. V.48. №4. P. 1313-1321.

77. Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Kuznetsov B.B., Tourova, T.P. Emended description of Paracoccus kondratievae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V.52. №2. P.679-682.

78. Duine J.A., Frank J., Jongejan J.A., Dijkstra M. Enzymology of the bacterial methanol oxidation step. In: Microbial growth on C|- compounds. Washington. 1984. P.92-96.

79. Duine J.A., Frank J., Ruitcr L.S. Isolation of methanol dehydrogenase with a functional coupling to cytochrome c. J. Gen. Microbiol. 1979. V.l 15. P.523-524.

80. Dumont M.G., Neufeld J.D., Murrell J.C. Isotopes as tools for microbial ecologists. Current Opinion in Biotechnology. 2006. V. 17. P.57-58.

81. Elliot W.I I. Glutamine synthesis. In Methods Enzymol. Acad. Press. New York. 1955. V.2. P.337.

82. Fall R. Cycling of methanol between plants, methylotrophs and the atmosphere. In Microbial Growth on CI-Compounds Eds. M.E. Lidstrom, F.R. Tabita. Kluvver Acad. Publ. Dordrecht. Netherlands. 1996. P.343-350.

83. Fclsenstein J. PIIYLIP (Phylogcnetic Interference Package) version 3.5 c. Department of Genetics, University of Washington, Seattle. USA. 1993.

84. Ferenci Т., Strom Т., Quayle J.R. Purification and properties of 3-hexulose phosphate synthase and phospho-3-hexuloisomerasc from Methylococcus capsulatus. Biochem. J. 1974. V.l44. P.477-486.

85. Galbally I.E., Kirstine W. The production of methanol by flowering plants and the global cycle of methanol. J. Atmospheric Chemistry. 2002. V.43. P. 195-229.

86. Galinski E.A. Osmoadaptation in bacteria. Adv. Microbial. Physiol, (ed. Poole R.K.) Acad. Press. 1995. V.37. P.273-328.

87. Galinski E.A., Pfeiffer H.P., Truper II.G. l,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidine carboxylic acid, a novel cyclic amino acid from halophilic phototrophic bacteria of the genus Ectothiorhodospira. Eur. J. Biochem. 1985. V.149. P. 135-139.

88. Galinski Е.Л., Truper II.G. Microbial behaviour in salt-stressed ecosystems. FEMS Microbiol. Rev. 1994. V.l5. P.95-108.

89. Gordon S.A., Weber R.P. Colorimetrie estimation of indoleacetic acid. Plant Physiol. 1951. V.26. P.192-195.

90. Govorukhina N.I., Trotsenko Y.A. Methylovorus, a new genus of methylotrophic bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. V.41. P. 158-165.

91. Grant W.D, Mwatha W.E., Jones B.E. Alkaliphiles ecology, diversity and applications. FEMS Microbiol. Rev. 1990. V.75. P.255-270.

92. Hirsch P. Genus Ilyphomicrobiwn Stutzer and Hartleb 1898, 16м'. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 1989. V.3. P.1895-1904. Eds. J.T. Stalcy et al. New York, Willians and Wilkins.

93. Hoeft S.E., Rogers D.R., Visscher P.T. Metabolism of methyl bromide and dimethyl sulfide by marine bacteria isolated from coastal and open waters. Aquat. Microb. Ecol. 2000. V.21. P.221-230.

94. IIopner J., Trautwein A. Pscudomonas oxalalicus: requirement of a cosubstrate for growth on formate. Biochem. J. 1971. V.l55. P.234-245.

95. Itoh N. Volatile halogcnated compounds from marine algae; their formation mechanism and geochemical aspects. Recent Res. Develop. Phytochem. 1997. V.l. P.309-327.

96. Jacob D.J., Field B.D., Li Q., Blake D.R., de Gouw J., Warneke C., Hansel A., Wisthaler A., Singh 11.В., Guenther A. Global budget of methanol: Constraints from atmospheric observations. J. Geophys. Res. 2005. V.l 10. Cite ID D08303 (JGRD 1 lomepauc)

97. Jamashad M., Dc Marco P., Pacheco C.C., Ilanczar Т., Murrcll J.C. Identification, mutagenesis and transcriptional analysis of the methanesulfonate transport operon of Methylosulfonomonas methylovora. Appl. Environ. Microbiol. 2006. V.72. P.276-283.

98. Janvier M., Frehel C., Grimont F., Gasser F. Melhylophaga marina gen. nov., sp. nov. and Melhylophaga thalassica sp. nov., marine methylotrophs. Int. J. Syst Bacterid. 1985. V.35. P.131-139.

99. Janvier M., Grimont F. The genus Melhylophaga, a new line of descent within phylogenetic branchy ofProleobacteria. Res. Microbiol. 1985. V.146. P.543-550.

100. Janvier M., Regnault В., Grimont P. Development and use of fluorescent 16S rRNA-targeted probes for the specific detection of Melhylophaga species by in situ hybridization in marine sediments. Res. Microbiol. 2003. V.154. №7. P.483-490.

101. Jcbbar M., Talibart R., Gloux K., Bernard Т., Blanco C. Osmoprotection of Escherichia coli by ectoine: uptake and accumulation characteristics. J. Bacteriol. 1992. V.174. P.5027-5035.

102. Jebbar M., von Blohn C., Bremer E. Ectoine functions as an osmoprotectant in Bacillus subtilis and is accumulated via the ЛВС-transport system OpuC. FEMS Microbiol. Lett. 1997. V.154. P.325-330.

103. Jenkins O., Byrom D., Jones D. Methylophilus: a new genus of methanol-utilizing bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 1987. V.37. P.446-448.

104. Johnson P.A., Quayle J.R. Microbial growth on C|-compounds. Oxidation of methanol, formaldehyde and formate by methanol-grown Pseuclomonas AMI. Biochem. J. 1964. V.93. P.281-290.

105. Jones B.E, Grant W.D., Duckworth A.W., Owenson G.G. Microbial diversity of soda lakes. Extremophiles. 1998. V.2. P. 191 -200.

106. Jones B.E., Grant W.D., Collins N.C., Mwatha W.E. Alkaliphiles: diversity and identification. In: Bacterial diversity and systematics (ed. Priest et al.). 1994. P. 195-228. Plenium Press, New York.

107. Jones B.F., Eugster H.P., Rettig S.L. Hydrochemistry of the Lake Magadi basin, Kenya. Geochimica et Cosmochimica Acta. 1977. V.41. P.53-72.

108. Joyc S.B. Connell T.L., Miller L.G., Oremland R.S. and Jellison R.S. Oxidation of ammonia and methane in an alkaline, saline lake. Limnol. Oceanogr. 1999. V.44. № 1. P.178-188.

109. Kates M. Influence of salt concentration on membrane lipids of halophilic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 1986. V.39. №1. P.39-101.

110. Kelly D.P., Baker S.C., Tricket J., Davey M., Murrell J.C. Methane sulfonate utilization by a novel methylotrophic bacterium involves an unusual monooxygenase. Microbiology. 1994. V.140. P.1419-1426.

111. KeppIer F., Hamilton J.T.G., Bra(3 M., Rockmann T. Methane emissions from terrestrial plants under aerobic conditions. Nature. 2006. V.439. P. 187-191.

112. Khmelenina V.N., Kalyuzhnaya M.G., Sakharovsky, V.G., Suzina, N.E., Trotsenko,Y.A, Gottsclmlk G. Osmoadaptation in halophilic and alkaliphilic methanotrophs. Arch Microbiol. 1999. V.172. №5. P.321-329.

113. Khmelenina V.N., Kalyuzhnaya M.G., Starostina N.G., Suzina, N.E., Trotsenko,Y.A. Isolation and characterization of halotolerant alkaliphilic methanotrophic bacteria from Tuva soda lakes. Curr. Microbiol. 1997. V.35. №5. P.257-261.

114. Kiene R.P. Microbial sources and sinks for methylated sulphur compounds in the marine environment. In Microbial Growth on C| Compounds. 1993. P.15-33. Edited by J.C. Murrell & Kelly D.P. Andover: Intercept. U.K.

115. Kim S-G., Bae II-S., Oh II-M., Lee S-T. Isolation and characterization of novel halotolerant and/or halophilic denitrifying bacteria with versatile metabolic pathways for the degradation of trimcthylaminc. FEMS Microbiol. Lett. 2003. V.225. P.263-269.

116. Kimura Т., Sugahara I., Hanai K., Asalii T. Purification and characterization of a new y-glutamylmethylamide-dissimilating enzyme system from Methylophaga sp ЛЛ-30. Biosci. Biotech. Biochem. 1995. V.59. P.648-655.

117. Klick S., Abbrahamsson K. Biogenic volatile iodated hydrocarbons in the ocean. J. Geophys. Res. 1992. V.97. P. 12683-12687.

118. Korotkova N., Chistoscrdova L., Kuksa V., Lidstrom M. E. The glyoxylate regeneration pathway in the methylotroph Methylobacterium extorqaens AMI. J. Bacteriol. 2002. V.l84. P. 1750-1758.

119. Krulwich T.A. Alkaliphiles: 'basic' molecular problems of pi I tolerance and bioenergetics. Biophys. Biochim. Acta. 1995. V. 15. P.403-410.

120. Kussmaul M., Wilimzig М., Воск В. Mcthanotrophs and methanogcns in masonry. Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. P.4530-4532.

121. Kussmaul M.,Grocngroeft A., Kocthe H. Emissions of porewatcr compounds and gases from the subaquatic sediment disposal site "Rodewischhafen", Hamburg harbour. Water Sci. Technol. 1998. V.37. P.87-93.

122. Labbe N., Jutcau P., Parent S., Villemur R. Bacterial diversity in a marine methanol-fed denitrification reactor at the Montreal Biodom, Canada. Microb. Ecol. 2003. V.46. P. 12-21.

123. Lane. D.J. 16S/23S rRNA sequencing. In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. Edited by E. Stackebrandt and M. Goodfeltow. Chichester: Wiley. 1991. P. 115-175.

124. Large P.J., Bam forth C.W. Methylotrophy and biotechnology. Longman. London. 1988. P.222-227.

125. Lee J.I I., Kim Y.S., Choi T-J., Lee W.J., Kim Y.T. Paracoccus haeundaensis sp.nov., a gram-negative, halophilic, astaxanthin-producing bactcrium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V.54. №5. P.1699-1702.

126. Leisinger T. Biodegradation of chlorinated aliphatic compounds. Curr. Opinion in Biotechnol. 1996. V.7. P.295-300.

127. Levering P.J., Dijukhuizen L., Harder W. Metabolic regulation in the facultative methylotroph Arthrobacter PI. Growth on primary amines as carbon and energy source. Arch Microbiol. 1984. V. 139. P. 188-195.

128. Lippert K., Galinski E.A. Enzyme stabilization by ectoin-type compatible solutes protection against heating, freezing and drying. Appl. Microbiol. Biotech. 1992. V.37. P.61-65.

129. Lous P., Galinski E.S. Characterization of genes for the biosynthesis of the compatible solute ectoine from. Marinococcus halophilus and osmoregulated expression in Escherichia coli. J. Microbiol. 1997. V.143. P.l 141-1149.

130. Malin G., Lapidot A. Induction of synthesis tetrahydropyrimidine derivatives in StreptomycL's strain and their affect on Escherichia coli in response to osmotic and heat stress. J. Bactcriol. 1996. V.178. P.385-395.

131. Margesin R„ Schinner F. Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology. Extremophiles. 2001. V.5. P.73-83.

132. Marmur J. A. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. 1961. V.3. P.208-214.

133. McDonald I.R., Murrell J.C. The methanol dehydrogenase structural gene mxaY and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs. Appl. Environ. Microbiol. 1997. V.63 №8. P.3218-3224.

134. Meers J.L., Tempest D.W. Glutaminc (amide): cx-oxoglutarate aminotransferase oxidoreductase (NADP) an enzyme involved in biosynthesis of glutamate by some bacterial. J. Gen. Microbiol. 1970. V.64. P.187-194.

135. Nunn D.N., Day D., Anthony C. The second subunit of methanol dehydrogenase of Methylobaeterium extorquens AMI. Biochem. J. 1989. V.260. P.857-862.

136. Patt Т.Е., Cole G.C., Hanson R.S. Methylobaeterium, a new genus of facultatively methylotrophic bacteria. Int. J. Syst. Bacterid. 1976. V.26. P.226-229.

137. Peel B.D., Quayle J.R. Microbial growth on C) compounds. Isolation and characterization of Psemlomonas AMI. Biochem. J. 1961. V.81. P.465-469.

138. Peters R., Galinski Е.Л., Truper II.G. The biosynthesis of ectoine. FEMS Microbiol. Lett. 1990. V.71.№ 1-2. P.157-162.

139. Poolman B. and Glaasker E. Regulation of compatible solute accumulation in bacteria. Mol. Microbiol. 1998. V.29. № 2. P.397-407.

140. Raj H.D. Oligotrophic methylotrophs: Ancylobactcr (Basonym "Microcyclus" Orskov) Raj gen. nov. Critical Rev. Microbiol. 1989. V.17. P.89-106.

141. Reed R.H., Richardson D.L., Warr S.R.C., Stewart W.D.P. Carbohydrate accumulation and osmotic stress in cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 1984. V.l30. P. 1-4.

142. Reichenbecher W., Murrell J.C. Purification and partial charactirization of the hydroxylase component of the methanesulfonic acid monooxygenase from Melhylosulfonomonas methylovora strain M2. Eur. J. Biochem. 2000. V.267. P.4763-4769.

143. Reshctnikov A.S., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A. Characterization of the ectoine biosynthesis genes of haloalkalitolerant obligate mcthanotroph "Methylomicrobium alcaliphilum 20Z". Arch. Microbiol. 2006. V.l84. №5. p.286-296.

144. Roberts M.F. Organic compatible solutes of halotolcrant and halophilic microorganisms. Saline Systems. 2005. V.5. P.l-30.

145. Roe|31er M„ Mtiller V. Osmoadaptation in bacteria and archaea: common principles and differences. Environmental Microbiology. 2001. V.3. №12. P.743-754.

146. Saigne C., Legrand M. Measurements of methanesulfonic acid in Antarctic ice. Nature. 1987. V.330. P.240-242.

147. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sci. 1977. V.74, P.5463-5467.

148. Schacterlc L.B., Pollack R.L. A simplified method for the quantitative assay of small amounts of protein in biological material. Anal. Biochem. 1973. V.51. P.654-655.

149. Schaefer J.K., Goodwin K.D., McDonald I.R., Murrcll J.C., Oremland R.S. Leisingera methylohalidivorans gen. nov., sp. nov., a marine methylotroph that grows on methyl bromide. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V.52. P.851-859.

150. Schall C., Laturnus F., Ileumann K.G. Biogenic volatile organoiodine and organobromine compounds released from polar macroalgae. Chcmosphere. 1994. V.28. РЛЗ15-1324.

151. Severin J., Wohlfarth A., Galinski E.A. The predominant role of recently discovered tetrahydopyrimidines for the osmoadaptation of halophilic eubacteria. J. Gen. Microbiol. 1992. V.138. P.1629-1638.

152. Sleator R.D., Hill.C. Bacterial osmoadaptation: the role of osmolytes in bacterial stress and virulence. FEMS Microbiol. Rev. 2001. V.26. P.49-71.

153. Sorokin D.Yu., Gorlenko V.M., Namsaraev B.B., Namsaracv Z.B., Lysenko A.M., Eshinimaev B.T., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A. Prokaryotic communities of the northeastern Mongolian soda lakes. Hydrobiologia. 2004. V.522. P.235-248.

154. Strom Т., Ferenci Т., Quayle J.K. The carbon assimilation pathway's of Methylococcus capsulalus, Pseudomonas methanica and Methylosinus trichosporium. Biochem. J. 1974. V.144. P.465-476.

155. Tindall B.J. Procaryotic life in the alkaline, saline, athalassic environment. In Halophilic bacteria (Ed. Rodrigucz-Valera F. Boca Raton), FL: CRC Press. 1988. P.31-67.

156. Trotsenko Y.A., Doronina N.V., Govorukhina N.I. Metabolism of non-motile obligately methylotrophic bacteria. FEMS Microbiol. Letters 1986. V.33. P.293-297.

157. Trotsenko Y.A., Khmelenina V.N. Biology of extrcmophilic and extremotolerant methanotrophs. Arch Microbiol. 2002. V.177. №1. P.123-131.

158. Triiper H.G., Galinski E.A. Concentrated brines as habitats for microorganisms. Fxperientia. 1986. V.42. P.1182-1187.

159. Urakami Т., Komagata K. Characterization of species of marine mcthylotrophs of the genus Melhylophaga. Int J Syst Bacteriol. 1987. V.37. P.402-406.

160. Urakami Т., Komagata К., Emendation of Melhylobacillus Yody Weaver 1977, a genus for methanol-utilizing bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. V.36. P.502-511.

161. Urakami 'Г., Tamaoka J., Suzuki K-I., Komagata K. Acidomonas gen.nov., Incorporating Acetobacter methanolicus as Acidomonas methanolica comb.nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 1989. V.39. №1. P.50-55.

162. Ventosa A., Nieto J.J., Oren A. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V.62. №2. P.504-544.

163. Vorholt J.A., Chistoserdova L., Lidstrom M.E., Thaucr R.K. The NADP-dependent methylene tetrahydromethanopterin dehydrogenase in Methylobaclerium extorquens AMI. J. Bactcriol. 1998. V.180.№20. P.5351-5356.

164. Walsh D.A., Cooper R.H., Denton R.M., Bridges B.J., Randle P.S. Elementary reactions of the pig heart pyruvate dehydrogenase complex. Biochem. J. 1976. V.l 57. P.41-67.

165. Ward B.B., Martino P.P., Diarz M.C., Joe S.B. Analysis of ammonia-oxidizing bacteria from hypcrsaline Mono Lake, California, on the basis of 16S RNA sequences. Appl. Environ. Microbiol. 2000. V.66. №7. P.2873-2884.

166. Wiegel S. The genus Xanhobacter. The Prokaryotes. Eds. Balows A. Et al., N.Y.: Springer-Verlag. 1992. V.3. P.2365.

167. Wohlfarth A., Severin J., Galinski E.A. The spectrum of compatible solutes in heterotrophic halophilic eubacteria of the family Halomonadaccac. J. Gen. Microbiol. 1990. V.l36. P.705-712.

168. Wood W.A. Assay of enzymes representative of metabolic pathways. Methods Microbiol. 1971. V.6A. P.421.

169. Xin Y.H., Zhou Y.G., Chen W.X. Ancylobacter polymorphic sp.nov. and Ancylobacter vacuolates sp.nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V.56. P. 1 185-1 188.

170. Xin Y.I I., Zhou Y.G., Zhou ILL., Chen W.X. Ancylobacter rudongensis sp.nov., isolated from roots oLSpartina anglica. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V.54. P.385-388.

171. Yamashita S-i., Uchimura Т., Komagata K. Emendation of the genus Acidomonas Urakami, Tamaoka, Suzuki and Komagata 1989. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V.54. P.865-870.

172. Yordy J.R., Weaver T.Y. Methylobacillus, a new genus of obligate methylotrophic bacteria. Int J Syst Bacteriol. 1977. V.27. P.247-255.

173. Yumoto I., Yamasaki K., Sawabe Т., Nakano K., Kawasaki K., Ezura Y and Shinano H. Bacillus horti sp.nov., a new gram-negative alkaliphilic bacillus. Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V.48. P.565-571.

174. Zhilina T.N. and Zavarzin G.A. Alkaliphilic anaerobic community at pll 10. Cur. Microbiol. 1994. V.29. P. 109-112.

Информация о работе

Ли Цырегма Дармаевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Галоалкалофильные аэробные метилобактерии рода Methylophaga - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Галоалкалофильные аэробные метилобактерии рода Methylophaga ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Галоалкалофильные аэробные метилобактерии рода Methylophaga"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ли Цырегма Дармаевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Галоалкалофильные аэробные метилобактерии рода Methylophaga"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ли Цырегма Дармаевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ли Цырегма Дармаевна, Пущино

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Галоалкалофильные аэробные метилобактерии рода Methylophaga
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология