Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биокатализаторы на основе метилотрофных бактерий и выделенных из них ферментов как распознающие элементы амперометрических биосенсоров

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биокатализаторы на основе метилотрофных бактерий и выделенных из них ферментов как распознающие элементы амперометрических биосенсоров"

На правах рукописи

«"0533126

КУЗНЕЦОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ И ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НИХ ФЕРМЕНТОВ КАК РАСПОЗНАЮЩИЕ ЭЛЕМЕНТЫ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ БИОСЕНСОРОВ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 9 СЕН 2013

МОСКВА-2013

005533126

Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета и в лаборатории радиоактивных изотопов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

РАН, г. Пущино

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент Тульского

государственного университета Понаморева Ольга Николаевна

Официальные оппоненты: кандидат химических наук,

старший научный сотрудник лаборатории комплексного катализа Института проблем химической физики РАН Гвоздев Рудольф Иванович

доктор биологических наук, заведующий лабораторией масс-спектрометрии Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН Зякун Анатолий Маркович

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится « 7 » октября 2013 г. в 16 ч.ЗО мин. часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова (МИТХГ им. М.В. Ломоносова) по адресу 119571 Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571 Москва, пр. Вернадского, 86.

ю

Автореферат разослан « 5 » сентября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник

А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*

Актуальность темы исследования.

Аэробные метилобактерии, использующие метанол, и другие окисленные или замещенные производные метана в качестве источников углерода и энергии, составляют особую физиологическую группу микроорганизмов, обладающих уникальной способностью строить клеточные компоненты из восстановленных Ci-соединений (Троценко и др. 2010). Метилобактерии все более активно используются в промышленной биотехнологии, где одним из ключевых факторов, определяющих стоимость продукта, является природа и цена источника углерода. Метанол, являясь доступным непищевым сырьем, служит источником углерода при культивировании продуцентов кормового белка, для биотехнологических процессов производства биоразлагаемых полимеров, биопротектора - эктоина и других продуктов биосинтеза (Троценко и Торгонская 2012).

Для эффективного ведения биотехнологических процессов требуется постоянный мониторинг потребления исходного субстрата и образования интер-медиатов. В последнее десятилетие для непрерывного аналитического контроля биотехнологических процессов все более активно применяют биосенсоры (Решетилов 2005; Bäcker et al., 2011), которые характеризуются простотой, низкой стоимостью, экспрессностью и высокой чувствительностью, в отличие от стандартных методов определения Ci-соединений. Большинство биосенсоров основаны на электрохимическом типе детекции и содержат клетки или ферменты в качестве биокатализатора (Su et al., 2011). Значительный прогресс в создании амперометрических биосенсоров стал возможен благодаря использованию в них медиаторов - соединений, способных к переносу электронов от активных центров ферментов на электрод. Медиаторы электронного транспорта могут взаимодействовать не только с выделенными ферментами in vitro, но и с внутриклеточными ферментами in vivo.

Ключевым фактором переноса электронов на электрод является мембранная локализация дегидрогеназ, связанных с ферментами дыхательной цепи бактерий. Наиболее часто в качестве биокатализаторов в медиаторных биосенсорах используют уксуснокислые бактерии рода Gluconobacter, обладающие активностями основных ферментов катаболизма углеводов и спиртов - пирро-лохинолинхинон (PQQ)-3aBHCHMbix альдоз- и алкогольдегидрогеназ, взаимодействующих с медиаторами переноса электронов (Tkac et al., 2009; Инджгия с соавт., 2011). Перспективными биокатализаторами для разработки биосенсоров могут служить клетки метилобактерий, которые, подобно уксуснокислым бактериям, имеют периплазматическую локализацию PQQ- дегидрогеназ (Goodwin and Anthony 1995). Основным ферментом первичного Сгметаболизма у мети-лотрофных прокариот является периплазматическая PQQ-метанолдегидрогеназа (МДГ, КФ 1.1.2.7), катализирующая окисление метанола до формальдегида (ФА) и передающая электроны на специфический кислый

*В руководстве работой и подготовке к защите принимал участие доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией ФГБУН ИБФМ им Г.К. Скрябина РАН Троценко Юрий Александрович.

цитохром cL (Гвоздев с соавт., 2012). Кофактор PQQ, прочно связанный с апо-ферментом, катализирует рН-зависимую двухэлектронную/протонную реакцию окисления метанола при относительно низких положительных потенциалах, что выгодно отличает МДГ от НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы (КФ 1.1.1.1). Важным преимуществом МДГ является независимость реакции от кислорода, в отличие от ФАД-алкогольоксидазы дрожжей (КФ 1.1.3.13) (Ikeda and Капо 2003; Misra et al., 2012). Способность окислять токсичные одноугле-родные соединения делает возможным использование этих бактерий в качестве биокатализаторов при создании амПерометрических биоаналитических систем мониторинга уровня Сг соединений. Следует отметить, что взаимодействие ферментных систем метилобактерий in vivo с искусственными акцепторами электронов ранее практически не исследовалось.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - изучение биокаталитических свойств клеток и ферментов аэробных метилобактерий как основы функционирования амперометрического медиаторного биосенсора для определения содержания С,-соединений. Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

1. Определение основных физиологических параметров роста метилобактерий как потенциальных биокатализаторов при разработке амПерометрических биосенсоров.

2. Оценка биокаталитических свойств метилобактерий в условиях аэробного окисления субстратов с помощью амперометрической биосенсорной системы на основе кислородного электрода.

3. Изучение биоэлектрохимического окисления метанола клетками метилобактерий в зависимости от фазы роста при использовании в качестве медиаторов электронного транспорта редокс-соединений разных классов и определение их эффективности.

4. Определение аналитических и метрологических параметров амперометрического медиаторного биосенсора при использовании клеток, цито-плазматических и мембранных фракций метилобактерий в качестве биокатализаторов.

5. Выделение, очистка и характеристика МДГ; разработка на ее основе амперометрического медиаторного биосенсора для количественного определения метанола.

Научная новизна.

Впервые показана возможность переноса электронов в биоэлектрохимических системах «метанол - клетки метилобактерий - медиаторы электронного транспорта - электрод» и определены индексы эффективности медиаторов 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ), ферроцена (ФЦ), 2,5-дибром-п-бензохинона (ДББХ).

Выявлен эффект изменения субстратной специфичности при окислении спиртов различного строения, ФА и метановой кислоты клетками, цитоплазма-тическими и мембранными фракциями метилобактерий в присутствии ФЦ. Мембранные фракции Methylobacterium dichloromethanicum в данных условиях специфичны к ФА, что имеет существенное значение при создании селективных биосенсорных систем для анализа многокомпонентных смесей.

Впервые очищена и охарактеризована МДГ Methylobacterium nodularis. Установлено, что фермент является димером (м. м. нативного белка ~ 70 кДа), состоящим из большой (60 кДа) и малой (6 кДа) субъединиц, PQQ- зависимым белком, с pi - 8,7 и константой Михаэлиса к метанолу Км = 70 мкМ. Фермент обладает высокой стабильностью при хранении.

Модификация графито-пастовых электродов гидроксиапатитом (ГА) приводила к увеличению тока биоэлектрохимического окисления метанола иммобилизованной МДГ в присутствии ФЦ, не влияя на окислительно-восстановительные свойства медиатора.

Практическая значимость.

Комплексный подход по оценке биокаталитических свойств метилобак-терий с использованием методов, применяемых в биосенсорной области, а также анализ и обобщение полученных результатов выявили способность метило-бактерий участвовать в биоэлектрохимическом окислении Ci-соединений в присутствии акцепторов электронов, что может быть использовано в качестве научной основы при разработке высокочувствительных и экспрессных электрохимических биосенсоров для количественного определения метанола и ФА.

Разработан макет биосенсорного анализатора на основе графито-пастового электрода с иммобилизованной МДГ Mb. nodularis и медиатора - ФЦ для определения концентрации метанола в культуральной среде метилобакте-рий при ведении биотехнологических процессов. Полученные результаты подтверждают возможность применения действующего макета биосенсорного анализатора как прототипа опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.

Результаты работы внедрены в учебный процесс - поставлена новая лабораторная работа по курсам «Биосенсоры» и «Биотехнология защиты окружающей среды» для студентов специальностей 020100 Химия и 240901 Биотехнология.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 19-22 марта 2013 г.) (диплом за III место, медаль конкурса)', Всероссийских конференциях с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология» (Тула, 2010,2011 и 2012 гг. (диплом победителя конкурса))-, Общероссийской студенческой научной конференции «Студенческий научный форум 2011» (15 - 20 февраля 2011 г.); 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 г.); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 21-25 марта 2011 г.) {диплом, медаль конкурса)', Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биологический мониторинг природно-техногенных систем» (Киров, 29-30 ноября 2011 г.), Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации» (Екатеринбург, 1-5 октября 2012 г.), Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, МГУ им. Н.П. Огарева, 3-5 октября 2012 г.).

По теме диссертации опубликованы 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК и 12 сообщений в форме тезисов и материалов конференций.

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнялась на кафедрах Химии и Биотехнологии ЕНФ «ТулГУ», а также в лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках проектов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (2009-2013 г) (ГК № 02.740.11.0296, ПС № П551) и РФФИ (грант 11-04-97544-р_центр_а). Автор работы является победителем конкурса Программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2012 г. (г. Тула), госконтракт № 11419р/17125.

Благодарности. Автор благодарен коллективам кафедр химии и биотехнологии Тульского государственного университета и сотрудникам лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ РАН за неоценимую помощь в проведении исследований и интерпретации результатов. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям - к.х.н., проф. Алферову В.А., к.х.н., доц. Понаморевой О.Н. и д.б.н., проф. Троценко Ю.А.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, анализа результатов исследований, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 136 стр., содержит 61 рисунок и 23 таблицы. Список литературы включает 194 источника, из них 30 на русском и 154 на английском языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложены актуальность темы, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 1. В первой главе диссертации проанализирована и обобщена научно-техническая информация по теме исследования. В первой части обзора литературы изложены особенности биологии и метаболизма метилобактерий, их биотехнологический потенциал, описаны физиолого-биохимические свойства метилобактерий, которые служили объектами исследований. Вторая часть обзора литературы посвящена характеристике, структуре, механизму действия МДГ. В заключительной части обзора представлены сведения о физико-химических преобразователях, используемых для разработки биосенсоров ам-перометрического типа, в том числе на основе бактериальных клеток и PQQ-зависимых дегидрогеназ.

Глава 2. Во второй главе подробно описаны материалы и методы исследования.

Бактериальные штаммы. В работе использовали штаммы аэробных метилобактерий Methylovorus mays ВКМ В-2221, Methylobacterium mesophili-сит JCM 2829, Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4, Methylobacterium nodularis ORS2060T, любезно предоставленные д.б.н., в.н.с. H.B. Дорониной (лаборатория радиоактивных изотопов ИБФМ РАН).

Условия культивирования. Культуры выращивали на качалке (180 об/мин) при 29 °С в колбах Эрленмейера с 200 мл среды "K"(Doronina, Braus-Stromeyer et al. 1995), содержащей (г/л): КН2Р04 - 2, (NH4)2S04 - 2, NaCl -0,5, MgS04-7H20 - 0,025, FeS04-7H20 - 0,002, pH 7,2. Метанол вносили в стерильные среды до концентрации 0,5 % (по объему).

Газовая хроматография. Содержание метанола на разных фазах роста метилобактерий определяли методом газо-жидкостной хроматографии, описанным в ГОСТ 30536-97 на хроматографе Кристалл 5000.2 СКБ «Хроматэк» (Россия). Условия проведения хроматографии: колонка DB-FFAP (США) 50 м*0,32 ммх0,50 мкм; газ-носитель - гелий, сжатый в баллоне по ГОСТ 929374; температура термостата - 75 °С, испарителя (инжектора) - 200 °С, детектора ионизации в пламени - 250 °С; скорость потока газа-носителя — 0,144 дм3/ч.

Биосенсорные измерения. Окислительную активность метилобактерий в аэробных условиях регистрировали с помощью амперометрического биосенсора на основе кислородного электрода типа Кларка «Кронас» (Россия), на рабочей поверхности которого фиксировали клетки, иммобилизованные на стекловолокнистых бумажных фильтрах типа GF/A «Whatman» (Англия).

Медиаторный биосенсор представлял собой двухэлектродную систему, в которой электродом сравнения служил хлорсеребряный, а рабочим - графито-пастовый электрод (площадь поверхности 7,1 мм2). Биоматериал (клетки, мембранные и цитоплазматические фракции или фермент) наносили на поверхность рабочего электрода и фиксировали диализной мембраной («Sigma», США, размер пор 14 кДа). Электрохимические измерения проводили с помощью гальвано-потенциостата IPC-Micro 8.65 «Вольта» (Россия) в калий-фосфатном буфере (КФБ) с добавлением 15 мМ NH4C1 при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке (300 об/мин). Диапазон регистрируемых токов 1 нА - 10 мА; за ответ сенсора принимали амплитуду изменения между начальной и конечной величинами силы тока до и после введения субстрата в измерительную кювету.

В качестве биоматериала для электрода использовали клетки М. mays, Mb. dichloromethanicum и Mb. mesophilicum, собранные в фазе замедления роста. Для получения ферментных фракций клетки разрушали на ультразвуковом генераторе УЗПЗ-0,1/22 (Россия) с последующим дифференциальным центрифугированием (5000 g, 15 мин; 30000 g, 30 мин) на центрифуге Avanti J-30I «Beckman Coulter, Inc.» (США) при 4 °С, получая цитоплазматическую фракцию и фракцию суммарных мембран.

Очистка МДГ. Все стадии очистки фермента проводили при 4 °С. Клетки ресуспендировали в 0,1 М Трис-HCl буфере (рН 7,5), содержащим лизоцим и ЭДТА, и разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе «MSE» (Англия). Го-могенат центрифугировали (18000 об./мин., 30 мин) и экстракт высаливали (NIi|)2S04, получая фракцию от 40 % до 60 % насыщения. Осадок растворяли в 10 мМ Трис-HCl буфере (рН 8,0) и обессоливали на колонке с Сефадексом G-25. Для удаления балластных белков и нуклеиновых кислот препарат пропускали через колонку с ДЭАЭ-сефарозой Fast Flow «GE Healthcare» (Швеция). В данным условиях МДГ на колонке не сорбировалась, поэтому препарат сразу наносили на колонку с ГА HA-Ultrogel «LKB» (Швеция), используя 10 мМ

Трис-HCl буфер (pH 8,0). Колонку промывали тремя объемами 0,2 М NaCl в 25 мМ КФБ (pH 7,0), и элюировали МДГ градиентом 0,025-0,25 М КФБ (pH 7,0). Активные фракции объединяли, концентрировали на ультрафильтрацион-н'ой мембране YM10 «Amicon» (США). В заключение проводили катионооб-менную ВЭЖХ на хроматографе LC-20 Prominence «Shimadzu» (Япония) на колонке (8 х 75 мм) Protein Pak Glass SP-5PW «Waters» (США), уравновешенной 20 мМ буфером МЭС-NaOH (pH 5,5). МДГ элюировали линейным градиентом 0 - 0,25 М NaCl. Активные фракции объединяли, концентрировали и переводили в 20 мМ КФБ (pH 7,0) ультрафильтрацией, как указано выше. Препарат

хранили при -70 "С.

Характеристика МДГ. Активность МДГ определяли спектрофотомет-рически при 30 °С с ФМС ДХФИФ в качестве акцепторов электронов по известной методике (Day and Anthony 1990) с незначительной модификацией реакционной смеси. Реакцию инициировали ферментом, измеряя уменьшение поглощения при 600 нм (е = 1,9-104 М^см-1) в течение 15-30 сек. За единицу активности принимали количество МДГ, которое катализирует восстановление 1 мкмоль ДХФИФ в 1 мин.

Электрофорез проводили в градиенте (10-20 %) полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по методу Лэмли (Laemmli 1970). Гели окрашивали Кумасси R250 «Serva» (Германия). Для калибровки гелей использовали набор стандартных белков S8445 «Sigma - А1-drich» (США).

Молекулярную массу (м.м.) нативного белка определяли гель-фильтрацией на колонке Bio-Sil TSK 250 «Bio-Rad Laboratories Inc.» (США), откалиброванной с помощью стандартных белков MWGF200 S8445 «Sigma -Aldrich» (США). Элюирующий буфер - 0,1 М КФБ (pH 7,0). Скорость протока - 0,5 мл/мин. Белок определяли методом Брэдфорд, в качестве стандарта использовали БСА.

Изоэлектрофокусирование проводили в ПААГ, используя амфолины pH 3,5 - 10 «LKB» (Швеция) по рекомендациям фирмы. Для калибровки геля использовали набор стандартных белков 17-0471-01 «GE Healthcare» (Швеция).

Обработка результатов. Математическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью компьютерной программы SigmaPlot 11.0 и Excel 2003.

Глава 3. В третьей главе приведены основные результаты работы и их обсуждение.

1.Сравнительная характеристика физиологических параметров роста ме-

тилобактерий.

В работе использовали бактерии родов - Methylobacterium и Methylovorus, реализующие различные пути первичного Сгметаболизма (сериновый -Methylobacterium-, рибулозомонофосфатный (РМФ) - Methylovorus), что может влиять на биокаталитические свойства этих бактерий и их ферментов, соответственно.

Кроме того, на рост метилобактерий в условиях периодического культивирования оказывают воздействие такие факторы, как температура, степень аэрации, природа ростовых субстратов, их концентрация и др. На разных ста-

днях роста метилобактерий функционируют различные ферментные системы, изменение которых оказывает заметное влияние на окислительную активность, и, следовательно, на биокаталитические свойства. В табл. 1 приведены основные физиологические параметры роста трех штаммов метилобактерий.

Таблица !.Основные физиологические параметры роста метилобактерий.

Параметр М. mays ВКМ В-2221 Mb. mesophilicum JCM 2829 Mb.dichloro-methanicum ДМ 4

Максимальная удельная скорость роста, ч'1 0,33±0,02 0,060±0,002 0,163±0,005

Время удвоения, ч 2,1±0,1 11,6±0,4 4,3±0,1

Максимальная

численность метилобактерий, КОЕ/мл (1,5±0,2)-101с (4,7±0,2)-10" (1,0±0,2)-1010

Выход биомассы, г/л 14±2 3,2±0,5 2,7±0,1

Продуктивность по биомассе, г/(л ч) 0,23±0,03 0,021±0,004 0,039±0,001

Метаболический коэффициент, ч'1 8,33-10'5 1,28-10"4 3,70-10"

Экономический коэффициент 6,25 1,7 1,3

Показано, что бактерии рода Methylobacterium уступают М. mays по основным параметрам. Так, максимальная удельная скорость роста М. mays ВКМ В-2221 вдвое больше таковой Mb. dichloromethanicum и в 5,5 раза, чем Mb. mesophilicum. Как следствие, для М. mays характерно меньшее время удвоения (2,1 ч). Необходимо отметить, что бактерии рода Methylobacterium, реализующие сериновый путь Ci-ассимиляции, растут медленнее в данных условиях, чем бактерии рода Methylovorus с РМФ-путем. Как известно, РМФ-цикл более эргономичен (Quayle 1980), что объясняет полученные результаты.

2. Потребление метанола в динамике роста метилобактерий.

Путь окисления метанола под действием ферментных систем метилобактерий последовательно через ФА и формиат до С02 обеспечивает клетки энергией и восстановительными эквивалентами. Причем первым ферментом, катализирующим окисление метанола до ФА, является PQQ-зависимая МДГ (КФ 1.1.2.7), характерная для большинства метилобактерий (Anthony 1982, 2004; Williams et al., 2005). Следовательно, метаболическую активность бактерий в ходе их жизненного цикла можно оценивать по скорости потребления ростового субстрата - метанола. Содержание метанола в культуральной жидкости на разных стадиях роста метилобактерий представлено на рис. 1.

^540 HM 1,4

[CH3OH], % об ^540 нм

О 20 40 60 80 100 120 140 160 время, ч

А 540 нм 1,6

ICH3OH], % об.

0,6

Рис. 1. Зависимость концентрации метанола в культуральной среде метилобактерий от времени культивирования: А) М. mays; Б) Mb. mesophilicum; В) Mb. dichloro-methanicum.

10 20 30 40 50 60 время, ч

Наиболее активно метаболизирует метанол М. mays (скорость потребления метанола v = 0,018 % об.-ч"1), реализующий РМФ-путь. Более низкая скорость усвоения метанола у бактерий с сериновым путем: Mb. mesophilicum (v = 0,003 % об.-ч'1) и Mb. dichloromethanicum (v = 0,009 % об.-ч"1) может быть обусловлена слабой активностью МДГ. Это согласуется с вышеизложенными результатами определения ростовых параметров изучаемых штаммов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что для разработки биосенсоров каталитического типа в качестве биорецепторного элемента перспективна культура М. mays. Однако для дальнейшего изучения биокаталитических свойств метилобактерий использовали триаду штаммов, поскольку представлялось логичным получить сравнительную характеристику бактерий с разными путями С |-метаболизма для применения в качестве биораспознающего элемента биосенсора.

3. Спектр окисляемых субстратов клетками метилобактерий в аэробных условиях.

Для определения спектра окисляемых органических соединений клетками метилобактерий оценивали их дыхательную активность по отношению к различным субстратам с помощью амперометрической биосенсорной системы на основе кислородного электрода Кларка. В качестве субстратов использовали спирты, амины, галометаны, глюкозу, т.к. известно, что метилобактерии способны окислять эти субстраты, наряду с некоторыми другими соединениями

(нитропроизводные, амиды и сложные эфиры карбоновых кислот и др.) (Троценко с соавт., 2010).

Принцип работы такого биосенсора заключается в окислении клетками органических соединений, добавляемых в измерительную ячейку. В результате возрастает дыхательная активность клеток, а концентрация кислорода в при-электродном пространстве снижается, что регистрируется электродом Кларка. Сила тока пропорциональна концентрации кислорода в исследуемом образце. На монитор выводится графическое отображение изменения силы тока во времени. По полученному отклику вычисляли ответ сенсора как максимальную скорость изменения силы тока от времени. Регистрируемое изменение концентрации кислорода позволяет судить о дыхательной активности клеток на поверхности электрода и, следовательно, о концентрации окисляемых соединений (Понаморева с соавт., 2010). Скорости окисления различных субстратов, определенные посредством амперометрической биосенсорной системы с метило-бактериями в качестве биокатализаторов, представлены на рис.2.

МЪ. сИЛЬготегИатсит МЬ. тезорИШсит □ М. тау.ч_

Рис.2. Профиль субстратной специфичности клеток метилобактерий в аэробных условиях, полученный с помощью амперометрического биосенсора на основе электрода Кларка.

Так, наибольшие ответы сенсоров на основе трех штаммов метилобактерий получены на метанол, этанол, ФА, пропанол-1, бутанол-1, муравьиную кислоту и изоамиловый спирт, что связано с активностью мембранной МДГ. Известно, что МДГ, не являясь узкоспецифичным ферментом, кроме метанола, может окислять ФА и другие первичные спирты (С1-С5), но слабо взаимодейст-

-11 -

вует с их вторичными и третичными изомерами (Гвоздев с соавт., 2012). Активность фермента снижалась с увеличением длины углеродной цепи субстрата. Значительный ответ биосенсора на ФА также может быть обусловлен высокой активностью формальдегиддегидрогеназы (ФАДГ) - фермента пути прямого окисления ФА.

Ответ биосенсора с клетками М. mays на бензиловый спирт составил 58 % относительно метанола, что косвенно согласуется с данными, о том, что МДГ некоторых метилобактерий может окислять ароматические спирты, хотя субстратная специфичность относительно метанола составляет 45 - 60 % (Mountfort 1990).

Низкую окислительную активность клеток наблюдали по отношению к галогенпроизводным алканов, нитрометану, а также к первичным и третичным аминам. Как известно, Mb. dichloromethanicum участвует в окислительной деструкции галометанов, однако для этого необходимо индуцировать ферментные системы, катализирующие превращения галометанов, при чем способность окислять метанол у таких бактерий снижается (Liesinger and Braus-Stromeyer 1995).

В целом, М. mays характеризуется достаточно высокими значениями окислительной активности по отношению практически ко всем исследуемым субстратам, что может быть связано с более высокими активностями ферментов. Так, удельная активность МДГ в экстрактах М. mays составляла 0,58 Е/мг белка, а для Mb. nodularis - 0,27 Е/мг белка.

4. Биоэлектрохимическое окисление метанола метилобактериями в присутствии ферроцена.

В клетках метилобактерий метанол окисляется до ФА под действием фермента PQQ-МДГ, передавая электроны на специфический кислый цитохром cL. Напротив, известно, что in vitro МДГ проявляет активность с искусственными акцепторами электронов, такими как феназинмето- /этосульфат (Ghosh and Quayle 1979; Гвоздев и др. 2012). Эффективный перенос электронов от фермента in vivo на электрод возможен при использовании природных или синтетических соединений, способных диффундировать через клеточную мембрану и взаимодействовать с восстановленными сайтами бактерий. Для изучения биоэлектрохимического окисления метанола метилобактериями на разных стадиях роста использовали ФЦ, который широко применяется в качестве медиатора при разработке электрохимических биосенсоров на основе клеток и ферментов, представляя собой высоко обратимую окислительно-восстановительную систему (Чигринова с соавт.,. 2007; 2008).

Процесс окисления метанола мембранной МДГ в присутствии ФЦ может быть представлен следующим образом:

Анод (подается потенциал 250 мВ Относительно хлорсеребряного электрода сравнения):

СН3ОН + PQQ-МДГ -- НСОН + PQQH2-MflF

PQQHz-МДГ + 2[Fe(C5H5)2]+-- PQQ-МДГ + 2 Fe(C5H5)2 + 2Н+

Fe(C5H5)2 - le'-- [Fe(C5H5)2]+

-12-

AgCl + e"

Ag + CI"

Катод:

Активные центры ферментов способны взаимодействовать с ферроцений-ионом, восстанавливая его до ферроцена. При наложенном на рабочий электрод потенциале ФЦ окисляется до ферроцений иона и вступает в новый цикл взаимодействий.

Эффективность окисления метанола метилобактериями в присуствии ФЦ изучали электрохимическим методом с помощью амперометрической биосенсорной системы, сравнивая величины отклика сенсора на одну и ту же концентрацию субстрата. Рабочим электродом в этой системе служил графито-пастовый электрод, содержащий в составе пасты ФЦ, а на поверхности -клетки метилобактерий, собранные на разных стадиях роста.

ответ сенсора, % от макс.

1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

ответ сенсора, % от макс.

100

Рис. 4. Зависимость окислительной активности метилобактерий: А) Ме-thylovorus mays, Б) Methylobacterium mesophilicum, В) Methylobacterium e/i-chloromethanicum (ответ сенсора,% от максимального) и оптической плотности As4o.im от времени культивирования;

1 - лаг - фаза, 2 - фаза ускорения роста,

3 - экспоненциальная фаза, 4 - фаза замедления, 5 - стационарная фаза.

Как видно на рис. 4, три штамма метилобактерий проявляли максимальную активность в экспоненциальной фазе роста, когда уровни и активность ферментов в клетках наибольшие, в то время как, в логарифмической и стационарной фазах роста окислительная активность низкая. Напротив, М. mays характеризуется повышенной окислительной активностью к метанолу практически на всех стадиях роста. Эти факты согласуются с результатами изучения метаболической активности метилобактерий по скорости потребления метанола.

Исходя из полученных результатов, для дальнейшего изучения взаимодействия ферментных систем метилобактерий с искусственными акцепторами электронов использовали клетки, собранные в экспоненциальной фазе роста.

6. Эффективность медиаторов электронного транспорта в процессе биоэлектрохимического окисления метанола клетками метилобактерий.

Для определения возможности применения редокс-соединений разных классов (ферроцены, хиноны, индофенолы) в качестве медиаторов в биосенсорах на основе клеток метилобактерий изучали биоэлектрохимическое окисление метанола в присутствии медиаторов электронного транспорта: ФЦ, ДББХ и ДХФИФ. Использовали ранее предложенную модель, где окисление субстрата суспендированными (Ikeda et al., 1996) или иммобилизованными (Babkina et al., 2006) клетками бактерий в присутствии медиаторов переноса электронов рассматривается как бисубстратная ферментативная реакция, протекающая по механизму «пинг-понг». Мы предположили, что окисление метанола при использовании в качестве биокатализатора клеток метилобактерий будет протекать по аналогичной схеме, в которой первым субстратом является метанол, а вторым -медиатор.

ki к,

S + Е0К -*"Р + ЕВ (1);

k-i

Мок + Е, ЕМ М, + Е0К (2),

кз

где S и Р - субстрат и продукт; М„, и М, - окисленная и восстановленная форма медиатора в клетке соответственно; E01t и Е, - фермент, локализованный на мембране бактериальной клетки в окисленной и восстановленной форме, соответственно; k], k_i, к2, к3, к.3 и к4 - константы скоростей соответствующих стадий реакции.

Общее уравнение для силы тока биоэлектрохимического окисления метанола ферментными системами бактерий, основанное на механизме «пинг-понг», имеет вид:

7 = , „ /гIr г «ш <3)' 7«= и •F -к™ [Е]

1 + Ks/[S] + Ku/[M]

где Ks и Км - эффективные константы Михаэлиса для субстрата и медиатора, учитывающие распределение субстрата и медиатора между компонентами клетки и раствором, соответственно;

[Е]-концентрация ферментов in vivo на единицу площади поверхности электрода.

Исходя из предложенной модели, процесс биоэлектрохимического окисления субстрата ферментными системами бактерий можно охарактеризовать тремя параметрами: максимальной силой тока Imax, эффективными константами Михаэлиса для этанола и медиатора Ks и Км:

где К5,р и Км,р - константы распределения субстрата и медиатора, соответственно, между внутренней средой клетки и внешним раствором.

Параметры окисления метанола в присутствии медиаторов электронного транспорта можно рассчитать, используя уравнения типа Михаэлиса-Ментен (8) - (9), полученные из уравнения (3) при условии избытка медиатора или субстрата в системе:

-—- [при — « 1- избыток субстратаI

1 + Ки/[М] р [5] ) (8)

/ =

/ = -

при

— «1 [М]

избыток медиатора J

(9)

Значения силы тока при варьировании исходной концентрации метанола (в условиях избытка медиаторов) и концентрации медиаторов (в условиях избытка метанола) при использовании в качестве биокатализатора клеток М. mays представлены на рис. 5.

ответ сенсора, нА

1800

1600

1400

1200

1000

800

600.

400.

200 0

ответ сенсора, нА 2500

2000

1500

500

♦ ДББХ

Г о ФЦ

..... * ДХФИФ

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 [ДББХ/ФЦ1, ммоль/г

8 10 12 14 [СН,ОН|, иМ

0,0 0,2 0,4

0,6 0,8 1,0 [ДХФИФ], мМ

Рнс.5. Зависимость ответов биосенсора с электродом на основе клеток М. mays от концентрации а) метанола в условиях избытка медиаторов или б) медиаторов в условиях избытка метанола.

Аналогичные зависимости были получены для медиаторных электродов на основе клеток Mb. mesophilicum. Эти зависимости имели гиперболический вид и были аппроксимированы по уравнениям (8) и (9). Параметры биоэлектрохимического окисления метанола: максимальная сила тока I,™*, эффективные константы Михаэлиса для метанола Ks и для медиатора Км представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2. Параметры биоэлектрохимического окисления метанола клетками М. mays в присутствии медиаторов электронного транспорта.

Медиатор Условия Almax, мкА Ks, мМ Км, мМ AImax/Ks AImax/Км

ДХФИФ метанол 6,25 мМ ДХФИФ 0,25 мМ 2,40±0,05 2,0±0,1 0,5±0,1 0,030±0,001 4,0±1 80il

ФЦ метанол 6,25 мМ ФЦ 0,54 мМ/г 1,21 ±0,02 0,74±0,02 0,33±0,02 0,036±0,002 2,2±0,1 34il

ДББХ метанол 6,25 мМ ДББХ 0,13 мМ/г 2,8±0,1 1,3±0,1 1,8±0,2 0,025±0,004 0,7±0,1 llOilO

Та клеткам транспо блица 3. Параметры биоэлектрохимического окисления метанола и МЬ. теяорМИсит в присутствии медиаторов электронного ота.

Медиатор Условия Almax, МКА Ks', мМ Км> мМ AImax/Ks Almax/K м

ДХФИФ метанол 6,25 мМ ДХФИФ 0,25 мМ 0,05±0,01 0,47±0,03 0,9±0,1 0,11±0,01 0,55i0, 04 0,5±0,3

ФЦ метанол 6,25 мМ ФЦ 0,54 мМ/г 0,22±0,01 0,15±0,01 0,18±0,02 0,044±0,003 0,8 liO, 07 5,0i0,l

ДББХ метанол 6,25 мМ ДББХ 0,13 мМ/г 0,46±0,03 0,27±0,02 0,9±0,1 0,017±0,004 0,32i0, 01 27i4

Из уравнений (4-7) следует, что отношение ^/Кз характеризует бимолекулярное взаимодействие фермента с метанолом и не зависит от используемого медиатора (10), а отношение 1т„/Км характеризует взаимодействие медиатора с ферментом и дает индекс эффективности медиатора электронного транспорта (11).

«Ж) к*

Сравнительный анализ индексов эффективности медиаторов электронного транспорта в биосенсорах на основе метилобактерий с ранее полученными рядами эффективности для подобных сенсоров на основе Gluconobacter oxydans (табл. 4) выявил, что ДББХ способен взаимодействовать с ферментными системами бактерий in vivo лучше других медиаторов.

Таблица 4. Индексы эффективности медиаторов электронного транспорта для бактериальных систем._____

~ ——Медиатор Биокатализатор " ----__ ДХФИФ ФЦ ДББХ

М. mays 80±1 34±1 110±10

Mb. mesophilicum 0,5±0,3 5,0±0,1 27±4

Gluconobacter oxydans* 3,3±0,8 120±20 370±70

* - литературные данные (Babkina et al., 2006)

При выборе медиатора электронного транспорта для дальнейшего изучения биокаталитических свойств метилобактерий и разработки макета биосенсора необходимо учитывать стабильность работы электродов. Данный параметр определяется операционной стабильностью биосенсоров, характеризующей устойчивость ответа сенсора на одну и ту же концентрацию субстрата при проведении большого числа последовательных измерений. Показано, что наилучшей стабильностью обладают сенсоры на основе клеток М. mays и Mb. mesophilicum при использовании медиатора ФЦ, который был выбран для дальнейшего изучения биокаталитических свойств ферментов метилобактерий.

6. Окисление субстратов клетками и ферментными фракциями метилобактерий в присутствии ферроцена.

Нами высказано предположение, что использование разрушенных клеток метилобактерий в качестве биокатализаторов увеличит доступность соответствующих ферментов для медиатора ФЦ. Клетки, выращенные до экспоненциальной фазы роста, разрушали ультразвуком и подвергали дифференциальному центрифугированию. Учитывая, что дегидрогеназы метилобактерий имеют ци-топлазматическую и мембранную локализацию, в дальнейших исследованиях использовали цитоплазматическую фракцию и фракцию суммарных мембран в качестве биокатализаторов в сравнении с интактными клетками.

Для изучения специфичности биокатализаторов оценивали величину откликов сенсора на одну и ту же концентрацию субстрата. Результаты биоэлектрохимического окисления субстратов клетками и ферментными фракциями метилобактерий представлены на рис. 6-8.

Рис. 6. Профиль субстратной специфичности клеток метилобактерий в присутствии ФЦ.

1800 1600 1400 1200 1000 800

600 400 -200 0

1

□ М. тау5

ЕЗ МЬ. теяорЫИсит

■ МЬ. сИсМоготеЛатсит

Ип ^п р«—

— NN —

Ё 2

й- а

К о

г 3

ь 2

я §

£

£ Й Б

й 5

Рис. 7. Профиль субстратной специфичности цитоплазматических фракций метилобактерий в присутствии ФЦ.

DM, mays БЗ Mb. mesophilicum

.Lira Jv'

■гИь 1. . П___Г1 г*п * ¡L

Метанол Этанол Пропанол-1 Пропанол-2 1,2,3-Пропангриол Бутанол-1 Бутанол-2 2-Метил пропанол-2 3-Метил бутанол-1 Циклогексанол Формальдегид Метановая кислота 1 Глюкоза

Рис. 8. Профиль субстратной специфичности мембранных фракций метилобактернй в присутствии ФЦ.

Высокие ответы сенсоров на ФА, как уже упоминалось, обусловлены активностью цитоплазматической ФАДГ или неспецифическим окислением МДГ гидратированной формы ФА (гемдиола). В целом, М. mays характеризуется повышенными значениями окислительной активности по отношению ко всем субстратам. Однако, если сравнить ответы сенсора на основе клеток М. mays и видов рода Methylobacterium на муравьиную кислоту можно увидеть следующую закономерность: относительный ответ сенсора на основе М. mays составляет около 50 % от максимального ответа (ФА), тогда как для представителей рода Methylobacterium он сопоставим с максимальными ответами. Известно, что НАД-зависимая формиатдегидрогеназа, катализирующая окисление метановой кислоты, имеет низкий уровень активности или вообще отсутствует у метилобактернй с РМФ-циклом (Доронина с соавт., 2000), что согласуется с выявленной закономерностью. Примечательно, что профили субстратной специфичности клеток метилобактернй, полученные посредством биоэлектрохимического окисления субстратов в присутствии ФЦ (рис. 6) и в условиях аэробного окисления (рис. 2) коррелируют.

Значительное снижение ответов сенсора на основе мембранных и цито-плазматических фракций метилобактернй на метанол и другие спирты, по сравнению с ответами сенсора на основе клеток, можно объяснить низким содержанием активатора МДГ - ионов аммония. Известно, что NH4 необходим для проявления активности МДГ с искусственными акцепторами электронов in vitro (Reddy and Bruice 2004), но не всегда в присутствии цитохрома (Anthony 1992). Измерения проводили в КФБ при физиологическом значении pH 7,5, тогда как активной формой является аммиак, для которого необходимо более щелочное значение (pH 8-9). Резонно предположить, что при использовании в ка-

-19-

честве биокатализатора интактных клеток бактерий активность МДГ сохраняется даже при низкой концентрации активатора.

Следует отметить, что разрушение клеток М. mays приводило к значительному ингибированию каталитической активности как в экстрактах, так и в мембранных фракциях, свидетельствуя о низкой стабильности фермента в данных условиях. При этом цитоплазматические фракции Mb. mesophilicum и Mb. dichloromethanicum в присутствии ФЦ характеризовались значительным увеличением специфичности к ФА.

Поскольку избирательность биосенсорного анализа определяется специфичностью биоматериала, использование мембранной фракции Mb. dichloromethanicum обеспечивает селективный анализ уровня ФА.

8. Очистка и характеристика МДГ Methylobacterium nodularis.

Для очистки и характеристики фермента использовали два штамма мети-лобактерий с разными путями первичного Срметаболизма: М. mays и Mb. nodu-lans. Однако предварительные эксперименты показали, что активность МДГ в экстрактах М. mays через 5 сут хранения снизилась на 90 %, что указывало на низкую стабильность фермента и необходимость подбора стабилизаторов белка для дальнейших исследований. В то же время, мониторинг активности МДГ в экстрактах Mb. nodulans после хранении при 4 и -20 °С выявил незначительное снижение активности, поэтому для очистки фермента была выбрана именно эта культура.

Одностадийная очистка МДГ Mb. nodulans катионообменной хроматографией, в отличие от фермента из Methylobacterium extorquens AMI (Liu et al., 2006), не привела к получению гомогенного препарата. Поэтому для очистки использовали многостадийную процедуру, включающую ионообменную хроматографию на анионите ДЭАЭ-сефарозе, хроматографию на геле ГА, катио-нообменную хроматографию и ультрафильтрацию. Бесклеточный экстракт предварительно фракционировали сульфатом аммония благодаря чему, несмотря на потери, достигалась очистка в 6 раз. После заключительной катионообменной ВЭЖХ и концентрирования степень очистки фермента составила 18,2 с удельной активностью 3,9 Е/мг белка. Результаты очистки МДГ представлены в табл. 5.

Таблица 5. Очистка МДГ из Methylobacterium nodulans.

Стадия очистки Уд. активность, Е/мг Белок, мг/мл Общ. активность, Е Общий белок, мг Выход, % Степень очистки

Экстракт 0,21 ИД 227,0 1080 100 1

40-60% (NH4)2S04 1,23 23,3 107,3 87,4 47 5,9

ДЭАЭ-сефароза 2,53 1,0 77,2 30,5 34 12,1

HA-Ultrogel 3,68 0,34 72,4 19,7 32 17,6

Ультрафильтрация 3,78 0,75 62,5 14,3 28 18

ВЭЖХ на SP-5PW 3,82 1,38 52,7 13,8 23 18,2

Молекулярная масса и субъединицы МДГ. Используя данную схему очистки, был получен электрофоретически гомогенный препарат МДГ (рис.9). Денатурирующий БОЗ-ПААГ - электрофорез очищенного белка выявил при-

сутствие большой и малой субъединиц с м. м. 60,5 кДа и 6,5 кДа соответственно, что совпадает со значениями, рассчитанными на основании транслированных нуклеотидных последовательностей генов mxaF большой (62548 Да) и малой mxal субъединиц (5838 Да) МДГ (Refseq/GenBank NC_011894/ СР001349). М.м. нативного белка, определенная методом гель-фильтрации, составляет около 70 кДа, что соответствует гетеродимеру (сф); при этом белковый пик на хроматограмме соответствовал пику активности МДГ. Ранее аналогичным методом (Duine and Jongejan 1989) было показано существование мономерной формы МДГ у некоторых метанотрофов, хотя для большинства позднее доказа-

Рис.9. SDS-ПААГ-электрофорез МДГ на разных стадиях очистки. 1 -гомогенат, 2 - 40-60 % (NH4)2SO„, 3 - ДЭАЭ-сефароза, 4 - HA-Ultrogel и ультрафильтрация, 5,6 - SP-5PW, М - маркеры.

pi. Изоэлектрическая точка МДГ равна 8,7, как и у большинства ранее изученных МДГ грамотрицательных бактерий.

Кофактор МДГ. В

спектре поглощения МДГ Mb. nodularis наблюдали максимум при 350 нм и широкое плечо абсорбции до 410 нм. Такой спектр идентичен спектрам «классических» PQQ-МДГ метилобактерий и свидетельствует о присутствии в белке восстановленной формы PQQ. Именно в таком виде находится данная простетическая группа в чистых препаратах изученных ранее МДГ(Бгапк and Duine 1990; Richardson and Anthony 1992).

Стабильность МДГ. Фермент Mb. nodulans характеризуется относительно высокой стабильностью при хранении в отсутствии метанола нежели ранее изученные МДГ. Очищенный препарат в 20 мМ КФБ (рН 7,0) при 4 °С терял приблизительно 20 % активности за неделю и 40 % при - 20 °С в месяц. Интересно, что при -70 °С активность МДГ не изменялась в течение двух месяцев. В отличие от большинства МДГ, фермент Mb. nodulans стабилен в широком диапазоне рН даже в отсутствии стабилизаторов, таких как цианид и метанол. МДГ Mb. nodulans в 0,1 М КФБ (рН 6,0) сохраняла активность в течение 20 мин при 50 "С, тогда как при 60 °С потеря активности составляла 35 %.

Зависимость активности МДГ от рН. Максимальную активность фермент проявлял в диапазоне рН 9,0 - 10,0. Выше рН 10 активность не удалось измерить из-за неустойчивости ФМС и ДХФИФ. Оптимум рН находился в щелочной области при рН 9 и выше, что характерно для всех изученных ранее МДГ в системах с искусственными акцепторами электронов.

Зависимость активности МДГ от температуры. Активность МДГ в 0,1 М трис-HCl буфере (рН 9,0) в стандартной реакционной смеси линейно воз-

растала с увеличением температуры от 20 до 50 °С. При более высоких температурах получить достоверные значения активности не удалось из-за неферментативных реакций ФМС и ДХФИФ.

Активаторы МДГ. Аналогично другим PQQ-МДГ, активность МДГ Mb. nodularis с искусственными акцепторами электронов in vitro зависела от присутствия активатора - NH4+. В отсутствии NH4CI реакции с метанолом и эндогенным субстратом не наблюдали. Половина максимальной скорости достигалась при концентрации NH4CI 1,2 ± 0,3 мМ, когда акцептором являлся ФМС. Кроме NH4CI, слабым активирующим действием обладал метиламин.

Субстратная специфичность МДГ. Подобно другим PQQ - МДГ, исследуемый фермент проявлял широкую субстратную специфичность относительно первичных спиртов, но не окислял вторичные и бензиловый спирты, при этом обладал наибольшим сродством к метанолу (Км = 70 мкМ). В целом, с увеличением длины углеродной цепи первичных спиртов, возрастало кажущееся значение Км фермента, тогда как Vmax изменялась незначительно. Субстратами также являются ФА и ацетальдегид, которые, как известно, при высоких концентрациях ингибируют МДГ. Примечательно, что ФМС оказался более эффективным акцептором электронов, чем ФЭС.

Итак, высокая стабильность и сродство к метанолу дают основания считать МДГ Mb. nodulans перспективным ферментом для создания амперометри-ческого биосенсора. Очищенный препарат МДГ был иммобилизован на поверхности графито-пастового электрода, содержавшего медиатор электронного транспорта - ФЦ. Для улучшения адсорбции гидрофильного фермента на поверхности гидрофобного электрода в графитовую пасту добавляли ГА. При этом увеличивался ответ биосенсора и улучшалась операционная стабильность электрода. Введение в графитовую пасту ГА так же расширило рН-оптимум активности МДГ, иммобилизованной на поверхности электрода. Благодаря этому удалось проводить измерения практически без потери чувствительности при рН < 9.

9. Сравнительный анализ характеристик медиаторных биосенсоров.

В работе были определены параметры биосенсоров на основе всех типов изучаемых биокатализаторов, из которых выбраны наиболее перспективные (таблица 6).

Селективность. При изучении субстратной специфичности всех типов биокатализаторов показано, что максимальные ответы сенсоров получены на метанол, его гомологи (СГС5) и ФА, причем биосенсор на основе мембранных фракций Mb. dichloromethanicum оказался селективным по отношению к ФА.

Чувствительность. На коэффициент чувствительности может влиять доступность ферментов и их активность. Коэффициенты чувствительности для сенсоров с ферментными фракциями Mb. dichloromethanicum в качестве биокатализаторов превосходят значение коэффициента чувствительности клеточного сенсора, что объясняется лучшей доступностью активных центров ферментов для субстрата и медиатора. Уместно отметить, что высокое значение коэффициента чувствительности к ФА сенсора на основе цитоплазматической фракции согласуется с локализацией ФАДГ в цитозоле. Биосенсор на основе очищенного препарата МДГ обладал наилучшим коэффициентом чувствительности, од-

нако уменьшение рабочего диапазона за счет снижения верхней границы определяемых концентраций не всегда удобно, т.к. требуется дополнительное разведение образца.

Таблица 6. Характеристики медиаториых биосенсоров на основе клеток, ферментных фракций и МДГ метилобактерий.__

Параметр Клетки М. mays Цитоплазмати-ческая фракция Mb. dichloro-methanicum Мембранная фракция Mb. dichloromethani-сит МДГ Mb. nodularis

Коэффициент чувствительности, нА/мМ 21±1 980±90* 42±2 25±3 3000±50 7200±300*

Предел обнаружения, мМ 0,14 0,03* 0,06 0,05 0,011 0,0045*

Верхняя граница линейного диапазона определяемых концентраций (Км), мМ 8±1 0,33±0,02 * 7,9±0,4 7,0±0,5 1,5±0,1 0,49±0,03*

Операционная стабильность, (п=15), % 4,2 6,6 7,3 7,6

Стабильность, потеря активности за 10 сут, % 90 33 63 12

Примечание: анализируемое вещество - ФА, *- метанол.

Стабильность. Изучение операционной стабильности показало, что сенсоры на основе всех типов биокатализаторов имели стабильные отклики на раствор метанола (относительное стандартное отклонение для 15 последовательных измерений в пределах 8 %).

Установлено, что наилучшим показателем долговременной стабильности биокатализатора характеризовался МДГ-сенсор, который сохранял высокие ответы в течение максимального периода времени. Выше отмечалось, что МДГ Mb. nodularis обладает достаточной устойчивостью при хранении, а присутствие добавки ГА в графитовой пасте может дополнительно стабилизировать фермент, тем самым улучшая этот показатель биосенсора.

Экспрессность. Временные затраты метода, которые в первую очередь определяются длительностью единичного измерения, зависят от концентрации субстрата и типа биокатализатора. Установлено, что время единичного измерения с учетом регенерации электрода для всех типов изучаемых биокатализаторов не превышало 10 мин.

Таким образом, клетки, ферментные фракции и МДГ метилобактерий могут служить эффективными биокатализаторами амперометрических медиатор-ных биосенсоров для определения концентраций метанола и ФА. Использование ферментных фракций бактерий рода Methylobacterium позволило повысить селективность и чувствительность биосенсора к ФА. Применение модифицированных ГА и ФЦ графито-пастовых электродов на основе очищенной МДГ Mb. nodularis обеспечивало высокие токи биоэлектрохимического окисления метанола и увеличение стабильности биосенсора.

выводы

1. Определены физиологические параметры роста трех штаммов аэробных метилобактерий как перспективных биокатализаторов амперометриче-ских биосенсоров. Наиболее эффективным деструктором метанола является Methylovorus mays, который характеризуется максимальными показателями: удельной скорости роста - 0,33±0,02 ч'1; выхода биомассы -14±2 г/л; метаболическим и экономическим коэффициентами - 8,33-10'5 и 6,25, соответственно, а также скоростью потребления метанола v = 0,018 % об.-ч"1.

2. Установлено, что исследуемые метилобактерии проявляют максимальную биоэлектрохимическую активность в фазе экспоненциального роста в присутствии ферроцена как медиатора электронного транспорта. Максимальные ответы медиаторных сенсоров на основе метилобактерий получены на формальдегид (112 %), метанол (100 %) и его гомологи: этанол, пропанол-1, бутанол-1 - 88 %, 78 %, 77 %, соответственно, что согласуется с данными окисления субстратов в аэробных условиях.

3. Впервые показано, что искусственные акцепторы электронов - ферроцен (ФЦ), 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) и 2,5-дибром-п-бензохинон (ДББХ), могут функционировать в биоэлектрохимических системах «метанол - метилобактерии - медиатор - электрод». Определены ряды эффективности медиаторов переноса электронов: для биосенсоров на основе М. mays - ФЦ<ДХФИФ<ДББХ, и Methylobacterium mesophilicum - ДХФИФ < ФЦ < ДББХ.

4. Выявлено, что биосенсор на основе клеток М. mays обладал хорошей операционной стабильностью (Sr = 4,2 %, Р = 0,95, п = 15); биосенсор на основе мембранных фракций Mb. dichloromethanicum обеспечивал селективное определение формальдегида, тогда как биосенсор на основе МДГ Mb. nodularis имел наилучшие показатели чувствительности к метанолу (7200±300 нА/мМ) и долговременной стабильности (потеря активности за 10 сут не превышала 12 %).

5. Метанолдегидрогеназа Mb. nodularis впервые очищена до электрофорети-чески гомогенного состояния и охарактеризована. М. м. нативного белка ~ 70 кДа, состоит из большой (60 кДа) и малой (6 кДа) субъединиц, pi - 8,7, рН - оптимум активности в пределах 9-10, обладает наибольшем сродством к метанолу (Км = 70 мкМ) и высокой стабильностью. Иммобилизованный фермент использовали для амперометрической детекции метанола в линейном диапазоне от 0,0135 до 0,5 мМ, с пределом обнаружения -4,5 мкМ.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Кузнецова Т.А., Бесчастный А.П., Понаморева О.Н., ТроценкоЮ.А. Очистка и свойства метанолдегидрогеназы ризосферного фитосимби-онта Methylobacterium nodulans II Прикл. биохим. микробиол. — 2012. — Т. 48 (№6).-С. 606-611.

2. Кузнецова Т.А., Понаморева О.Н., Решетников А.С., Горячева А.А. Биоэлектрокаталитическое окисление формальдегида метилобакте-риями Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4 в присутствии медиатора электронного транспорта - ферроцена. // Известия ТулГУ. Естественные науки. Тула: Изд-во ТулГУ.- Вып. 1. - 2012. - С. 236-245.

3. Кузнецова Т.А., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Эффективность био-электрокаталитического окисления метанола клетками метилотроф-ных бактерий в присутствии медиаторов электронного транспорта // Известия ТулГУ. Естественные науки. - Тула: Изд-во ТулГУ.- Вып. 1. -2013.-С. 222-232.

4. Кузнецова Т.А., Бесчастный А.П., Алферов С.В., Троценко Ю.А. Свойства модифицированных амперометрических биосенсоров на основе метанолдегидрогеназы и клеток Methylobacterium nodulans I/ Прикл. биохим. микробиол. -2013. - Т. 49 (№ 6). - С. 613-618.

Тезисы докладов:

1. Кузнецова Т.А. Амперометрический биосенсор на основе PQQ-метанолдегидрогеназы Methylobacterium nodulans для детекции метанола. Материалы VII Московского Международного Конгресса «Биотехнология: Состояние и Перспективы Разбития» 19-22 Марта 2013 г. М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2013-с. 23-24.

2. Kuznetsova Т.A. Amperometric detection of methanol and formaldehyde with biosensor based on methylobacteria biocatalysts. Materidly IX mez-inarodni vedecko - praktickd konference «Aktualni vymozenosti vedy -2013». - Dil 16. Biologicke vedy. Ekologie. Zemepis a geologie. Zverolekafstvi: Praha. Publishing House «Education and Science» s.r.o -32-33 stran.

3. Кузнецова T.A. Биокатализаторы на основе метилотрофных бактерий и выделенных из них ферментов как распознающие элементы амперометрических биосенсоров. Биология будущего: традиции и новации: Материалы II Всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых. Екатеринбург, 1-5 октября, 2012 г. -Екатеринбург: Изд-во Урал, ун-та, 2012. - с. 112-115

4. Кузнецова Т.А. Амперометрический биосенсор с биокатализаторами на основе метилобактерий для мониторинга срсоединений. Материалы междунар. науч. конф. «Достижения и перспективы развития био-

технологии» (Саранск, МГУ им. Н.П. Огарева, 3-5 октября 2012 г.) -Саранск: Типография ООО «Мордовия - Экспо», 2012. - с. 27-28

5. Ершова O.E., Кузнецова Т.А. Изучение окислительной активности метилотрофных бактерий. Научно-теоретический журнал «Успехи Современного Естествознания» № 8, 2011 - с. 36-37.

6. Кузнецова Т.А., Доронина Н.В., Понаморева О.Н. Аэробные метило-трофные бактерии как биораспознающие элементы биосенсоров. Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнолигия: состояние и перспективы развития» - Москва, 2011 - Часть 2, с.43-44.

7. Кузнецова Т.А., Ершова O.E. Биокатализаторы на основе биопрепаратов метилотрофных бактерий. Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2011» -Тула-2011 -С.21

8. Кузнецова Т.А., Чибисов В.А. Изучение особенностей окисления субстратов целыми клетками метилотрофных бактерий в аэробных условиях. Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2011»-Тула, 2011 -С.16

9. Кузнецова Т.А., Чибисов В.А. Окисление субстратов целыми клетками метилотрофных бактерий в аэробных условиях. Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биологический мониторинг природно-техногенных систем». -Киров, 2011. - 4.2, стр. 140.

Ю.Кузнецова Т.А., Алферов В.А. Метилотрофные бактерии как перспективные биокатализаторы в биораспознающих элементах биосенсоров. 14-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2010. - Сборник тезисов. Том 1, с. 264.

П.Кузнецова Т.А. Биокаталитические свойства метилотрофных бактерий Methylovorus mays и Methylobacterium mesophilicum в присутствии медиаторов электронного транспорта. Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксико-логия-2010» - Тула - 2010 - С. 14

12.Ершова O.E., Акатова Е.В., Кузнецова Т.А. Определение окислительной активности метилотрофных бактерий Methylovorus mays KYK и Methylobacterium mesophilicum JCM 2829 в зависимости от фаз роста. Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2010» - Тула -2010-C.il

Подписано в печать:

03.09.2013

Заказ № 8708 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Кузнецова, Татьяна Александровна, Москва

ФГБОУ ВПО «Тульский государственный университет»

На правах рукописи

04201361986

/

КУЗНЕЦОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ И ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НИХ ФЕРМЕНТОВ КАК РАСПОЗНАЮЩИЕ ЭЛЕМЕНТЫ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ БИОСЕНСОРОВ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель

кандидат химических наук, доцент Понаморева Ольга Николаевна

МОСКВА - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.....................................................................................9

1.1. Метилотрофия и биотехнология.......................................................................................9

1.1.2.Особенности метаболизма метилобактерий................................................................10

1.1.3.Биотехнологический потенциал метилобактерий.......................................................13

1.2. Метанолдегидрогеназа - ключевой фермент метаболизма метилобактерий.........16

1.2.1. Характеристика МДГ....................................................................................................16

1.2.2. Структура МДГ..............................................................................................................18

1.2.3. Механизм действия МДГ..............................................................................................20

1.2.4. Пути переноса электронов и протонов от МДГ.........................................................25

1.3. Амперометрические медиаторные биосенсоры............................................................26

1.3.1. Биосенсоры на основе клеток микроорганизмов.......................................................31

1.3.2.Биосенсоры на основе Р(^С)-дегидрогеназ...................................................................38

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ....................................................................41

2.1. Бактериальные штаммы..................................................................................................41

2.2. Условия культивирования...............................................................................................41

2.3. Изучение роста метилобактерий.....................................................................................41

2.4. Электрохимические измерения.......................................................................................41

2.4.1. Кислородный биосенсор...............................................................................................41

2.4.2. Медиаторный биосенсор...............................................................................................42

2.5.Выделение и очистка МДГ МеШуЬЬа^епит пойи1ат.................................................44

2.5.1. Разрушение клеток ультразвуком................................................................................44

2.5.2. Фракционирование сульфатом аммония.....................................................................44

2.5.3. Анионообменная хроматография.................................................................................45

2.5.4. Хроматография на геле гидроксиапатита...................................................................45

2.5.5. Ультрафильтрация и замена буфера............................................................................45

2.5.6. Катионообменная ВЭЖХ..............................................................................................45

2.6. Характеристика МДГ........................................................................................................46

2.6.1. Определение активности..............................................................................................46

2.6.2. Электрофорез в полиакриламидном геле....................................................................46

2.6.3. Определение молекулярной массы белков.................................................................47

2.6.4.Определение изоэлектрической точки р1.....................................................................47

2.7. Газовая хроматография....................................................................................................49

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................50

3.1. Физиология роста метилобактерий................................................................................52

3.1.1. Динамика роста метилобактерий.................................................................................52

3.1.2. Характеристика физиологических параметров роста метилобактерий...................56

3.1.3. Потребление метанола в динамике роста метилобактерий.......................................57

3.2. Окисление субстратов метилобактериями в аэробных условиях............................59

3.2.1.Спектр окисляемых субстратов клетками метилобактерий в аэробных условиях. .59

3.2.2. Мониторинг дыхательной активности метилобактерий при хранении...................60

3.2.3. Определение параметров сенсора на основе метилобактерий..................................61

3.3. Окисление субстратов клетками и ферментными фракциями метилобактерий в присутствии медиаторов электронного транспорта..........................................................65

3.3.1. Определение активности метилобактерий на разных фазах роста...........................66

3.3.2. Эффективность медиаторов электронного транспорта в процессе биоэлектрохимического окисления метанола клетками метилобактерий.........................68

3.3.3. Биоэлектрохимическое окисление субстратов клетками и ферментными фракциями метилобактерий в присутствии ферроцена.......................................................75

3.3.3.1. Селективность медиаторных сенсоров на основе метилобактерий..................76

3.3.3.3. Долговременная стабильность сенсоров..............................................................83

3.3.3.4. Калибровочные зависимости медиаторных сенсоров на формальдегид..........85

3.3.4.5. Аналитические и метрологические характеристики медиаторных сенсоров на основе клеток и ферментных фракций метилобактерий.................................................89

3.4.0чистка и характеристика МДГ Methylobacterium nodularis......................................92

3.4.1. Очистка МДГ Mb. nodularis..........................................................................................93

3.4.2. Характеристика МДГ Mb.nodulans..............................................................................96

3.4.2.1. Выбор оптимальных условий хранения МДГ Mb. nodularis..............................98

3.4.2.2. Изучение температурной и рН-стабильности МДГ Mb. nodulans.....................99

3.4.2.3. Зависимость активности МДГ от рН и температуры........................................100

3.4.2.4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность МДГ Mb. nodulans........102

3.4.2.5. Субстратная специфичность МДГ Mb. nodulans...............................................107

3.5. МДГ Mb. nodulans как биокатализатор амперометрического медиаторного биосенсора.................................................................................................................................110

3.5.1. Иммобилизация МДГ Mb. nodulans на поверхности графито-пастового электрода.

.................................................................................................................................................110

3.5.2.3ависимость ответов медиаторного МДГ-сенсора от природы буферного раствора и рН среды..............................................................................................................................112

3.5.3. Стабильность медиаторного сенсора на основе иммобилизованной МДГ Mb. nodulans..................................................................................................................................113

3.5.4. Определение содержания метанола с помощью медиаторного сенсора на основе иммобилизованной МДГ Mb. nodulans...............................................................................114

3.6. Сравнительный анализ характеристик медиаторных биосенсоров......................118

ВЫВОДЫ..................................................................................................................................120

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................121

БЛАГОДАРНОСТИ................................................................................................................136

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А540 - оптическая плотность при длине волны 540 нм

Р(ЗС2 - пирролохинолинхинон

БОБ - додецилсульфат натрия

АО - алкогольоксидаза

ВПК - биологическое потребление кислорода

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГА - гидроксиапатит

ГЖХ - газо-жидкостная хроматография

ДЭ АЭ - диэтиламиноэтил

ДББХ -2,5-дибром-1,4-бензохинон

ДТТ - дитиотрейтол

ДХФИФ - 2,6-дихлорфенолиндофенол

КОЕ - колониеобразующие единицы

КФБ - калий фосфатный буферный раствор

МДГ - метанолдегидрогеназа

МЭС - 2-(Ы-морфолино)этансульфоновая кислота

НАД(Ф)+ - никотинамидадениндинуклеотид(фосфат), окисленный

НАД(Ф)Н - никотинамидадениндинуклеотид(фосфат), восстановленный

РБФ - рибулозо-1,6-бисфосфат

РМФ - рибулозомонофосфат

Трис - трис[гидроксиметил]аминометан

ПААГ - полиакриламидный гель

ПВП - поливинилпирролидон

ПЭИ - полиэтиленимин

ПХМБ - п-хлормеркурибензоат

ФА- формальдегид

ФАД - флавинадениндинуклеотид

ФАДГ - формальдегиддегидрогеназа

ФМС - феназинметосульфат

ФЦ - ферроцен

ФЭС - феназинэтосульфат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Аэробные метилобактерии, использующие метанол, и другие окисленные или замещенные производные метана в качестве источников углерода и энергии, составляют особую физиологическую группу микроорганизмов, обладающих уникальной способностью строить клеточные компоненты из восстановленных С1-соединений (Троценко с соавт., 2010). Метилобактерии все более активно используются в промышленной биотехнологии, где одним из ключевых факторов, определяющих стоимость продукта, является природа и цена источника углерода. Метанол, являясь доступным непищевым сырьем, служит источником углерода при культивировании продуцентов кормового белка, для биотехнологических процессов производства биоразлагаемых полимеров, биопротектора - эктоина и других продуктов биосинтеза (Троценко и Торгонская 2012).

Для эффективного ведения биотехнологических процессов требуется постоянный мониторинг потребления исходного субстрата и образования интермедиатов. В последнее десятилетие для непрерывного аналитического контроля биотехнологических процессов все более активно применяют биосенсоры (Решетилов 2005; Bäcker et al., 2011), которые характеризуются простотой, низкой стоимостью, экспрессностью и высокой чувствительностью, в отличие от стандартных методов определения С1-соединений. Большинство биосенсоров основаны на электрохимическом типе детекции и содержат клетки или ферменты в качестве биокатализатора (Su et al., 2011). Значительный прогресс в создании амперометрических биосенсоров стал возможен благодаря использованию в них медиаторов - соединений, способных к переносу электронов от активных центров ферментов на электрод. Медиаторы электронного транспорта могут взаимодействовать не только с выделенными ферментами in vitro, но и с внутриклеточными ферментами in vivo.

Ключевым фактором переноса электронов на электрод является мембранная локализация дегидрогеназ, связанных с ферментами дыхательной цепи бактерий. Наиболее часто в качестве биокатализаторов в медиаторных биосенсорах используют уксуснокислые бактерии рода Gluconobacter, обладающие активностями основных ферментов катаболизма углеводов и спиртов - пирролохинолинхинон (Р(3<3)-зависимых альдоз- и алкогольдегидрогеназ, взаимодействующих с медиаторами переноса электронов (Tkac et al., 2009; Инджгия с соавт., 2011). Перспективными биокатализаторами для разработки биосенсоров могут служить клетки метилобактерий, которые, подобно уксуснокислым бактериям, имеют периплазматическую локализацию PQQ- дегидрогеназ (Goodwin and Anthony 1995). Основным ферментом первичного С i-метаболизма у метилотрофных прокариот является периплазматическая PQQ-метанолдегидрогеназа

(МДГ, КФ 1.1.2.7), катализирующая окисление метанола до формальдегида (ФА) и передающая электроны на специфический кислый цитохром cl (Гвоздев и др. 2012). Кофактор PQQ, прочно связанный с апоферментом, катализирует рН-зависимую двухэлектронную/протонную реакцию окисления метанола при относительно низких положительных потенциалах, что выгодно отличает МДГ от НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы (КФ 1.1.1.1). Важным преимуществом МДГ является независимость реакции от кислорода, в отличие от ФАД-алкогольоксидазы дрожжей (КФ 1.1.3.13) (Ikeda and Капо 2003; Misra et al., 2012). Способность окислять токсичные одноуглеродные соединения делает возможным использование этих бактерий в качестве биокатализаторов при создании амперометрических биоаналитических систем мониторинга уровня Ci- соединений. Следует отметить, что взаимодействие ферментных систем метилобактерий in vivo с искусственными акцепторами электронов ранее практически не исследовалось.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - изучение биокаталитических свойств клеток и ферментов аэробных метилобактерий как основы функционирования амперометрического медиаторного биосенсора для определения содержания Ci-соединений. Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

1. Определение основных физиологических параметров роста метилобактерий как потенциальных биокатализаторов при разработке амперометрических биосенсоров.

2. Оценка биокаталитических свойств метилобактерий в условиях аэробного окисления субстратов с помощью амперометрической биосенсорной системы на основе кислородного электрода.

3. Изучение биоэлектрохимического окисления метанола клетками метилобактерий в зависимости от фазы роста при использовании в качестве медиаторов электронного транспорта редокс-соединений разных классов и определение их эффективности.

4. Определение аналитических и метрологических параметров амперометрического медиаторного биосенсора при использовании клеток, цитоплазматических и мембранных фракций метилобактерий в качестве биокатализаторов.

5. Выделение, очистка и характеристика МДГ; разработка на ее основе амперометрического медиаторного биосенсора для количественного определения метанола.

Научная новизна.

Впервые показана возможность переноса электронов в биоэлектрохимических системах «метанол - клетки метилобактерий - медиаторы электронного транспорта -

электрод» и определены индексы эффективности медиаторов 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ), ферроцена (ФЦ), 2,5-дибром-п-бензохинона (ДББХ).

Выявлен эффект изменения субстратной специфичности при окислении спиртов различного строения, ФА и метановой кислоты клетками, цитоплазматическими и мембранными фракциями метилобактерий в присутствии ФЦ. Мембранные фракции Methylobacterium dichloromethanicum в данных условиях специфичны к ФА, что имеет существенное значение при создании селективных биосенсорных систем для анализа многокомпонентных смесей.

Впервые очищена и охарактеризована МДГ Methylobacterium nodularis. Установлено, что фермент является димером (м. м. нативного белка ~ 70 кДа), состоящим из большой (60 кДа) и малой (6 кДа) субъединиц, PQQ- зависимым белком, с pi - 8,7 и константой Михаэлиса к метанолу Км = 70 мкМ. Фермент обладает высокой стабильностью при хранении.

Модификация графито-пастовых электродов гидроксиапатитом (ГА) приводила к увеличению тока биоэлектрохимического окисления метанола иммобилизованной МДГ в присутствии ФЦ, не влияя на окислительно-восстановительные свойства медиатора.

Практическая значимость.

Комплексный подход по оценке биокаталитических свойств метилобактерий с использованием методов, применяемых в биосенсорной области, а также анализ и обобщение полученных результатов выявили способность метилобактерий участвовать в биоэлектрохимическом окислении С1-соединений в присутствии акцепторов электронов, что может быть использовано в качестве научной основы при разработке высокочувствительных и экспрессных электрохимических биосенсоров для количественного определения метанола и ФА.

Разработан макет биосенсорного анализатора на основе графито-пастового электрода с иммобилизованной МДГ Mb. nodularis и медиатора - ФЦ для определения концентрации метанола в культуральной среде метилобактерий при ведении биотехнологических процессов. Полученные результаты подтверждают возможность применения действующего макета биосенсорного анализатора как прототипа опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.

Результаты работы внедрены в учебный процесс: поставлена новая лабораторная работа «Определение рабочих параметров функционирования амперометрического медиаторного биосенсора на основе клеток и мембранной фракции метилобактерий» по курсам «Биосенсоры» и «Биотехнология защиты окружающей среды» для студентов специальностей 020100 Химия и 240901 Биотехнология.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 19-22 марта 2013 г.) {диплом за IIIместо, медаль конкурса); Всероссийских конференциях с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология» (Тула, 2010, 2011 и 2012 гг. (диплом победителя конкурса)); Общероссийской студенческой научной конференции «Студенческий научный форум 2011» (15 - 20 февраля 2011 г.); 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 г.); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 21-25 марта 2011 г.) {диплом, медаль конкурса)-, Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биологический мониторинг природно-техногенных систем» (Киров, 29-30 ноября 2011 г.), Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации» (Екатеринбург, 1-5 октября 2012 г.), Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, МГУ им. Н.П. Огарева, 3-5 октября 2012 г.).

По теме диссертации опубликованы 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК и 12 сообщений в форме тезисов и материалов конференций.

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы вып�