Закономерности функционирования ферментных систем микроорганизмов как биокатализаторов в амперометрических биосенсорах

Понаморева, Ольга Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Закономерности функционирования ферментных систем микроорганизмов как биокатализаторов в амперометрических биосенсорах
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Закономерности функционирования ферментных систем микроорганизмов как биокатализаторов в амперометрических биосенсорах"

На правах рукописи

! /

л .Г

ПОНАМОРЕВА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ МИКРООРГАНИЗМОВ КАК БИОКАТАЛИЗАТОРОВ В АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ БИОСЕНСОРАХ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

14 0|(Г 2013 005535416

МОСКВА-2013

005535416

Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета ФГБОУ ВПО «Тульский государственный университет»

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией биосенсоров (ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН) Решетилов Анатолий Николаевич

Официальные оппоненты:

профессор, доктор химических наук, заведующий кафедрой технологии химико-фармацевтических и косметических средств (ФГБОУ ВПО «Российский химико-технологический университет им. Д.И.Менделеева») Авраменко Григорий Владимирович

профессор, доктор химических наук, профессор кафедры химии (ФГБОУ ВПО «Липецкий государственный технический университет») Ермолаева Татьяна Николаевна

доктор биологических наук, заведующий лабораторией масс-спектрометрии (ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН) Зякун Анатолий Маркович

Ведущая организация:

ФГБУН Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита диссертации состоится 11 ноября 2013 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова» по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова» по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

Ежегодно в окружающую среду выбрасываются сотни новых загрязняющих веществ с неизученным влиянием на человека. Ужесточение требований к их нормированию приводит к необходимости проведения сложных и дорогостоящих исследований. Физико-химические методы анализа позволяют с высокой точностью и селективностью определять индивидуальные вещества, однако не дают прямой информации о биологической опасности ксенобиотиков и не позволяют адекватно оценить действие веществ на окружающую среду и на человека, так как не учитывают синергические, антагонистические эффекты и потенциальные эффекты неизвестных соединений. Одним из приоритетных направлений биотехнологии является разработка эффективных методов биотестирования для оценки токсичности различных объектов. Получаемая с помощью методов биотестирования информация характеризуется интегральным характером восприятия и отражения всех токсических воздействий, обусловленных совместным присутствием токсикантов. Микроорганизмы - это живые датчики, реакция которых зависит от взаимодействия целой группы факторов, отражая множество тонких и важных изменений в окружающей среде, поэтому целые клетки микроорганизмов можно использовать как тест-объекты для биотестирования. Аналитическим сигналом при этом является изменение состояния жизнедеятельности клеток, то есть их реакция на раздражитель. Сопряжение биологического компонента с физико-химическим преобразователем позволяет разрабатывать не только новые методы биотестирования, но и биоаналитические системы для получения количественной информации о состоянии окружающей среды - микробные биосенсоры. При этом техническое решение методов анализа с применением биосенсоров существенно упрощено по сравнению с физико-химическими методами анализа в специализированных лабораториях или биологическими методами оценки токсичности. По имеющимся прогнозам мировой рынок биосенсоров достигнет 12 миллиардов долларов США к 2015 году, при этом сектор рынка биосенсоров для мониторинга окружающей среды неуклонно растет и составит в 2016 году 14,6% от всего рынка биосенсоров по сравнению с 12,6% в 2009 году. Исследование закономерностей функционирования микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков и их ферментных систем является необходимым этапом при разработке биосенсоров для экологического мониторинга.

Клетки микроорганизмов — электрохимические станции, которые преобразуют энергию химических связей органических соединений в энергию восстановительных потенциалов, что лежит в основе функционирования биотопливных элементов и медиаторных биосенсоров. При разработке таких систем широко используется способность некоторых соединений с обратимыми окислительно-восстановительными свойствами (медиаторов электронного транспорта) к быстрому переносу на электрод электронов, генерируемых в процессе окисления субстратов ферментами или ферментными системами клеток микроорганизмов. Исследование вопроса о том, какой тип медиатора или какое его свойство обеспечивает быстрый перенос электронов от ферментов к электроду

в системах с целыми клетками микроорганизмов, имеет не только теоретическое значение, но важно для разработки эффективных микробных топливных элементов и медиаторных биосенсоров электрохимического типа, в том числе для экологического мониторинга

Решение проблем и вопросов, позволяющих сократить пробелы в недостатке знаний о биохимических и биофизических принципах функционирования биоэлектрохимических систем на основе целых клеток микроорганизмов, послужит созданию надежных, высокочувствительных и селективных методов и устройств биодетекции для решения задач экологического мониторинга, что и определило выбор направления исследований в данной работе. В общей постановке данная задача не может быть рассмотрена в силу значительного многообразия микроорганизмов и их ферментных систем. В связи с этим исследование в диссертационной работе ограничено анализом функционирования ферментных систем уксуснокислых бактерий &исопоЬас<ег, способных к быстрому переносу электронов на медиаторы и бактерий-деструкторов капролактама. Выявленные закономерности медиаторного биоэлектрокатализа и аэробной деградации ксенобиотиков использованы при разработке биосенсоров для экологического контроля. На примере разработанного биосенсора оценки токсичности товаров народного потребления на основе других микроорганизмов, избирательно чувствительных к определенному соединению или широкому спектру соединений, показана возможность создания унифицированной биосенсорной системы для решения других практических задач.

Цель работы: решение комплекса научно-практических задач, связанных с разработкой надежных и высокочувствительных амперометрических биосенсоров на основе целых клеток микроорганизмов и аналитических биотехнологий в области экологического мониторинга.

Для реализации цели в рамках этой работы были поставлены следующие основные задачи:

- построить экспериментальные модели для исследования процессов переноса заряда в системе «окисляемое соединение — бактерии - медиатор -электрод»;

- разработать методологию оценки эффективности переноса электронов от ферментов иммобилизованных бактерий на электрод в присутствии медиаторов электронного транспорта, основанную на использовании амперометрического метода, для выбора сочетания «окисляемое соединение - бактерии - медиатор» при разработке амперометрических микробных биосенсоров и биотопливных элементов;

- выявить закономерности аэробной деградации капролактама бактериями с различным сочетанием «бактериальный хозяин - САР-плазмида» при разработке биосенсоров для экологического контроля;

- выяснить роль ферментов деградации капролактама в трансформации низкомолекулярных олигомеров аминокапроновой кислоты бактериями-деструкторами капролактама;

- исследовать возможность создания унифицированной биосенсорной системы, на основе которой возможна разработка серии приборов для экологического мониторинга водных сред, унифицированность системы основана на использовании различных штаммов микроорганизмов, избирательно чувствительных к определенному соединению или широкому спектру соединений;

- разработать макеты биосенсоров для экологического мониторинга, которые могут быть использованы в научных исследованиях, в учебном процессе и как прототипы опытных образцов приборов для серийного выпуска.

Научная новизна работы заключается в разработке научно-методологического подхода к созданию надежных и высокочувствительных электрохимических биосенсоров на основе целых клеток микроорганизмов и аналитических биотехнологий в области экологического мониторинга. В рамках данной работы получены оригинальные данные о закономерностях функционирования ферментных систем уксуснокислых бактерий и бактерий-деструкторов капролактама. Все результаты исследования являются новыми. В том числе:

На основе количественного анализа процессов, протекающих в микробных медиаторных биосенсорах, установлено, что окисление в биоэлектрохимических системах «глюкоза/этанол — & охусЬт — медиатор электронного транспорта — электрод» можно рассматривать как двухсубстратную ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понге, что обусловлено функционированием мембранлокализованных ферментов. Эта модель позволяет провести количественную оценку эффективности медиаторов электронного транспорта и биокатализаторов в медиаторных биосенсорах. На примере производных ферроцена показано, что эффективность медиаторов зависит от электронных эффектов заместителей.

Впервые показана возможность применения мембранных фракций разрушенных клеток уксуснокислых бактерий в качестве биораспознающего элемента при создании медиаторного биосенсора для определения индекса БГЖ. Это открывает новые возможности при разработке чувствительных, недорогих стабильных биосенсорных систем для экологического контроля.

Впервые показана возможность быстрой оцегаси окислительной активности бактериальных штаммов с различными комбинациями «бактериальный хозяин -плазмида деградации». Показано, что биосенсорная регистрация дыхательной активности иммобилизованных клеток микроорганизмов обеспечивает оперативность и надежность получаемых данных.

Впервые выявлен путь биотрансформации низкомолекулярных линейных олигомеров е-аминокапроновой кислоты, который включает реакции окислительного переаминирования до соответствующих дикарбоновых кислот под действием ферментов катаболизма капролактама. Установлено, что процесс трансформации линейных олигомеров находится под генетическим контролем САР-плазмид.

Впервые сформулированы принципы, положенные в основу методики для оценки токсичности товаров бытового назначения из полимерных и текстильных материалов с помощью электрохимического микробного биосенсора.

Практическая значимость результатов работы.

Описанные закономерности функционирования ферментных систем уксуснокислых бактерий &охусйяи^ в условиях электрокаталитического окисления субстратов в присутствии медиаторов электронного транспорта формируют теоретическую основу для создания микробных биосенсоров и биотопливных элементов.

Выявленная способность бактерий - деструкторов капролактама участвовать в частичной трансформации низкомолекулярных линейных олигомеров за счет широкой субстратной специфичности ферментов пути деградации капролактама имеет практическое значение для разработки технологий биологической очистки отходов производств капролактама.

Разработана новая методика биотестирования - методика оценки токсичности товаров народного потребления из полимерных и текстильных материалов. Методика апробирована в испытательных лабораториях, осуществляющих контроль товаров народного потребления.

Макеты биосенсоров проточно-инжекционного и юоветного типов для определения ВПК, содержания капролактама, оценки токсичности товаров народного потребления могут служить прототипами опытных образцов приборов для серийного освоения. Разрабатываемые биоаналитические системы могут использоваться для выполнения ежедневных текущих анализов проб воды и стоков на предприятиях системы водоочистки РФ, Станциями санитарно-эпидемиологического контроля, службами МЧС, экологическими структурами предприятий химической и нефтеперерабатывающей промышленности. По итогам апробация биосенсора для оценки токсичности получено экспертное заключение из ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области» о том, что биосенсорные анализаторы на основе термооксиметра и иммобилизованных микроорганизмов могут быть использованы для оснащения лабораторий Роспотребнадзора и различных экологических структур.

В шести патентах, заявленных в Российской Федерации, отражены принципы и методы функционирования биосенсоров на основе целых клеток микроорганизмов для определения суммарного содержания легкоутилизируемых субстратов, БПК, токсичных органических соединений, капролактама. Показано превосходство разработанных биосенсоров по своим характеристикам над известными аналогами.

Биосенсорные установки функционируют в лабораториях университета и используются в ходе обучения студентов по направлениям 020100-Химия, 240700-Биотехнология, 020400-Биология, что позволяет совершенствовать экспериментальную и приборную базу университета и повысить качество образования.

Связь с крупными паучпыми программами и проектами:

Представленные результаты получены в ходе исследований, проводившихся в 2001-2010 годах в рамках следующих научных программ и проектов, участником

и руководителем которых была соискатель: гранты РФФИ 01-04-96023. «Закономерности функционирования ферментных систем бактериальных клеток в условиях естественного и электрокаталитического окисления субстратов» (исполнитель, 2001-2003), 04-04-96705 «Изучение процессов окисления ксенобиотиков бактериальными штаммами на основе их дыхательной активности» (исполнитель, 2004-2005), 09-03-97528 «Эффективность медиаторов электронного транспорта в процессах электрокаталитического окисления субстратов ферментными системами микроорганизмов» (исполнитель, 2009), 13-03-97514 «Закономерности и механизмы преобразования энергии микробного метаболизма в электрическую в системах на основе метилотрофных и уксуснокислых бактерий в сочетании с медиаторами электронного транспорта» (руководитель, 2013-2015); ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники 2002-2006 годы»: г/к 02.438.11.7021 «НОЦ Экобиотехнология» (исполнитель, 2005-2006), г/к 02.457.11.7066 «Разработка и подготовка промышленного выпуска биосенсорных анализаторов для экспресс-оцепки содержания органических/токсичных соединений в водных средах» (исполнитель, 2006), АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП 2.1.1.7789 «Сравнительное изучение закономерностей функционирования ферментных систем бактериальных клеток в условиях естественного и электрокаталитического окисления субстратов» (исполнитель, 2006-2008); ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»: г/к 02.740.11.0296 «Молекулярные основы получения новых биопрепаратов, биосенсоров и биотопливных элементов с использованием аэробных микроорганизмов» (исполнитель, 2009-2011), г/к П 976 «Закономерности функционирования микроорганизмов-деструкторов

ксенобиотиков как биокатализаторов при разработке биосенсоров для экологического мониторинга» (руководитель, 2009-2011).

Апробация работы. Результаты диссертации представлялись и обсуждались на Международных конгрессах по биосенсорам (Гранада, Испания, 2004; Глазго, Великобритания, 2010), Международных конгрессах по биотехнологии (Москва, 2004, 2007, 2009, 2011, 2013), Международной конференции по биодеградации ксенобиотиков (Минск, 2003), Международном конгрессе по аналитическим наукам (Москва, 2004), Международной конференции по крахмалу (Москва - Краков, 2003), Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология» (Томск, 2006), Международной конференции по фундаментальным основам инженерных наук (Москва, 2006), Международной конференции «Наукоемкие химические технологии» (Волгоград, 2008 г.; Иваново 2010 г.), Международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010 г.), 5-ом Европейской конференции по биоремедиации (Крит, Греция, 2011).

Основные положения, выносимые па защиту; 1. Выявленные закономерности функционирования ферментных систем уксуснокислых бактерий С.охус1ат в условиях биоэлектрохимического окисления субстратов в присутствии медиаторов электронного транспорта, как

теоретическая основа разработки медиаторных биосенсоров и биотопливных элементов.

2. Предложенный подход для быстрой оценки окислительной активности бактериальных штаммов с помощью биосенсоров на основе иммобилизованных микроорганизмов, который обеспечивает оперативность и надежность получаемых данных и является эффективным инструментом оценки деградативных свойств аэробных микроорганизмов.

3. Выявленный путь биотрансформации низкомолекулярных линейных олигомеров в-аминокапроновой кислоты: окислительное переаминирование до соответствующих дикарбоновых кислот под действием ферментов катаболизма капролактама, гены которых локализованы на САР-плазмидах, что имеет большое практическое значение для разработки технологий биологической очистки отходов производств капролактама и полимеров на его основе.

4. Характеристики разработанных макетов биосенсоров на основе разных штаммов микроорганизмов для экологического мониторинга (БПК, суммарного содержания Сахаров и спиртов, определения содержания капролактама, оценки токсичности товаров народного потребления), которые могут служить прототипами опытных образцов приборов для серийного освоения.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах работ: формулирование проблемы, постановка целей и задач проведенных исследований, планирование экспериментов, руководство ими, интерпретация, анализ и обобщение экспериментальных результатов, подготовка научных публикаций. В диссертации изложены результаты исследований, выполненных при непосредственном участии автора, а также дипломниками и аспирантами, работавшими под научным руководством автора или получавших научные консультации автора, о чем свидетельствуют совместные научные публикации по теме диссертации. Под руководством автора защищены две диссертации на соискание ученой степени кандидата наук. Личный вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоит в обобщении и моделировании результатов по биохимическим и биофизическим аспектам функционирования биоэлектрохимических систем на основе бактерий ЫисопоЬааег, биохимическому пути трансформации капролактама; разработке подходов к использованию целых клеток микроорганизмов для создания биосенсоров; обоснование основных направлений их практического применения.

Масс-спектрометрическое исследование процессов биотрансформации олигомеров аминокапроновой кислоты, подтверждающее предположения автора, проведены сотрудниками Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН. При разработке методики по оценки токсичности товаров народного потребления токсикологические исследования осуществлены сотрудниками ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области».

Публикации. Материалы диссертации изложены в 101 публикации, в том числе в 61 статье, включая обзоры, монографии и главы в книгах, 6 патентах РФ. В автореферате представлены избранные публикации, в которых опубликованы основные положения и результаты работы.

Структура работы и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 285 страницах, состоит из введения, 4-х глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 358 ссылок, и приложения в виде списка публикаций автора. Работа содержит 36 таблиц и 85 рисунков. Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цели исследования, определены научная новизна и практическая значимость работы. В каждой главе представлены анализ литературы по рассматриваемым вопросам; результаты экспериментальных исследований и их обсуждение. В главе 3 приведено описание и характеристики разработанных макетов биосенсоров. В главе 4 суммированы основные экспериментальные методы, использованные в работе.

ГЛАВА 1. БИОЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ И СПИРТОВ УКСУСНОКИСЛЫМИ БАКТЕРИЯМИ GLUCONOBACTER

OXYDANS

1.1. Потенциал бактерий Gluconobacter oxydans как биокатализаторов для разработки медиаторных биосенсоров и биотопливных элементов

Бактерии рода Gluconobacter принадлежат к семейству уксуснокислых микроорганизмов Acetobacteraceae, вид Gluconobacter oxydans — строгие аэробы. Важными особенностями этих бактерий являются высокая оперативность цепи электронного транспорта, низкая эффективность роста при высокой скорости реакций неполного окисления субстратов, накопление продуктов окисления в культуральной среде и стереоспецифичность ферментов, участвующих в этих превращениях. Большинство мембранных ДГ содержат простетическую группу PQQ и цитохромсодержащую субъединицу, или связаны с цитохромами дыхательной цепи, их активные центры ориентированы в периплазматическое пространство. Это обеспечивает лёгкий доступ искусственных акцепторов

электронов (медиаторов электронного транспорта) к активным центрам ферментов, что свидетельствуют о потенциале использования целых клеток уксуснокислых бактерий и их ферментов для создания медиаторных амперометрических биосенсоров и БТЭ. (рис. 1).

В этой связи было

Рис. 1. Схематическая модель процесса окисления субстрата ферментами

бактериальных клеток при участии искусственных акцепторов электронов (медиаторов электронного транспорта)

проведено

всестороннее изучение возможности использования редокс-соединений разных классов в качестве медиаторов переноса электронов от ферментных систем уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans на электрод. Особое внимание

уделялось соединениям ферроценового ряда, которые зарекомендовали себя как наилучшие медиаторы в системах на основе ферментов. Характерной чертой ранее проводимых работ в этой области является их направленность на решение конкретных прикладных задач по созданию селективных и чувствительных анализаторов для оценки концентрации глюкозы, этанола и других углеводов и спиртов (Ткас). Таким образом, особую ценность приобретают исследования, направленные на углубленное изучение процессов взаимодействия бактериальных клеток и медиаторов электронного транспорта, поскольку они могут представить новые данные об особенностях использования уксуснокислых бактерий как биокатализатора при разработке медиаторных биосенсоров и биотопливных элементов.

1.2. Взаимодействие ферментных систем бактерий Gluconobacter oxydons с искусственными акцепторами электронов (медиаторами электронного

транспорта)

Для определения оксидоредуктазной активности в биологических системах часто используют спектрофотометрический метод, который основан на восстановлении ферментами редокс-соединений — искусственных акцепторов электронов. В работе спектрофотометрический метод применили для определения скорости восстановления целыми клетками бактерий растворимых редокс-красителей.

1.2.1. Конкуренция кислорода и искусственных акцепторов за электроны

мембранных оксидоредуктаз бактерий Gluconobacter oxydans.

Исследования проводили в атмосфере азота и в атмосфере воздуха для выявления конкуренции между естественным акцептором электронов -кислородом и искусственными акцепторами электронов от редокс-центров бактерий Gluconobacter oxydans sbsp. industrius B-1280. После первой минуты скорости восстановления ДХФИФ и ФМС в атмосфере воздуха становятся равны скоростям их восстановления в атмосфере азота. Это обусловлено интенсивным дыханием уксуснокислых бактерий, что приводит к уменьшению содержания кислорода в кювете в течение короткого времени. Редокс-красители конкурируют с кислородом за электроны дыхательной цепи бактерий, однако скорость окисления глюкозы при участии кислорода превышает скорость его диффузии к бактериям. Таким образом, в данном случае нет необходимости искусственно создавать анаэробные условия в анодном отделении, как это обычно принято. Это следует учитывать при разработке биотопливных элементов на основе уксуснокислых бактерий.

1.2.2. Эффективность искусственных акцепторов электронов в системе "глюкоза - G. oxydans — акцептор".

Вопрос о том, какой тип молекул медиатора или какое его свойство обеспечивает быстрый перенос электрона в системах с микроорганизмами, относится к числу трудноразрешимых. Некоторое представление о механизме взаимодействия клеток с медиатором можно получить, анализируя кинетику восстановления редокс-соединений различного строения.

Для выявления влияния природы редокс-красителя на его способность взаимодействовать с оксидоредуктазами целых клеток уксуснокислых бактерий

исследовали кинетику восстановления хинонов (БХ), индофенолов (ДХФИФ), феназинов (ФМС) и неорганических комплексов Fe+3 на примере ГЦФ. Для определенного микроорганизма и ИАЭ скорость его восстановления вполне воспроизводима и обнаруживает лишь небольшие колебания. Эффективность ИАЭ возрастает в ряду: ДХФИФ-ФМС 2 (1,8мкМ-с') > ФМС (1,0мкМ-с"') > БХ (0,8мкМ-с"') ДХФИФ (0,5мкМ-с"') > ГЦФ (меньше 0,1 мкМ-с"') (рис. 2). Композиция ДХФИФ-ФМС восстанавливается бактериями G. oxydans с наибольшей скоростью. Каждый их этих акцепторов электронов способен взаимодействовать с разными ферментами дыхательной цепи бактериальных клеток, что обеспечивает более эффективный перенос электронов в целом. БХ и ФМС восстанавливаются микроорганизмами с близкими скоростями, эти соединения легко проникают через мембраны бактериальных клеток благодаря своей липофильности.

Рис. 2. Скорости восстановления ИАЭ (0,ЗмМ) бактериями G. oxydans (глюкоза , 50мМ); 1 -скорость восстановления медиаторов до исчерпания в системе кислорода, 2 - скорость восстановления медиаторов после исчерпания в системе кислорода (данные приведены с учетом количества переносимых электронов ДХФИФ, ФМС, БХ -двухэлектронные переносчики, ГЦФ - одноэлектронный)

Феррицианид (ГЦФ) взаимодействует с активными центрами дыхательной цепи Gluconobacter oxydans sbsp. industrius В-1280 неэффективно, в то время как словацкие ученые (Tkac et al.) широко используют биоэлектрохимические реакции в системе «Gluconobacter oxydans - ГЦФ» для разработки амперометрических целоклеточных биосенсоров. Предположительно, донором электронов для неорганических комплексов железа являются цитохромы с, связанные с PQQ-субъединицами дегидрогеназ в дыхательной цепи бактерий. Наши коллеги (Alferov S. , 2009) исследовали влияние мембранлокализованных цитохромов на эффективность переноса заряда на модельных бактериях Е. coli с высокой экспрессией цитохрома с550, цитохромсодержащий домен которого связан с мембраной трансмембранной петлей, и показали, что введение в плазматическую мембрану бактерий дополнительных гем-содержащих субъединиц оксидоредуктаз не приводило к значительному изменению в биоэлектрокаталитическом поведении бактерий. Следовательно, для эффективного внеклеточного переноса зарядов необходимо не просто наличие цитохромов в мембране, но и их сопряжение с другими мембранными дегидрогеназами, катализирующими окисление субстратов. Недавно на примере уксуснокислых бактерий Gluconacetobacter diazotrophicus Мееер с колл. (Meyer M., 2012) обнаружили изомерные формы мебранлокализованных PQQ-алкогольдегидрогеназ (PQQ-АДГ), которые в зависимости от конформации имеют

I 0,002-,

Sei 0,0015-й ш ^

а. $ с

° га § 0,001 "us

о 0,0005

□ ДХФИФ И ФМС

разную феррицианид/ферроцианид окидоредуктазную активность. Поскольку PQQ-АДГ содержат PQQ-субъединицу, [2Fe-2S]-6enoK и 4 цитохрома с, то наиболее вероятным объяснением различных окислительно-восстановительных свойств этих изоферментов являются изменения в относительной ориентации гема. Следовательно, различающаяся феррицианид-восстанавливающая активность уксуснокислых бактерий, опубликованная разными исследовательскими группами, обусловлена особенностями строения и локализацией электрон-транспортной цепи разных видов и штаммов бактерий Gluconobacter, в том числе эффективностью взаимодействия PQQ-сайтов с цитохромными белками или локализацией этих белков. Таким образом, скорость восстановления ИАЭ микроорганизмами позволяет получить некоторое представление о механизме взаимодействия клеток с медиатором и может служить одним из критериев для выбора эффективного переноса электронов в системе «бактерия - медиатор». Однако этот подход применим только для водорастворимых редокс-красителей, и не позволяет учитывать процессы электрохимического окисления редокс-соединений.

1.3. Сравнительная оценка скоростей биоэлектрохимического окисления субстратов уксуснокислыми бактериями

Для выявления общих закономерностей переноса заряда в системе "субстрат-бактерии-медиатор-электрод" использовали высокочувствительные электрохимические методы регистрации окислительной активности биологического материала, которые позволяют производить высокоточные измерения в наноамперном диапазоне токов, что дает возможность исследовать свойства микро- и нанограмммовых количеств биомассы и разрабатывать аналитические бионанотехнологии. В исследовании применяли технику регистрации окислительных процессов с помощью химически модифицированных (медиаторных) электродов, которую нами предложено использовать для изучения свойств иммобилизованных микробных клеток и ферментных систем in vivo в условиях биоэлектрохимического окисления субстратов. Электрохимические измерения проводили с помощью гальванопотенциостатов IPC (Вольта), интегрированных с компьютером. Диапазон регистрируемых токов 1 нА - 10 мА.

1.3.1. Вольтамперные характеристики электрохимических и биоэлектрохимических реакций редокс-соединений на графитовых электродах

Возможность использования веществ с обратимыми окислительно-восстановительными свойствами в качестве медиаторов переноса электронов от биологических рецепторов на поверхность электрода изучали методом вольтамперометрии. В отсутствии биокатализатора на поверхности графитово-пастового электрода, модифицированного медиатором, величины анодного и катодного пиков приблизительно одинаковы (рис. 3).

Рис. 3. Вольтамперограммы графитовопастового электрода (электрод сравнения хлорсеребряный, вспомогательный электрод -платиновый, скорость

сканирования 50 мВ/с): а -ферроцен; б -ферроцен, бактерии, глюкоза

Иммобилизация бактерий О.охуйат на электрод и добавление в

электрохимическую ячейку глюкозы или этанола приводит к значительному увеличению анодного тока: бактерии окисляют субстрат, окисленная форма медиатора, взаимодействует с восстановленными сайтами ферментов бактерий, переходя при этом в восстановленную форму, увеличение концентрации восстановленной формы вызывает рост анодного тока, что и служит критерием, показывающим принципиальную возможность использования редокс-соединения в качестве медиатора в биосенсорных системах. Увеличение анодного тока в биоэлектрокаталитической системе на основе бактерий О. охуЛат наблюдали в присутствии водорастворимых соединений ДХФИФ, БХ, ГЦФ, ФМК, ФДК и для электродов, модифицированных ДМФ, ЭФ, ФЦ, ФДМ, АФЦ, ФКА, ДБХ, МБХ. Все эти редокс-соединения участвуют в переносе электронов от ферментных систем иммобилизованных бактерий С.охунЗат на электрод, в то время как 1,2-нафтохинон не способен к такому взаимодействию.

Используя прямой метод регистрации переноса заряда в системе "субстрат -клетка - медиатор - электрод" (метод вольтамперометрии) показали, что редокс-соединения ДХФИФ, БХ, ГЦФ, ФЦ, его производные и некоторые хиноны (ДБХ, МБХ) могут служить медиаторами переноса зарядов от цепи электронного транспорта бактерий СУ. охус!ат на электрод. Для ФЦ, ФМК, ФДК, АФЦ, ФКА, ДБХ, МБХ возможность переноса заряда в сочетании с уксуснокислыми бактериями аисопоЬааег охуЛат продемонстрирована впервые.

1.3.2. Субстратная специфичность бактерий (¡1исопоЬас(ег оху(1ат в условиях биоэлектрохимического окисления при участии медиаторов электронного транспорта

Для сравнительного анализа скорости окисления субстратов иммобилизованными бактериями применили амперомегрический метод, который основан на регистрации изменение силы тока от времени при фиксированном потенциале (рабочем потенциале). Вольтамперные зависимости позволяют выбрать те значения потенциала, при которых генерируются токи биоэлектрохимического окисления. Необходимо учитывать, что высокие значения потенциала ингибируют биокатализатор и уменьшают стабильность биоаналитической системы, что приводит к снижению метрологических и

1, мкА 0,14-!—

-0,02 -1—.-.-т-'->-

300 400 500 600 700 800 Е, мВ

аналитических характеристик биосеноорного определения. Следует отметить, что в биосенсорах на основе целых клеток предпочтительно использование медиаторов со значениями рабочих потенциалов ниже 250 мВ, поэтому АЦФ и ФА, для регенерации которых необходимы высокие значения потенциала, в дальнейших исследованиях не применяли.

В некоторых случаях при разработке микробных сенсоров применяют приемы, позволяющие снизить роль физиологических аспектов функционирования живых клеток и использовать только каталитическую активность ферментных систем микроорганизмов. В окислении большей части углеводов и спиртов у бактерий G.oxydans принимают участие мембранные ДГ (рис. 1), поэтому в качестве биокатализатора нами было предложено использовать не только целые клетки, но и мембранную фракцию, полученную ступенчатым фракционированием лизатов бактерий.

Дегидрогеназная активность и генерируемые токи биоэлектрохимического окисления субстратов выше в системах на основе мембранной фракции бактерий

Рис. 4. Зависимость силы тока

биоэлектрохимического окисления этанола в системе на основе иммобилизованных бактерий G. oxydans и их мембранных фракций от времени (медиатор -ферроцен; рабочий

потенциал - 250 мВ; содержание ферроцена в графитовой пасте - 1,6 ммоль/г; содержание биокатализатора - 200 мг/мл биомассы бактерий или 90 мг/мл мембранной фракции бактерий;

концентрация этанола - 1 мМ).

Таблица 1. Кинетические параметры окисления этанола и глюкозы целыми клетками бактерий G.oxydans и выделенными ферментными фракциями

Субстрат Биокатализатор Этанол Глюкоза

Константа Михаэлиса Км, ммоль/дм3 Удельная активность х104, мкмоль/ (минмг) Константа Михаэлиса Км, ммоль/дм3 Удельная активность х104, мкмоль/ (минмг)

Клетки бактерий 0,75±0,05 1,68±0,08* 0,51 ±0,04 1,33 ±0,07*

Мембранная фракция 0,17±0,02 23 ±2 0,84±0,06 4,0 ± 0,5

* -удельную активность рассчитывали как активность на 1 мг биомассы

Время, с

-биосенсор на основе бактерий Glucoiiobacler oxydans

...... биосенсор на основе мембранной фракшш ферментов

Это свидетельствует о значительном потенциале мембранной фракции бактерий G.oxydans как катализаторов биоэлектрохимического окисления легкоутилизируемых субстратов. В условиях биоэлектрохимического окисления субстратов бактериями или их мембранными фракциями интенсивность окисления того или иного потенциального субстрата фиксируется по изменению содержания восстановленной формы медиатора электронного транспорта, что и определяет величину силы тока в биоэлектрохимической системе.

Скорость биоэлектрохимической реакции определяется биохимическими особенностями взаимодействия специфических ДГ с различными субстратами, при этом могут восстанавливаться разные редокс-центры бактерий, и их доступность для медиаторов различного строения также может отличаться. Эти факторы будут определять эффективность переноса зарядов на электрод в биоэлектрохимических системах на основе микроорганизмов. Сравнительный анализ специфичности ферментных систем бактерий в условиях биоэлектрохимического окисления субстратов (в присутствии искусственного акцептора электронов) и в условиях естественного окисления субстратов (конечный акцептор электронов - кислород) позволяют судить о локализации специфических оксидоредуктаз и, в определенной степени, охарактеризовать ферментные системы бактерий in vivo. Скорость потребления кислорода уксуснокислыми бактериями в присутствии этанола выше, чем в присутствии глюкозы, в то время как генерируемые токи биоэлектрохимического окисления глюкозы выше, чем токи окисления этанола в исследуемой системе на основе бактерий G.oxydans. Это свидетельствует о существовании разных редокс-центров уксуснокислых бактерий при окислении спиртов и углеводов. В присутствии всех типов медиаторов в целом сохраняется профиль субстратной специфичности, но изменяется соотношение генерируемых токов (рис. 5).

Рис. 5. Профиль субстратной специфичности рецепторного элемента биосенсора на основе бактерий G. oxydans. За ответ биосенсора принимали величину генерируемого тока

биоэлектрохимиче ского окисления субстратов или максимальную скорость потребления кислорода в

условиях

естественного окисления субстратов (ответы биосенсоров на глюкозу приняты за 100%; концентрация субстратов бОмМ)

140

120

100 -

íS 80 -В

О 60 40 20 0

s ч — гч

Ç 5 5 S с;

& &

g | ¡

03 кислород ■ ФЦ

□ ДБВХ И ДМФЦ

□ МЕХ

Следовательно, доступность редокс-центров для медиаторов разного строения отличается, причем значительные изменения генерируемых токов наблюдаются при окислении спиртов. Это обусловлено различиями в строении мембранлокализованных PQQ-зависимых ГДГ (КФ 1.1.5.2) и АДГ (КФ 1.1.5.5). Оба фермента содержат каталитический домен восьмипропеллерной структуры, характерный для всех хинопротеиновых ДГ, акцептором электронов является мембранный убихинон. Однако ГДГ состоит из одной полипептидной цепи, в то время как АДГ представляет собой хиногемопротеиновый комплекс, состоящий из трех субъединиц. Особенностью PQQ-АДГ является внутренний транспорт электронов от первого акцептора электронов PQQ к гемовой группе, расположенной у внешней поверхности белка, с которой электроны далее передаются на убихинон дыхательной цепи бактерий. Вероятно, более сложное строение и функционирование АДГ затрудняет электронный транспорт при участии ИАЭ в мембранах бактерий. Отсутствие ответов биосенсора на метанол согласуется с субстратной специфичностью PQQ-алкогольдегидрогеназы бактерий Gluconobacter oxydans и косвенно подтверждает возможности применения медиторных микробных биосенсоров для экспресс-оценки биохимических свойств ферментных систем бактерий in vivo. Субстратная специфичность биокатализатора на основе мембранной фракции бактерий хорошо согласуется с субстратной специфичностью биокатализатора на основе целых клеток G. oxydans в присутствии медиатора ферроцена (рис. 6).

бактерий G. oxydans и выделенной из них мембранной фракции в присутствии ферроцена как медиатора электронного транспорта (за 100% приняли ответ биосенсора на глюкозу)

Это подтверждает предположение, что в биосенсорах па оспине целых клеток бактерий с медиатором электронного транспорта взаимодействуют преимущественно мембранлокализованные ферменты. При использовании мембранной фракции ответы биосенсора на спирты становятся соизмеримыми с ответами на глюкозу, в отличие от клеток, при использовании которых ответ на глюкозу и другие углеводы выше ответов на спирты. Этот факт является примером появления новых качеств в биоэлектрохимической системе при использовании наноразмерного биокатализатора на поверхности графита.

Важно отметить преимущество биосенсорного подхода в исследовании биохимических свойств биокатализаторов, при котором иммобилизованные микроорганизмы находятся в сопряжении с физико-химическим преобразователем. Биосенсорная регистрация окислительной активности иммобилизованных бактерий обеспечивает воспроизводимость и надежность получаемых данных и позволяет оперативно оценить интегральную активность ферментов/группы ферментов в отношении различных субстратов.

1.3.3. Моделирование процессов электрокаталитического окиагения глюкозы иммобилизованными бактериями G.oxydam.

Ранее японские исследователи (Ikeda, 1996) показали, что биоэлектрохимическое окисление глюкозы суспензией бактерий G.industríus по характеру зависимости генерируемого тока от концентрации окисляемого бактериями субстрата в присутствии водорастворимых медиаторов электронного транспорта напоминает ферментативную кинетику, которая описывается уравнением типа Михаэлиса-Ментен. Однако вклад в эффективные константы кинетического уравнения вносят не только стадии ферментативной кинетики, но и диффузионные процессы в анализируемой системе. Иммобилизованные биокатализаторы — еще более сложная система для изучения закономерностей функционирования бактериальных ферментов in vivo. В такой системе значительный вклад в кинетику всего процесса может оказывать диффузия субстрата и медиатора через слой иммобилизованного биоматериала.

1.3.3.1. Скоростъопределяющие стадии окисления субстратов иммобилизованными на поверхности электрода бактериями в условиях функционирования медиаторного биосенсора.

Для выявления

скоростьопределяющей стадии

процессов, протекающих на ферментных медиаторных биосенсорах, используется подход, разработанный Элбери и Бартлетом, в котором

биоэлектрокаталитическое окисление субстрата на электроде представляют в виде физической модели, учитывающей Рис. 7. Физическая модель различные стадии

функционирования микробного биоэлектрохимического окисления

медиаторного биосенсора субстратов. Некоторые допущения

позволили нам применить эту физическую модель и ее математический анализ для систем на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов или их мембранных фракций. Процесс биоэлектрохимического окисления представляет собой последовательные стадии, протекающие у поверхности электрода: перенос субстрата к активным центрам ферментов (при этом целые клетки рассматривали как иммобилизованные ферменты), реакцию субстрата с ферментом, регенерацию фермента под действием медиатора, диффузию медиатора и его окисление на электроде (рис. 7).

Математический анализ физической модели основан на равенстве потоков веществ и электронов через каждую стадию процесса в стационарном состоянии. После преобразования системы уравнений можно получить уравнение типа Хэйнса для анализа кинетики ферментативных реакций в рамках схемы Михаэлиса - Ментен:

} к'ш

К-ХП

■ = I

(2) } = »РА (3)

где j - поток электронов, рассчитываемый по формуле: I - сила тока, протекающего через электрод; п - число электронов; Р - постоянная Фарадея; А - площадь электрода); Б - концентрация субстрата в кювете;

кис - константа для микробного электрода, эквивалентная константе Михаэлиса, к"

з- константа скорости массопереноса субстрата;

к:'

«е - эффективная константа скорости электрохимической реакции на микробном электроде определяется выражением: 1 = Ки 1 к'ш (4)

ех - общая концентрация ферментного комплекса в составе бактериальных клеток на электроде;

Км- аналогична константе Михаэлиса для кинетики гомогенной ферментативной реакции;

Ь - толщина слоя биоматериала.

В зависимости от того, какая стадия медленнее, эффективная константа

скорости электрохимической реакции на микробном электроде ( «в)

определяется либо кинетикой ферментативного процесса (член, содержащий

К /к к'

"' *'»), либо транспортом субстрата к биокатализатору (член, содержащий 5).

Для графического решения уравнения (4) рассчитывают параметры р и у,

которые не имеют конкретного физического смысла, но позволяют представить

экспериментальные данные в необходимом для анализа виде графической

зависимости у от р:

Согласно уравнению (6), зависимость у от р должна быть прямолинейной. Положение прямой на графике позволяет оценить относительный вклад кинетики ферментативной реакции и транспорта веществ к ферментам в наблюдаемое значение к'МЕ. Если значение р0 (отрезок, отсекаемый на оси абсцисс) равно единице, то скоростьопределяющей стадией является транспорт субстрата к ферментным системам бактерий. Если получается горизонтальная линия, соответствующая р0=оо, то лимитирующей является скорость ферментативной реакции. Для микробных биосенсоров на основе всех применявшихся в исследовании медиаторов получены зависимости у от р сходного вида, па которых можно выделить участки, соответствующие кинетическому контролю и диффузионному контролю (рис. 8).

Рис. 8. Графически! чаписммосп, у иг р. построенная на оспонашш

экспериментальных и расчетных данных окисления глюкош бактериями (i'.ii\yil,uix на графитопо-иастоиом шектроде, модифицированном ферроценом

При переходе от лткп.ч концентраций глюкозы и этанола к высоким (1,5 - 2 мМ) происходит смена лимитирующей стадии (диффузионный контроль

сменяется на кинетический). окисление субстратов бактериями

1,3.3.2. Электрокаталитическое

С.охус1ап$ как двухсубстратная ферментативная реакиия по механизму «пинг-

понг»._Эффективность медиаторов электронного транспорта.

Экспериментальные данные, которые обеспечивают функционирование биосенсорной системы в условиях кинетического контроля, использовали для расчета кинетических параметров биоэлектрохимического окисления. Для этого окисление субстратов иммобилизованным биокатализатором (целыми клетками бактерий или их мембранными фракциями) в присутствии медиаторов переноса электронов рассматривали как двухсубстратнуго ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг». Согласно модели процесса окисления субстрата ферментами бактериальных клеток в присутствии медиаторов электронного транспорта (рис. 1 и рис. 8) субстрат проникает через наружную мембрану к дегидрогеназам, локализованным в периплазматическом пространстве или цитоплазматической мембране бактерий, и окисляется (схема 1, а). Восстановленные дегидрогеназы передают электроны окисленному медиатору непосредственно или через определенный сайт дыхательной цепи (схема 1, б). Восстановленный медиатор окисляется на электроде и вступает в новый цикл взаимодействия с ферментными системами бактериальных клеток (схема 1, в):

5 + Е0К ^^ЕЭ —~Р + Е» (а)

М0К + Е„ ЕМ М» + Н0К

к° (б)

Мв - пе" М0К ^

Схема 1. Биоэлектрохимическое окисление по механизму «пинг-понг»: 8 н Р - субстрат (этанол) и продукт (ацетальдегид); Мои и М„ - окисленная и восстановленная форма медиатора; Е,ж и Е, - фермент, локализованный в мембране бактериальной клетки в окисленной и восстановленной форме, соответственно; к|, к.1, кг, кз, к_з и к< - константы скоростей соответствующих стадий реакции.

Константы скорости электрохимической регенерации медиатора (схема 1, в) в большинстве случаев велики по сравнению с константами скорости ферментативной реакции (схема 1, а и б), поэтому стадия окисления восстановленной формы медиатора на электроде не лимитирует скорость процесса биоэлектрохимического окисления субстратов. Скорость окислительно-восстановительных реакций прямо пропорциональна скорости переноса электронов в системе. Таким образом, уравнение для тока электрокаталитического окисления субстратов ферментными системами бактерий, основанное на механизме «пинг-понг», имеет вид:

/ к* /с, к_г+кА

ж таг А. - ---К —---

\ + Ks¡\S] + KM,'[M] (7) к2+к, ktKSp (g) к2+к, къКМр (9)

где [S] и [М] - концентрация субстрата (этанола) и медиатора соответственно; Ks и Км - эффективные константы Михаэлиса для этанола и медиатора соответственно, учитывающие распределение субстрата и медиатора между внутренней средой клетки и раствором.

KSp и Км,„ - константы распределения субстрата и медиатора соответственно между внутренней средой клетки и внешним раствором.

Максимальный ток, протекающий в системе, выражается уравнением:

(Ю)

где [Е] - концентрация фермента in vivo на единицу площади электрода; F - число Фарадея;

Кат - каталитическая константа реакции.

Каталитическая константа, как и константы Михаэлиса для субстрата и медиатора, связана с константами скоростей протекающих в системе реакций (схема 1, а и б)) следующим образом: k1-kA

к_____— .

к2+к, (П)

Исходя из предложенной модели, процесс электрокаталического окисления субстрата ферментными системами бактерий можно охарактеризовать тремя параметрами: максимальной силой тока эффективными константами

Михаэлиса для субстрата и медиатора К3 и Км.

Из уравнений (8-11) следует, что отношение 1т;„/К8 характеризует бимолекулярное взаимодействие фермента с этанолом и не шппсит от используемого медиатора (12), а отношение 1т;,ч/Км хпракгертугт взаимодействие медиатора с ферментом и дает индекс эффективности медиатора электронного транспорта (13).

К$ (^ч+'-'з) (^12) К„ (1Ц

В таблице 2 представлены параметры окисления глюкозы п »тимола уксуснокислыми бактериями С1исопоЬас1ег охус1ап.1 вЬвр. ми{ш1гш,ч И- 12X0 и их мембранными фракциями, иммобилизованными ни графитово-пастовом электроде, модифицированном медиаторами ферроцепового ряда (параметры окисления в присутствии других медиаторов представлены н диссертации).

Величины 1тах/К5 совпадают для всех медиаторов одного типа, что подтверждает правильность принятой модели. Индекс эффективности ферроценов при использовании мембранной фракции в несколько раз выше, чем при использовании целых клеток. Это свидетельствует о том, что мембранная фракция по сравнению с целыми клетками бактерий является более эффективным биокатализатором электрохимического окисления глюкозы и этанола.

Таблица 2. Параметры биоэлектрохимического окисления этанола и глюкозы в биосенсорной системе на основе целых клеток бактериями СЫсопоЬасХег охус!ат ¡Ьзр. ¡пс1ш!гшх В-1280 и их мембранных фракций и медиаторов переноса электронов ферроценового ряда

Параметры биоэлектрохимического окисления субстратов Медиатор \ Биокатализатор «р^-СНз Ра сн3 1 Ре га? к ---- о «аг^он 1 ре 1

Этанол

1шах/К5, мкА-дм3-моль~' Целые клетки 1,3±0,2 1,1+0,1 1,1+0,1 1,3+0,1 1,3±0,1

[шах/Ку, мкАтмоль"' 13,3 ±0,7 28,0±0,4 35±1 100+10 120±30

1тах/Кч, мкЛдм'молт.1 Мембранные фракции 3,5±0,4 3,4±0,3 3,7±0,2 3,3±0,5 3,7±0,4

1тах/Км, мкАт-моль'1 130±30 240±30 510±80 800±100 3200±500

Глюкоза

Ьпах/К^, мкА-дм3-моль"' Целые клетки 0,9±0,2 Э,8±0,2 0,7±0,2 0,8±0,1 0,9+0,2

1тах/Км, мкАгмоль"1 8±1 50±10 120±20 150±30 180±20

[тах/Кд, мкА-дм3моль"' Мембранные фракции Э,8±0,1 Э,8±0,1 1,0±0,2 Э,8±0,1 0,8±0,1

[тах/Км, мкА-гмоль"1 110±30 200±50 220±50 360±40 24001-600

Эффективность производных ферроцена, как медиаторов переноса электронов, увеличивается в ряду: этилферроцен < диметилферроцен < ферроцен < ферроцендиметанол < ферроценмонокарбоновая кислота. Для нерастворимых хинонов: МБХ< ДББХ. Важно отметить, что полученные индексы эффективности для медиаторов независимо от используемого биокатализатора связаны с электронными эффектами заместителей в циклопентадиенильных кольцах ферроцена: электроноакцепторные заместители (карбоксильная, гидроксиметильная группы) увеличивают индекс эффективности, а электронодонорные (метильная, этильная группы) заместители, напротив, уменьшают эффективность. Однако 1,1'-ферроцендикарбоновая кислота не подчиняется этому правилу, что может быть связано с гидрофильностью этого соединения и затруднением (снижением) диффузии медиатора через гидрофобные мембраны биоматериала к активным центрам ферментов.

Эффективность растворимых медиаторов переноса электронов (данные представлены в диссертации) увеличивается в ряду ГЦФ<ДХФИФ<БХ. Результаты, полученные амперометрическим методом, согласуются с результатами спектрофотометрического исследования кинетики восстановления этих соединений. Для оценки эффективности медиаторов в биосенсорных системах или биотопливных элементах на основе целых клеток бактерий можно применять подход, базирующийся на использовании амперометрического метода оценки скорости ферментативных реакций в условиях электрохимического окисления субстратов.

В заключение по изучению свойств системы "субстрат-бактерии-медиатор" можно отметить следующее. Поскольку возможность теоретического предсказания эффективности того или иного типа медиаторов в сочетании с определенным типом бактериальных клеток ограничена, в основном, отсутствием необходимых данных относительно структурной и функциональной организации ферментных систем микроорганизмов, полученные новые результаты являются важными и служат отправной точкой для экспериментальные поиска оптимального сочетания "тип медиатора - тип бактериальных клеток" в процессе биоэлектрохимического окисления. Электрохимический метод является одним из наиболее простых, удобных, надежных аналитических инструментов выбора такого сочетания при разработке амперометрических микробных биосенсоров и биотопливных элементов.

ГЛАВА 2. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ -

ДЕСТРУКТОРЫ КАПРОЛАКТАМА КАК БИОРАСПОЗНАЮЩИЕ ЭЛЕМЕНТЫ БИОСЕНСОРОВ

Прямые методы регистрации окислительной активности (спектрофотометрия, амперометрия и вольтамперометрия) позволяют исследовать закономерности мембранлокализованных ферментных систем in vivo. Однако у большинства бактерий способность к трансформации или деградации различных органических соединений, в том числе ксенобиотиков, хорошо известна, основана на наличии у них специфических ферментных систем, локализованных в цитоплазме и связанных с функционированием дыхательной цепи посредством восстановительных эквивалентов, что используют при создании микробных

биосенсоров на основе кислородного электрода. На примере некоторых бактерий - деструкторов ксенобиотиков выяснили, что в присутствии органических соединений (субстратов исследуемых микроорганизмов) происходит увеличение дыхательной активности бактерий, но не происходит генерирования тока и присутствии медиаторов электронного транспорта. Поэтому для выянлсния закономерностей аэробной деградации ксенобиотиков микроорганизмами -деструкторами применили электрохимические системы на основе кислородного электрода. Микроорганизмы, используемые для разработки биосенсоров, можно рассматривать как тест-объекты в биотестировании. Биологические ответы (тест-реакции) микроорганизмов в биораспознающих элементах сенсоров могут быть связаны с клеточным дыханием. В рамках диссертационной работы изучали закономерности аэробной деградации капролактама, олигомеров е-аминокапроновой кислоты (олигомеры 6-аминогексаповой кислоты, олигомеры капролактама, нейлоновые олигомеры) плазмидсодержащими штаммами бактерий - деструкторов капролактама, как потенциальных тест-объектов для использования в биосенсорах.

2.1. Биохимические основы и генетический контроль деградации капролактама и олигомеров е-амннокапроновой кислоты

Ранее из отходов производств капролактама, расположенных в различных географических регионах страны, нашими коллегами (Есикова Т.З. и др.) выделено и охарактеризовано около 70 штаммов бактерий рода Pseudomonas, способных использовать капролактам в качестве единственного источника углерода и азота. При изучении микробного метаболизма капролактама, используемого в качестве единственного источника углерода и азота, одновременно русскими и японскими исследователями была предложена схема последовательных этапов его превращения (рис 9). Способность к окислению капролактама у большинства штаммов бактерий рода Pseudomonas контролируется конъюгативными плазмидами биодеградации капролактама (САР-плазмидами), которые детерминируют деградацию ¿-капролактама, по крайней мере, до сукцината. К настоящему времени описан ряд САР-плазмид, которые отличаются по характеру детерминируемой ими способности к утилизации капролактама и его интермедиатов. Находясь в одном и том же бактериальном хозяине, они в значительной степени различаются по характеру регуляции процесса трансформации указанного ксенобиотика. Гетерогенность плазмид с точки зрения их функциональной экспрессии дает возможность конструирования практически полезных штаммов с повышенной способностью к разложению ксенобиотика. Так, показано, что плазмиды pBS262 и pBS266 не обеспечивают клеткам рост на среде с адипинатом, а плазмида pBS267 - на среде с аминокапроновой кислотой. Плазмиды pBS265, pBS268, pBS276 отличаются по размерам, но относятся к одной группе несовместимости Р-9 и детерминируют, по-видимому, катаболизм капролактама по одному и тому же биохимическому пути. Находясь в одном и том же бактериальном хозяине, они в значительной степени различаются по характеру регуляции процесса трансформации ксенобиотика, образования и дальнейшего превращения аминокапроновой и адипиновой кислот. Влияние видовых и штаммовых различий бактерий-хозяев

плазмид и комбинаций «плазмида-бактериальный хозяин» на характер экспрессии генетических систем биодеградации относится к вопросу, требующему подробного исследования. Гетерогенность плазмид с точки зрения их функциональной экспрессии дает возможность конструирования практически полезных штаммов с повышенной способностью к разложению Е-капролактама. о

ЕС 3.5,2,-с-капролакгам- ^ лактамэза

"О

е-калролзктам

димер 6-аминогексаноата

Рис. 9.

капролактама олигомеров

Схема и а

деградации линейных

ЕС2.6.1.-6-аминогексаноат-трансаминааа О

6-аминогексаноат

а-кетоглутарат

Чг

-он

ЕСЗ.5.1.46

6-аминогексаноат-димер-гмдролаэа

- глутамат

ЕС 1.2.1.63 6-оксогексаноат-дегидрогеназа

о^^Ао

о'

сукцинат

Линейные и циклические нейлоновые олигомеры,

образующиеся в процессе полимеризации капролактама, являются более

труднодоступными соединениями для

микроорганизмов, капролактам. В связи с этим, вопрос о биотрансформации олигомеров аминокапроновой кислоты

изучен^ в гораздо меньшей степени. Деградация линейных олигомеров у бактерий Е1ауоЬасГегшт начинается с гидролиза амидной связи с образованием свободных

молекул 6-аминогексановой кислоты (рис.9). Осуществление данной реакции требует наличия специфического фермента - 6-аминогексаноат-димер гидролазы, который

последовательно отщепляет от олигомеров единичные молекулы 6-аминогексановой кислоты. Образовавшаяся молекула 6-аминогексановой кислоты далее превращается в адипиновый полуальдегид, адипинат и в интермедиаты цикла Кребса в соответствии со схемой катаболизма капролактама. Таким образом, деградация капролактама и его линейных олигомеров происходит по одному и тому же биохимическому пути. Различие между процессами деструкции капролактама и олигомеров заключается в реакции подготовительного обмена 6-аминогексановой кислоты, хотя в обоих случаях этой реакцией является гидролиз амидной связи в молекуле предшественника. Однако псевдомонады, являющиеся эффективными деструкторами капролактама, не используют олигомеры в качестве единственных источников углерода. Отсутствие роста данных бактерий на минеральных средах, содержащих олигомеры в качестве ростовых субстратов.

О^Э-СоА

ацетил-КоА

к циклу Кребса

не исключает возможности их трансформации, которая может существенно изменять структуру органического вещества, но не приводит к его полной утилизации. Важно отметить, что трансформация неприродных соединений может способствовать увеличению доступности для других микроорганизмов -деструкторов, что, в свою очередь, увеличивает степень биодеградации отходов химических предприятий. Таким образом, выявление в способности бактерий-деструкторов капролактама участвовать также в трансформации низкомолекулярных линейных олигомеров капролактама и выявление роли САР-плазмид в этом процессе является актуальной задачей, имеющей общебиологическое и практическое значение. На этом этапе исследований применяли спектрофотометрический, газохроматографический и ТСХ методы определения содержания капролактама в водных средах, масс-спектрометрию и колориметрический метод определения активности трансаминаз.

2.2. Скрининг бактерий с различными сочетаниями «САР-плазмида -бактериальный хозяин» по окислительной активности

Для исследования выбрали бактерии-деструкторы капролактама из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН, любезно предоставленные Есиковой Т.З. Для оценки роли САР-плазмиды в процессе окисления разных субстратов провели сравнительное изучение субстратной специфичности бактерий по изменению их дыхательной активности на примере Р. putida BS394, содержащих САР-плазмиду pBS268, и бесгогазмидных бактерий. Бактерии, содержащие плазмиду деградации капролактама, окисляют капролактам и его метаболиты (б-аминогексаноат и адипинат), причем наибольшая дыхательная активность наблюдается по отношению к капролактаму. Штамм BS394, не содержащий плазмид биодеградации капролактама, не способен окислять капролактам и его интермедиа™. Таким образом, биосенсоры на основе целых клеток микроорганизмов можно использовать также для быстрой оценки субстратной специфичности бактерий и выявления плазмид биодеградации у бактерий. Для исследования влияния комбинаторики «бактериальный хозяин -САР-плазмида» на процесс утилизации капролактама использовали, с одной стороны, бактериальные штаммы, относящиеся к разным видам рода Pseudomonas, содержащие одну и ту же плазмиду биодеградации капролактама, с

^ 5 Pseudomonasßuorescens 38a(pBS268)

-С> Pseudomonas ¡nitida BS394(pBS268) ^

BS394(pBS265)

Бактериальный штамм с различными СА.Р-плазмидами

BS394(pBS276)

другой стороны, один и тот же штамм -бактериальный хозяин с различными САР-плазмидами (рис. 10).

Рис. 10. Бактериальные штаммы как основа рецепторных элементов биосенсоров

4>Pseudomonas chlororaphis PCL 1391(pBS268)

Принцип работы микробного сенсора на основе кислородного электрода основан на том, что при окислении субстрата иммобилизованными на поверхности кислородного электрода микроорганизмами (рецепторный элемент биосенсора) возрастает их дыхательная активность, и в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода. Все биорецепторные элементы содержали одинаковое количество клеток микроорганизмов, что обеспечивало количественный подход в получении сравнительных оценок окислительной активности штаммов бактерий в отношении различных субстратов. Связь дыхательной активности бактерий с концентрацией субстрата в кювете позволяет получить градуировочные зависимости откликов сенсора от концентрации капролактама для биосенсоров на основе каждого штамма (рис.11).

концентрация капролактама, мМ концентрация капролактама, мМ

а б

Рис. 11. Градуировочные зависимости микробных сенсоров: а - на основе штаммов-бактериальных хозяев плазмиды рВБ268; б - на основе штамма Р.риййа ВБ394 с разными плазмидами

Анализ экспериментальных данных показывает, что полученные зависимости можно аппроксимировать уравнением гиперболы типа Михаэлиса-Ментен, описывающим экспериментальную зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (табл. 3).

Таблица 3. Параметры градуировочных зависимостей микробных биосенсоров

Штамм Эффективная константа Михаэлиса Км, мМ Коэффициент чувствительности Ь, нАДСмМ)

Р. ригШа В5394(рВ5268) 0,12±0,06 0,08±0,01

Р.риМа В3394(рВ5265) 0,14±0,03 0,11±0,01

Р. рийда В3394(рВЙ276) 0,14±0,05 0,020±0,006

Р. Аиогезсет 38а(рВ5268) 0,6±0,1 0,002±0,002

Р. сЫогогарЫа РСЫ391(рВ3268) 0,71 ±0,06 0,003±0,002

Биосенсоры на основе штаммов Р.риМа В8394(рВ8268) и Р.риМа В8394(рВ8265) характеризуются наибольшими коэффициентами

чувствительности. Полученные оценки позволяют заключить, что использование штаммов P.putida BS394(pBS265) и P.putida BS394(pBS268) как основы биосенсоров является более предпочтительным.

Эффективность функционирования бактериальной ферментной системы катаболизма капролактама можно оценить по скорости его утилизации микроорганизмами. Удельную активность ферментных систем деградации капролактама /и vivo для исследуемых пята штаммов определяли по убыли субстрата при инкубации капролактама с бактериальными клетками.

Таблица 4 . Удельная активность ферментных систем деградации капролактама

Штамм Удельная активность ферментных систем деградации капролактама а, мкМ/(мг-мин) Степень деструкции капролактама, %

P.putida BS394(pBS268) 0,17±0,03 80

P.putida BS394(pBS265) 0,16±0,03 80

P. putida BS394(pBS276) 0,11±0,03 56

P. fluoresceins 38a(pBS268) 0,09±0,03 48

P. chlororaphis PCL1391(pBS268) 0,06±0,03 24

Ферментативная активность штамма P.pulida BS394, содержащего ту или иную плазмиду биодеградации капролактама - pBS268, pBS265, или pBS276, изменяется незначительно (табл.4). Перенос плазмиды pBS268 в ризосферные штаммы P.fluorescens 38а и P.chlororaphis PCL1391 приводит к снижению активности ферментной системы деградации капролактама у полученных трансконъюгантов. Следовательно, на процесс утилизации капролактама влияет в первую очередь бактериальный хозяин. Наибольшую степень деструкции капролактама (отношение изменения концентрации капролактама к его исходному содержанию) наблюдали для штаммов P. putida BS394(pBS268) и Р. putida BS394(pBS265).

Таким образом, для сравнения способности к утилизации капролактама штаммов с различными комбинациями «бактериальный хозяин — САР-плазмида» впервые применили биосенсорный подход. Наилучшие результаты получили для скрининга бактерий с комбинаций одна плазмида/разные бактериальные хозяева. 2.3. Трансформация линейных олигомеров аминокапроновой кислоты бактериями-деструкторами капролактама

Псевдомонады, являющиеся эффективными деструкторами капролактама, не способны расти в присутствии олигомеров (димер и тример) как источника углерода. Следует отметить, что Негоро (Negoro) с соавт. выявили возможности адаптации бактерий-деструкторов капролактама Pseudomonas aeruginosa РА01 и Flavobacterium sp. KI72, которая проявляется в приобретении способности к биодеградации олигомеров. Они предположили несколько возможных механизмов появления деградативной способности бактерий по отношению к ксенобиотикам: расширение субстратной специфичности имеющихся в клетке

ферментов, активация критических генов вследствие мутаций; изменение регуляторных механизмов. Однако механизмы приобретения бактериальными клетками способности к деградации олигомеров капролактама остаются невыясненными. Нами исследовались возможности бактерий-деструкторов капролактама участвовать в катаболизме линейных олигомеров е-аминокапроновой кислоты.

В качестве объектов исследования использовали бактерии Р. putida BS394(pBS268), Р. putida BS394(pBS262), Р. putida KT2440(pBS268) и Р. putida KT2440(pBS262). Эти штаммы получены методом конъюгационного переноса плазмид из природных штаммов-деструкторов, выделенных из отходов производства капролактама. Бактериальный хозяин Pseudomonas putida КТ2442 является спотанным рифампицинустойчивым мутантом штамма Pseudomonas putida КТ2440, генетическая последовательность которого полностью определена, содержит хромосомную устойчивость к стрептамицину и gfp-тт, и является удобной моделью для исследований. Штамм Р. putida BS394(pBS268) является наиболее эффективным деструктором (см. п.2.2). САР-плазмиды отличаются между собой размерами и принадлежностью к разным группам несовместимости (Inc Р2 и Inc Р9 для pBS262 и pBS268 соответственно).

Для выявления способности бактерий-деструкторов капролактама

использовать олигомеры как ростовые субстраты исследовали их рост на минеральной среде, содержащей димер или тример 6-аминогексановой кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии. Однако рост всех штаммов в этих условиях отсутствовал и, следовательно, штаммы-деструкторы КАП не способны полностью утилизировать линейные олигомеры. , 2 3 4 5 Несмотря на отсутствие роста, Рис. 12. Субстратная специфичность дыхательная активность САР-

P.putida BS394(pBS268). За 100% плазмидсодержащих бактерий

принимали ответ сенсора на 1 мМ увеличивалась в присутствии не только капролактам. Субстраты (концентрация 1 капролактама и его интермедиатов, но и мМ): 1-капролактам, 2-димер, 3-тример, 4- линейных димера и тримера (рис.12). Для аминокапронат, 5-адипинат , г

' ферментов подготовительного метаболизма

микроорганизмов и особенно ферментов первичной атаки ксенобиотиков характерна широкая субстратная специфичность. Поэтому микроорганизмы могут атаковать и частично изменять отдельные участки в молекуле органического соединения для получения энергии, но не могут использовать это соединение в качестве источника углерода. В связи с этим, отсутствие деградации линейных олигомеров аминокапроновой кислоты штаммами-деструкторами мономера не исключает возможности их трансформации, т.е. неполной деградации. Следует отметить, что изменение

дыхательной активности бактерий количественно зависит от концентрации олигомеров в измерительной кювете (в отсутствии капролактама) (рис. 13).

Рпс. 13. Градуировочная зависимость

биосенсора на основе штамма BS394(pBS268) от концентрации

ответов P.putida димера

Исследование путей

трансформации олигомеров

первоначально проводили на примере штамма P.putida BS394(pBS268). Для этого бактериальные клетки длительно инкубировали в неростовых условиях с димером или тримером.

Идентификацию веществ,

содержащихся в реакционной смеси, осуществляли методом масс-спектрометрии. На масс-спектре образца в первый момент после внесения биомассы бактерий в реакционной смеси доминирует пик, соответствующий димеру (m/z 243) (рис. 14 А). 243

jö o,oi о

0,00

0 12 3 4

концентрация димера, мМ

А 1«

s еэ

i а

112

150

225

|,t.illll. ft. И tl_ijt Ii „^

100

153

200

asa

а'г

3äS

430

0 £

5 2S

J58

243

jiiL.

Рис. 14. Масс-спектры реакционной смеси после инкубации бактерий P.putida BS394(pBS268) с линейным димером (в режиме

отрицательных ионов: (Л) начальные условия; (Б) 24 ч.

Фрагментные ионы с молекулярной массой 112; 356 и 469 свидетельствуют о наличии в исходном образце незначительных примесей капролактама и его линейных олигомеров тримера и тетрамера. Через 24 ч инкубации в масс-спектрах реакционной

смеси появлялся

фрагментный ион с m/z 258, который отсутствовал в масс-спектрах реакционной смеси в начале инкубации димера с бактериями (рис.14 Б).

300

350

«к»

и4

Нами было выдвинуто предположение, что наиболее вероятным продуктом трансформации является соответствующая дикарбоновая кислота. Для подтверждения структуры предполагаемого продукта трансформации димера анализировали МС/МС спектр фрагментного иона [М-Н]"=258, на основании которого была предложена схема фрагментации молекулы предполагаемого соединения. Распад молекулы идет по двум направлениям: 1) отщепление молекулы б-аминогексановой кислоты с образованием иона m/z 127, из которого далее элиминируется молекула муравьиной кислоты; 2) отщепление молекулы воды с образованием фрагмента m/z 240. Проведенный МС/МС-анализ иона, соответствующего продукту трансформации димера, косвенно подтверждает структуру продукта трансформации димера. Результаты трансформации тримера клетками штамма P.putida BS394(pBS268) в течение более длительного периода (48 часов) свидетельствуют об одинаковом пути трансформации обоих олигомеров. Образующиеся при этом дикарбоновые кислоты накапливаются в культуралыгой жидкости и, следовательно, не используются бактериями в основном метаболизме. Для того чтобы исключить возможность неспецифических изменений линейных олигомеров, а также выявить роль плазмиды биодеградации капролактама в процессе трансформации, проводили инкубацию клеток бесплазмидного штамма P.putida BS394 в присутствии димера в тех же условиях. Однако в этом случае изменений в составе реакционной смеси не происходило. Это означает, что процесс трансформации низкомолекулярных линейных олигомеров находится под генетическим контролем САР-плазмиды.

Полученные данные позполяют

'-соон

NH2-(CH2)5-C-N-(CII2)5

трапсаминаза

а-квтоглугарат

Н-С-(СН2)4-

дегидрогеназа

C-N-(CH2)5-(-COOH Ö

надф++н2о 01АД*)

НАДФН+Н*-н (11АДН Ii')

Дыхательная цепь бактерий

НООС-(СН2)4-C-N-(CH2)5-о

соон

Рис. 15. Схема трансформации олигомеров под действием ферментов катаболизма капролактама

предположить, что бактериальные клетки, содержащие САР-плазмиду, способны к трансформации линейных олигомеров за счет широкой субстратной специфичности двух ферментов биодеградации

капролактама: трансаминазы (ЕС 2.6.1.-) и дегидрогеназы (ЕС 1.2.1.63). Для проверки этого предположения определяли трансаминазную

активность в лизатах бактерий Р. putida BS394(pBS268) в присутствии 6-аминогексаноата и димера. Активность трансаминазы (ЕС 2.6.1.) определяли спектрофотометрически по интенсивности окраски продуктов взаимодействия полуальдегидов МБТГ в присутствии хлорида железа(Ш) при длине волны 580 нм через 10 мин после запуска реакции. Удельная активность трансаминазы по отношению к димеру в два раза

ниже (0.48 нмоль мин"1 мГ1), чем по отношению к мономеру — 6-аминогексаноату (0.91 нмоль мин"1 мг"1). На основании полученных результатов, нами предложена схема трансформации низкомолекулярных линейных олигомеров аминокапроновой кислоты бактериями-деструкторами мономера (рис.15).

Важно отметить, что биохимические реакции превращения линейных олигомеров до соответствующих производных с концевыми карбоксильными группами микроорганизмами ранее не были описаны.

Для выявления общих закономерностей трансформации линейных олигомеров бактериями-деструкторами капролактама, а также оценки влияния бактериального хозяина и/или САР-плазмиды на этот процесс исследовали динамику образования продукта трансформации в реакционной смеси в ходе длительной (до 96 ч) инкубации штаммов с различными комбинациями «бактериальный хозяин-плазмида». Для этого использовали штамм P.putida КТ2442, с разными САР-плазмидами (pBS268 и pBS262) с одной стороны, и штаммы P.putida КТ2442 и P.putida BS394, содержащие одну и ту же САР-плазмиду - pBS262 - с другой. Плазмиды биодеградации капролактама pBS268 и pBS262 различаются по размерам и группам несовместимости, что, в первую очередь, характеризует их базовые репликоны. Трансформацию димера этими штаммами исследовали в тех же условиях, как и в случае P.putida BS394(pBS268). В масс-спектрах всех вариантов эксперимента после инкубации бактерий с субстратом обнаруживали фрагментный ион с m/z 258, который отсутствовал в масс-спектрах образцов, взятых в начале эксперимента. Это означает, что трансформация димера аминокапроновой кислоты исследуемыми бактериями происходит по схеме предложенной нами для штамма P.putida BS394(pBS268) (рис.15), т.е. закономерности трансформации линейных олигомеров являются общими для бактерий, содержащих САР -плазмиды. Это подтверждает выдвинутое нами предположение о том, что трансформация олигомеров обусловлена широкой субстратной специфичностью ферментов пути деградации капролактама, гены которых локализованы на плазмидах.

Для сопоставления динамики трансформации исследуемыми штаммами проводили сравнительный анализ интенсивностей молекулярного иона [М+Н]+" =245 к иону [М+Н]+=260. При измерениях предполагали одинаковую интенсивность ионов димера и ионов образующегося в процессе его трансформации продукта. Такое допущение позволило лишь приблизительно оценить накопление продукта трансформации и убыль исходного димера во времени; в то же время такой подход можно использовать для сравнительной оценки способности штаммов трансформировать олигомеры аминокапроновой кислоты. Наибольшую скорость убыли субстрата наблюдали для штамма P.putida BS394, содержащего различные САР-плазмиды. Содержание продукта трансформации в реакционной смеси с клетками штамма P.putida BS394(pBS268) так же увеличивалось быстрее по сравнению с остальными культурами. Перенос плазмид в реципиентный штамм P.putida КТ2442 также обеспечивал способность бактерий осуществлять трансформацию олигомеров, но с значительно меньшей скоростью (рис.16). Таким образом, на скорость трансформации олигомеров, детерминируемой катаболическими плазмидами, влияет в первую очередь

природа бактериального штамма-хозяина. Эти результаты согласуются с результатами, полученными нами в процессе исследования эффективности утилизации капролактама бактерия с различным сочетанием «плазмида -бактериальный хозяин» (см. п.2.2).

А 180

« fyatfÄ BS}« {рв»«8>

* ерюыь шзя (рйьгг>2)

В 1Ш>

S»

* &

40 Р-

о Ы—

Время, ч

• ¡•.¡xisiila KTM42(|»8SZ<8.t I ЧГ.ртШи KT2442<pB82S2} !

Рис. 16. Динамика трансформации димера бактериями Pseudomonas с различным сочетанием «плазмида-бактериальный' хозяин»: (А) P.putida BS394, несущая САР-плазмиды (pBS262 или pBS268), (В) P.putida КТ2442, несущая такие же САР-плазмиды

Полученные результаты § имеют не только фундаментальное 2« к значение для понимания механизмов адаптации бактерий к новым условиям окружающей среды и расширения

метаболического разнообразия ш микроорганизмов, но и

существенное практическое

значение для разработки т 5' технологий биологической очистки | отходов производств капролактама и полимеров на его основе, ё Биологическая очистка

| промышленных сточных вод, g содержащих капролактам и его g олигомеры в качестве основных а компонентов, затрудняется тем, что в таких объектах оптимальное для микроорганизмов соотношение в субстратах (C:N:P) сдвинуто в сторону увеличения содержания капролактама и низкомолекулярных

г «) i

О 24 -»

Врем«, ч

азота. Поэтому для полного удаления олигомеров биологическими методами прибегают к дополнительному внесению в сточную воду веществ — дополнительных источников углерода (таких как метанол) или к предварительной химической обработке стоков -дезаминированию. Удаление аминогруппы из олигомеров в процессе их трансформации с помощью ферментных систем бактерий - деструкторов капролактама, приводящее к снижению содержания азота в субстратах, может стать заменой существующим методам предварительной подготовки капролактам- и олигомерсодержащих стоков для последующей биологической очистки, что отвечает принципам «зеленой» химии.

ГЛАВА 3. БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

Экспресс-оценка степени загрязнения объектов окружающей среды органическими соединениями является необходимым компонентом экологического контроля. Учитывая постоянно растущий перечень веществ, поступающих как загрязнители в окружающую среду, эффективным инструментом анализа оказываются методы, основанные на интегральной оценке органических компонентов, а не только на определении содержания индивидуальных веществ. В этой связи значительное внимание уделяется разработке биосенсорных экспресс-методов контроля, значительно повышающих оперативность анализа, снижающих его стоимость и позволяющих выполнить как интегральную оценку загрязненности, так и проводить селективный анализ.

3.1. Макет микробного сенсора проточно-инжекционного типа для детекции

капролактама

Макет биосенсора проточно-инжекционного типа для определения капролактама в водных средах разрабатывали на базе анализатора растворенного кислорода «Биолан», созданного в рамках программы РАН и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Активизация инновационной деятельности в сфере уникального научного приборостроения» при участии автора. Принцип работы такой системы заключается в следующем: в проточно-инжекционной системе биосенсорный элемент встроен в канал, по которому постоянно прокачивается буферный раствор. Проба впрыскивается в поток и через определенное время поступает в зону измерительного электрода, где микроорганизмы окисляют субстрат, содержащийся в пробе. При этом в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода Кларка, сопряженного с гальваностатом-потенциостатом. На монитор компьютера, интегрированного с биосенсорной системой, выводится графическое отображение изменения силы тока,

Рис. 17. Отклики биосенсора на различные концентрации

капролактама: 1 - 0,05 мМ; 2-0,1 мМ; 3 - 1 мМ; 4 - 2 мМ; 5 - 5 мМ

В качестве

биораспознающего элемента биосенсора использовали иммобилизованные бактерии Р.риШа В8394(рВ8268), показавшие наибольшую активность при окислении капролактама (п.2.2).

Аналитические и метрологические характеристики макета биосенсора: - длительность единичного измерения 10 мин;

протекающего в системе, во времени (рис.17):

- нижний предел обнаружения 0,005 мМ, что позволяет определять концентрации капролактама ниже ПДК (ПДК капролактама в водоемах составляет 1 мг/л (0,009 мМ));

- операционная стабильность 5,3 %;

- долговременная стабильность 10 сут. (падение активности клеток составило 31%.).

Макет биосенсора проточно-инжекционного типа применили для анализа реальных образцов, содержащих капролактам. Образец №1 представлял собой производственные воды цеха предприятия по производству капролактама «Щекиноазот» (г. Щекино, Тульская область), в которых содержатся капролактам, органические примеси - циклогексанон, циклогексанол и сульфат аммония; образец №2 - капролактам-олигомерный концентрат дистилляции -твердые отходы с предприятия по производству полимерных волокон «Химволокно» (г. Щекино, Тульская область), содержащие капролактам и его олигомеры. Результаты анализа содержания капролактама в этих образцах представлены в таблице 5.

Таблица 5. Содержание капролактама в анализируемых образцах

Метод определения Образец Ml Образец №2

Биосенсорное определение 5,2±0,2 % 75±4%

Тонкослойная хроматография 5,0±0,5 % 80±8%

Фотометрический метод 5,3+0,2 % 81±2%

Возможность применения разработанного макета биосенсора для мониторинга процесса биологической очистки капролактам-содержащих производственных отходов исследовали в модельных системах и на образцах отходов завода по производству капролактама. Для этого к разбавленным до 190 г/дм3 капролактама образцу №2 добавляли бактерии-деструкторы капролактама (2,3 х 109 КОЕ/мл), определяли содержание капролактама в реакционной смеси в ходе биодеградации методом ГХ и спектрометрии. Инкубация бактерий-деструкторов в среде, содержащей капролактам, привела к уменьшению содержания капролактама на 51 и 67% в течение часа и на 96 и 98% через 6 часов.

3.2.Микробный сенсор для оценки токсичности продукции бытового назначения

Одной из важнейших задач современной токсикологической экспертизы является оценка токсичности товаров народного потребления. Производство одежды, обуви, посуды, игрушек, и других изделий из синтетических материалов, привело к тому, что в настоящее время ощущается острая потребность во всесторонней оценке этой группы товаров по показателям безопасности для здоровья человека. Существующие методы экспресс-оценки токсичности помимо преимуществ имеют и свои ограничения. Предпочтительно комплексное использование нескольких биотестов, взаимно дополняющих друг друга по чувствительности к различным группам веществ, поэтому ведутся работы по поиску и выбору дополнительных тест-объектов. Для определения загрязнения

окружающей среды часто используют амперометричсские биосенсоры на основе различных штаммов микроорганизмов, поэтому такие системы нами предложено использовать для оценки токсичности товаров народного потребления. Для этого исследованы возможности использования дыхательной активности микроорганизмов с различными типами метаболизма. Бактерии рода Pseudomonas, несущие плазмиды деградации нафталина, являются эффективными деструкторами широкого круга ксенобиотиков, таких как углеводороды нефти, моно- и полиароматические соединения и их производные и другие. Метилотрофные дрожжи H.polymorpha NCYC 495 In, используют метанол и формальдегид как источники энергии, также известно, что метаболическая активность этих микроорганизмов сильно зависит от содержания токсичных компонентов в среде - фенола, ПАВ, ионов тяжелых металлов. Бактерии E.coli К-12 являются стандартными объектами биотестирования в других методах, а их свойства, субстратная специфичность и пути биодеградации ксенобиотиков хорошо изучены. Бактерии E.coli ТОРЮ используются в качестве реципиентных клеток для клонирования гена в молекулярной биотехнологии, и в случае удовлетворительных результатов испытаний могут представлять интерес, так как их легко модифицировать для улучшения характеристик.

В качестве объектов оценки токсичности использовали водные вытяжки образцов товаров народного потребления из полимерных и текстильных материалов, получивших неудовлетворительные результаты токсикологической экспертизы. Согласно токсикологическим методам оценки вредного воздействия химических факторов, их степень токсичности зависит от времени экспозиции. Бактерии рода Pseudomonas и Escherichia coli К-12 показали высокую избирательную чувствительность к образцам, совпадающую с результатами токсикологической экспертизы, с разным уровнем ответа сенсора, поэтому при использовании микроорганизмов в качестве биоматериала в рецепторных элементах сенсоров для оценки токсичности, важно учесть их чувствительность к токсичным образцам в первые часы экспозиции. Дыхательная цепь E.coli К-12 показала наибольшую чувствительность.

Для количественного измерения тест-реакции (в данном случае, дыхательной активности микроорганизмов) при действии ксенобиотика необходимо использовать стандартный образец положительного контроля. В качестве стандартного образца выбрали водный раствор ацетальдегида, что обусловлено несколькими причинами. Содержание ацетальдегида в водных вытяжках из исследуемых товаров нормируется, в том числе, в Единых санитарно-эпидемиологических и гигиенических требованиях, принятых в 2010 году странами-членами таможенного союза. При этом альдегиды часто встречаются в товарах бытового назначения, получивших отрицательные заключения токсикологической экспертизы (ПДК ацетальдегида в водных вытяжках из исследуемых товаров составляет 0,2 мг/дм3). Ацетальдегид - это опасный токсикант, продукт разложения многих органических веществ, применяемых в промышленности. В пределах диапазона концентраций от 0,8 мг/дм3 до 20 мг/дм3 зависимость ответа сенсора от концентрации ацетальдегида линейна (г = 0,9998). Параметры градуировочной зависимости: а (коэффициент

чувствительности) равен 0,435 ± 0,005 02мкгхс'1хмг'1, у0 (фоновый сигнал) равен 1,87 i 0,05 Огмкг/дм3. Основные аналитические и метрологические характеристики биосенсора на основе E.coli К-12 представлены в табл. 6.

Таблица 6. Основные аналитические и метрологические характеристики биосенсора

Характеристика биосенсора Значение характеристики

Предел обнаружения (по ацетальдегиду), мг/дм"1 0,4

Рабочий линейный диапазон (по ацетальдегиду), мг/дм3 0,8-20

Коэффициент чувствительности, СЬмкгхс'хмг"1 0,435 ±0,005

Повторяемость (отклонение от среднего значения за 15 измерений), % 6,8

Долговременная стабильность (не менее), сут. 33

Параметры разработанного макета биосенсора свидетельствуют о возможности использования этой биоаналитической системы для получения количественной информации о токсичности бытовых товаров, используя ацетальдегид в качестве стандартного образца положительного контроля. Полученные нами результаты биосенсорного определения токсичности продукции из полимерных и текстильных материалов параллельно подтверждали другими методами. В качестве методов сравнения использовали аналитические методы и биотестирование: метод оценки токсичности с использованием тест-объекта спермы крупного рогатого скота и метод оценки токсичности, основанный на измерении биолюминесценции бактерий Эколюм (табл. 7). Наблюдали полное совпадение результатов оценки токсичности образцов, получивших положительное заключение токсикологической экспертизы и контрольного опыта. Таким образом, разработаны количественные критерии оценки токсичности товаров из полимерных и текстильных материалов с использованием микробного биосенсора на основе кислородного электрода с использованием стандарта положительного контроля - ацетальдегида.

Вместе с тем имеют место расхождения в интерпретации результатов в образцах №№ 3, 4, 7, 8. Причем, образцы №№ 3, 4 определяются как токсичные только одним из утвержденных альтернативных методов, по при исследовании аналитическими методами в них обнаружено превышение норм по ацетальдегиду, альфа-метилстиролу и ацетофенону, кроме того, данные образцы при оценке с помощью биосенсора также токсичны. Образцы №№ 7, 8 при оценке двумя альтернативными методами нетоксичны, но при исследовании аналитическими и органолептическими методами не соответствуют требованиям нормативных документов, что совпадает с оценкой токсичности предложенной моделью биосенсора. Обнаруженные аналитическими методами цинк, ацетальдегиды и другие органические соединения, в том числе и те, которые не нормируются в единых санитарно-эпидемиологических и гигиенических требованиях, могут оказывать влияние на дыхательную активность микроорганизмов и обуславливают интегральную токсичность образцов бытовых товаров.

Ложноположительные или ложноотрицательные результаты биотестирования могут объясняться как специфической реакцией тест-объекта на воздействие токсикантов, так и факторами внешней среды (содержание кислорода, рН, температура и другие).

Таблица 7. Результаты исследования токсичности бытовых товаров различными методами

№ Объект Метод исследования

Биосенсор Биотоке АТ-05 СФ.ГХ ААС ГХ-МС Органолептика

1 Пижама детская Сильно токсично Токсично Токсично Ацетальдегид 1,20 мг/дмЗ Цинк не обнаружен МС, ¡АФ, Неприятный запах

2 Носки детские Сильно токсично Токсично Токсично Ацетальдегид 1,20 мг/дмЗ Цинк не обнаружен МС, АФ Неприятный запах

3 Одежда 1-го слоя (образец №2) Сильно токсично Не токсично Токсично Ацетальдегид 0,70 мг/дмЗ Цинк не обнаружен- МС, АФ Неприятный запах

4 Одежда 1-го слоя (образец №4) Сильно токсично Токсично Не токсично Ацетальдегид 0,80 мг/дмЗ Цинк не обнаружен МС, АФ Сильный неприятный запах

5 Одежда 1-го слоя (образец N° 1) Токсично Токсично Токсично Ацетальдегид 0,30 мг/дмЗ Цинк 2,59 мг/дмЗ ЦБФ Сильный неприятный запах

6 Сланцы зеленые Токсично Токсично Токсично Ацетальдегид 0,30 мг/дмЗ Цинк 0,12 мг/дмЗ МС, АФ, ЦБФ Сильный неприятный запах

7 Одежда 1-го слоя (образец №5) Токсично Не токсично Не токсично Ацетальдегид 0,30 мг/дмЗ Цинк 0,05 мг/дмЗ МС, АФ, Неприятный запах

8 Сланцы синие Токсично Не токсично Не токсично Ацетальдегид 0,40 мг/дмЗ Цинк не обнаружен МС, АФ, ЦБФ Сильный неприятный запах

9 Игрушка детская Не токсично Не токсично Не токсично Ацетальдегид не обнаружен Цинк не обнаружен - Запах отсутствует

10 Пластиковый стаканчик Не токсично Не токсично Не токсично Ацетальдегид не обнаружен Цинк не обнаружен - Запах отсутствует

11 Вода диет. Не токсично Не токсично Не токсично Ацетальдегид не обнаружен Цинк не обнаружен - Запах отсутствует

(СФ - спектрофотометрия, ГХ - газовая хроматография; ААС - атомно-абсорбционная спектрометрия; ГХ-МС - газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием; ДБФ - дибутилфталат; МС - альфа-метилстирол; АФ- ацетофенон)

Таким образом, для однозначного определения токсичности бытовых товаров необходимо одновременное применение нескольких систем биотестирования, использующих разные жизненные функции тест-организмов. Сравнительный анализ полученных результатов свидетельствует о том, что биосенсоры, функционирующие на основе дыхательной активности микроорганизмов, позволяют получать данные с высокой корреляцией к стандартным методам гигиенической оценки и могут успешно использоваться для оценки токсичности бытовой продукции. Необходимо отметить, что

разработанный нами биосенсор не давал ложноотрицательных результатов, что свидетельствует о большей универсальности данного метода по сравнению с другими методами биотестирования.

3.3. Медиаторные биосенсоры на основе уксуснокислых бактерий и выделенных из них мембранных фракций для определения суммарного содержания Сахаров, спиртов и БПК

Важной характеристикой степени загрязненности воды легкоокисляемыми органическими веществами является индекс биохимического потребления кислорода (БПК). Традиционная методика определения БПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы в течение 5, 10 или 20 суток (БПК5, БПК10 или БПК2о, соответственно). Отсутствие оперативности существенно снижает ценность традиционной методики. Для оперативного анализа разрабатываются методы оценки БПК, основанные на использовании биосенсорных анализаторов. Биосенсорные анализаторы БПК представляют собой надежные, простые и дешевые аналитические инструменты и с успехом используются для контроля водных экосистем (наряду с традиционными методами определения БПК) за рубежом. В России аналогичные анализаторы в настоящее время промышленно не выпускаются. При создании БПК-сенсоров наиболее часто используют биосенсоры на основе кислородного электрода Кларка и целых клеток микроорганизмов, принцип функционирования которых основан на измерении скорости дыхания микроорганизмов вблизи поверхности преобразователя. Для того, чтобы на значение БПК, определяемого с помощью микробного дыхания, не влияло количество растворенного кислорода в образце, предложено использовать БПК-медиаторные биосенсоры. Преимуществом применения медиаторов электронного транспорта является возможность регистрации БПК в анаэробных условиях, так как ферменты дыхательной цепи микроорганизмов способны регенерироваться за счет восстановления искусственных акцепторов электронов. Следует отметить, что в медиаторных микробных сенсорах генерируются токи в 100 - 1000 раз большие, чем при использовании кислородного электрода, что обеспечивает возможность дальнейшей миниатюризации биосенсоров (создания микросенсоров).

Одной из важных проблем в экологии является очистка сточных вод биотехнологических производств, в том числе спиртовых производств. Уксуснокислые бактерии С.охус1ат имеют мембранную локализацию основных ферментов катаболизма углеводов и спиртов. Это обеспечивает эффективное окисление органических стоков спиртовых производств и облегчает взаимодействие ферментов катаболизма легкоутилизируемых субстратов с медиаторами электронного транспорта, что свидетельствует о возможности применения этих бактерий для разработки медиаторных БПК-биосенсоров. Наряду с определением интегральных показателей качества воды важным является одновременное определение содержания отдельных компонентов в водных средах. Биосенсоры на основе уксуснокислых бактерий или их ферментов могут быть использованы для экспресс-оценки содержания указанных компонентов в полупродуктах или готовой продукции.

Проведенные нами исследования закономерностей электрокаталитического окисления углеводов и спиртов бактериями (хохус/апэ легли в основу разработки макета медиаторного биосенсора для определения БПК (табл. 8, 9), суммарного содержания углеводов и спиртов. Преобразователем служили гальвано-потенциостаты, внесенные Государственном реестре средств измерений и допущенные к применению в Российской Федерации, что облегчает возможность продвижения разработанного биосенсора на Российский рынок.

Таблица 8. Характеристики макетов БПК-биосенсора

Метрологические и аналитические характеристики | Биораспознающий элемент Значение параметра

Целые клетки Мембранные фракции

Время единичного измерения, мин 15

Линейный диапазон зависимости ответов биосенсора от БПК5, мг/л 40 - 550 34-440

Операционная стабильность (относительное стандартное отклонение по 10 измерениям), % 5 4

Долговременная стабильность (времяработы биосенсора без потери активности), сут 23 29

Чувствительность (тангенсугла наклона линейного участка зависимости ответов сенсора от БПК; исследуемого раствора), нА-дм3/ мг 5 б

Макет БПК-биосенсора апробировали на отходах спиртового производства и полупродуктах брожения пшеничной и ржаной муки, имитирующих состав сточных вод бродильных производств (табл. 9).

Таблица 9. Значения индексов БПК5 образцов, полученные с помощью медиаторного биосенсора и стандартным методом разбавления

№ образца Название образца Значение БПК5, определенное с помощью биосенсора, г/дм3 Значение БПКз, определенное стандартным методом, г/дм3

1 Бродильная смесь на основе пшеничной муки осахаривания а-амилазой 3,1±0,2 2,9±0,2

2 Бродильная смесь на основе пшеиичной муки после осахаривания глюкоамилазой 33±3 35±2

3 Бродильная смесь на основе пшеничной муки в конце брожения 48±5 49±5

4 Бродильная смесь на основе ржаной муки после добавления осахаривающих ферментов глюкоамилазы и а-амилазы 29±4 26±3

5 Бродильная смесь на основе ржаной муки в конце брожения 45±5 47±5

6 Барда ржаная 3,0±0,6 2,8±0,6

- амилолитические препараты (Ко\'о['егт)

Полученные результаты определения индекса БПК5 с помощью биосенсора

согласуются с данными, полученными стандартным методом разбавления

(коэффициент смешанной корреляции 0,993). Разработанный макет медиаторного

БПК-биосенсора рекомендуется использовать для быстрого определения индекса

БПК стоков бродильных производств.

ВЫВОДЫ

1. Построены экспериментальные модели амперометрических медиаторных биосенсоров на основе иммобилизованных целых клеток микроорганизмов на поверхности графитовых и графитово-пастовых электродов, эти модели биосенсоров позволяют производить высокоточные измерения токов биоэлектрохимического окисления субстратов в наноамперном диапазоне и исследовать функционирование ферментных систем бактерий in vivo при использовании нано- и микро- количеств биомассы микроорганизмов.

2. Разработана методология оценки эффективности переноса электронов от ферментов иммобилизованных бактерий на электрод в присутствии медиаторов электронного транспорта для выбора сочетания «окисляемое соединение -бактерии - медиатор» при разработке амперометрических микробных биосенсоров и биотопливных элементов, которая основана на моделировании процессов биоэлектрохимического окисления субстратов иммобилизованными клетками бактерий.

2. Предложена модель биоэлектрохимического окисления субстратов иммобилизованными бактериями при участии медиаторов переноса электронов как двухсубстратная ферментативная реакция, протекающая по механизму «пинг-понг». Получены новые данные о возможности переноса заряда в системах «глюкоза/этанол - биокатализаторы (уксуснокислые бактерии или их мембранные фракции) - ферроцены и хиноны - электрод». Выявлена связь индексов эффективности медиаторов с электронными эффектами заместителей.

3. Впервые показана возможность применения мембранных фракций разрушенных клеток уксуснокислых бактерий в качестве биораспознающего элемента при создании медиаторных биосенсоров для определения индекса БПК как недорогих и стабильных биосенсорных систем экологического контроля.

4. На примере бактерий - деструкторов капролактама показана возможность быстрой оценки окислительной активности бактериальных штаммов с различными комбинациями «бактериальный хозяин - плазмида деградации» с использованием микробных биосенсоров на основе кислородного электрода.

5. Впервые показано, что под действием ферментов катаболизма капролактама происходит окислительное переаминирование линейных олигомеров аминокапроновой кислоты до соответствующих дикарбоновых кислот. Установлено, что процесс трансформации линейных олигомеров находится под генетическим контролем САР-плазмид.

6.Разработана унифицированная биосенсорная система, на основе которой возможна разработка серии приборов для экологического мониторинга водных сред, унифицированность биосенсора основана на использовании различных штаммов микроорганизмов, избирательно чувствительных к определенному

соединению, либо к большому их числу (для определения БПК и оценки токсичности).

7. Определены функциональные характеристики макетов биосенсоров проточно-инжекционного и кюветного типов для определения БПК, содержания капролактама . оценки токсичности товаров народного потребления. Эти являются прототипами опытных образцов приборов для серийного освоения в службах по экологическому и санитарно-химическому надзору.

8. Сформулированы принципы, положенные в основу методики для оценки токсичности товаров бытового назначения из полимерных и текстильных материалов с помощью электрохимического микробного биосенсора. Разработанная методика оценки токсичности товаров народного потребления из полимерных и текстильных материалов апробирована в испытательных лабораториях, осуществляющих контроль товаров народного потребления.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ, В КОТОРЫХ ПРЕДСТАВЛЕНЫ ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ И РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

(обозначения: ВАК - российский журнал из списка ВАК, WS - российский или зарубежный журнал, цитируемый в реферативной базе данных Web of Science):

Обзоры, монографии, главы в книгах

1. Решетилов А.Н., Решетилова Т.А., Алферов В.А., Понаморева О.Н. Биосенсоры. Медицинские, биотехнологические и экологические аспекты. II Вестник новых медицинских технологий. 1999. Т.VI. № 3-4. С. 44-49 (ВАК)

2. Решетилов А.Н., Алферов В.А, Решетилова Т.А., Понаморева О.Н. Биосенсоры в России. Тула: Изд.ТулГУ, 2007. - 111 с.

3. Arlyapov V.A., Chigrinova Е. Yu., Ponamoreva O.N., Reshetilov A. N. Express detection of BOD in wastewaters of starch-processing industry. Starch science and technology / Editor: G.E. Zaikov, 2008. pp. 43 - 50.

4. Понаморева О.Н. Биосенсоры и биотопливные элементы на основе целых клеток микроорганизмов и выделенных из них ферментов. Обзор. // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2009. Вып. 1. С. 138 - 157. (ВАК)

5. Понаморева О.Н.. Арляпов В.А., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Теория и примензние микробных биосенсоров для оперативного монитоинга биохимического потребления кислорода. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова, 2009, Т. 5, № 1, с. 42-48 (ВАК)

6. Понаморева О.Н. Бактериальные биосенсоры для экологического мониторинга углеводородов нефти: мини-обзор. Известия ТулГУ. Естественные науки. Вып. 2. 2010. С. 273 - 281 (ВАК)

7. Понаморева О.Н., Арляпов В.А., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Микробные биосенсоры для определения биологического потребления кислорода. Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т.47. №1. С. 5-15 (WS).

Избранные экспериментальные статьи в журналах

8. Рыбакова Е.В., Понаморева О.Н.. Алферов В.А., Китова А.Е., Кузмичев А.В., Решетилов А.Н. Биосенсорный анализ крахмала: применение гомогенного гидролиза с детекцией глюкозы ферментным и микробным сенсорами. И Сенсорные системы. 2005. Т. 29. № 1. С. 90-96 (ВАК).

9. Лобанов А.В., Решетилов А.Н., Понаморева О.Н. Определение состава многокомпонентных смесей при помощи микробных сенсоров. // Сенсорные системы. 2005. Т. 29. № 1. С. 83-89 (ВАК).

Ю.Россинская И.В., Понаморева О.Н.. Алферов В.А., Есикова Т.З., Кошелева И.А., Решетилов А.Н. Сравнительная оценка окисляющей активности ферментных систем бактерий-деструкторов капролактама и эффективности функционирования этих штаммов в качестве биорецеторного элемента биосенсора // Известия ТулГУ. Химия. 2005. Вып.5. С.78-88 (ВАК).

11.Решетилов А.Н., Понаморева О.Н.. Решетилова Т.А., Богдановская В.А. Генерация электрической энергии в биотопливном элементе на основе клеток микроорганизмов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2005. Т. 1. № 2. С. 54-62 (ВАК).

12.Babkina Е., Chigrinova Е., Ponamoreva О., Alferov V., Reshetilov А. Bioelectrocatalytic oxidation of glucose by immobilized bacteria Gluconobacter oxydans. Evaluation of water-insoluble mediator efficiency. // Electroanalysis. 2006. Vol. 18. No. 19-20. P.2023 - 2029 (WS).

13.Reshetilov A., Alferov S. , Tomashevskaya L., Ponamoreva O. Testing of bacteria Gluconobacter oxydans and electron transport mediators composition for application in Biofuel Cell. II Electroanalysis. 2006. V. 18. № 19-20. P. 2030 -2034 (WS).

14.Бабкина E.E., Понаморева O.H., Алферов B.A., Решетилов А.Н., Богдановская В.А. Оценка эффективности водорастворимых медиаторов при биоэлектрокаталитическом окислении глюкозы иммобилизованными бактериями // Сенсорные системы. 2006. Т. 20. № 4. С. 329-335 (ВАК).

15.Алферов C.B., Томашевская Л.Г., Богдановская В.А., Понаморева О.Н.. Решетилов А.Н. Анод биотопливного элемента на основе бактериальных клеток Gluconobacter oxydans и медиатора электронного транспорта 2,6-дихлорфенолиндофенола. // Электрохимия. 2006. Т. 42. № 4. С. 456-457 (WS).

16.Чигринова Е.Ю., Бабкина Е.Е., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Микробные сенсоры на основе производных ферроцена и бензохинона, применяемых в качестве медиаторов // Сенсорные системы. 2007. Т. 21. № 3. С. 263-269 (ВАК).

17.Россинская И.В., Есикова Т.З., Понаморева О.Н.. Решетилов А.Н. Биосенсорная оценка катаболической активности штаммов-деструкторов е-каполактама с различными сочетаниями «САР-плазмида - бактериальный хозяин»// Биотехнология. 2008. №4. С. 44-47 (ВАК).

18.Арляпов В.А., Понаморева O.I1. Алферов В.А. Многоканальная биосенсорная система для определения содержания глюкозы, метанола и этанола при их совместном присутствии. // Биотехнология. 2008. № 5. С. 84 -91 (ВАК).

19.Россинская И.В., Понаморева О.Н.. Есикова Т.З., Власова Ю.А., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Детекция капролактама двумя типами микробных биосенсоров И Вода: Химия и Экология. 2008. №1. С. 30-35 (ВАК).

20.Арляпов В.А., Понаморева О.Н.. Алферов В.А., Рогова Т.В., Блохин И.В., Чепкова И.Ф., Решетилов А.Н. Микробные биосенсоры для экспресс-определения ВПК сточных вод предприятий пищевой промышленности. П Вода: Химия и Экология. 2008. №3, с 20 - 22 (ВАК).

21.Чигринова Е. Ю., Бабкина Е.Е., Иськив E.H., Алферов В.А., Понаморева Q.H., Воронин A.M. Влияние электронных эффектов заместителей в молекулах ферроценов на их медиаторные свойства в биосенсоных системах на основе бактерий Gluconobacter oxydans. // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2008. Вып. 2. С. 23 8-245 (ВАК).

22.Чепкова И.Ф., Ануфриев М.А., Понаморева О.Н.. Алферов В.А., Решетилов А.Н., Щеглова В.А., С.Н.Петров. Применение биосенсора на основе иммобилизованных микроорганизмов для оценки токсичности продукции бытового назначения и товаров для детей. // Токсикологический вестник. 2010. № 1. С.34-40 (ВАК).

23.Понаморева О.Н.. Есикова Т.З., Власова Ю.А., Баскунов Б.П., Алферов В.А. Трансформация низкомолекулярных линейных олигомеров капролактама бактериями Pseudomonas putida BS394(pBS268) - деструкторами капролактама. // Микробиология. 2010. Т.79. № 3. С. 337-343 (WS).

24.Понаморева О.Н., Инджгия Е.Ю., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Эффективность биоэлектрокаталитического окисления этанола целыми клетками и мембранной фракцией бактерий Gluconobacter oxydans в присутствии медиаторов электронного транспорта. II Электрохимия. 2010. Т. 46. Т 12. С. 1503-1508 (WS).

25.Инджгия Е.Ю., Хитрова Ю.С., Понаморева О.Н., Бабкина Е.Е. Определение индекса БГОС отходов и полупродуктов спиртового брожения с помощью медиаторного биосенсора. Известия ТулГУ. Естественные науки. 2010. Вып. 2. С.256-264 (ВАК).

26.Алферов В.А., Зайцев М.Г., Понаморева О.Н., Кузнецова Т.А., Рогова Т.В., Решетилов А.Н. Электрохимический сенсор на основе алкогольоксидазы для экспресс-определения содержания низших спиртов. Журнал аналитической химии. 2011. Т.66. № 12. С. 1322-1329 (WS).

27. Алферов С. В., Воеводская О. А., Нгуен В. Т., Арляпов В. А., Понаморева О. Н., Решетилов А. Н. Уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans как биокатализаторы в медиаторном биотопливном элементе. Сенсорные системы. 2011. Т. 25. №4. С.346-351 (ВАК).

28.Арляпов В. А., Понаморева О. Н.. Алферов С. В., Алферов В. А., Решетилов

A. Н. Применение низкоселективных микробных биосенсоров для определения содержания компонентов в многокомпонентных водных средах. Сенсорные системы. 2011. Т. 25. № 4. С.352-360 (ВАК).

29.Понаморева О.Н.. Чепкова И.Ф., Ануфриев М.А., Алферов В.А., Щеглова

B.А., Музафаров E.H. Микробный биосенсор как инструмент биотестирования: оценка токсичности товаров народного потребления.

Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. 2011. Т.7, № 2, с. 21-28 (ВАК).

30.Arlyapov V., Kamanin S., Ponamoreva P.. Reshetilov A. Biosensor analyzer for BOD index express control on the basis of the yeast microorganisms Candida maltosa, Candida blankii, and Debaryomyces hansenii. II Enzyme and Microbial Technology. 2012. V. 50. P. 215- 220 (WS).

31.Esikova Т., Ponamoreva P.. Baskunov В., Taran S., Boronin A. Transformation of low-molecular linear caprolactam oligomers by caprolactam-degrading bacteria. II J. Chem Tech Biotech. 2012. V.87. P.1284-1290 (WS).

32.1ndjgia E., Ponamoreva P.. Alferov V., Reshetilov A. Interaction of ferrocene mediators with Gluconobacter oxvdans immobilized whole cells and membrane fractions in oxidation of ethanol// Electroanalysis. 2012. V24 (4). P. 924 - 930 (WS). Патенты РФ

33.Патент РФ №. 59255. Биосенсориый автоматический анализатор органических/токсичных соединений. / Решетилов А.Н., Алферов В.А., Понаморева Р.Н., Смирнов В.А., Лурье И. Б. Зарегистрирован 10.12.2006 (Бюллетень изобретений полезных моделей). Заявка № 2006127247.2006.

34.Патент №70661 Российская Федерация, МПК C12N 1/00 (2006.01). Устройство для определения е-капролактама / Понаморева Р.Н., Российская И.В., Есикова Т.З., Решетилов А.Н. - № 2007128608/22; заявл. 26.07.2007; опубл. 10.02.2008, Бюл.№4. - 3 с.

35.Патент РФ №66815. МПК C12N 1/00 (2006.01). Устройство для определения олиго- и полисахаридов / Китова А.Е., Понаморева О.Н., Решетилов А.Н.- № 2007111202/22; заявл. 28.03.2007

36.Патент №70580 Российская Федерация, МПК G01N 27/00 (2006.01). Многофункциональный автоматический биосенсорный анализатор органических соединений / Решетилов А.Н., Алферов В.А., Понаморева О.Н.- Заявка № 2007130487/22; заявл. 09.08.2007; опубл. 27.01.2008. Бюл.№3. -2 с.

37.Патент РФ № 98414, приоритет от 11.06.2010. Арляпов В.А., Алферов

B.А., Понаморева О.Н., Решетилов А.Н. А Устройство для определения содержания глюкозы, фруктозы, метанола и этанола. - Заявка № 2010124010/10; заявл. 11.06.2010; опубл. 20.0.2010. Бюл.№29. -2 с.

38.Патент РФ на полезную модель № 106898, приоритет от 03.12.2010. Арляпов В.А., Каманин С.С., Алферов С.В., Алферов В.А., Понаморева О.Н. Устройство для экспресс-определения биохимического потребления кислорода. Заявка № 2010149689/10, заявл. 03.12.20104 опубл. 27.07.2011. Бюл. №21.-2 с.

Избранные материалы в сборниках международных конференций

39.Россинская И.В., Алферов В.А., Понаморева О.Н.. Решетилов А.Н., Кошелева И.А. Изучение путей деградации ксенобиотиков с помощью микробного сенсора // Материалы II Международной научной конференции «Ксенобиотики и живые системы». Мп.: БГУ. Минск, 11-15 ноября 2003 г.

C. 36-40

4Q.Ponamoreva O.N.. Babkina E.E., Alferov V.A., Reshetilov A.N.. Electrocatalytic oxidation of glucose by bacterial cells in the presence of electron transport mediators. II Biosensors 2004 Poster Program / The Eighth World Congress on Biosensors. — Granada, Spain, 2004. - P. 2.5.22.

41.Россинская И.В., Понаморева O.H.. Решетилов A.H., Кошелева И.А., Алферов В.А. Использование микробного сенсора для изучения путей аэробной деградации ксенобиотиков. Материалы II Международной научной конференции и выставки "Биотехнология - охране окружающей среды". - Москва, 2004. - С. 150-153

42.Понаморева О.Н.. Бабкина Е.Е., Чигринова Е.Ю., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Микробные медиаторные биосенсоры // Фундаментальные основы инженерных наук. Сб. трудов международной научной конференции посвященной 90-летию со дня рождения Нобелевского лауреата A.M. Прохорова. Москва. 2006. Т. 2. С. 96-102.

43.Арляпов В.А., Понаморева О.Н., Решетилов А.Н., Алферов В.А., Блохин И.В. Микробный биосенсор для экспресс-определения ВПК сточных вод промышленных предприятий. Материалы IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий». Том 2. Томск: изд-во ТПУ, Томск, 2006, с. 329 - 331

44.Россинская И.В., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Есикова Т.З., И.А. Кошелева. Биосенсоры на основе бактериальных клеток как инструмент изучения процессов биодеградации ксенобиотиков // Материалы IV международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий». Том 2. Томск: изд-во ТПУ. Томск, 2006. С. 428-429.

45.Chigrinova E.Yu., Babkina Е.Е., Ponamoreva O.N., Alferov V.A., Reshetilov A.N. Parameters of microbial sensor with ferrocenes and quinones as mediators -Book of Abstracts. International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006, 25-30 June 2006, Moscow, Russia. - V. 1,2006 - P. 292.

46.Rossinskaya I.V., Ponamoreva O.N.. Alferov V.A., Kosheleva I.A., Esikova T.Z. Reshetilov A.N. Biosensor for detection of e-caprolactam // International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006, 25-30 June 2006, Moscow, Russia. -V. 1,2006-P. 368.

47.Alferov S., Chigrinova E., Tomashevskaia L., Babkina E., Ponamoreva P.. Reshetilov A/ Biosensor approach to assessment of efficiency of mediators for their application in microbial biofuel cells. // The International Conference "Molecular and nanoscale systems for energy conversion (MEC-2007)". Moscow. 2007. P.37-43.

48.Чигринова Е.Ю., Бабкина E.E., Понаморева O.H., Алферов В.А. Безреагентный микробный медиаторный биосенсор для экспресс-мониторинга загрязнения сточных вод. // Тезисы докладов XVUI Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Москва. 2007. Т. 4. С. 606.

49.Российская И.В. Понаморева О.Н. Биосенсорная система для экспресс-характеристики штаммов-деструкторов ксенобиотиков и детекция

капролактама в водных средах. // Материалы Четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2007. Т. 3. С. 13.

50.Чигринова Е.Ю., Бабкина Е.Е., Понаморева О.Н. Биоэлектрокаталитическое окисление субстратов бактериями Gluconobacter oxydons. // Материалы Четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2007. Т. 2. С. 269.

51.Инджгия Е.Ю., Понаморева О.Н.. Решетилов А.Н. Медиаторный биосенсор на основе мембранной фракции ферментов бактерий Gluconobacter oxydons для экспресс-определения БПК сточных вод II Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов». Москва. 2010. С.437-438.

52.Ponamoreva О.. Alferov V., Reshetilov A. Characteristic of xenobiotic compounds degrading microorganisms using electrochemical biosensors. // Biosensors 2010 Poster Program / 20th Anniversary World Congress on Biosensors. - Glasgow, UK, 2010.

53.Esikova T., Ponamoreva P.. Transformation of low-molecular linear caprolactam oligomers by the caprolactam-degrading bacteria, in Book of Abstracts of 5th European Bioremediation Conference, Chania, Crete, Greece, ed. Kalogerakis N andFavaF. 2011. P. 98

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность своему научному консультанту д.х.н., проф. Решетилову А.Н. и заведующему кафедрой химии ТулГУ, к.х.н., проф. Алферову В.А., по инициативе которых было начато это исследование, за постоянное внимание, помощь, обсуждение результатов и огромную организационную помощь в работе.

Искренне признательна коллегам, принимавшим участие в работе на разных ее этапах: преподавателям, дипломникам и аспирантам кафедры химии и кафедры биотехнологии ТулГУ - д.б.н. Музафарову E.H., к.х.н. Бабкиной Е.Е., к.х.н. Инджгия Е.Ю., K.X.H. Алферову C.B., к.х.н. Арляпову В.А., к.х.н. Российской И.В., к.б.н. Чепковой И.Ф., к.б.н. Лагуновой НЛ., Ануфриеву М.А. и многим другим.

Хотелось бы выразить огромную благодарность директору ИБФМ РАН, чл.-корр. РАН, д.б.н. Воронину A.M. и ученому секретарю ИБФМ РАН, д.б.н. Решетиловой Т.А. за организацию совместных научных исследований и поддержку в работе.

Большую благодарность приношу сотрудникам ИБФМ РАН к.б.н. Есиковой Т.З. и Баскунову Б.П. за неоценимую помощь в проведении микробиологических и масс-спектрометрических исследований по биотрансформации оли гомеров аминокапроновой кислоты и интерпретации полученных результатов, к.б.н. Филонову А.Е. и K.6.H. Пунтус И.Ф. за методическую помощь и профессиональные советы.

Искренняя благодарность заведующей лаборатории санитарно-химических и токсикологических исследований ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в

Тульской области» В.А.Щегловой за содействие в проведении токсикологических исследований.

Особая признательность заведующему кафедрой био- и нанобиотехнологии МИТХТ им. М.В.Ломоносова, чл.-корр. РАМН Швецу В.И., заведующему кафедрой химии и технологии биологически активных соединений имени H.A. Преображенского МИТХТ им. М.В.Ломоносова, д.х.н., проф. Миронову А.Ф., к.х.н., вед.н.с. МИТХТ им. М.В.Ломоносова Румянцевой В.Д. - моим первым учителям в науке, которые открыли для меня эту прекрасную сторону жизни, верили в меня и поддерживали.

Большое спасибо членам моей семьи, моим друзьям, всем коллегам за постоянную моральную поддержку и веру в успех.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

РС}(2 - пирролохшюлинхинон

САР - плазмиды - плазмиды деградации

капролактама

АДГ - алкогольдегидрогеназа

АФЦ - ацетилферроцен

БПК - биохимическое потребление

кислорода

ЕТЭ - биотопливные элементы

БХ- бензохинон

ГДГ - глюкоздегидрогеназа

ГХ - газовая хроматография

ГЦФ - гексацианоферрат (Ш) калия,

феррицианид

ДБХ- 2,5-дибромхинон

ДГ- дегидрогеназы

ДМФ-1,1 -диметилферроцен ДХФИФ -дихрофенолиндофенол ИАЭ — искусственные акцепторы электронов

МБТГ - 3-метил-2-бензотиазолинон-2-падрозон

МБХ - метоксибенохинон, толухинон ПДК — предельно допустимая концентрация ТСХ - тонкослойная хроматография ФКА- ферроценкарбальдегид ФДК - ферроцендикарбоновая кислота ФМК - ферроценмонокарбоновая кислота ФМС - феназинметасульфат ФЦ - ферроцен ЭФ - этилферроцен

Подписано в печать:

09.10.2013

Заказ № 8851 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора химических наук, Понаморева, Ольга Николаевна, Тула

фгбоу впо «тульским государственный университет»

естественно-научный факультет

На правах рукописи

05201351963

ПОНАМОРЕВА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА

закономерности функционирования ферментных систем микроорганизмов как биокатализаторов в амперометрических биосенсорах

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора химических наук

Научный консультант профессор, доктор химических наук Решетилов Анатолий Николаевич

Тула - 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

САР - капролактам PQQ, - пирролохинолинхиноу PQQH2 - пирролохинолинхинол Q - убихинон

Qi - 2,3-Диметокси-5-метил-6-(3-метил-2-бифенил)-1,4-бензохинон

Qio - убихинон-10

АДГ - алкогольдегидрогеназа

АТФ - аденозинтрифосфат

АЦФ - ацетилферроцен

БПК - биохимическое потребление кислорода БТЭ - биотопливные элементы БХ - бензохинон

ВКМ - Всероссийская коллекция микроорганизмов

ГДГ - глюкозодегидрогеназа

мГДГ - мембранная глюкозодегидрогеназа

ГХ - газовая хроматография

ГЖХ - газожидкостная хроматография

ГТДФ - гексацианоферрат (III) калия, ферринианид

ДБХ - 2,5-дибромхинон

ДГ- дегидрогеназы

ДМФ - 1,1 -диметилферроцен

ДХФИФ - дихрофенолиндофенол

ИАЭ - искусственные акцепторы электронов

МБТГ - 3-метил-2-бензотиазолинон-2-гидрозон

МБХ - метоксибенохинон, толухинон

МДГ - метанолдегидрогеназа

МТЭ - микробный топливный элемент

НАД+, НАДН - никотинамидадениндинуклеотид

ПАВ - поверхностно-активные вещества

ПДК - предельно допустимая концентрация

ТСХ - тонкослойная хроматография

ФА- ферроценкарбальдегид

ФДК - ферроцендикарбоновая кислота

ФДМ - 1Д'-ди(2-гидрокси)этилферроценом, (ферроцендиметанол) ФМК - ферроценмонокарбоновая кислота ФМС - феназинметасульфат ФЦ - ферроцен ЭФ - этилферроцен

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................10

ГЛАВА 1. БИОЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ И СПИРТОВ УКСУСНОКИСЛЫМИ БАКТЕРИЯМИ вШСОМОВАСТЕК ОХУОАЫБ...............................................................................................................18

1.1. Потенциал бактерий СЫсопоЬаМег как биокатализаторов при разработке медиаторных биосенсоров и биотопливных элементов: обоснование выбора объекта исследований...................................................18

1.1.1. Физиолого-биохимические особенности уксуснокислых бактерий рода аисопоЬас1ег.........................................................................................18

1.1.1.1. Особенности дыхательной цепи...................................................20

1.1.1.2. Метаболизм углеводов и спиртов................................................23

1.1.1.3. Характеристика мембранных дегидрогеназ................................26

1.1.2. Биоэлектрохимические системы на основе уксуснокислых бактерий ЫисопоЬаМег. обзор разработанных устройств и подходов к их созданию ..........................................................................................................................34

1.1.2.1. Биосенсоры на основе СЫсопоЬасгег..........................................37

1.1.2.2. Микробные топливные элементы на основе Glucon.oba.cter.....41

1.2. Восстановление искусственных акцепторов электронов ферментными системами целых клеток аисопоЬаМег..........................................................44

1.2.1. Редокс-красители для определения их метаболической активности микроорганизмов: обоснование методики исследования..........................44

1.2.2. Конкуренция кислорода и искусственных акцепторов за электроны мембранных оксидоредуктаз СЫсопоЪаШг охуйат.................................49

1.2.3. Эффективность искусственных акцепторов электронов при окислении глюкозы бактериями СЫсопоЬасгег охуйат............................55

1.2.4. Анализ субстратной специфичности бактерий Glucon.oba.cter охуйат при взаимодействии с искуссвенным акцептором электронов... 58

1.2.5. Сравнительная характеристика целых клеток С1исопоЬас1ег охус1ат и их ферментных фракций как биокатализаторов окисления глюкозы и

этанола в присутствии искусственных акцепторов электронов................61

1.3. Анализ процессов биоэлектрохимического окисления субстратов уксуснокислыми бактериями аисопоЬаМег охуйат (медиаторный биоэлектрокатализ)............................................................................................65

1.3.1. Оценка возможности использования редокс-соединений как медиаторов переноса электронов в биосенсорах на основе бактерий СШсопоЬаШг охус1ат методом вольтамперометрии.................................69

1.3.2. Субстратная специфичность бактерий аисопоЪасгег охус1ат в условиях биоэлектрохимического окисления при участии медиаторов электронного транспорта...............................................................................77

1.3.3. Моделирование процессов электрокаталитического окисления глюкозы иммобилизованными бактериями Glu.conoba.cter охуйат.........81

1.3.3.1. Скоростьопределяющие стадии окисления субстратов иммобилизованными на поверхности электрода бактериями в условиях функционирования медиаторного биосенсора........................................82

1.3.3.2. Биоэлектрокаталитическое окисление субстратов в системах с иммобилизованными бактериями - механизм «пинг-понг». Эффективность медиаторов.......................................................................92

ГЛАВА 2. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ -ДЕСТРУКТОРЫ КАПРОЛАКТАМА КАК БИОРАСПОЗНАЮЩИЕ

ЭЛЕМЕНТЫ БИОСЕНСОРОВ..........................................................................110

2.1. Методы анализа капролактама в водных средах и биохимические основы деградации капролактама и его олигомеров (обзор): отправные точки для исследования..................................................................................114

2.1.1 Физико-химические методы определения 8-капролактама в водных

средах.............................................................................................................114

2.1.2. Биодеградация капролактама и олигомеров аминокапроновой кислоты..........................................................................................................115

2.1.2.1. Биохимические и генетические аспекты катаболизма капролактама.............................................................................................115

2.1.2.2. Ферменты деградации нейлоновых олигомеров......................120

2.2. Скрининг бактерий с различными сочетаниями «САР-плазмида -бактериальный хозяин» по окислительной активности..............................125

2.3. Трансформация линейных олигомеров е-аминокапроновой кислоты бактериями-деструкторами капролактама....................................................135

2.3.1. Дыхательная активность бактерий-деструкторов капролактама в присутствии олигомеров.............................................................................135

2.3.2. Трансформация олигомеров бактериями-деструкторами капролактама: масс-спектрометрическое исследование..........................137

3.3.3. со-Трансаминазная активность бактерий в присутствии 6-аминогексаноата и димера 6-аминогексаноата.........................................145

ГЛАВА 3. БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА. 149

3.1. Микробные биосенсоры в экотоксикологии: принципы функционирования и практическое применение (обзор)............................150

3.1.1. Биосенсоры для оценки токсичности среды и определения токсикантов...................................................................................................150

3.1.2. БПК-биосенсоры................................................................................157

3.2. Микробный сенсор для мониторинга содержания капролактама в стоках................................................................................................................163

3.2.1. Макет микробного сенсор кюветного типа для детекции капролактама.................................................................................................164

3.2.2. Макет биосенсора проточно-инжекционного типа........................169

3.3. Микробный биосенсор и методика для оценки токсичности продукции

бытового назначения.......................................................................................176

3.4. Медиаторные биосенсоры на основе уксуснокислых бактерий и выделенных из них мембранных фракций для определения суммарного

содержания Сахаров, спиртов и БПК.............................................................194

3.4.1. Микробный медиаторный биосенсор..............................................195

3.4.1.1. Выбор рабочих параметров функционирования микробных сенсоров.....................................................................................................195

3.4.1.2. Долговременная и операционная стабильность микробных медиаторных биосенсоров.......................................................................197

3.4.2. Медиаторный биосенсор на основе мембранных фракций бактерий

........................................................................................................................199

3.4.2.1. Выбор рабочих параметров функционирования медиаторного

биосенсора на основе мембраной фракции бактерий аисопоЬаМег охус1ат........................................................................................................199

3.4.2.2. Долговременная и операционная стабильность медиаторных биосенсоров на основе мембранной фракции бактерий аисопоЬас1ег охуйат........................................................................................................201

ч 3.4.3. Характеристики макетов БПК-биосенсоров....................................203

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................206

4.1. Реактивы и материалы..............................................................................206

4.2. Биокатализаторы как основа биораспознающих элементов биосенсоров: штаммы микроорганизмов, питательные среды, условия культивирования, буферные растворы, ферментные фракции бактерий.. 206

4.2.1. Штаммы микроорганизмов...............................................................206

4.2.2. Среды и условия культивирования микроорганизмов...................207

4.2.3. Буферные растворы............................................................................210

4.2.4. Выделение ферментных структур бактерий СЫсопоЬасгег охус1ап8

........................................................................................................................210

4.3. Взаимодействие искусственных акцепторов электронов с уксуснокислыми бактериями..........................................................................210

4.3.1. Дегидрогеназная активность ферментных фракций бактерий.....211

4.3.2. Скорости восстановления редокс-красителей целыми клетками бактерий.........................................................................................................211

4.4. Амперометрические методы регистрации окислительной активности иммобилизованного биоматериала................................................................212

4.4.1. Биоэлектрохимические системы с медиаторным переносом электронов.....................................................................................................212

4.4.2. Регистрация дыхательной активности иммобилизованных микроорганизмов-деструкторов капролактама с помощью амперометрического кислородного датчика.............................................214

4.5. Методы определения капролактама и степени его деградации...........218

4.5.1. Тонкослойная хроматография растворов капролактама................218

4.5.2 Фотометрический метод определения капролактама......................218

4.5.3. Газохроматографическое определение капролактама...................219

4.5.4. Определение концентрации капролактама в образцах промышленных отходов..............................................................................219

4.5.5. Оценка степени биодеградации капролактама в образцах промышленных отходов..............................................................................219

4.6. Масс-спектрометрический анализ биодеградации олигомеров 6-аминогексановой кислоты..............................................................................220

4.7. Трансаминазная активность....................................................................221

4.8. Оценка токсичности образцов бытовой продукции..............................222

4.8.1. Пробоподготовка образцов продукции бытового назначения......222

4.8.2. Дыхательная активность микроорганизмов как тест-функция для оценки токсичности.....................................................................................223

4.8.3. Референтные методы для гигиенической оценки продукции

бытового назначения по химическому фактору.......................................224

4.9. Определение БПК5 модельных и реальных образцов...........................225

4.9.1. Стандартный метод разбавления......................................................225

4.9.2. Моделирование процесса спиртового брожения............................225

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................226

ВЫВОДЫ.............................................................................................................229

БЛАГОДАРНОСТИ............................................................................................231

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................232

ПРИЛОЖЕНИЕ...................................................................................................275

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Ежегодно в окружающую среду выбрасываются сотни новых загрязняющих веществ с неизученным влиянием на человека. Ужесточение требований к их нормированию приводит к необходимости проведения сложных и дорогостоящих исследований по экологической безопасности [1]. В экологии и токсикологии предпочтительно комплексное использование различных методов анализа: физико-химических, биохимических, биологических [2, 3]. Физико-химические методы позволяют с высокой точностью и селективностью определять индивидуальные вещества, однако не дают прямой информации о биологической опасности ксенобиотиков и не позволяют адекватно оценить действие веществ на окружающую среду и на человека, так как не учитывают синергические, антагонистические и потенциальные эффекты неизвестных соединений [4]. Биохимические методы анализа основаны на специфических взаимодействиях биологических макромолекул между собой или с другими соединениями в анализируемых образцах. Эти взаимодействия сопровождаются изменениями в системе, которые можно зарегистрировать с помощью физико-химических преобразователей. Биологические макромолекулы можно рассматривать как химические соединения, поэтому биохимические методы анализа позволяют определять содержание специфических соединений в пробе с высокой чувствительностью, что является их главным достоинством [5]. Следует отметить, что в качестве биочувствительного компонента могут выступать не только индивидуальные биологические молекулы, но и биологические системы, например, органеллы, целые клетки и ткани. Однако, как и физико-химические, биохимические методы не позволяют оценить токсическое действие анализируемого образца. Биологические методы анализа - методы качественного обнаружения, основанны на применении живых организмов в качестве аналитических индикаторов [6]. Живые организмы всегда обитают в

среде строго определенного химического состава и в условиях воздействия определенных факторов окружающей среды. Если нарушить этот состав, то живая система через некоторое время подаст определенный сигнал. Живые организмы в этом случае выступают в роли индикаторов или тест-объектов. Биологические методы анализа можно разделить на две группы: биоиндикация и биотестирование. Биоиндикация - обнаружение и определение экологически значимых антропогенных нагрузок на основе реакций на них живых организмов непосредственно в среде обитания [7]. Биотестирование - это процедура установления токсичности исследуемого объекта с помощью живых организмов в лабораторных условиях [8]. Для этого используют реакции живых организмов (тест-функции). Большинство биологических методов позволяют только оценить качество среды, но не позволяют проводить количественное определение токсикантов. В то же время получаемая с помощью этих методов информация характеризуется интегральным характером восприятия и отражением всех токсических воздействий, обусловленных совместным присутствием токсикантов. В 2010 году странами-членами таможенного союза приняты Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования [9], направленные на обеспечение безопасности продукции, и многие разделы этого документа включают такой показатель как токсичность. Однако существующие методы экспресс-оценки токсичности имеют свои ограничения. Принятие Регламента №1907/2006 Европейского Парламента и Совета ЕС от 18 декабря 2006, касающегося правил регистрации, оценки, санкционирования и ограничения химических веществ (REACH), также подталкивает развитие токсикологических методов биотестирования [10].

Таким образом, разработка эффективных методов биотестирования для оценки токсичности является одним из приоритетных направлений аналитической биотехнологии. Сопряжение биологических и биохимических компонентов с физико-химическими преобразователями позволяет

разрабатывать биоаналитические системы (биосенсоры) и новые методы биотестирования на их основе [11]. Биосенсор - это интегральная система, которая способна воспринимать и преобразовывать специфичную количественную или полуколичественную аналитическую информацию с использованием биологического распознающего элемента, находящегося в тесном контакте с преобразователем. Биосенсор отличается от любой биоаналитической системы, прежде всего, тем, что при его использовании в анализе нет необходимости в дополнительных процедурах пробоподготовки [12]. Техническое решение методов анализа с применением биосенсоров упрощено по сравнению с физико-химическими, биохимическими методами анализа и биологическими методами оценки токсичности.

В качестве биораспознающего компонента в биосенсорах может использоваться различный биоматериал, как биологические макромолекулы (ферменты, иммунокомпоненты, ДНК и т.д.), так и живые объекты (срезы тканей, клетки, органеллы). Принципы функционирования молекулярных биосенсоров основаны на биохимических взаимодействиях, т.е. с их помощью реализуются биохимические методы анализа. Целоклеточные биосенсоры можно рассматривать и как инструменты для реализации биохимических методов, и как инструменты биот�

Информация о работе

Понаморева, Ольга Николаевна
доктора химических наук
Тула, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Закономерности функционирования ферментных систем микроорганизмов как биокатализаторов в амперометрических биосенсорах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Закономерности функционирования ферментных систем микроорганизмов как биокатализаторов в амперометрических биосенсорах - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы